Diæt med højt fosforindhold inducerer opregulering af Bmp2- og Spp1-MRNA-ekspression i rottenyre

Hiroshi Matsuzaki, Kikue Mori, Shinichi Katsumata 

For at afklare mekanismen for udviklingen af ​​nefrocalcinose induceret af en kost med højt fosforindhold (P) fokuserede vi på knoglerelaterede proteiner såsom knoglemorfogenetisk protein 2 og osteopontin. Denne undersøgelse undersøgte virkningerne af en høj-P diæt på mRNA-ekspressionen af ​​Bmp2 og Spp1 hos rotternyre. Wistar-rotter blev opdelt i to grupper og fodret med en kontroldiæt (kontrolgruppe) eller en høj-P-diæt (høj-P-gruppe).Nyrecalcium- og P-koncentrationer var signifikant øget i høj-P-gruppen sammenlignet med kontrolgruppen. mRNA-ekspressionen af ​​både Bmp2 og Spp1 var signifikant øget i høj-P-gruppen sammenlignet med kontrolgruppen. Disse resultater indikerer, at en høj-P diæt inducerer opregulering af Bmp2 og Spp1 mRNA inyre.

Nøgleord: kost med højt fosforindhold, nefrocalcinose, Bmp2, Spp1,nyre, rotte

For mere information kontakt venligst:emily.li@wecistanche.com

cistanche til behandling af nyresygdom

Introduktion

Nephrocalcinose er en lidelse karakteriseret ved kalkaflejringer (Ca) i nyreparenkymet. Fosfor (P) i kosten er især en afgørende faktor i udviklingen af ​​denne lidelse. Administration af en høj-P diæt har vist sig at resultere i øget Ca-koncentration inyreog Ca-aflejringer i nyreparenkymet1-6）. Selvom effekten af ​​en høj-P diæt på udviklingen af ​​nefrocalcinose har været i fokus for igangværende undersøgelser, er lidt kendt om den mekanisme, der er ansvarlig for udviklingen af ​​denne lidelse. Derfor er der behov for en rettidig løsning på dette problem.

Vi rapporterede, at der ved histologisk undersøgelse ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi blev observeret hydroxyapatit-lignende nåleformede krystaller i nyretubuli hos rotter fodret med en høj-P diæt6, 7）. Røntgenmikroanalyse indikerede, at Ca-aflejringer induceret af en høj-P-diæt hovedsageligt består af Ca og P7）. Disse resultater afslørede, at Ca-aflejringer induceret af en høj-P diæt er en form for hydroxyapatit. Baseret på dette fund postulerer vi, at udviklingen af ​​nefrocalcinose styres af en mekanisme, der ligner den, der er ved knogledannelse. Derfor fokuserede denne undersøgelse på knogleassocierede proteiner såsom knoglemorfogenetisk protein 2 (BMP2). BMP2 er en osteogen faktor, der udviser osteogenese-inducerende aktivitet8, 9）. Det er bemærkelsesværdigt, at BMP2 blev identificeret som en faktor, der inducerer ektopiskknogledannelse10, 11）. Således antog vi, at hvis BMP2 spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​nefrocalcinose, vil ekspressionen af ​​dette protein inyreville blive opreguleret af en høj-P diæt. Den foreliggende undersøgelse havde til formål at bestemme, om en høj-P diæt påvirker mRNA-ekspressionen af ​​Bmp2 inyre.

I mellemtiden rapporterede vores tidligere undersøgelse, at en høj-P-diæt hæver osteopontin (OPN)-ekspression i nyretubuli ved hjælp af immunhistokemisk analyse, hvilket tyder på, at OPN kan være impliceret i udviklingen af ​​Ca-aflejringer induceret af en høj-P-diæt12）. Derfor undersøgte vi ændringerne i Spp1 mRNA-ekspression inyresåvel.

Resultaterne af denne undersøgelse kan give værdifuld indsigt i den mekanisme, der er ansvarlig for udviklingen af ​​nefrocalcinose induceret af en høj-P diæt.

Materialer og metoder

Dyr og diæter.

Nærværende undersøgelse blev godkendt af Animal Use Committee ved Tokyo University of Agriculture, og alle dyr blev vedligeholdt i overensstemmelse med universitetets retningslinjer for pleje og brug af forsøgsdyr (Godkendelse nr. 300049).

Det er vigtigt at bemærke, at hunrotter udvikler nefrocalcinose lettere end hanrotter13, 14）. Derudover rapporterede vi, at en høj-P diæt øger OPN-ekspression i nyretubuli hos hunrotter12）. Den nuværende undersøgelse brugte derefter hunrotter som forsøgsdyr. Fire uger gamle Wistar-hunrotter (Clea Japan, Tokyo, Japan) blev anbragt i individuelle bure med trådnet af rustfrit stål. I løbet af forsøgsperioden blev burene placeret i et rum med kontrolleret belysning under en 12-h lys: mørke cyklus (lys, 0800-2000 h), temperaturen på 22 ± 1 grad og relativ luftfugtighed på 60 procent til 65 procent.

Sammensætningen af ​​forsøgsdiæterne er vist iTabele 1. Eksperimentelle diæter blev udarbejdet med henvisning til AIN{{0}}G-diæten15). De eksperimentelle diæter indeholdt to forskellige P-koncentrationer (kontroldiæt, 0,3 procent; høj-P-diæt, 1,5 procent). P-koncentrationen i diæten med høj P blev sat til 1,5 procent, siden vores tidligere undersøgelser observerede, at en diæt-P-koncentration på 1,5 procent inducerer

svær nefrocalcinose6, 7, 12, 14) og høj OPN-ekspression12). Alle eksperimentelle diæter havde den samme koncentration af Ca (0,5 procent). P- og Ca-koncentrationer, som bestemt ved analyse af de eksperimentelle diæter, er vist iTabele 1. Før studiets start blev alle rotter akklimatiseret i 7 dage, hvor de fik fri adgang til kontroldiæten og deioniseret vand. Efter akklimatiseringsperioden blev rotterne tilfældigt opdelt i to grupper med ens gennemsnitlig kropsvægt og fodret enten med kontroldiæten (kontrolgruppen) eller høj-P-diæten (høj-P-gruppen) i 14 dage. Rotter fik fri adgang til de tildelte forsøgsdiæter og deioniseret vand gennem hele forsøgsperioden. Ved slutningen af ​​forsøgsperioden blev rotter aflivet ved intraperitoneal injektion af bedøvelsesblandingen (medetomidin, midazolam og butorphanol) og blod ognyreprøver blev indsamlet til analyse. Blodprøver blev centrifugeret, og supernatanter blev anvendt som serumprøver. Nyrerne blev fjernet, og nyrekapslen blev kasseret. Serumet ognyreprøver blev opbevaret ved -80 grader, indtil de skulle bruges til analyse. Den højre nyre blev brugt til kvantitativ analyse af Bmp2 og Spp1 mRNA, og den venstrenyreblev brugt til analyse af Ca- og P-koncentrationer.

Mineralanalyse.

Prøver af de eksperimentelle diæter ognyrerblev forasket ved 550 grader i 48 timer i en muffelovn, og mineraler blev ekstraheret i 1 mol/L HCl til analyse. Ca-koncentrationer i forsøgsdiæterne ognyrerblev bestemt ved atomabsorptionsspektrofotometri16）. P-koncentrationer i forsøgsdiæterne ognyrerblev analyseret ved hjælp af metoden fra Gomori17）.

Kvantitativ analyse af Bmp2 og Spp1 mRNA.

Total RNA blev isoleret fra den homogeniserede nyre under anvendelse af TRIzol-reagens (Life Technologies, CA, USA) i henhold til producentens specifikationer. Mængden og renheden af ​​RNA'et blev vurderet ved hjælp af en NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, MA, USA). cDNA blev syntetiseret ved hjælp af SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix til qRT-PCR (Life Technologies) og derefter udsat for kvantitativ real-time RT-PCR under anvendelse af SYBR Select Master Mix (Life Technologies). Specifikke primere18-20）blev brugt til analysen af ​​Bmp2 (fremad, 5'-ACCGTGCTCAGCTTCCATCAC-3'; omvendt, 5'-TTCCTGCATTTTGTTCCCGAAA-3'), Spp1 (fremad, 5'- TGAGACTGGCAGTGGTTTGC-3'; omvendt, 5'-CCACTTTCACCGGGAGACA-3') og Gapdh (fremad, 5'-TGGGAAGCTGGTCATCAAC-3'; omvendt, 5'-GCAT-CACCCCATTTGATGTT{{26} }'). Real-time PCR-reaktionen blev udført ved hjælp af et StepOne Real-Time PCR-system (Applied Biosystems, CA, USA), og mRNA-ekspressionsniveauer blev normaliseret til Gapdh-mRNA-niveauer. Værdien af ​​kontrolgruppen blev anset for at være 1,00.

Statistisk analyse.

Resultater præsenteres som middelværdier ± SEM for hver gruppe på 6 rotter. Efter at have udført en F-test for at bestemme variansens homogenitet, blev en Students t-test brugt til at bestemme signifikante forskelle mellem de to grupper. Hvis homogeniteten af ​​varianser ikke var ens, blev Welchs t-test brugt i stedet for Elevens t-test. Forskelle blev betragtet som signifikante ved p ＜ 0.05

Resultater

Kropsvægt, fødeindtagelse og serumanalyse.

Den endelige kropsvægt og fødeindtagelse var signifikant faldet i høj-P-gruppen sammenlignet med kontrolgruppen (Bord 2). Nyrevægt og mineralkoncentrationer.Nyrevåde og tørre vægte var signifikant øget i høj-P-gruppen sammenlignet med kontrolgruppen (Bord 3). NyreCa- og P-koncentrationer var også signifikant øget i høj-P-gruppen sammenlignet med kontrolgruppen.

Renal Bmp2 og Spp1 mRNA ekspression.

Bmp2 mRNA-niveauer i høj-P-gruppen var signifikant øget sammenlignet med kontrolgruppen (Fig.1A). mRNA-ekspression af Spp1 var også signifikant øget i høj-P-gruppen sammenlignet med kontrolgruppen (Fig. 1B).

Diskussion

En af de velkendte fysiologiske virkninger af en høj-P diæt er udviklingen af ​​nefrocalcinose. I denne undersøgelse var nyre-Ca- og -P-koncentrationerne øget i høj-P-gruppen sammenlignet med kontrolgruppen, hvilket er i overensstemmelse med resultaterne fra de tidligere undersøgelser1-6）. Tidligere undersøgelser rapporterede, at histologiske scoringer af nefrocalcinose var positivt korreleret med nyre Ca- og P-koncentrationer4, 21）. Selvom ingen histologisk observation af nyren blev udført i den foreliggende undersøgelse, indikerer øgede nyre Ca- og P-koncentrationer, at nefrocalcinose blev induceret af diæten med højt P.

Fordi Ca-aflejringer induceret af en høj-P-diæt generelt antages at være en form for hydroxyapatit6, 7）, antog vi, at udviklingen af ​​nefrocalcinose styres af en mekanisme svarende til osteo-genese. Således undersøgte vi virkningerne af en høj-P diæt på Bmp2 mRNA-ekspression i nyren. Resultaterne

viste, at nyre-Bmp2-mRNA-ekspression var øget i høj-P-gruppen, og at en høj-P-diæt inducerer opregulering af Bmp2-mRNA-ekspression i nyren. Dette fund kan hjælpe med at forklare mekanismen for udvikling af nefrocalcinose induceret af en høj-P diæt. Selvom der mangler definitive beviser, der understøtter vores hypotese, er en mulighed, at ekspressionen af ​​osteogene transkriptionsfaktorer er forhøjet i forkalkede områder i nyren. BMP2 inducerer osteoblastdifferentiering og knogledannelse ved at regulere osteogene transkriptionsfaktorer såsom Osterix, Runx2 og Msx28, 9）; således kan BMP2 fremme nefrocalcinose via reguleringen af ​​sådanne osteogene transkriptionsfaktorer. På nuværende tidspunkt er den detaljerede rolle af BMP2 i udviklingen af ​​nefrocalcinose stadig uklar. Da kun Bmp2-mRNA-ekspressionen blev målt i denne undersøgelse, vides det desuden ikke, om der er en forskel i BMP2-proteinekspressionen. Vores resultater tyder imidlertid på en mulig mekanisme, hvorved ændringer i BMP2-ekspression spiller en potent rolle i patogenesen af ​​high-P diæt-induceret nefrocalcinose.

Den nuværende undersøgelse fokuserede på Spp1 mRNA-ekspression ud over Bmp2 mRNA-ekspression. Vores tidligere undersøgelse ved hjælp af immunhistokemisk analyse indikerede høje niveauer af OPN-ekspression i nyretubuli hos rotter fodret med en høj-P diæt12）. Den nuværende undersøgelse fandt, at Spp1-mRNA-ekspression blev øget med ca. 10-fold i høj-P-gruppen. Resultater af de nuværende og tidligere undersøgelser afslører, at en høj-P diæt inducerer OPN-ekspression i nyrerne. På den anden side har andre forskere vist, at OPN som stenmatrix er en vigtig faktor i dannelsen af ​​urinsten22, 23）; således foreslog vores tidligere rapport, at OPN kan have en rolle som en matrixkomponent i dannelsen af ​​Ca-aflejringer induceret af en høj-P diæt12). Imidlertid har Paloian et al. for nylig rapporteret, at OPN spiller en rolle i forebyggelsen af ​​high-P diæt-induceret nefrocalcinose i OPN KO mus24). OPN's fysiologiske rolle på høj-P diæt-induceret nefrocalcinose ser ud til at være undertrykkelse snarere end en fremme af forkalkning inyre. Desuden er tidligere rapporter beskrevet, at OPN-niveauer stiger for at opveje yderligere patologisk ektopisk forkalkning inyreog vaskulatur, da OPN opreguleres på stedet for patologisk forkalkning.

Som nævnt ovenfor antydede den nuværende undersøgelse vigtigheden af ​​BMP2 og OPN i high-P diæt-induceret nefrocalcinose. Det er bemærkelsesværdigt, at virkningerne af BMP2 og OPN på udviklingen af ​​nefrocalcinose menes at være reguleret af forskellige mekanismer. Disse mekanistiske forskelle kan indikere, at den underliggende mekanisme for nefrocalcinose er kompliceret. Det næste punkt at overveje er, at væksthæmning kan have påvirket Bmp2- og Spp1-mRNA-ekspression inyrefordi den nuværende undersøgelse observerede en reduktion af den endelige kropsvægt i en høj-P gruppe. Observationer i vores tidligere12） og nuværende undersøgelser kan hjælpe med at forklare dette punkt. Vi har tidligere rapporteret øget OPN-proteinekspression i nyretubuli hos rotter, hvis vækst

blev ikke hæmmet af en diæt med højt P12）. Desuden viste den foreliggende undersøgelse væksthæmning i høj-P-gruppen, men høje niveauer af Spp1 mRNA-ekspression i nyren. Baseret på disse observationer ser den foreliggende undersøgelse ud til at have ringe effekt af væksthæmning af Bmp2- og Spp1-mRNA-ekspression. Imidlertid forbliver detaljerne i forholdet mellem væksthæmning og Bmp2- og Spp1-genekspression uklare. Derfor er der behov for yderligere undersøgelser for at belyse dette punkt.

Som konklusion, for at klarlægge mekanismen for udviklingen af ​​nefrocalcinose induceret af en høj-P diæt, bestemte denne undersøgelse virkningerne af en høj-P diæt på Bmp2 og Spp1 mRNA-ekspression inyre. Nyre Ca- og P-koncentrationer var signifikant øget i høj-P-gruppen sammenlignet med kontrolgruppen. Yderligere var mRNA-ekspression af Bmp2 og Spp1 signifikant øget i høj-P-gruppen sammenlignet med kontrolgruppen. Disse resultater indikerer, at en høj-P diæt fremmer opregulering af Bmp2 og Spp1 mRNA ekspression inyre.

Referencer

1） Hitchman AJ, har nogen SA, Hitchman A, Harrison JE, Tam C: Fosfatinduceret nyreforkalkning hos rotte. Can J Physiol Pharmacol 57: 92-97, 1979

2） Parker HE: Magnesium og fosfor indbyrdes forhold ved tilstrækkelige til overskydende fosforniveauer i kosten. Nutr Rep Int 32: 1311-1318, 1985

3） Ritskes-Hoitinga J, Lemmens AG, Danse LHJC, Beynen AC: Fosfor-induceret nefrocalcinose og nyrefunktion hos hunrotter. J Nutr 119: 1423-1431, 1989

4） Cockell KA, L'Abbe MR, Belonje B: Koncentrationerne og forholdet mellem calcium og fosfor i kosten påvirker udviklingen af ​​nefrocalcinose hos hunrotter. J Nutr 132: 252-256, 2002

5) Katsumata S, Matsuzaki H, Uehara M, Suzuki K: Effekter af diætisk calciumtilskud på knoglemetabolisme, nyremineralkoncentrationer og nyrefunktion hos rotter fodret med en kost med højt fosforindhold. J Nutr Sci Vitaminol 61: 195-200, 2015

6） Matsuzaki H, Uehara M, Suzuki K, Liu QL, Sato S, Kanke Y, Goto S: Diæt med højt fosfor inducerer hurtigt nefrocalcinose og proksimal tubulær skade hos rotter. J Nutr Sci Vitaminol 43: 627-641, 1997

7) Liu QL, Sato S, Kishikawa T, Matsuzaki H, Yamanaka N: Effektiviteten af ​​traditionel kinesisk medicin, Wulingsan, til at undertrykke udviklingen af ​​nefrocalcinose induceret af en kost med højt fosforindhold hos unge rotter. Med Electron Microsc 34: 103-114, 2001

8） Sirard C, Kim S, Mirtsos C, Tadich P, Hoodless PA, Its A, Maxson R, Wrana JL, Mak TW: Målrettet forstyrrelse i murine celler afslører et variabelt krav til Smad4 i transformation af vækstfaktor-relateret signalering. J Biol Chem 275: 2063-2070, 2000

9） Matsubara T, Kida K, Yamaguchi A, Hata K, Ichida F, Meguro H, Aburatani H, Nishimura R, Yoneda T: BMP2 regulerer Osterix gennem Msx2 og Runx2 under osteoblastdifferentiering. J Biol Chem 283: 29119-29125, 2008

10） Urist MR: Knogle: Dannelse ved autoinduktion. Science 150: 893-899, 1965

11） Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ, Mitsock LM, Whitters MJ, Kriz RW, Hewick RM, Wang EA: Nye regulatorer af knogledannelse: Molekylær kloner og aktiviteter. Science 242: 1528-1534, 1988

12） Matsuzaki H, Katsumata S, Uehara M, Suzuki S, Miwa M: kost med højt fosforindhold inducerer osteopontin-ekspression af nyretubuli hos rotter. J Clin Biochem Nutr 41: 179-183, 2007

13） Cousins ​​FB, Geary CPM: En kønsbestemt nyreforkalkning hos rotter. Nature 211: 980-981, 1966

14） Matsuzaki H, Katsumata S, Masuyama R, Uehara M, Nakamura K, Suzuki K: Kønsforskelle i nyremineralkoncentrationer og urinalbuminudskillelse hos rotter, der får foder med højt fosforindhold. Biosci Biotechnol Biochem 66: 1737-1739, 2002

15） Reeves PG, Nielsen FH, Fahey GC Jr: AIN-93 oprensede diæter til laboratoriegnavere: Slutrapport fra American Institute of Nutrition ad hoc-skrivekomité om omformulering af AIN-76A gnaverdiæt . J Nutr 123: 1939-1951, 1993

16) Gimblet EG, Marney AF, Bonsnes RW: Bestemmelse af calcium og magnesium i serum, urin, kost og afføring ved atomabsorptionsspektrofotometri. Clin Chem 13: 204-214, 1967

17）Gomori G: En modifikation af den kolorimetriske fosforbestemmelse til brug med det fotoelektriske kolorimeter. J Lab Clin Med 27: 955-960, 1942

18) Ming LG, Lv X, Ma XN, Ge BF, Zhen P, Song P, Zhou J, Ma HP, Xian CJ, Chen KM: Prenylgruppen bidrager til aktiviteter af phytoøstrogen 8-prenynaringenin til at øge knogledannelsen og inhibering af knogleresorption in vitro. Endocrinology 154: 1202-1214, 2013

19） Kreke MR, Huckle WR, Goldstein AS: Væskeflow stimulerer ekspression af osteopontin og knoglesialoprotein af knoglemarvsstromaceller på en tidsafhængig måde. Bone 36: 1047-1055, 2005

20) Drechsler J, Grotzinger J, Hermanns HM: Karakterisering af rotte-oncostatin M-receptorkomplekset, der ligner det menneskelige, men adskiller sig fra den murine cytokinreceptor. PLoS One 7: e43155, 2012

21) Hoek AC, Lemmens AG, Mullink JWMA, Beynen AC: Indflydelse af diætcalcium: phosphorforhold på mineraludskillelse og nefrocalcinose hos hunrotter. J Nutr 118: 1210-1216, 1988 

22) Kohri K, Suzuki Y, Yoshida K, Yamamoto K, Amasaki N, Yamate T, Umekawa T, Iguchi M, Shinohara H, Kurita T: Molekylær kloning og sekventering af cDNA, der koder for et urinstensprotein, som er identisk med osteopontin. Biochem Biophys Res Commun 184: 859-864, 1992

23）Kohri K, Nomura S, Kitamura Y, Nagata T, Yoshioka K, Iguchi M, Yamate T, Umekawa T, Suzuki Y, Shinohara H, Kurita T: Struktur og ekspression af det mRNA, der koder for urinstensprotein (Osteopontin). J Biol Chem 268: 15180-15184, 1993

24) Paloian NJ, Leaf EM, Giachelli CM: Osteopontin protesterer mod høj phosphatinduceret nefrocalcinose og vaskulær forkalkning. Kidney Int 89: 1027-1036, 2016

25) Giachelli CM, Bae N, Almeida M, Denhardt DT, Alpers CE, Schwartz SM: Osteopontin er forhøjet under neointima-dannelse i rottearterier og er en ny komponent i humane aterosklerotiske plaques. J Clin Invest 92: 1686-1696, 1993