Vi har tidligere fundet ud af, at nyre-infiltrerende T-celler (KIT'er) i murin lupus nefritis (LN) lignededysfunktionelle T-celler, der infiltrerer tumorer. Dette uventede fund rejste spørgsmålet om hvordanat forene den "udtømte" fænotype af KIT'er med igangværende vævsdestruktion i LN. At adresseredette udførte vi enkeltcellede RNA-Seq og TCR-Seq af KIT'er i murine lupus-modeller. Vi fandtden CD8plusKIT'er eksisterede først i en overgangstilstand, før de klonalt ekspanderede og udviklede sig hen imodudmattelse. På den anden side CD4plusKIT'er passede ikke ind i de nuværende differentieringsparadigmermen inkluderede både hypoksiske og cytotoksiske undergrupper med en gennemgående udmattelsessignatur. Dermed,autoimmun nefritis er i modsætning til akut patogenimmunitet; snarere nyrernes mikromiljøundertrykker T-celler ved gradvist at inducere udmattede tilstande. Vores resultater tyder på, at LN, enkronisk tilstand, som følge af den langsomme udvikling af skader forårsaget af dysfunktionelle T-celler og deresforløbere på vej til udmattelse. Disse fund har implikationer for både autoimmunitet ogtumor immunologi.

Ifølge relevante undersøgelser er cistanche en traditionel kinesisk urt, der er blevet brugt i århundreder til at behandle forskellige sygdomme. Det er videnskabeligt bevist at besidde anti-inflammatoriske, anti-aging og antioxidante egenskaber. Undersøgelser har vist, at cistanche er gavnligt for patienter, der lider af nyresygdom. De aktive ingredienser i cistanche er kendt for at reducere inflammation, forbedre nyrefunktionen og genoprette svækkede nyreceller. Integrering af cistanche i en nyresygdomsbehandlingsplan kan således give patienterne store fordele ved at håndtere deres tilstand. Cistanche hjælper med at reducere proteinuri, sænker BUN- og kreatininniveauer og mindsker risikoen for yderligere nyreskade. Derudover hjælper cistanche også med at reducere kolesterol- og triglyceridniveauer, hvilket kan være farligt for patienter, der lider af nyresygdom.

Klik her for at se produkter fra Cistanche for nyresygdom

【For mere information: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Introduktion

Infiltration af faste organer af formentlig patogene T-celler er et fælles træk ved mange autoimmune sygdomme og organtransplantatafstødning. Disse patogene hændelser er histologisk og konceptuelt parallelt med T-celleinfiltration af tumorer, hvilket kan føre til tumorcelleødelæggelse. I modsætning til de velundersøgte tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL'er) har vævsinfiltrerende T-celler, der medierer sygdom i autoimmunitet, fået langt mindre opmærksomhed. Det er nu godt accepteret, at tumormikromiljøet virker til at hæmme immunresponser og inducere T-celleudmattelse (1-3), mens det i autoimmunitet generelt menes, at patogene T-celler aktivt ødelægger normalt væv uhindret, da ikke-malignt væv ikke kan udvikle resistens. For at udforske karakteren af ​​autoimmune infiltrater har vi valgt at studere lupus nefritis (LN), da nyren er et centralt mål i denne autoimmune sygdom. T-celleafhængig interstitiel nefritis er den vigtigste prognostiske indikator for organsvigt i lupus (4, 5).

Vores seneste arbejde, der viser, at nyre-infiltrerende T-celler (KIT'er) er funktionelt og transkriptionelt udmattede (6) - ligesom TIL'er eller CD8 plus T-celler efter en kronisk virusinfektion - udfordrer 2 paradigmer. For det første argumenterer det imod ideen om, at autoimmun ødelæggelse af parenkymvæv er en direkte effektorproces, beslægtet med en reaktion på viralt inficerede celler. I stedet kan nogle væv være udstyret med naturlige selvbevaringsmekanismer, der nedregulerer eller undertrykker infiltrerende T-celler, hvilket kan forhindre eller svække autoimmunitet. For det andet tyder det på, at tumorer ikke udvikler et de novo sæt af veje til negativt at regulere T-celler. I stedet kan sådanne veje være native for visse parenkymale væv, og tumorer kan forstærke dem eller blot naturligt udtrykke dem.

Opdagelsen af, at nyrer og måske andre væv kan undertrykke infiltrerende T-celler, rejste et vigtigt spørgsmål: Hvis KIT'er er funktionelt og transkriptionelt inerte eller udmattede, med hvilke mekanismer forløber vævsskade så? En hypotese til at løse dette spørgsmål er, at udmattede celler mere korrekt betragtes som dysfunktionelle - snarere end ikke-funktionelle - og at de langsomt kan påføre vævsskade fra resterende effektorfunktion, ligesom udmattede T-celler i kronisk infektion tjener til at beskytte mod mere aggressive infektion (7, 8). En anden, ikke-eksklusiv forklaring er, at selvreaktive T-celler bevarer effekten til at fungere ved ankomsten til nyren, men de bliver gradvist mindre funktionelle på grund af påvirkningen af ​​vævets mikromiljø. Efter denne opfattelse påføres skade af en given T-celleklonotype i højere grad i begyndelsen og afbødes derefter af et udmattelsesprogram. Kronisk sygdom kunne opretholdes ved den kontinuerlige rekruttering af nye kloner, der i starten er mere funktionelle.

For at undersøge disse mekanismer er det nødvendigt at belyse arten af ​​intraparenkymale autoimmune reaktioner dybere. Resultatet af et sådant arbejde - en forståelse af arten af ​​skadesfremkaldende T-celler - kunne afsløre måder at målrette dem specifikt på, for eksempel baseret på deres metaboliske status eller overfladefænotype. Derudover kunne sådanne oplysninger afsløre sygdomsdrivere og give værktøjer til at stratificere patienter - 2 vigtige problemer i lupus, som er notorisk heterogen i manifestation (9, 10). Yderligere vil sådanne indsigter sandsynligvis gælde for andre målorganer og sygdomsindstillinger.

Det er imidlertid usædvanligt udfordrende at løse disse spørgsmål i humant LN på grund af knapheden på tilgængeligt væv, som kun kan opnås efter en ekstra "forskningspassage" af en nålebiopsi. Faktisk lykkedes det et nyligt konsortiumstudie, selvom det var heroisk, kun at vurdere omkring 1000 enkeltceller ved RNA-Seq over alle patienterne (11). Desuden var næsten alle disse patienter under behandlinger, der var designet specifikt til at påvirke de samme celler, hvilket i høj grad komplicerer fortolkningen.

Af denne grund har vi her brugt murine lupus-modeller, som giver os adgang til væv uden komplikation af forskellige behandlinger. Vi har brugt enkeltcellet RNA-Seq (scRNA-Seq) til at identificere en overraskende grad af heterogenitet blandt både CD4 plus og CD8 plus KIT'er, hvilket tyder på en mere dynamisk proces med målorganbeskadigelse, end der var blevet mistænkt. Inden for CD8-rummet blev der identificeret en stor klynge af "overgangs"-celler, som bibeholdt delvis aktivering og effektorfunktion og blev forudsagt at udvikle sig til både udmattede celler såvel som residente hukommelsesceller, som alle også blev identificeret blandt KIT'er. Hvorimod CD4 plus-celler, spændende nok, ikke passede ind i eksisterende Th-paradigmer, men snarere inkluderede en cytotoksisk klynge samt demonstrerede en gennemgående udmattet fænotype. Derudover var vi ved at bruge TCR-Seq i stand til at forbinde forskellige klynger af KIT'er, hvilket afgrænsede en overbevisende progressiv udvikling af klontyper i nyren. Dette arbejde afslører landskabet af interaktioner mellem infiltrerende T-celler og parenkymet i et lupus-målorgan og foreslår en dynamisk model for, hvordan nefritis udvikler sig som en kronisk tilstand. Disse indsigter kunne danne grundlag for nye strategier til at afbryde processen.

Resultater

Eksperimentelt design. Vi genererede 3 eksperimentelle kohorter for at adressere T-celle-omprogrammering efter vævsinfiltration i murint LN ved hjælp af 10x Genomics scRNA-Seq-platformen og hashtag-oligonukleotid (HTO) dekonvolutionsteknologi (figur 1A). I den indledende kohorte (Main-Seq) sammenlignede vi milt-T-celler og KIT'er fra gamle lupus-tilbøjelige nefritiske MRL/lpr-mus såvel som "naive" T-celler fra ikke-lupus-tilbøjelige B6-mus. I den anden kohorte fokuserede vi på KIT'er fra MRL/lpr-mus og vurderede desuden KIT TCR-repertoiret (MRL-TCR-Seq). Endelig gennemførte vi i den tredje kohorte en lignende KIT-analyse som i kohorte 2 ved hjælp af Fc R2B–/–.Yaa-modellen af ​​LN (Yaa-TCR–Seq).

T-celler klynges baseret på oprindelse, autoreaktiv status og CD4/8-fænotype. Lavopløsnings-transkriptom-baseret clustering af alle T-celler i Main-Seq-kohorten, ved hjælp af Seurat (12), identificerede 14 klynger (figur 1B). HTO-dekonvolution afgrænsede celler baseret på T-celletype (dvs. CD4 og CD8), oprindelsesorgan (nyre vs. milt) og potentiel autoreaktiv status (B6 vs. lupus-tilbøjelige mus, figur 1C). Alle 3 MRL/lpr-mus bidrog til hver defineret population, uden at nogen population blev drevet af en specifik donor (Supplerende figur 1; supplerende materiale tilgængeligt online med denne artikel; https://doi.org/10.1172/jci. insight.156048DS1) . Mens CD4 plus og CD8 plus T-celler fra ikke-autoimmune mus var relativt ensartede, viste CD4 plus og CD8 plus T-celler fra syge mus bemærkelsesværdig heterogenitet (figur 1, B og C).

Heterogenitet og potentielle funktioner af CD4 plus T-celler i murin lupus. Klynger i høj opløsning gav 13 CD4 plus T-celleklynger (figur 2A). HTO-dirigeret dekonvolution fremhævede adskillelsen mellem nyre-afledte og milt-afledte T-celler fra MRL/lpr-mus, mens CD4 plus T-celler fra B6-mus overvejende faldt i 2 klynger (5 og 11) (Figur 2A, højre panel). Ved at identificere de mest differentielt udtrykte gener (DEG'er) i hver klynge (Supplerende figur 2), forsøgte vi at tildele specifikke fænotypiske undertyper til hver CD4 plus klynge. Ved at bruge denne tilgang blev kun 2 af CD4 plus T-celleklyngerne let matchet til konventionelle T-cellefænotyper: klynge 6 repræsenterede Tregs, mens klynge 12 udviste en type I IFN-signatur (IFNhi).

Vi undersøgte derefter TF-ekspression og kanoniske T-celle-genekspressionssignaturberigelsesoverlejringer for velbeskrevne CD4 plus T-cellefænotyper, herunder Treg, Th1, Th2, T follikulær hjælper (Tfh) og Th17 (se Supplerende tabel 1 for genlister) ( 13-23). Som forventet udviste den formodede Treg-klynge stærke Treg-associerede gensignaturer og udtrykte Foxp3 (figur 2B). Th1-signaturen var forbundet med klynger 1, 4 og 8, og Tbet blev udtrykt i en lignende fordeling (figur 2C). En stærkere Th2-gensignatur og Gata3-ekspression blev også observeret i de nyredominerende klynger 1, 4, 8 og 10, hvilket tyder på en vis samekspression af Th1- og Th2-fænotype uden nogen klar afgrænsning mellem de 2 linjer (figur 2, C og D) ). Flere rapporter har foreslået en rolle for Th17 i LN; I lighed med resultaterne i prøverne fra human nefritis, som Accelerating Medicines Partnership in SLE-netværket (AMP-konsortium) undersøgte (11), blev der dog ikke observeret nogen signifikant Th17-profil ved gensignatur eller Rorc-ekspression i noget rum (supplerende figur 3, A og B) ). Få celler udviste enten den Tfh-associerede gensignatur eller Bcl6-ekspression, i overensstemmelse med rapporter om få germinale centre i MRL/lpr-milte (24) (Supplerende figur 3C). Endelig repræsenterede klynge 7 sandsynligvis et centralt hukommelses T-celle (TCM) rum, og klynge 5 repræsenterede naive T-celler (supplerende figurer 3, D og E).

Vi identificerede flere TF'er, hvis motiver blev beriget blandt DEG'er af givne klynger ved hjælp af SCENIC-algoritmen. Selvom type I IFN-klyngen (klynge 12) viser tegn på IRF1-, IRF7-, IRF9- og STAT2-regulering (25) (Figur 3A), fandt vi generelt ikke unikke TF-foreninger inden for specifikke klynger. Imidlertid foreslog hierarkisk klyngeanalyse af TF'en transkriptionel organisering af oprindelsesorganet eller tilstedeværelsen af ​​autoimmunitet. Der var en nyrespecifik indflydelse, idet talrige TF-bindingsmotiver (herunder HIF1, TGIF2, CREM, JUN og FOS) blev beriget i størstedelen af ​​KIT'er, uanset klyngen; flere af disse TF'er var også selv transkriptionelt opregulerede, herunder Crem og Hif1, som tidligere har været forbundet med henholdsvis vævsresidency og hypoxi (18, 26, 27) (figur 3B). Ved Hif1-ekspression og transkriptionel aktivitet beskrev nyere arbejde en hypoxigenekspressionsprofil i bulk RNA-Seq af KIT'er isoleret fra MRL/lpr-mus (18). Tilsvarende observerede vi, at en del af KIT'er udtrykte en hypoxiprofil, især i klynger 1, 4, 8 og 10 og KIT Treg-populationen (figur 4A).

I betragtning af resultaterne fra vores tidligere arbejde, der tyder på KIT-udmattelse, vurderede vi udmattelsessignaturen (6), som syntes beriget blandt CD4 plus KIT'er i alt (figur 4, A og B). Udmattelsessignaturer i flere klynger var højere end basislinjen defineret af CD4 plus B6 milt T-celler, hvor klynger 0, 4, 8, 10 og 9 udviste den højeste score (figur 4B). Disse klynger var hovedsageligt sammensat af KIT'er, undtagen cluster 9, som bestod af både KIT'er og milt-T-celler fra MRL/lpr-mus; selv i klynge 9 var de mere udmattede celler imidlertid nyreafledte (figur 4B). På trods af heterogeniteten af ​​CD4 plus KIT'er vises udmattelsesassocieret genekspression derfor i transkriptomerne af flere klynger af T-celler.

Da cytotoksiske CD4 plus T-celler er blevet rapporteret i aldring, (13) tumorinfiltrater (28) og systemisk sklerose (29), vurderede vi, om en cytotoksisk gensignatur blev observeret i KIT'er. Faktisk udtrykte en del af både milt- og nyre-afledte T-celler fra MRL/lpr-mus, omfattende klynger 0, 2 og 9, en cytotoksisk gensignatur (figur 4A). Interessant nok udtrykte KIT-klynger generelt enten en hypoxisk profil eller en cytotoksisk gensignatur, men ikke begge dele.

Baneanalyse identificerer udviklingsforløbet af CD4 plus T-celler. Baseret på analysen af ​​klyngegensignaturer antog vi, at der er en progression fra naive til perifere effektor/cytotoksiske T-celler, som derefter invaderer nyren, hvor de først udtrykker et cytotoksisk program, efterfulgt af et hypoxi-respons ledsaget af udmattelse/dysfunktion. For at evaluere denne model oprettede vi en afstamningsforløbsanalyse ved hjælp af Monocle3, som integrerer tidsmæssig genekspression (figur 4C). HTO-overlejringer på Monocle3-pseudotidsbanen (figur 4C) indikerede, at afstamningsoprindelse forekommer med den B6-naive klynge; programmet postulerede derefter tidlig forgrening af Treg-klyngen sammen med progression gennem aktiverede lupus-tilbøjelige miltceller og til sidst til nyre-infiltrerende celler. I denne model ser det ud til, at naive T-celler går ind i den "autoimmune/cytotoksiske fase" lige før eller parallelt med nyreinfiltration, som antaget, og endelig udvikler sig til en hypoxisk/dysfunktionel tilstand (figur 4D).

KIT Tregs udtrykker vævsresidente markører. For at vurdere den uafhængige effekt af vævsomprogrammering på T-cellefænotype evaluerede vi nærmere Treg-populationen (klynge 6), da denne klynge var sammensat af celler fra alle 3 oprindelser. Efter genklyngning blev KIT Tregs kortlagt separat fra milt Tregs af enten B6 eller autoimmun oprindelse (figur 5, A og B). Et vulkanplot (figur 5C) afslørede adskillige DEG'er mellem perifere og nyre-Tregs, for det meste opreguleret i nyren, hvilket tyder på, at vævsresidens inducerede et yderligere transkriptionelt program. Disse DEG'er inkluderede Crem og Klf6, TF'er, der tidligere var forbundet med CD4 plus KIT-fænotyper i vores TF-kortlægning (figur 3B). Interessant nok blev gener, der tidligere var identificeret i vævsresidente Tregs sammenlignet med lymfoide Tregs, på samme måde transkriptionelt opreguleret i KIT Tregs, herunder Crem, Rgs1, Rgs2, Id2, Ctla4 og Areg (Figur 5C, fremhævet i pink) (30).

CD8 plus KIT'er udviser heterogenitet efter vævsinfiltration. CD8 plus T-celler (fra Main-Seq) blev analyseret som udført for CD4 plus-populationen, hvilket gav 9 klynger, der blev opløst baseret på HTO (figur 6, A og B). Vi kunne identificere de fleste af disse klynger efter DEG'erne i hver (figur 6C). Størstedelen af ​​milt-T-celler blev klynget til højre side af UMAP, hvor klynge 4 overvejende var sammensat af B6 milt-T-celler og klynge 0 repræsenterer størstedelen af ​​MRL/lpr milt-T-celler og antyder en TCM-fænotype.

Autoimmune milt-T-celler var også repræsenteret i klynger 6 og 5, som omfatter henholdsvis T-effektorhukommelse (TEM) og perifert udmattede celler. CD8 plus KIT'er fra MRL/lpr-mus blev fundet i flere unikke klynger. Klynge 2 indeholdt en udmattet T-cellepopulation (TEX). Klynge 3 bestod af en resident memory T-cellepopulation (TRM). Klynge 6 var en TEM-klynge, bestående af cirka 50 procent KIT'er og 50 procent milt-T-celler. Klynge 1 var den største KIT-klynge. Det så ud til at repræsentere en overgangstilstand, da celler i denne klynge udtrykte en blanding af gener, der indikerer TEX, TRM og TEM. De 2 mindste klynger var delende celler (klynge 7) og IFNhi T-celler (klynge 8) med celler fra flere kilder.

For at bekræfte klyngernes formodede identiteter blev referencegensignaturer (supplerende tabel 1) overlejret på UMAP-plotsene (figur 6, D-I). Den residente hukommelsessignatur afbildes stærkest til TRM- og KIT TEX-klyngerne (figur 6D). Gensidigt var den perifere gensignatur forbundet med milt-afledte T-celler - især den naive, TCM- og miltdelen af ​​TEM-klyngerne (figur 6E); dog udviste den perifere TEX-klynge hverken en TRM eller en perifer signatur. Som forventet udviste CD8 plus KIT-populationen som helhed en robust "udtømt" signatur (6). Blandt KIT'er var udmattelsessignaturen mest forbundet med klynger 2 og 3 og i mindre grad 1, som repræsenterer henholdsvis KIT TEX, TRM og overgangspopulationer (figur 6F). Referencegen UMAP-overlejringer for TEM- og TCM-transkriptionelle signaturer bekræftede vores indledende klassifikationer af disse klynger (figur 6, G og H).

Unik TF-profil forbundet med T-celleinfiltration og udmattelse. Vi udførte yderligere TF-motivberigelse for CD8 plus T-celleklynger ved hjælp af SCENIC (figur 7A). Som forventet blev IRF1, IRF7, IRF9 og STAT1 identificeret som transkriptionelle drivere af IFNhi-klyngen. I lighed med CD4 plus-rummet blev flere motiver beriget i alle CD8 plus KIT'er (UQCRB, CREM og KLF6), mens andre TF'er var klyngespecifikke; for eksempel i TEX-klyngerne (2 og 5) blev motiver for NR3C1, HTATIP2 og ELF1 beriget.

Ikke alle TF'er kan kortlægges af SCENIC. For at give en alternativ tilgang overlejrede vi udtrykket af flere TF'er på UMAP-plottene (figur 7B). Ekspression af Crem og i mindre grad Klf6 var forbundet med KIT'er, mens Uqcrb ikke var, hvilket afslørede en vis uoverensstemmelse mellem TF-ekspression og forudsagt TF-genregulering. Ekspression af både Tox og Eomes, som er regulatorer af T-celleudmattelse (31-33), er korreleret med TEX-klyngerne 2 og 5, hvilket yderligere validerer deres identitet. Især Tcf7, som er stærkt udtrykt i milt-T-celler, blev også observeret i overgangsceller, med ekspression generelt slukket i TEX- og TRM-populationer. Et mønster svarende til Tcf7 blev set med Klf2, hvorimod Klf6 og Id2 havde gensidige mønstre.

【For mere information: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】