Efter at have fastslået, at den senolytiske effekt af Ouabain er celletypeafhængig

Venligst kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mere information

Forstyrrelse af K*/Nat-homeostase forårsaget af ouabain fører til forskellige fysiologiske reaktioner i kontrol og senescent A549 og END-MSC'er

Efter at have fastslået det faktum, at senolytisk effekt af ouabain er celletypeafhængig, forsøgte vi yderligere at belyse, hvad der kan ligge til grund for de afslørede forskelle i responser fra hMSC'er og A549. Til dette formål analyserede vi oxidativ stress-induceret senescens af END-MSC'er og etoposid -induceret senescens af A549 mere præcist.cynomorium fordeleDen vigtigste molekylære virkningsmekanisme for forskellige hjerteglykosider er hæmning af Nat/K plus -ATPase [44].Nat/K plus -ATPase er et plasmamembranenzym, der pumper natrium ud af cellen, mens det pumper kalium ind i cellen mod koncentrationsgradienter og dermed deltage i vedligeholdelsen af ​​K plus og Na plus homeostase. Derfor spurgte vi, om der kunne være nogen forskelle i basal og ouabain-induceret ionhomeostase mellem kontrol- og senescentceller af to typer.

Klik venligst her for at vide mere

Forstyrrelsen i K plus og Na plus homeostase forårsaget af ouabain skulle i sidste ende føre til spredning af plasmamembranpotentialet. Således brugte vi yderligere specifik fluorescerende probe DiBAC4(3) til at måle transmembranpotentialet af ikke-exciterbare celler. Øget fluorescens af dette farvestof afspejler membrandepolarisering.ørkenhyacintI hver testet celletype inducerede ouabain forudsigelig membrandepolarisering, hvilket bekræfter ionisk ubalance (fig. 10a). Navnlig observerede vi sammenlignelige niveauer af membrandepolarisering i kontrol- og senescent END-MSC'er, mens senescent A549 var karakteriseret ved signifikant mere depolariseret membran sammenlignet med kontrol A549-celler.

Andre vigtige konsekvenser af ionisk deregulering er ændringer i mitokondrielt membranpotentiale (MP).

Ved hjælp af fluorescerende probe JC-1 vurderede vi således MMP i kontrol- og senescerende celler efter ouabain-behandling. Det skal specifikt fremhæves, at senescerende celler almindeligvis er karakteriseret ved nedsat MMP, hvilket afspejler funktionsfejl i mitokondrier, ændringer i energimetabolisme og øgede niveauer af intracellulære reaktive oxygenarter[45]. Som forventet var MMP i senescerende END-MSC'er og A549-celler lavere end i kontrolcellerne,

selvom dette fald ikke påvirkede levedygtigheden af ​​senescerende celler (fig. Id, 6a, 10b).flavonoid ekstraktionsmetode pdfI lighed med ovenstående resultater inducerede ouabain udtalt MMP-depolarisering i senescent A549 sammenlignet med deres prolifererende modstykker, mens effekten på MMP af kontrol og senescent END-MSC'er var minimal (fig. 10b). Ved at opsummere resultaterne beskrevet i denne del kan vi konkludere, at blokering af Na plus /K plus -ATPase af ouabain fører til den dramatiske depolarisering af plasmamembran og fald af MMP i tilfælde af senescent A549, i modsætning til senescent END-MSCS.

Ændringer i mekanismerne for K plus import medierer ouabain-resistens af senescent END-MSC'er

For at afklare mekanismer, der medierer ouabain-inducerede ændringer i membranpolarisering og MMP mellem senescent A549 og END-MSC'er, brugte vi yderligere en avanceret bio-informatisk tilgang. Formålet med analysen var at afsløre mulige transkriptomiske træk, der medierer celletypeafhængig ouabain-resistens eller -følsomhed af senescerende celler. Med andre ord stillede vi spørgsmålet: hvordan adskiller senescens af END-MSC'er (ouabain-resistente celler) sig fra senescens af A549 (ouabain-følsomme celler)? For at besvare dette spørgsmål brugte vi tre uafhængige RNA-sekventeringsdatasæt (RNA-Seq). Den første var RNA-Seq-analyse

Fig. 6 Validering af etoposid-induceret A549 senescensmodel. Ældrende A549-celler viser et tab af proliferation, b erhverver forhøjet cellestørrelse, c autofluorescensniveau og d SA-b-Gal-aktivitet sammenlignet med kontrolcellerne. e Fosforyleringsniveauer af p53 og Rb og ekspressionsniveauer af p21 og HMGBI proteiner i kontrol og senescent A549. De præsenterede værdier er middel ± SD. For flere grupper blev sammenligninger ved en envejs ANOVA anvendt, n=3, ns ikke signifikant,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c,="" and="" d="" welch's="" test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001.>flavonoiderSkaleringsstænger for billeder er 500 μm. GAPDH blev brugt som belastningskontrol af kontrol og senescent END-MSC'er udført af os. Den anden var datasættet for kontrol og senescent A549 downloadet fra GEO [43]. Det skal bemærkes, at alderdomsinducerende forhold faldt sammen med dem, der blev anvendt i denne undersøgelse og i pilotundersøgelserne af hjerteglykosider-induceret senolyse. Og det tredje datasæt var til kontrol og senescent IMR-90 opnået direkte fra undersøgelsen af ​​hjerteglykosider som senolytiske forbindelser [25]. Det er vigtigt, at IMR-90 viste sig at være tilbøjelig til ouabain-induceret analyse. Det skal bemærkes, at sammenligning af kun to datasæt, der er relevante for END-MSC'er og A549, i sidste ende vil føre til ukorrekte resultater, da den eftersøgte forskel mellem alderdomsprocessen i END-MSC'er og A549 i en sådan analyse ikke ville kunne skelnes fra variationerne medieret af forskellige tekniske batch-effekter (dvs. type sekventeringsmaskine, prøvens betingelser). For at minimere batcheffekter sammenlignede vi ét datasæt for ouabain-resistente celler (END-MSC'er) og to for ouabain-følsomme celler (A549, IMR-90). For at validere relevansen af ​​den yderligere sammenlignende analyse udførte vi en hovedkomponentanalyse for undergruppen af ​​gener relateret til GO-udtrykket "cellulær senescens" (GO 0090398) baseret på det sammenfattende datasæt indeholdende prøver fra alle tre beskrevne eksperimenter. Faktisk, for hver celletype er prøver grupperet i to separate grupper - kontrolgruppen og de senescente (fig. 10d).

cistanche kan anti-aging

For at udføre en analyse af differentielt udtrykte gener (DEG'er) under senescens af ouabain-resistente og -følsomme celler, genererede vi den statistiske model, der opsummerede to forudsigere og deres interaktion. Den skematiske præsentation af analysen er vist i fig. 10c. Kort fortalt opdelte den første prædiktor i modellen alle prøver efter kontrol- og senescensundergrupper, den anden - efter ouabain-resistens eller ouabain-følsomhed, og den sidste komponent i modellen afspejlede interaktion mellem begge prædiktorer. Resultatet af differentiel ekspressionstestning for den sidste variabel er præsenteret i supplerende tabel 1.

Vi udførte derefter gensætberigelsesanalyse (GSEA) i Gene Ontology (GO) termer for biologiske processer (BP) (supplerende tabel 2). Blandt de væsentligt berigede processer fandt vi især, at 'kaliumionimport' og 'positiv regulering af kationtransmembrantransport blev opreguleret under senescens af ouabain-resistente END-MSC'er sammenlignet med senescens af ouabain-følsomme celler (fig. 10e) ). Kerneberigelsesgenlister relateret til disse processer inkluderede KCNJ2, KCNJ14, KCNJ8, SLC12A7, SLC12A8, WNK4, som var signifikant opreguleret i senescent END-MSC'er (fig. 10f). Proteinerne kodet af KCNJ-gener er kaliumkanaler af typen indadrettet ensretter, som har en større tendens til at tillade kalium at strømme ind i en celle i stedet for ud af en celle.hesperidin brugerSLC12 en familie af kation-du-plet chloridtransportere. WNK4-genet koder for serin/threoninkinase, der fungerer som en aktivator af natrium-koblede chlorid-cotransportere og inhibitorer af kalium-koblede chlorid-cotransportere. Tilsammen tillod disse fund at antyde, at senescent END-MSC'er kan genoprette udtømte intracellulære K plus-niveauer mere effektivt end senescent A549-celler og dermed kan klare sig med ouabain-induceret ionisk ubalance.

Senescent END-MSC'er vises forhøjet

apoptose-resistens sammenlignet med kontrol, mens senescent A549 ikke gør

Rollen af ​​intracellulær K plus i reguleringen af ​​celledød er veletableret [46]. Afslørede forskelle mellem senescent END-MSC'er og A549-celler i evnen til at opretholde intracellulær K plus homeostase fik os til at sammenligne den overordnede stressresistens erhvervet under senescens af begge celletyper. Det er kendt, at eksogene belastninger er ledsaget af forstyrrelsen i ionisk homeostase, hvilket fører til en hurtig udveksling af forskellige ioner, herunder K plus mellem cellen og dens miljø [46]. Resultaterne af stressende påvirkninger er i høj grad afhængige af cellernes evne til at genoprette den passende intracellulære ionbalance. Som vist i fig. 10e,f blev alderdom af END-MSC'er ledsaget af opregulering af K plus import, hvilket tyder på, at under

Fig.10 Ouabain-resistente senescerende END-MSC'er er i stand til at genoprette forstyrrelser af K plus/Nat-homeostase forårsaget af ouabain via effektiv K plus-import, mens ouabain-sensitive senescerende celler mangler denne evne. a Membranpotentialebestemmelse af kontrol- og senescerende END-MSC'er og A549-celler før og 24 timer efter ouabain-behandling ved hjælp af fluorescerende probe DiBAC4(3). b Mitokondriel membranpotentialeevaluering af kontrol- og senescerende END-MSC'er og A549-celler før og 24 timer efter ouabain-behandling ved hjælp af fluorescerende probe JC-1. c Design af den komparative bioinformatiske analyse af tre uafhængige RNA-Seq-datasæt.d Hovedkomponentanalyse for undergruppen af ​​gener relateret til GO-udtrykket "cellulær senescence" (GO 0090398) baseret på de kombinerede data fra tre uafhængige RNA-Seq-datasæt . e GSEA-resultater for de differentielt udtrykte gener mellem cellerne, der er resistente over for ouabain-medieret analyse (END-MSC'er) og dem, der er følsomme over for ouabain-medieret analyse (A549 og IMR-90) for 'Positiv regulering af kation-transmembrantransport' og 'Kaliumionimport af biologiske processer. f Heatmap, der afspejler kerneberigelsesgenerne for 'Positiv regulering af kationtransmembrantransport' og 'Kaliumionimport' biologiske processer. Værdier er middel ± SD. Statistisk signifikans blev vurderet ved Elevens t-test: ns ikke signifikant,*s<><><>

senescence-udvikling END-MSC'er forbedrer deres evne til at genoprette K plus-niveauer. Interessant nok var vi ikke i stand til at afsløre en lignende tendens til A549-ældning, så A549 syntes ikke at erhverve nogen specifikke egenskaber relateret til K*-importen under alderdomsprogression. Ifølge de litterære data favoriserer stress-induceret fald i intracellulær K* og manglende evne til at genoprette dets niveau aktivering af caspaser og nukleaser og foreslås derfor at være en pro-apoptotisk faktor [46].

I overensstemmelse med dette forslag afslørede vi ved hjælp af bioinformatisk analyse af ovenstående RNA-seq-datasæt betydelig nedregulering af processerne relateret til apoptose under alderdom af END-MSC'er sammenlignet med A549 og IMR-90 (Fig. lla) . Desuden er alderdom af A549 og IMR-90 karakteriseret ved signifikant opregulering af pro-apoptotiske gener, herunder BAD, BAX, BOK, BAK-1 og NOXA (fig. 11b). Disse data indikerer, at END-MSC'er erhverver apoptose-resistent fænotype under senescens, mens senescerende IMR-90 og A549 blev apoptose-tilbøjelige (fig. 11b). For at styrke denne observation analyserede vi desuden mikroarray-datasæt for kontrol og replikative senescerende AD-MSC'er, der også bevarede ouabain-resistens under ældning som angivet ovenfor (fig.4g). Når vi analyserede for ekspressionsniveauerne af de apoptose-relaterede gener, observerede vi distinkt apoptose-resistent fænotype af senescent AD-MSC'er svarende til senescent END-MSC'er (Supplerende Fig. S8a, b).

For at verificere resultaterne af transkriptomisk analyse estimerede vi ekspressionsniveauer af gener relateret til apoptose og K plus import i begge typer senescerende celler-END-MSC'er og A549 ved RT-PCR (Supplerende Fig. S9). Derudover analyserede vi ekspressionen af ​​den samme genliste ved hjælp af henholdsvis andre ouabain-resistente og ouabain-følsomme cellulære modeller, doxorubicin-behandlede senescent DP-MSC'er og etoposid-behandlet senescent SK-Help (Supplerende Fig. S9). Som vist i Supplerende Fig. S9 viste begge typer af ouabain-resistente celler-ældende END-MSC'er og DP-MSC'er lignende genekspressionsmønstre, specifikt KCNJ2, SLC12A og WNK4, der deltog i K plus restaurering, blev opreguleret, proapoptotisk BAX blev nedreguleret, mens antiapoptotisk MCL-I blev opreguleret. Desuden adskilte ekspressionsmønsteret af de samme gener sig fra dem, der blev observeret for ouabain-følsomme A549 og SK-Hep1. Disse resultater bekræfter vores transkriptomiske data og styrker konklusionen vedrørende forskellige apoptoseprofiler erhvervet under ældning af forskellige celletyper.

Vi testede derefter, om de observerede forskelle i apoptosebaggrund under senescens af END-MSC'er og A549 kan have en indvirkning på den overordnede stressresistens af senescerende celler. For at gøre det vurderede vi cellelevedygtighed efter oxidativt stress og staurosporin, typisk anvendt til at inducere apoptose. Faktisk viste senescent END-MSC'er sig at være betydeligt mere modstandsdygtige over for begge spændinger sammenlignet med deres kontrolmodstykker (fig. 1lc). I modsætning hertil viste A549-celler en omvendt situation, da senescerende celler udviste en tendens til at være mere følsomme over for stress-induceret celledød (fig. 11d). Denne observation ændrer det eksisterende paradigme om, at øget dødsresistens er et fælles træk ved enhver form for senescerende celler, hvilket viser dens åbenlyse cellespecificitet.

Baseret på ovenstående data antog vi, at reduktion af apoptose "forsvar" af senescent END-MSC'er skulle skabe gunstige betingelser for yderligere analyse. I denne henseende fokuserede vi på et velkendt antiapoptotisk medlem af BCL-2-familieproteiner – MCL-1, da dets ekspression var opreguleret i apoptose-resistente senescent END-MSC'er (fig. 1lb og supplerende fig. S9a). Til dette formål forbehandlede vi kontrol- og senescent END-MSC'er med A-1210477 den specifikke MCL-1-hæmmer og påførte derefter hjerteglykosider for at inducere analyse. Det skal bemærkes, at A-1210477 i sig selv ikke havde nogen effekt på spredningskapaciteten af ​​kontrolceller og på levedygtigheden af ​​senescente celler som angivet på vækstkurverne (fig. 1le). Efterfølgende påføring af hjerteglykosider førte til et fald i antallet af levedygtige celler, men effekten var dog mere udtalt i ældre ESC'er (fig. 11f). Derfor inhiberer MCL-1 med A-1210477 prædisponerede senescerende ESC'er mod ouabain-induceret død, hvilket indikerer til analyse. Sidstnævnte bevis for apoptose-resistens erhvervet under END-MSCs senescens er en iboende barriere for effektiv analyse udløst af hjerteglykosider.

Diskussion

Inden for denne undersøgelse testede vi senolytiske virkninger af hjerteglykosider, nemlig ouabain og bufalin, på hMSC'er. Begge forbindelser blev for nylig identificeret for at have selektiv cytotoksisk virkning på senescerende celler (onkogen-/therapy-inducerede senescensmodeller) af forskellig oprindelse, herunder primære celler IMR-90,HUVEC, ARPE-19,T/ C-28 og kræftceller SK-Help,A549,SK-Mel-5,MCF7,HCT116, HaCat,H1299,U373-MG,H1755[25,26]. Uventet har vi var ikke i stand til at afsløre nogen præferentielle cytotoksiske virkninger af hverken ouabain eller bufalin på senescerende END-MSC'er sammenlignet med kontrol. Det er vigtigt, at fraværet af analyse blev verificeret ved hjælp af hMSC'er opnået fra fedtvæv, tandpulp og Warton-gelé og forskellige senescensmodeller. Sidstnævnte førte os til forslaget om, at resistens over for hjerteglykosid-induceret analyse kan være det fælles træk ved hMSC'er. Samtidig var vi i stand til at inducere apoptose fortrinsvis i senescent A549 og SK-Help, og dermed reproducere senolytisk effekt af hjerteglykosider beskrevet i de relevante artikler [25,26]. Med celler, der er resistente og følsomme over for ouabain-induceret analyse (ouabain-resistente/ouabain-sensitive) til rådighed, forsøgte vi at belyse grundlæggende årsager, der ligger til grund for denne forskel. Den almindelige molekylære mekanisme for hjerteglykosiders virkning binder til Nat/K plus -ATPasen og blokerer dens aktivitet. Ved at hydrolysere ATP sikrer dette enzym pumpning af Na plus ud af cellen og import af K plus ind i cellerne og dermed opretholdelse af fysiologisk elektrokemisk gradient, ionisk homeostase, cellulær pH ​​og cellevolumen, der er afgørende for celleoverlevelse og funktion [47]. Derfor spekulerede vi i, at den senolytiske evne af ouabain kunne afhænge af sværhedsgraden af ​​K plus /Nat ubalance i de behandlede celler. I overensstemmelse med dette forslag afslørede vi, at ouabain inducerede mere udtalt depolarisering af plasmamembran og fald af MMP i ouabain-følsomme senescent A549.

Generelt blev virkningen af ​​Nat/K plus -ATPase-hæmning på celleoverlevelse vist at være celletypespecifik. For eksempel blev ouabain vist at forstærke apoptose i lymfocytter, Jurkat-celler og hundeepitelceller, mens det ikke formåede at inducere død i epitelceller fra rotte-aorta, rotte-cerebrale granulaceller og porcine nyreproksimale tubulære LLC-PK1-lymfocytter på trods af lignende modulering af det kationiske forhold [48-54]. En af de foreslåede mekanismer for proapoptotisk ouabain-virkning er udtømning af intracellulært, der favoriserer apoptotisk svind, aktivering af caspaser og initiering af apoptotisk programmering [46, 47]. I betragtning af sammenlignelige K plus-tab, men modsat effekt på dødsinduktion opnået for ouabain-resistente og ouabain-følsomme modeller, foreslog vi forskellene i kations kompensatoriske systemer. Faldet i intracellulært K plus-niveau skulle i det væsentlige føre til aktivering af K plus-importen fra det ekstracellulære rum for at kompensere for manglen på denne kation. Derfor kan effektiviteten af ​​K plus restaurering ligge til grund for apoptoseprædisponering ved ouabain-behandling. For at teste dette forslag anvendte vi kompleks bioinformatisk analyse, der sammenlignede ændringer i transkriptomiske signaturer under senescens af ouabain-resistente celler (END-MSC'er) og ouabain-følsomme celler (A549 og IMR-90). Vi observerede stærk opregulering af processerne relateret til kaliumionimport under END-MSCs senescens, mens disse processer under ældning af oua-bain-sensitive A549 og IMR-90 forblev uændrede eller endda faldet. Baseret på det kan vi spekulere i, at senescent END-MSC'er effektivt kan klare ouabain-induceret K plus-udtømning via aktive kationimporterende systemer, som forhindrer apoptose-induktion. I modsætning hertil ser vores-bain-følsomme senescent A549 og IMR-90 ud til at være mindre i stand til at overvinde K plus-tab og er derfor apoptose-tilbøjelige. Til fordel for denne antagelse inducerede ouabain mere signifikant plasma- og mitokondriemembrandepolarisering i ældende A549-celler, der viser udtalt ionisk ubalance typisk for døende celler.

I stedet for at være det unikke kendetegn ved ouabain-induceret apoptose, er et fald af intracellulært K plus-indhold sandsynligvis det fælles kendetegn ved apoptotisk død udløst af forskellige belastninger, f.eks. staurosporinbehandling og oxidativ stress [46]. Følgelig skulle nedsat evne hos senescent A549 til at genoprette cytoplasmatisk K plus i sidste ende føre til et fald i den samlede stressresistens. Imidlertid er denne opfattelse i modstrid med den moderne definition af celleældning, som siger, at senescerende celler er meget modstandsdygtige over for apoptose [16]. Det skal specifikt fremhæves, at øget apoptoseresistens dannede grundlaget for analyseudvikling [16, 17].

Den første omtale af den øgede stressresistens af senescerende celler går tilbage til 1995, hvor replikative senescerende fibroblaster blev fundet at være mere resistente over for serumabstinenser sammenlignet med kontrolcellerne [55]. Denne indledende undersøgelse blev efterfulgt af et begrænset antal undersøgelser, der indikerer, at senescerende celler er mere modstandsdygtige over for UV-lys, staurosporin, thapsigargin og andre belastninger end deres prolifererende modstykker [56, 57]. Vi er dog langt fra de første til at rejse spørgsmålet om den øgede apoptoseresistens som det generelle træk ved senescerende celler. I den anmeldelse, der blev offentliggjort i 2003, blev det således rapporteret, at "... apoptoseresistens ikke er et generelt træk ved senescerende celler, som også kan være apoptotisk tilbøjelige afhængigt af celletype og apoptotiske stimuli..."[58]. Faktisk viste adskillige data højere følsomhed hos senescentceller over for stress-induceret apoptose end for kontrolceller [59-61]. For eksempel var senescent HUVEC'er mere tilbøjelige til apoptose induceret af oxideret LDL eller TNFa sammenlignet med kontrolceller [61]. På trods af den åbenlyse kontrovers dukkede den sidste tvivl op i 2015 og lød som følger: "Det forekommer tvivlsomt, at global apoptoseresistens er et generelt træk ved senescensceller"[62]. Samme år blev den første undersøgelse, der afdækkede analyse offentliggjort [16 ]. Inden for denne undersøgelse fremhævede forfatterne den øgede ekspression af pro-overlevelsesgennetværk i senescerende celler, der bidrog til deres øgede resistens over for apoptose. Således repræsenterede senolytika oprindeligt lægemidlerne til at målrette proteiner, der beskyttede senescerende celler mod apoptose. Opdagelsen af ​​analyser sammen med de imponerende resultater af fjernelse af senescent-celler ved hjælp af INK-ATTAC transgene mus udløste en byge af undersøgelser, der søgte efter de nye forbindelser med hæmolytisk aktivitet [16-26,63]. I løbet af de sidste to år er der blevet offentliggjort masser af anmeldelser om analyse [13-15,64-66]. Siden 2015 var øget apoptoseresistens af senescerende celler imidlertid ikke et spørgsmål om debat, selvom det faktisk ikke blev testet i disse undersøgelser.

Interessant nok fandt vi, når vi sammenlignede transkriptomiske signaturer af ouabain-resistente celler (END-MSC'er) og ouabain-følsomme celler (A549 og IMR-90), at kun ældning af END-MSC'er blev ledsaget af erhvervelse af mærkbare anti-apoptotisk profil. Tværtimod er alderdom af A549 og IMR-90 karakteriseret ved betydelig opregulering af pro-apoptotiske gener, herunder BAD, BAX, BOK, BAK-1, NOXA og så videre. Det er vigtigt, at disse resultater blev udvidet under anvendelse af andre ouabatin-resistente celler DP-MSC'er. På den ene side giver disse resultater en yderligere molekylær forklaring på fraværet af ouabain-induceret analyse i hMSC'er, og på den anden side viser de tydeligt, at A459 og IMR-90 bliver disponeret for apoptose under senescens. Det skal bemærkes, at vores data vedrørende transkriptomiske ændringer i gener relateret til apoptose i senescent IMR-90 faldt sammen med de resultater, der blev præsenteret, men ikke diskuteret, i artiklen publiceret af Guerrero et al., som datasættene for kontrol og senescent IMR{ {19}} celler stammer fra denne undersøgelse [25]. Den præcise analyse af varmekortet tilvejebragt i denne undersøgelse afslørede opregulering af BAX, BAD, BAD, BAKI og NOXA i senes-cent IMR-90 sammenlignet med kontrolcellerne. Endvidere har Baar et al. afslørede også "uventet" opregulering af proapoptotiske og nedregulering af antiapoptotiske gener i senescent IMR-90, idet man nævner, at senescent IMR-90 bør forberedes til at gennemgå apoptose [21].

For at styrke vores observation sammenlignede vi modstanden af ​​kontrol og senescent END-MSC'er og A459 med den mest almindelige apoptose-inducerende stimuli-oxidativ stress og staurosporin. Ifølge resultaterne af vores bioinformatiske analyse viste senescerende END-MSC'er sig at være langt mere stress-resistente end kontrolceller. På samme tid viste senescent A549, at den modsatte reaktion var lidt mere modtagelig end kontrolceller for begge typer af stressende stimuli. Derfor kan senolytisk virkning af hjerteglykosider, i det mindste for A549, være medieret af ældende celler af denne oprindelses disposition for apoptose sammenlignet med deres kontrolmodstykker, hvorimod fraværet af ouabain-induceret senolyse i hMSC'er kan forklares med stigningen i overordnet apoptotisk resistens under senescens af disse celler. Desuden prædisponerede svækkelse af "antiapoptotisk forsvar" ved MCL-1-hæmning END-MSC'er for senolyse induceret af hjerteglykosider. Selvom vi var i stand til at opnå den ønskede senolyse af END-MSC'er ved at hæmme MCL-1, virker strategien til at modulere ekspressionen af ​​de konkrete anti-apoptotiske gener for at prædisponere senescent hMSC'er for senolyse ikke særlig lovende, da ekspressionen dynamikken i de konkrete anti- eller pro-apoptotiske gener kan variere mellem celler af forskellig oprindelse. Vi mener, at erhvervelse af den såkaldte "anti-apoptotiske" profil under celleældning, snarere end ændringer i de konkrete anti- eller pro-apoptotiske gener, er ansvarlig for ouabain-resistens, i denne henseende kan muligheden for at skifte hele profilen virker mere fornuftigt.

Vores konklusioner, der fremhæver apoptose-resistens erhvervet under hMSCs senescens for at være en iboende barriere for effektiv analyse, kan udvides langt ud over hjerteglykosider. Især blev senescent hMSC'er fundet at være resistente over for andre senolytiske forbindelser. Ved at analysere de eksisterende beviser fandt vi faktisk, at forskellige forbindelser med den angivne senolytiske aktivitet, herunder navitoclax, nikotinamidribosid, danazol geldanamycin, ganetespib, fisetin, BCL-XL-hæmmere, quercetin, etomoxir, antimycin A, FOXO4-DRI ,17-DMAG viste sig at være ineffektiv til målrettet fjernelse af senescent humane præadipocytter (fibroblastlignende precursorceller afledt af humant fedtvæv) og hMSC'er fra knoglemarv [17-19, 36, 40]. Dataene vedrørende fravær af analyse i hMSC'er modsiger i nogen grad de inspirerende resultater opnået ved hjælp af in vivo musemodeller, hvilket viser positive resultater ved systemisk anvendelse af analyser [37, 38]. For eksempel blev det vist, at clearance af senescerende spytkirtelstamceller ved hjælp af ABT263 kan forhindre strålebehandling-induceret xerostomi [38]. Ydermere forbedrede fjernelse af senescent knoglemarvs-MSC'er ved quercetin knoglemarvsdannelse [37]. Det er vigtigt, at det blev vist, at ældre mus og rotte-MSC'er i modsætning til hMSC'er reagerer på analyser. For eksempel fjernede quercetin, quercetin-tin＋dasatinib og ABT263 signifikant senescent muse-MSC'er [16]. Det har også vist sig, at 17-DMAG i høj grad reducerer senescent bmMSC'er i en progeroid musemodel [19]. Derfor spekuleres forbedringerne i forskellige organers og systemers funktion beskrevet i disse undersøgelser at være konsekvensen af ​​den målrettede fjernelse af senescent musestamceller. Imidlertid har disse analyser endnu ikke vist nogen funktionel foryngelse af hMSC'er. En sådan åbenlys skelnen mellem musenes og humane MSC'ers reaktionsevne over for analyse tyder på, at forbedringer fra senolytiske terapier muligvis ikke bevares på tværs af arten. Resultaterne opnået for den senolytiske forbindelse UBX0101 kan betragtes som en god illustration, der bekræfter den sidste erklæring. Dette middel har vist sig at fjerne ældningsceller i en musemodel af slidgigt, som signifikant reducerede smerte og fremmede reparation af den beskadigede brusk [20]. Desværre formåede UBX0101 ikke at dæmpe sygdomsprogression og smerter hos patienter med moderat-til-serve smertefuld slidgigt under fase II kliniske forsøg [67-69]. Lignende bekymringer er rejst om senolytisk kombination dasatinib＋querce-tin[68].

For at opsummere, udspringer to vigtige konklusioner fra de opnåede data. Førstnævnte viste, at hjerteglykosider ikke er i stand til at fjerne senescent hMSC. Fraværet af analyse kan være medieret af effektiv K plus cellulær import og øget apoptoseresistens i senescent hMSC'er. Sidstnævnte er mere fundamental og afslører, at apoptoseresistens ikke er et generelt træk ved senescerende celler, da nogle celler under ældning får en 'apoptose-resistent' fænotype, mens andre ikke gør. Det er vigtigt, at kun apoptosetilbøjelige senescerende A549-celler effektivt kunne renses af hjerteglykosider. Baseret på det kan vi spekulere i, at effektiviteten af ​​andre senolytiske tilgange kan afhænge af, om senescerende celler faktisk er apoptose-resistente sammenlignet med deres prolifererende modstykker. Endelig, selvom 'analytik' er et varmt emne, og en masse inspirerende data er offentliggjort, bør konklusioner vedrørende effektiviteten af ​​analysen tages med forsigtighed, da heterogenitet af celleældning stadig er et 'puslespil'.

Denne artikel er uddraget fra Cellular and Molecular Life Sciences (2021) 78:7757–7776 https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x