GSK3-hæmning ved phosphorylering ved Ser389 kontrollerer neuroinflammation

Abstrakt: Hæmningen af ​​Glycogen Synthase Kinase 3 (GSK3) ved Ser9-phosphorylering påvirker mange fysiologiske processer, herunder immunresponset. Imidlertid forbliver konsekvenserne af GSK3-hæmning ved alternativ Ser389-phosphorylering dårligt karakteriseret. Her har vi undersøgt neuroinflammation i GSK3 Ser389 knock-in (KI) mus, hvor phosphoryleringen af ​​Ser389 GSK3 er svækket. Antallet af aktiverede mikroglia/infiltrerede makrofager, astrocytter og infiltrerede neutrofiler var signifikant højere i disse dyr sammenlignet med C57BL/6J vildtype (WT) modparter, hvilket tyder på, at manglende inaktivering af GSK3 ved Ser389-phosphorylering resulterer i vedvarende lav-grade neuroinflammation. Desuden mislykkedes gliacelleaktivering og hjerneinfiltration af immunceller som reaktion på lipopolysaccharid (LPS) i GSK3 Ser389 KI-mus. Sådanne virkninger var hjernespecifikke, da perifer immunitet ikke blev påvirket på samme måde. Derudover mislykkedes phosphorylering af IkB-kinasekomplekset (IKK) som svar på LPS i GSK3 Ser389 KI-mus, mens STAT3-phosphorylering var fuldt konserveret, hvilket tyder på, at NF-KB-signalvejen er specifikt påvirket af denne GSK3-regulatoriske vej. Samlet set indikerer vores resultater, at GSK3-inaktivering ved Ser389-phosphorylering kontrollerer hjernens inflammatoriske respons, hvilket øger behovet for at evaluere dets rolle i progressionen af ​​neuroinflammatoriske patologier.

cistanche tubulosa-Anti-inflammatorisk

Nøgleord: neuroinflammation; mikroglia; astrocytter; neutrofiler; NF-KB-signalering; flowcytometri

Hvad gør cistanche herb - Anti-inflammatorisk

Klik her for at se Cistanche-produkter

【Spørg for mere】E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

1. Introduktion

Glycogen Synthase Kinase 3 (GSK3) er en serin-threoninkinase med bred specificitet. GSK3 regulerer processer så forskellige som inflammation, cellevækst, celledifferentiering og energimetabolisme og er impliceret i aldersrelaterede sygdomme som diabetes, Alzheimers sygdom og cancer [1]. Begge GSK3 isoformer, GSK3 og GSK3, er allestedsnærværende udtrykt, men deres funktioner overlapper ikke fuldt ud [2]. GSK3 er konstitutivt aktiv, selvom dens aktivitet kan hæmmes ved sekvestrering i cytosoliske komplekser såvel som ved phosphorylering ved resterne Ser9 og Ser389 [3]. Akt-induceret phosphorylering af GSK3 ved Ser9 er en GSK3 regulatorisk vej til stede i de fleste celletyper, og det er standardvejen til at begrænse GSK3 aktivering og forhindre celledød. I modsætning hertil har vi fundet, at p38 MAPK-induceret Ser389-phosphorylering er begrænset til specifikke væv såsom hjernen, thymus og milten [4], og at hjerneekspression af phospho-Ser389 GSK3 er udviklingsreguleret [5]. Fosforyleringen af ​​GSK3 af Ser389 udløses primært af DNA-dobbeltstrengsbrudsrespons, og det er afgørende at tillade DNA-reparation [6,7]. Mens phosphorylering på Ser9 er hovedvejen for inaktivering af cytoplasmatisk GSK3, bruges Ser389-phosphorylering til at inaktivere den nukleare pool af GSK3 for at øge overlevelsen under DNA DSB-reparation [8]. Manglende inaktivering af GSK3 gennem Ser389-phosphorylering som reaktion på DSB fører til øget celledød ved nekroptose [6,7]. Dette er yderst relevant, fordi den nekroptotiske dødstype er mere inflammatorisk og er blevet fundet ved inflammatoriske sygdomme [9]. Men i modsætning til phosphoryleringen af ​​Ser9 forbliver implikationerne af phosphorylering af GSK3 på Ser389 dårligt karakteriseret. En række undersøgelser har understøttet sammenhængen mellem GSK3 og inflammation. Aktivering af GSK3 ved inflammatoriske stimuli såsom stress, infektion eller traumer fremmer således produktionen af ​​pro-inflammatoriske cytokiner såsom IL-6, IL-1 og IFN, mens GSK3-hæmning undertrykker syntesen af pro-inflammatoriske mediatorer og øger IL-10 produktion af immunceller [10]. GSK3 kan aktiveres af lipopolysaccharid (LPS), et af de vigtigste immunstimulerende endotoksiner fra gramnegative bakterier [11,12]. Ved binding af bakteriel LPS til Toll-lignende receptorer (TLR'er), medierer GSK3 frigivelsen af ​​inflammatoriske cytokiner i celler i det medfødte immunsystem [13]. Desuden er det blevet rapporteret, at administration af GSK3-hæmmere til mus behandlet med en dødelig dosis LPS øger dyrenes overlevelse signifikant [14]. På trods af disse pro-inflammatoriske virkninger forbundet med GSK3, er anti-inflammatoriske virkninger også blevet dokumenteret [15,16]. GSK3-regulering er således afgørende for at opretholde balancen mellem pro- og antiinflammatoriske cytokiner efter TLR-aktivering [17]. Nuklear faktor kB (NF-kB) medierer produktionen af ​​pro-inflammatoriske cytokiner og er en af ​​de vigtigste transkriptionsfaktorer aktiveret af TLR'er. Flere forfattere har bekræftet, at GSK3 er i stand til at aktivere NF-kB-signalering gennem phosphorylering af IkB-kinasekomplekset (IKK), som phosphorylerer IkB og frigiver aktivt NF-kB. En anden transkriptionsfaktor phosphoryleret af GSK3 er en signaltransducer og aktivator af transkription -3 (STAT3), som medierer neuroinflammation i forbindelse med septisk shock [18]. STAT3-phosphorylering med GSK3 resulterer i nuklear translokation og aktivering. Derudover hæmmer GSK3 anti-inflammatoriske CREB og AP-1 transkriptionelle aktiviteter, hvilket forstærker ekspressionen af ​​proinflammatoriske cytokiner [10,19]. Microglia-celler er bosiddende makrofager i CNS. Sammen med infiltrerede leukocytter spiller mikroglia-aktivering en kritisk rolle i neuroinflammation. Astrocytter er også gliaceller med neuroimmune funktioner, da de krydstaler med mikroglia, leukocytter og endotelceller, og dermed modulerer både medfødte og adaptive immunresponser [20]. Aktivering af mikroglia og astrocytter som reaktion på inflammatoriske stimuli (gliose) er karakteriseret ved store cellulære ændringer, der omfatter proliferation, hypertrofi og cytokinfrigivelse [21]. GSK3 har været involveret i udviklingen af ​​gliose som reaktion på LPS eller ved overekspression af neural GSK3 [22]. Der er også bevis for, at glialreaktivitet og neuroinflammation induceret af GSK3 kan medieres ved aktivering af NF-kB-vejen i hjernen [19,23]. I modsætning hertil nedsætter inaktiveringen af ​​GSK3 glialreaktivitet, begrænser det neuroinflammatoriske respons og øger antiinflammatorisk CREB-aktivitet i neurale celler [24]. Derfor er det blevet foreslået, at GSK3 spiller en fundamental rolle i udviklingen af ​​neuroinflammatoriske lidelser, såsom Alzheimers sygdom og multipel sklerose [25]. Fosforylering er en regulatorisk mekanisme for GSK3-aktivitet med store implikationer for kontrollen af ​​immunresponset. Således opregulerer GSK3-hæmning ved klassisk Ser9-phosphorylering produktionen af ​​antiinflammatoriske mediatorer og nedregulerer frigivelsen af ​​pro-inflammatoriske cytokiner [26], selvom den også er involveret i opløsningen af ​​inflammation i en model for eksperimentel colitis induceret af trinitrobenzensulfonsyre [27]. I hjernen er defekt inhibering af GSK3 ved Ser9-phosphorylering blevet relateret til inflammatoriske neuropatologier såsom Parkinsons sygdom [28] og skizofreni [29]. I modsætning hertil, på trods af de høje niveauer af phospho-Ser389 GSK3 fundet i hjernen [4], er det stadig ukendt, om denne vej til inaktivering af GSK3 spiller en rolle i tuning af neuroinflammation. Her undersøger vi den mulige rolle af Ser389-phosphoryleringsmedieret GSK3-inaktivering i neuroinflammation ved hjælp af GSK3 KI-mus, hvor GSK3 Ser389 blev erstattet af Ala for at forhindre den C-terminale phosphorylering af GSK3 [7,8]. Vores resultater afslører, at manglende inaktiv GSK3 ved phosphorylering ved Ser389 under fysiologiske forhold fører til kronisk lavgradig neuroinflammation såvel som manglen på respons på inflammatoriske stimuli såsom LPS. Denne kroniske betændelse ser ud til at være specifik for hjernen, da det perifere immunsystem stort set er upåvirket. Vi viser også, at fraværet af phospho-Ser389 GSK3 i hjernen hos GSK3 KI-mus regulerer NF-kB-signalering, som er en central begivenhed i kontrollen af ​​neuroinflammation. Derfor giver vores resultater støtte til involvering af GSK3-inaktivering ved Ser389-phosphorylering i inflammatoriske neuropatologier.

2. Resultater

2.1. Manglende inaktivering af GSK3 ved Ser389-phosphorylering fører til øget basal neuroinflammation

Inaktivering af GSK3 ved phosphorylering på Ser9 er blevet forbundet med et antiinflammatorisk stadium i hjernen [30]. Selvom inaktiveringen af ​​GSK3 ved phosphorylering på Ser389 er vigtig for at reducere neuronal død forårsaget af DNA-dobbeltstrengsbrud i hjernen, har ingen undersøgelser undersøgt, om denne vej også kunne regulere det neuroinflammatoriske respons. Vi brugte derfor de tidligere beskrevne GSK3 Ser389 KI-mus, hvor Ser389 er erstattet af Ala, for at forhindre Ser389-phosphorylering. Vi undersøgte residente og infiltrerede immunceller i hele hjernen (undtagen cerebellum og olfaktoriske løg) fra WT og GSK3 Ser389 KI mus ved mekanisk dissociation af vævet og Percoll gradient, efter en tidligere optimeret protokol for at opnå en afbalanceret blanding af residente og infiltrerede celler i hjernen, herunder mikroglia/makrofager, astrocytter, infiltrerede neutrofiler og lymfocytter [31]. Celler blev derefter analyseret ved flowcytometri ved hjælp af standardmarkører (figur S1 i supplerende materialer) [31-33]. Aktiverede og hvilende mikroglia/makrofager blev identificeret som henholdsvis CD11b+CD45high og CD11b+CD45low, hvorimod lymfocytpopulationen blev markeret som CD45+CD11b- [32,34]. Neutrofiler blev karakteriseret som CD45+Ly6G+-celler; og astrocytter blev defineret i CD45−-populationen ved ekspression af celleoverfladeantigenet -2 (ACSA-2). Denne markør bruges til påvisning af udviklende og voksne astrocytter [35]. Opregulering af ACSA-2 er blevet observeret i reaktive astrocytter forbundet med inflammatoriske tilstande, såsom autoimmun demyelinisering [36]. Vi fandt tidligere, at antallet af ACSA-2+-astrocytter i musehjerner stiger efter LPS-behandling, hvilket yderligere indikerer, at niveauet af ACSA-2-ekspression korrelerer med astrocytaktivering som reaktion på inflammatoriske stimuli [31]. Selvom ACSA-2 også kan udtrykkes i en lille underpopulation af mikroglia og makrofager [35], er disse celler inden for CD45+-populationen. Flowcytometrianalyse af hjernecelleisolaterne fra mus under fysiologiske forhold afslørede en markant stigning i fraktionen af ​​aktiverede mikroglia/makrofager i GSK3 Ser389 KI-mus sammenlignet med WT-mus (figur 1a). I modsætning hertil faldt procentdelen af ​​hvilende mikroglia i hjernerne på GSK3 Ser389 KI-mus (figur 1b). Derudover var der en markant stigning i tilstedeværelsen af ​​ACSA-2+-astrocytter (dvs. aktiverede astrocytter) i GSK3 Ser389 KI-mus (figur 1c). Med hensyn til immuncelleinfiltration i hjernen var der en klar ophobning af neutrofiler i hjernen på GSK3 Ser389 KI-mus i forhold til WT-mus (figur 1d), hvilket yderligere viser tilstedeværelsen af ​​igangværende inflammatorisk respons i hjernen af ​​GSK3 Ser389 KI-mus under fysiologisk betingelser. Hyppigheden af ​​CD45+CD11b-leukocytter (overvejende lymfocytiske celler) i hjernen blev imidlertid ikke påvirket i GSK3 Ser389 KI-mus (figur 1e). Sammen viser disse resultater, at manglende inhibering af GSK3 ved phosphorylering ved Ser389 fører til en kronisk medfødt inflammatorisk respons i hjernen, der forårsager reaktivitet mellem mikroglia og astrocytter.

Figur 1. Inaktivering af GSK3 ved Ser389-phosphorylering påvirker hjernecellepopulationer impliceret i neuroinflammation. Hjerner fra både WT- og GSK3 Ser389 KI-mus blev fjernet og behandlet til flowcytometrianalyse af (a) CD11b++CD45-højaktiverede mikroglia/makrofager, (b) CD11b++CD45-lavhvilende mikroglia, (c) ACSA -2+ astrocytter, (d) Ly6G+ neutrofiler og (e) CD11b− lymfocytter. Histogrammer repræsenterer celleantal, udtrykt som procentdelen af ​​CD45−celler (astrocytter) eller CD45+-celler (alle andre populationer). Data vises som middelværdi ± SEM (n=7–9). Student t-test blev anvendt til at sammenligne genotyper. *, p < {{20}}.05; **, p < 0,01. WT, vildtype; KI og GSK3 Ser389 knockin.

2.2. Manglende effekt af GSK3-phosphorylering ved Ser389 på miltceller

For at undersøge, om den ændrede inflammatoriske tilstand påvist i GSK3 Ser389 KI-mus er begrænset til hjernen, eller om effekten også er systemisk, udførte vi flowcytometrianalyse for de forskellige cellepopulationer i milten. Neutrofiler blev identificeret som Ly6G+-celler. Ly6G-ekspression var meget variabel, da den afhænger af modningsstadiet af celler, som tidligere vist [37]. Derudover blev monocytiske myeloidceller mærket som Ly6G-CD38+CD11b+-celler. Disse monocytter/makrofager præsenterede to klart adskilte populationer baseret på niveauerne af CD38-ekspression, som tidligere rapporteret [38]. CD8+-celler, CD4+-celler og B220+-celler (B-celler) blev også evalueret (figur S2 i supplerende materialer).

Figur 2. Flowcytometrianalyse viser lignende miltcellepopulationer i WT- og GSK3 Ser389 KI-mus. Efter dissocieringen af ​​miltceller blev flowcytometri brugt til at vurdere antallet af (a) Ly6G+ neutrofiler, (b) CD38+CD11b+ monocytter/makrofager, (c) CD4+ celler, (d) CD8+-celler og (e) B220+-celler. Histogrammer viser celletal udtrykt som en procentdel af det samlede antal celler. Data svarer til middelværdi ± SEM (n=5–7). Student t-test blev anvendt til at sammenligne genotyper. WT, vildtype; KI, GSK3 Ser389 knockin.

2.3. LPS er ude af stand til at øge neuroinflammation hos GSK3 Ser389 KI-mus

Dernæst undersøgte vi, om afskaffelse af Ser389-phosphorylering, udover at forårsage basal tonisk inflammation, også kunne påvirke det inflammatoriske respons udløst af LPS. WT- og GSK3 Ser389 KI-mus blev injiceret intraperitonealt med en subletal dosis (0,5 mg/kg) af bakterielt lipopolysaccharid (LPS). Den hjerneinflammatoriske respons blev undersøgt tre dage senere, da en sådan behandling tidligere har vist sig at producere lavgradig inflammation i musehjerner [39,40]. Dette LPS-respons ligner også den kroniske inflammatoriske tilstand observeret i flere neurologiske sygdomme, herunder depression, angst og Parkinsons sygdom [41,42]. Som forventet inducerede LPS glialreaktivitet i WT-mus, som bestemt af stigningen i frekvensen af ​​aktiverede mikroglia/makrofager (figur 3a) og nedsat frekvens af hvilende mikroglia (figur 3b). I modsætning hertil kunne LPS ikke udløse yderligere inflammatorisk respons i GSK3 Ser389 KI-mus (figur 3a,b). Tabel 1 sammenligner direkte størrelsen af ​​LPS-responser mellem de to genotyper. Derudover øgede denne LPS-behandling procentdelen af ​​ACSA-2+-astrocytter i WT-mus, som tidligere rapporteret [31], men ikke i GSK3 Ser389 KI-mus (figur 3c). Med hensyn til hjerneinfiltration af immunceller forårsagede LPS en akkumulering af neutrofiler i WT-mus, men havde ingen effekt i GSK3 Ser389 KI-mus (figur 3d). Endelig fremmede LPS-administration ikke lymfocytakkumulering i hjernen i hverken WT- eller GSK3 Ser389 KI-mus (figur 3e). Alt i alt indikerer disse observationer, at inaktiveringen af ​​GSK3 ved Ser389-phosphorylering er afgørende for at forhindre en tonisk inflammatorisk tilstand i hjernen, men bidrager til akut hjernebetændelse som reaktion på stimuli såsom LPS.

Tabel 1. Forskelle i LPS-effekter mellem WT- og GSK3 Ser389 KI-mus. Værdier repræsenterer celleantal efter LPS-behandling i hver genotype og er udtrykt som en stigning i forhold til vehikelbehandlede kontroller (gennemsnit ± SEM). Stjerner indikerer statistisk signifikante forskelle mellem virkningerne af LPS i WT- og GSK3 Ser389 KI-dyr. WT, vildtype; KI, GSK3 Ser389 knockin; LPS, lipopolysaccharid. *, p < 0.05; **, p < 0,01.

Figur 3. Neuroimmunceller fra GSK3 Ser389 KI-mus reagerer ikke på LPS. Voksne WT- og GSK3 Ser389 KI-mus blev injiceret intraperitonealt med LPS (0,5 mg/kg). Tre dage senere, hjernepopulationer af (a) CD11b++CD45højaktiverede mikroglia/makrofager, (b) CD11b+CD45lavhvilende mikroglia, (c) ACSA-2+ astrocytter, (d) Ly6G+ neutrofiler, og ( e) CD11b-lymfocytter blev evalueret ved flowcytometri. Histogrammer viser LPS-effekter på celleantal i begge genotyper. Data præsenteres som procenter af CD45−celler (astrocytter) eller CD45+-celler (alle andre populationer), og værdier svarer til middelværdi ± SEM (n=7–9). Student t-test blev anvendt til at evaluere betydningen af ​​ændringer induceret af LPS i hver genotype. ** p < 0.01. WT, vildtype; KI, GSK3 Ser389 knockin; LPS, lipopolysaccharid.

Dernæst undersøgte vi den mulige indflydelse af hippocampal GSK3 Ser389-phosphorylering på basal glialaktivering og glialresponset på inflammatoriske stimuli. Til dette formål blev Iba-1-mærkning evalueret ved mikroskopi i dentate gyrus (figur 4a). Først blev WT-mus evalueret. Mikrografer afslører lav basal glial aktivering, men en robust stigning i glial immunreaktivitet som respons på LPS-injektion (0,5 mg/kg, 3 dage) (figur 4b). Kvantificering af den integrerede tæthed for Iba-1-immunfarvning viste værdier, der var 53 % højere i WT-mus efter behandling (figur 4d). Disse ændringer var statistisk signifikante og er i overensstemmelse med den fremtrædende cellulære hypertrofi forårsaget af LPS i musens hippocampus tidligere rapporteret [43,44].

Figur 4. Gliose som respons på LPS er ændret i GSK3 Ser389 KI-mus. Voksne WT- og GSK3 Ser389 KI-mus blev injiceret intraperitonealt med LPS eller vehikel (C). Efter 3 dage blev hjerner behandlet til fluorescerende mikroskopi. (a) En koronal hippocampus-sektion tilpasset fra musehjerneatlaset [45] indikerer lokaliseringen af ​​billederne, som inkluderer dentate gyrus. (b) Hjernesektioner blev immunmærket for mikroglia/makrofagemarkører Iba-1. Grafer viser den integrerede tæthed af Iba-1-immunreaktivitet, som er en måling af glialreaktivitet, der afspejler både intensiteten og forlængelsen af ​​glialfarvning. (c) Sammenligning af kontrol WT- og KI-dyr. (d) LPS-respons i hver musegenotype. Alle værdier er udtrykt med øget respekt for WT-kontroller behandlet med vehikel (gennemsnit ± SEM, n=4–5). Elev t-test blev anvendt. *, p < 0.05. Målestok, 100 µm. WT, vildtype; KI, GSK3 Ser389 knockin; C, køretøj; LPS, lipopolysaccharid.

Analysen af ​​hippocampus af Ser389 KI-mus afslørede forskelle i basal mikroglial aktivering med hensyn til WT-mus. Selvom visuel inspektion af mikrofotografier viste en moderat glial aktivering i mutante dyr (figur 4b), viste integrerede tæthedsmålinger, at stigningen i glial immunreaktivitet var statistisk signifikant (figur 4c). Interessant nok viste Ser389 KI-mus ingen tegn på yderligere aktivering efter LPS-behandling (figur 4b), og kvantitativ analyse bekræftede, at LPS ikke var i stand til at øge Iba-1-immunfarvning i hippocampus (figur 4d), hvilket tyder på, at gliacelleaktivering vha. LPS er svækket i fravær af GSK3 Ser389-phosphorylering.

cistanche-tilskudsfordele—Anti-inflammatorisk

2.5. Perifer immunrespons på LPS blev ikke påvirket i GSK3 Ser389 KI-mus

Vores tidligere eksperimenter afslører de dybe konsekvenser af GSK3-inaktivering ved Ser389-phosphorylering på hjernens reaktion på LPS. Dernæst behandlede vi, om lignende virkninger er til stede i systemisk immunitet. Da LPS er kendt for at forårsage aktivering af milt medfødte immunceller [46], blev miltcellepopulationer fra både WT- og GSK3 Ser389 KI-mus evalueret 3 dage efter LPS-injektion (0,5 mg/kg). antallet af Ly6G+ neutrofiler (figur 5a) og CD38++CD11b++Ly6G-monocytter/makrofager (figur 5b) steg signifikant i WT-mus som svar på LPS-behandling. Disse LPS-effekter, forventet i WT-mus, blev også observeret i GSK3 Ser389 KI-mus (figur 5a,b). Der blev heller ikke opnået forskelle mellem genotyper, når lymfocytpopulationer fra milten blev analyseret, da procenterne af milt-CD4+-celler (Figur 5c) og CD8+-celler (Figur 5d) også blev reduceret af LPS i begge musestrenge (reduktionen i mutante mus var kun statistisk signifikant for CD4+-celler); og B220+ B-celler var upåvirket af LPS uafhængigt af genotype (figur 5e). Disse observationer er i modsætning til de forskellige virkninger af LPS fundet i hjernen af ​​begge genotyper. Mens GSK3 Ser389 KI-mus er resistente over for neuroinflammation udløst af LPS, er disse mus således ikke systemisk desensibiliserede over for LPS. Derfor synes virkningerne af GSK3 Ser389-phosphorylering at være selektive for hjernen.

Figur 5. Lignende perifert immunrespons på LPS i GSK3 Ser389 KI- og WT-mus. Voksne WT- og GSK3 Ser389 KI-mus blev ip injiceret med LPS. Efter 3 dage blev miltceller ekstraheret og behandlet for ved flowcytometri at evaluere antallet af (a) Ly6G+ neutrofiler, (b) CD38+CD11b+ monocytter/makrofager, (c) CD8+, (d) CD4+ og (e) B220+ celler. Histogrammer viser virkningerne af LPS på celleantal, herunder WT- og KI-mus. Student t-test blev anvendt til at evaluere betydningen af ​​ændringer induceret af LPS i hver genotype. Gennemsnit ± SEM vises (n=5–7). *, p < 0.05; **, p < 0,01. WT, vildtype; KI, GSK3 Ser389 knockin; ip, intraperitoneal; C, køretøj; LPS, lipopolysaccharid.

2.6. LPS-induceret NF-KB-stiaktivering i Hippocampus er afskaffet i GSK3 Ser389 KI-mus

NF-KB er en transkriptionel faktor, der er afgørende for, at LPS kan inducere inflammation [47]. Derudover har NF-KB vist sig at blive reguleret af GSK3 i hjernen [2,19,23]. Vi undersøgte derfor NF-KB-aktivering i hjernen som reaktion på LPS ved analyse af IKK-phosphorylering, et tidligt trin i NF-kB-aktiveringsvejen. WT- og GSK3 Ser389 KI-mus blev ip administreret med LPS (0,5 mg/kg), og efter 4 timer blev hippocampus høstet. Helcelleekstrakter blev brugt til at undersøge phospho-IKK / og total IKK / ved Western blotting. Som forventet øgede LPS IKK-phosphorylering i hippocampus i WT-mus (figur 6a,b). I modsætning hertil formåede LPS ikke at inducere IKK-phosphorylering i GSK3 Ser389 KI-mus (figur 6a,b). Aktivering af STAT3 er også blevet forbundet med LPS-induceret inflammation [48]. Vi undersøgte derfor phosphoryleringen af ​​STAT3 ved Western blot-analyse. I modsætning til NF-kB-aktivering blev phosphorylering af STAT3 stærkt induceret i hippocampus af både WT- og GSK3 Ser389 KI-mus som svar på LPS (figur 6a, c). Forhindring af GSK3-inaktivering ved Ser389-phosphorylering svækker således selektivt NF-KB-signalering, hvilket er i overensstemmelse med en rolle for GSK3 som en opstrømsregulator af NF-KB-vejen i hippocampus. Disse resultater tyder på, at GSK3-vejen påvirker neuroinflammation ved at kontrollere vigtige inflammatoriske mediatorer, såsom NF-KB.

Figur 6. Manglende inaktivering af GSK3 ved Ser389-phosphorylering påvirker forskelligt NF-KB- og STAT3-signalering i LPS-behandlede mus. Aktivering af NF-KB- og STAT3-vejene blev undersøgt i helcellelysater fra hippocampus 4 timer efter ip-injektion af LPS ({{10}},5 mg/kg) eller vehikel (C) i begge WT og GSK3 Ser389 KI mus. Blots illustrerer Western blot-analysen af ​​phosphor-IKK / , total IKK / , phosphor-STAT3 og total STAT3. (a) -tubulin-detektion blev inkluderet som en ladningskontrol. Tilknyttede grafer svarer til (b) phospho-IKK//IKK/- og (c) phospho-STAT3/STAT3-forhold, opnået fra densitometriske analyse af Western blot-bånd. Student t-test blev anvendt til at sammenligne ubehandlede kontroller (C) og LPS-behandlede dyr i hver genotype (gennemsnit ± SEM, n=5-6). *, p < 0.05; ***, p < 0,001. Data er repræsentative for fire uafhængige eksperimenter for pIKK/IKK og tre uafhængige eksperimenter for pSTAT3/STAT3. WT, vildtype; KI, GSK3 Ser389 knockin; ip, intraperitoneal; C, køretøj; LPS, lipopolysaccharid.

3. Diskussion

I hjernen er dysregulering af GSK3-aktivitet forbundet med flere neuropatologier, hvor kronisk inflammation er et almindeligt kendetegn [25]. Da en stor litteratur understøtter, at hæmning af GSK3 ved Ser9-phosphorylering opregulerer anti-inflammatoriske mediatorer og nedregulerer pro-inflammatoriske cytokiner [23,28,30], er den mekanisme, der almindeligvis foreslås til at forklare defekt GSK3-inaktivering i neuroinflammatoriske patologier manglende phosphorylering af Ser9 [3]. Imidlertid er usædvanligt høje niveauer af phospho-Ser389 GSK3 blevet påvist i hjernen [4], hvilket tyder på, at denne alternative vej til GSK3-inaktivering også kan spille en fremtrædende rolle i hjernen. Eksperimenterne præsenteret her afslører implikationen af ​​GSK3 Ser389-phosphorylering i neuroinflammation, hvilket tilføjer tidligere beviser, der tyder på involveringen af ​​denne vej i hjernens DNA-reparation og neuronal overlevelse [6,7]. Et af de vigtigste resultater i dette arbejde er, at hjernen hos GSK3 Ser389 KI-mus viser vedvarende gliose og øget immuncelleinfiltration, hvilket er i overensstemmelse med forestillingen om, at forebyggelse af GSK3-inaktivering gennem Ser389-phosphorylering fører til neuroinflammation. Data fra vores flowcytometri-eksperimenter peger klart på øget neuroinflammation hos disse dyr, da antallet af aktiverede mikroglia/makrofager, ACSA 2+-astrocytter og infiltrerede neutrofiler i hjernen på Ser389 GSK3 KI-mus var signifikant højere. På trods af at mikro-astrogliose tydeligt blev observeret ved flowcytometri, afslørede analyse af hippocampus-mikrofotografier fra hjernesektioner af Ser389 GSK3 KI-mus, at hypertrofi af mikroglia/makrofager kun var mild. Lignende resultater blev observeret, når andre hjerneområder blev analyseret for at vurdere omfanget og intensiteten af ​​gliose (ikke vist). Derfor konkluderer vi, at i fravær af pro-inflammatoriske stimuli fører manglen på GSK3 Ser389-phosphorylering til en grad af neuroinflammation, der bør klassificeres som lavgradig. Talrige undersøgelser understøtter sammenhængen mellem GSK3-hyperaktivitet og neurodegeneration i neurologiske lidelser [25]. I denne sammenhæng kunne den inflammatoriske respons, som vi observerede i Ser389 GSK3 KI-mus, være konsekvensen af ​​neurodegeneration, da tidligere undersøgelser har påvist neuronal død i cortex og hippocampus af disse dyr [6]. Dette er i overensstemmelse med observationen, at DNA-skade inaktiverer GSK3 gennem Ser389-phosphorylering som en mekanisme til at forhindre celledød og fremme DSB-reparation [7,8]. Som følge heraf er hjernen hos KI-mus, hvor Ser389-phosphorylering forhindres, ikke beskyttet mod DSB-induceret neuronal død. Forbindelsen mellem phosphor-Ser389 GSK3-ekspression og celleoverlevelse blev først foreslået i lymfocytter som en mekanisme impliceret i det adaptive immunrespons. Fraværet af GSK3 Ser389-phosphorylering i KI-mus viste sig således at inducere nekroptose i B-celler under dets sene modning, hvilket er en meget inflammatorisk type celledød relateret til flere patologier [9]. Det er også interessant at bemærke, at ikke kun Ser389-phosphorylering, men også Ser9-phosphorylering kan udløses for at inaktivere GSK3 som reaktion på DNA-skade. Ser389 GSK3 KI-mus præsenterer imidlertid en neurodegenerativ fænotype [6] som ikke er til stede i Ser9 GSK3 KI-mus [49,50], hvilket indikerer, at Ser389-phosphorylering spiller specifikke roller i kontrollen af ​​GSK3-aktivitet, og at der er scenarier, hvor Ser9-phosphorylering ikke kan kompensere for tabet af Ser389-phosphorylering. Følgelig skal den spændende forbindelse mellem Ser389 GSK3-deregulering, neuroinflammation og neurodegeneration afsløret her yderligere udforskes for at afklare, om ændret GSK3-phosphorylering ved Ser389 kan være en nøglefaktor i neuropatologier, hvor kronisk inflammation er karakteristisk, såsom Alzheimers sygdom. Derudover er den milde, men vedvarende aktivering af neuroimmune celler observeret i GSK3 Ser389 KI mus i overensstemmelse med hypotesen om, at manglende phosphorylering af Ser389 kan være forbundet med immunosenescens. Dette er en aldersrelateret proces karakteriseret ved et fald i immunfunktioner sammen med en stigning i ekspressionen af ​​proinflammatoriske mediatorer; som fører til kronisk lavgradig inflammation [1,51]. Flere forfattere har peget på involveringen af ​​GSK3-deregulering i aldersrelateret inflammation [1,52]. Det er også blevet foreslået, at den unormale funktion af mikroglia observeret i forbindelse med hjerneimmunosenescens i sidste ende kan forårsage neurodegeneration [53]. Således kunne accelereret immunosenescens i Ser389 GSK3 KI-mus bidrage til tabet af neuroner, der tidligere er rapporteret i disse dyr [6]. LPS er blevet brugt i vid udstrækning til at inducere inflammation i både "in vivo" og "in vitro" modeller. Der er dog tegn på, at dosen af ​​administreret LPS i høj grad bestemmer typen af ​​inflammatorisk respons induceret [54-56]. Høje doser af LPS producerer septiske choklignende reaktioner; mens moderate LPS-doser udløser en vedvarende lavgradig inflammation tættere på den, der observeres i mange kroniske sygdomme [42]. I denne sammenhæng er det vigtigt at understrege, at den valgte LPS-dosis til vores forsøg (0,5 mg/kg, ip) er moderat og er langt fra den LD50, der er rapporteret for LPS hos mus (10-25 mg/kg) [57,58 ]. I overensstemmelse med tidligere rapporter [40,59] fandt vi, at en sådan LPS-dosis ikke er dødelig og er tilstrækkelig til at øge gliose og hjerneinfiltration af neutrofiler i WT-dyr, mens lymfocytinfiltration ikke påvirkes. Bemærkelsesværdigt var et sådant moderat (men signifikant) LPS-respons afskaffet i hjernen af ​​KI-mus med svækket inaktivering af GSK3 ved Ser389-phosphorylering. Ifølge denne observation kan forlænget GSK3-hyperaktivering i hjernen i sidste ende nedregulere følsomheden over for pro-inflammatoriske fornærmelser. Det er bemærkelsesværdigt, at det defekte respons på LPS i mutantmusene er foreneligt med mekanismen for immuntolerance eller resistens, en almindelig proces i CNS, der sigter mod at reducere gliacelleaktivering og begrænse hjerneskade fra overdreven inflammation [60,61]. I overensstemmelse med denne idé viste en tidligere undersøgelse, at GSK3-aktivering hos mus kan inducere immuntolerance og undertrykke LPS-responser [62].

Fordele ved cistanche tubulosa-styrke immunsystemet

Det er også interessant at overveje, at hjerneeffekterne beskrevet i denne undersøgelse viser høj specificitet. I modsætning til hjernen udviste de fleste miltcellepopulationer vurderet i WT- og Ser389 GSK3 KI-dyr den samme profil under ustimulerede forhold, såvel som et lignende respons på LPS. Dette tyder på, at GSK3-inaktiveringsvejen afhængig af Ser389-phosphorylering spiller specifikke roller i reguleringen af ​​neuroinflammation. I overensstemmelse med denne hypotese viser hjerneceller en høj ekspression af phospho-Ser389 GSK3 sammenlignet med andre væv, og dette udtryk er stramt reguleret under hjernens udvikling [5]. Endelig, ifølge vores resultater, er reguleringen af ​​GSK3 ved phosphorylering ved Ser389 specifikt medieret af NF-kB-signalvejen, da STAT3-aktivering var upåvirket i Ser389 GSK3 KI. Mange nedstrøms inflammatoriske mediatorer reguleres af NF-kB-aktivering, herunder cytokiner, receptorer, transkriptionsfaktorer og enzymer. At identificere hvilke af disse NF-kB-mål, der er påvirket af Ser389 GSK3-phosphorylering, ligger uden for vores arbejde, men det vil være et spændende mål for fremtidige undersøgelser, der sigter mod at klarlægge mekanismerne for neuroinflammation.

4. Materialer og metoder

4.1. Dyr

C57BL/6J vildtype (WT) mus blev købt fra Jackson Laboratories. C57BL/6 GSK3 Ser389 KI-mus, hvor Ser389-resten af ​​GSK3 blev erstattet af Ala for at forhindre phosphorylering, blev genereret som tidligere beskrevet [8]. Alle mus blev anbragt i dyrefaciliteten tilknyttet Albacete Medical School under en 12-lys/mørke-cyklus. Mad og vand blev leveret ad libitum. Fire til seks måneder gamle voksne mus blev brugt til eksperimenterne.

4.2. LPS Administration

For at inducere en inflammatorisk respons modtog mus en enkelt intraperitoneal (ip) injektion af {{0}},5 mg/kg LPS. Salmonella enterica LPS (serotype typhimurium, L7261 Sigma Aldrich, Madrid, Spanien) blev opløst i steril, endotoksinfri 0,9 % saltvand ved 10 mg/ml. Tre dage efter behandlingen blev musene aflivet, og hjernen og milten blev fjernet til immunhistokemi eller flowcytometrianalyse af gliaceller og infiltrerede immunceller. Til Western blotting-analyse blev dyrene aflivet 4 timer efter ip-injektion af 0,5 mg/kg LPS, da LPS tidligere er blevet rapporteret at opregulere inflammatoriske proteiner i muse- og rottehjerner 2-4 timer efter ip-administration [63,64].

4.3. Flowcytometri

Til flowcytometrianalyse af hjernevæv og miltceller blev dyr bedøvet med en ip-injektion af tribromethanol, som er blevet anbefalet til akutte terminale undersøgelser. Den lave dosis af tribromethanol, der anvendes (200 mg/kg) giver let anæstesi uden alvorlige bivirkninger eller indflydelse på inflammatorisk cytokinekspression [65]. Dyreprocedurer blev udført efter at have verificeret fraværet af reflekser.

4.3.1. Hjernevævsdissociation og Percoll-gradientisolering af neurale celler

Mus blev intrakardialt perfunderet med 50 ml 0,9% NaCl før vævsopsamling for at fjerne cirkulerende celler fra hjernens blodkar. Efter perfusion blev hjernerne fjernet, meninges og choroideus plexus blev omhyggeligt adskilt, og cerebellum og lugteløg blev kasseret. Det resterende væv blev anbragt i kold Hank's Balanced Salt Solution, som er fri for calciumchlorid og magnesiumchlorid (HBSS [-]CaCl2/[-]MgCl2: Gibco, Madrid, Spanien, 14175). Vævsprøver blev derefter finthakket med en skalpel før fordøjelse. Hakket væv blev derefter anbragt i MACS C-rør (Miltenyi Biotec, Pozuelo de Alarcón, Spanien, 130-093-237) ​​i et samlet volumen på 5 ml og behandlet med en mekanisk dissociator ved 6 rpm i 30 min. Enzymatisk dissociation blev udført i henhold til vores egen protokol [31] under anvendelse af papain (100 U; Worthington, LK003178) og dispase II (6 U; Sigma-Aldrich, Madrid, Spanien, D4963) i Earle's Balanced Salt Solution (EBSS [+]CaCl2 /[+]MgSO4; Gibco, Madrid, Spanien, 24010). DNAse I (100 U; Sigma-Aldrich, Madrid, Spanien, DN25) blev tilsat til opløsningen for at fjerne det DNA-slim, der negativt påvirker cellernes levedygtighed [66]. Før brug blev papain aktiveret i 30 minutter ved 37 ◦C i 5 % CO2. For at stoppe fordøjelsen blev prøverne fortyndet med kold HBSS og anbragt på is. Denne opløsning blev derefter pipetteret 10 gange under anvendelse af 5 ml pipetter og filtreret gennem en 70 µm cellesi (BD, 352350). Den resulterende enkeltcellesuspension blev centrifugeret ved 300 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. En 30 % PercollTM (GE Healthcare, Madrid, Spanien, 17-0891-01) gradient blev brugt til at fjerne myelin og berige homogenatet til levedygtige gliaceller. Til dette formål blev en stamopløsning af isotonisk Percoll (SIP) fremstillet (9:1 Percoll i 10× HBSS [-]CaCl2/[-]MgCl2; Gibco, 14185), og cellepelleter blev resuspenderet i 30 % (v/ v) SIP (i 1× HBSS). 30 % Percoll-gradienten blev udført ved at tilsætte 3 mL SIP til 7 mL 1 x HBSS indeholdende cellesuspensionen i et 14 mL polypropylenrør. Hver gradient blev centrifugeret uden bremse ved 300 x g i 30 minutter ved 18 ◦C. Efter centrifugering blev cellerne fra bundlaget opsamlet, vasket med 1 x HBSS, centrifugeret i 10 minutter ved 300 x g og resuspenderet i 10 ml 1 x lyseringsbuffer for røde blodlegemer ved 4 ◦C. Efter lysis blev cellesuspensionen centrifugeret ved 300 x g i 10 minutter, og den resulterende cellepellet blev til sidst resuspenderet i 50 µL blokerende buffer før farvning til flowcytometri.

4.3.2. Miltcelle-dissociation

Milte blev anbragt på en petriskål indeholdende RPMI 1640 og skåret i små stykker. Det resulterende væv blev ført ind i en 70 µm cellesi (BD, 352350) og brudt op i en cirkulær bevægelse med den ribbede top af en sprøjtes stempel. RPMI 1640 blev derefter ført gennem sigten. Det disintegrerede væv blev overført til 50 ml rør (Sarstedt, Barcelona, ​​Spanien, 62.547.254) og centrifugeret ved 100 g i 10 minutter. Supernatanten indeholdende cellesuspensionen blev derefter opsamlet og centrifugeret igen ved 300 g i 10 min. Den resulterende supernatant blev fjernet, og pelleten blev resuspenderet i 10 ml phosphatpufret saltvand (PBS) med 1 % FBS for at tælle antallet af celler under mikroskopet, hvorefter det blev re-centrifugeret ved 300 g i 5 minutter. Der blev kun brugt 500,000 celler pr. prøve. Hver prøve blev derefter resuspenderet i 50 µL blokerende buffer før farvning til flowcytometri.

4.3.3. Ekstracellulær flowcytometri farvning

Tabel 2. Antistoffer og reagenser anvendt til flowcytometrianalyse.

4.4. Immunhistokemi

Mus blev dybt bedøvet og intrakardialt perfunderet med saltvand {{0}},9 % (vægt/volumen). Deres hjerner blev opsamlet og efterfikseret med 4% paraformaldehyd i 24 timer. Efter postfiksering blev de kryobeskyttet med 30% saccharose og frosset ved -20 ◦C indtil sektionering. Vævssektioner (20 µm) blev skåret ved hjælp af en kryostat (ThermoFisher, Microm™ HM550), tø monteret på Superfrost Plus-objektglas (ThermoFisher, J1800AMNZ) og til sidst opbevaret ved -20 ◦C indtil farvning. Immunhistokemisk farvning af vævssnit blev udført som beskrevet før [67]. Primære og sekundære antistofopløsninger blev fortyndet i 1 x PBS med 1 % BSA. Sektionerne blev inkuberet med det primære antistof anti-kanin Iba-1 (1:500 fortynding; Wako Chemicals, Barcelona, ​​Spanien, 019-19741). Alexa Fluor 488-konjugeret gede-anti-kanin IgG (1:2000 fortynding; ThermoFisher, Madrid, Spanien, A11031) blev brugt som det sekundære antistof. Passende positivt kontrolvæv blev inkluderet, såvel som primære og sekundære negative kontroller. Fluorescerende mærkningsbilleder blev erhvervet ved hjælp af en ZEISS Apotome. 2 mikroskop med et axiom 503 mono digitalkamera og Zen Blue kontrolsoftware version 2.3 (Carl Zeiss). Et 10× objektiv (Plan-APOCHROMAT, V10×, NA 0,45, AIR) blev brugt til at visualisere hippocampus. Den integrerede tæthed inden for områderne af interesse blev beregnet med ImageJ-software. Denne parameter svarer til summen af ​​intensitetsværdierne for hver pixel i det valgte område. Derfor bruges den til kvantificering af antallet af farvede celler i kombination med farvningsintensiteten af ​​hver celle.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

4.5. Western Blot Analyse

Musehjerner blev hurtigt fjernet, og hippocampi blev straks dissekeret og frosset. Væv blev fremstillet under anvendelse af en hypertonisk lysisbuffer indeholdende proteaseinhibitorer som tidligere beskrevet [68]. De primære anvendte antistoffer var anti-kanin phosphor-IKK / (1:1000 fortynding; Cell Signaling, Alcobendas, Spanien, 2861), anti-kanin IKK / (1:1000 fortynding; Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Tyskland, sc{{ 9}}), anti-kanin phosphor-STAT3 (1:1000 fortynding; Cell Signaling, 9145) og anti-mus STAT3 (1:1000 fortynding; Santa Cruz Biotechnology, sc-8019). Anti-muse-tubulin (1:2000 fortynding; Santa Cruz Biotechnology, sc-32293) blev anvendt som en ladningskontrol. Anti-kanin HRP (1:5000 fortynding; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Baltimore, USA, 111-035-144) og anti-muse HRP (1:5000 fortynding; Jackson ImmunoResearch Laboratories, 115-035-003) blev brugt som sekundære antistoffer . Proteinbåndkvantificering blev udført ved bånddensitometrianalyse med NIH ImageJ Software (Version 1.50i, https://imagej.nih.gov/ij/, tilgængelig den 1. marts 2022). For at sikre ens belastninger blev den integrerede tæthed opnået for hvert bånd udtrykt som en relativ værdi i forhold til den passende husholdningsbelastningskontrol.

4.6. Statistisk analyse

Resultaterne blev statistisk analyseret med GraphPad Prism-softwaren (San Diego, CA, USA). Data præsenteres som middelværdi ± standardfejl af middelværdien (SEM) af generelt fire uafhængige eksperimenter (n {{0}}–9). Efter bekræftelse af den normale fordeling af data ved Shapiro-Wilk-testen, blev statistisk signifikans mellem de to grupper bestemt ved Student t-testen for parametriske data. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikante, når sandsynlighedsværdier (p) var mindre end 0.05 (*), 0,01 (**) eller 0,001 (***). Figurer viser repræsentative eksperimenter.

5. Konklusioner

Sammenfattende indikerer vores resultater, at manglende inaktivering af GSK3 ved Ser389-phosphorylering fører til kronisk inflammation og endotoksin-tolerance, og at inhiberingen af ​​GSK3 ved Ser9 og Ser389-phosphorylering spiller komplementære og ikke overflødige roller i det neuroimmune respons. Derfor bør de specifikke konsekvenser af GSK3 Ser389-phosphorylering for neuropatologi og hjernealdring undersøges.

Referencer

1. Souder, DC; Anderson, RM Et ekspanderende GSK3-netværk: Implikationer for aldringsforskning. Geroscience 2019, 41, 369-382. [CrossRef] [PubMed]

2. Hoeflich, KP; Luo, J.; Rubie, EA; Tsao, M.; Jin, O.; Woodgett, JR Krav til glykogensyntasekinase-3 i celleoverlevelse og NF-KB-aktivering. Nature 2000, 406, 86–90. [CrossRef] [PubMed]

3. Jope, RS; Johnson, GV Glykogensyntasekinases glamour og dysterhed-3. Trends Biochem. Sci. 2004, 29, 95-102. [CrossRef]

4. Thornton, TM; Pedraza-Alva, G.; Deng, B.; Træ, CD; Aronshtam, A.; Clements, JL; Sabio, G.; Davis, RJ; Matthews, DE; Doble, B.; et al. Fosforylering af p38 MAPK som en alternativ vej for GSK3beta-inaktivering. Science 2008, 320, 667-670. [CrossRef]

5. Calvo, B.; Thornton, TM; Rincon, M.; Tranque, P.; Fernandez, M. Regulering af GSK3 ved Ser 389-phosphorylering under neural udvikling. Mol. Neurobiol. 2020, 58, 809-820. [CrossRef] [PubMed]

6. Thornton, TM; Hare, B.; Colié, S.; Pendlebury, WW; Nebreda, AR; Falls, W.; Jaworski, DM; Rincon, M. Failure to Inactivate Nuclear GSK3 by Ser 389-Fosforylering fører til fokal neuronal død og langvarig frygtrespons. Neuropsychopharmacology 2018, 43, 393-405. [CrossRef] [PubMed]

7. Hare, BD; Thornton, TM; Rincon, M.; Golijanin, B.; King, SB; Jaworski, DM; Falls, WA To ugers variabel stress øger gamma-H2AX-niveauer i muselejekernen i stria terminalis. Neurovidenskab 2018, 373, 137-144. [CrossRef]

8. Thornton, TM; Delgado, P.; Chen, L.; Salas, B.; Krementsov, D.; Fernandez, M.; Vernia, S.; Davis, RJ; Heimann, R.; Teuscher, C.; et al. Inaktivering af nuklear GSK3beta ved Ser (389)-phosphorylering fremmer lymfocytfitness under DNA-dobbeltstrengsbrudrespons. Nat. Commun. 2016, 7, 10553. [CrossRef]

9. Pasparakis, M.; Vandenabeele, P. Necroptosis og dens rolle i inflammation. Natur 2015, 517, 311–320. [CrossRef]

10. Jope, RS; Cheng, Y.; Lowell, JA; Worthen, RJ; Sitbon, YH; Beurel, E. Stresset og betændt, kan GSK3 bebrejdes? Trends Biochem. Sci. 2017, 42, 180-192. [CrossRef]

11. Beutler, B.; Rietschel, ET Medfødt immunfornemmelse og dens rødder: Historien om endotoksin. Nat. Rev. Immunol. 2003, 3, 169-176. [CrossRef] [PubMed]

12. Morris, MC; Gilliam, EA; Button, J.; Li, L. Dynamisk modulering af medfødt immunrespons ved at variere doser af lipopolysaccharid (LPS) i humane monocytiske celler. J. Biol. Chem. 2014, 289, 21584-21590. [CrossRef]

13. Lu, YC; Ja, toilet; Ohashi, PS LPS/TLR4 signaltransduktionsvej. Cytokine 2008, 42, 145-151. [CrossRef] [PubMed]

14. Ko, R.; Jang, HD; Lee, SY GSK3-hæmmerpeptid beskytter mus mod LPS-induceret endotoksinchok. Immunnetw. 2010, 10, 99. [CrossRef] [PubMed]

15. Piazzi, M.; Bavelloni, A.; Cenni, V.; Faenza, I.; Blalock, WL Genbesøger rollen som GSK3, en modulator af medfødt immunitet, i idiopatisk inklusionskropsmyositis. Cells 2021, 10, 3255. [CrossRef] [PubMed]

16. Vines, A.; Cahoon, S.; Goldberg, I.; Saxena, U.; Pillarisetti, S. Ny anti-inflammatorisk rolle for glykogensyntase kinase-3beta i hæmningen af ​​tumornekrosefaktor-alfa- og interleukin-1beta-induceret inflammatorisk genekspression. J. Biol. Chem. 2006, 281, 16985-16990. [CrossRef]

17. Hoffmeister, L.; Diekmann, M.; Brand, K.; Huber, R. GSK3: En Kinase-balancerende fremme og opløsning af inflammation. Celler 2020, 9, 820. [CrossRef]

18. Beurel, E.; Jope, RS Lipopolysaccharid-induceret interleukin-6 produktion styres af glykogensyntase kinase-3 og STAT3 i hjernen. J. Neuroinflamm. 2009, 6, 9. [CrossRef]

19. Wang, M.; Huang, H.; Chen, W.; Chang, H.; Kuo, J. Glykogensyntasekinase-3-inaktivering hæmmer tumornekrosefaktorproduktion i mikroglia ved at modulere nuklear faktor κB og MLK3/JNK-signaleringskaskader. J. Neuroinflamm. 2010, 7, 99. [CrossRef]

20. Priego, N.; Valiente, M. Astrocytternes potentiale som immunmodulatorer i hjernetumorer. Foran. Immunol. 2019, 10, 1314. [CrossRef]

21. Vandenbark, AA; Offner, H.; Matejuk, S.; Matejuk, A. Microglia og astrocyt involvering i neurodegeneration og hjernekræft. J. Neuroinflamm. 2021, 18, 298. [CrossRef] [PubMed]

22. Lucas, JJ; Hernandez, F.; Gomez-Ramos, P.; Moran, MA; Hen, R.; Avila, J. Nedsat nuklear beta-catenin, tau hyperphosphorylation og neurodegeneration i GSK-3beta betingede transgene mus. EMBO J. 2001, 20, 27-39. [CrossRef] [PubMed]

23. Jorge-Torres, OC; Szczesna, K.; Roa, L.; Casal, C.; Gonzalez-Somermeyer, L.; Soler, M.; Velasco, CD; Martinez-San Segundo, P.; Petazzi, P.; Saez, MA; et al. Hæmning af Gsk3b reducerer Nfkb1-signalering og redder synaptisk aktivitet for at forbedre Rett-syndrom-fænotypen i Mecp2-knockout-mus. Celle. Rep. 2018, 23, 1665-1677. [CrossRef] [PubMed]

24. Martin, M.; Rehani, K.; Jope, RS; Michalek, SM Toll-lignende receptor-medieret cytokinproduktion er differentielt reguleret af glykogensyntase kinase. Nat. Immunol. 2005, 6, 777-784. [CrossRef]

25. Rippin, I.; Eldar-Finkelman, H. Mekanismer og terapeutiske implikationer af GSK-3 i behandling af neurodegeneration. Cells 2021, 10, 262. [CrossRef]

26. Androulidaki, A.; Iliopoulos, D.; Arranz, A.; Doxaki, C.; Schworer, S.; Zacharioudaki, V.; Margioris, AN; Tsichlis, PN; Tsatsanis, C. Kinasen Akt1 kontrollerer makrofagrespons på lipopolysaccharid ved at regulere mikroRNA'er. Immunitet 2009, 31, 220-231. [CrossRef]

27. Fichtner-Feigl, S.; Kesselring, R.; Martin, M.; Obermeier, F.; Ruemmele, P.; Kitani, A.; Brunner, SM; Haimerl, M.; Geissler, EK; Strober, W. IL -13 orkestrerer opløsning af kronisk tarmbetændelse via phosphorylering af glykogensyntase kinase-3. J. Immunol. 2014, 192, 3969-3980. [CrossRef]

28. Nagao, M.; Hayashi, H. Glycogensyntase kinase-3beta er forbundet med Parkinsons sygdom. Neurosci. Lett. 2009, 449, 103-107. [CrossRef]

29. Nadri, C.; Kozlovsky, N.; Agam, G.; Bersudsky, Y. GSK-3-parametre i lymfocytter hos skizofrene patienter. Psykiatri Res. 2002, 112, 51-57. [CrossRef]

30. Jope, RS; Yuskaitis, CJ; Beurel, E. Glycogensyntase kinase-3 (GSK3): Inflammation, sygdomme og terapeutiske midler. Neurochem. Res. 2007, 32, 577-595. [CrossRef]

31. Calvo, B.; Rubio, F.; Fernandez, M.; Tranque, P. Dissociation af neonatale og voksne musehjerne til samtidig analyse af mikroglia, astrocytter og infiltrerende lymfocytter ved flowcytometri. IBRO Rep. 2020, 8, 36-47. [CrossRef] [PubMed]

32. Legroux, L.; Pittet, CL; Beauseigle, D.; Deblois, G.; Prat, A.; Arbour, N. En optimeret metode til at behandle musens CNS til samtidigt at analysere neurale celler og leukocytter ved flowcytometri. J. Neurosci. Metoder 2015, 247, 23-31. [CrossRef] [PubMed]

33. Batiuk, MY; de Vin, F.; Duque, SI; Li, C.; Saito, T.; Saido, T.; Fiers, M.; Belgard, TG; Holt, MG En immunoaffinitetsbaseret metode til isolering af ultrarene voksne astrocytter baseret på ATP1B2-målretning af ACSA-2-antistoffet. J. Biol. Chem. 2017, 292, 8874-8891. [CrossRef] [PubMed]

34. Stevens, SL; Bao, J.; Hollis, J.; Lessov, NS; Clark, WM; Stenzel-Poore, MP Anvendelse af flowcytometri til at evaluere tidsmæssige ændringer i inflammatoriske celler efter fokal cerebral iskæmi hos mus. Brain Res. 2002, 932, 110-119. [CrossRef] [PubMed]

35. Kantzer, CG; Boutin, C.; Herzig, ID; Wittwer, C.; Reiss, S.; Tiveron, MC; Drewes, J.; Rockel, TD; Ohlig, S.; Ninkovic, J.; et al. Anti-ACSA-2 definerer et nyt monoklonalt antistof til prospektiv isolering af levende neonatale og voksne astrocytter. Glia 2017, 65, 990-1004. [CrossRef]

36. Moreno-García, Á.; Bernal-Chico, A.; Colomer, T.; Rodríguez-Antigüedad, A.; Matute, C.; Mato, S. Genekspressionsanalyse af astrocyt- og mikroglia-endocannabinoid-signalering under autoimmun demyelinisering. Biomolecules 2020, 10, 1228. [CrossRef] [PubMed]

37. Deniset, JF; Surewaard, BG; Lee, W.; Kubes, P. Splenic Ly6Ghigh modne og Ly6Gint umodne neutrofiler bidrager til udryddelse af S. pneumoniae. J. Exp. Med. 2017, 214, 1333-1350. [CrossRef]

38. Ng, HHM; Lee, RY; Goh, S.; Tay, ISY; Lim, X.; Lee, B.; Chew, V.; Li, H.; Tan, B.; Lim, S.; et al. Immunhistokemisk scoring af CD38 i tumormikromiljøet forudsiger respons på anti-PD-1/PD-L1 immunterapi i hepatocellulært karcinom. J. Immunother. Kræft 2020, 8, e000987. [CrossRef]

39. Okuyama, S.; Makihata, N.; Yoshimura, M.; Asakura, Y.; Yoshida, T.; Nakajima, M.; Furukawa, Y. Oenothein B undertrykker lipopolysaccharid (LPS)-induceret inflammation i musehjernen. Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 9767-9778. [CrossRef]

40. Carnevale, D.; Mascio, G.; Ajmone-Cat, MA; D'Andrea, I.; Cifelli, G.; Madonna, M.; Cocozza, G.; Frati, A.; Carullo, P.; Carnevale, L.; et al. Rolle af neuroinflammation i hypertension-induceret hjerne amyloid patologi. Neurobiol. Aldring 2012, 33, e19–e205. [CrossRef]

41. Zhang, J.; Xue, B.; Jing, B.; Tian, ​​H.; Zhang, N.; Li, M.; Lu, L.; Chen, L.; Diao, H.; Chen, Y. LPS aktiverer neuroinflammatoriske veje for at inducere depression i Parkinsons sygdomslignende tilstand. Foran. Pharmacol. 2022, 13, 961817. [CrossRef] [PubMed] 4

2. Tarr, AJ; Chen, Q.; Wang, Y.; Sheridan, JF; Quan, N. Neurale og adfærdsmæssige reaktioner på lavgradig inflammation. Opfør dig. Brain Res. 2012, 235, 334-341. [CrossRef] [PubMed]

43. Kang, J.; Park, D.; Shah, M.; Kim, M.; Koh, P. Lipopolysaccharide inducerer neuroglia-aktivering og NF-KB-aktivering i hjernebarken hos voksne mus. Lab. Anim. Res. 2019, 35, 19. [CrossRef]

44. Khan, MS; Ali, T.; Abid, MN; Jo, MH; Khan, A.; Kim, MW; Yoon, GH; Cheon, EW; Rehman, SU; Kim, MO Lithium forbedrer lipopolysaccharid-induceret neurotoksicitet i cortex og hippocampus i den voksne rottehjerne. Neurochem. Int. 2017, 108, 343-354. [CrossRef] [PubMed]

45. Paxinos, G.; Franklin, KB Musehjerne i stereotaksiske koordinater. 2001. Tilgængelig online: https://books.google.es/books/ about/The_Mouse_Brain_in_Stereotaxic_Coordinat .html?id=tZdjQgAACAAJ&redir_esc=y (tilgået den 1. marts 2022).

46. ​​Bronte, V.; Pittet, MJ Milten i lokal og systemisk regulering af immunitet. Immunitet 2013, 39, 806-818. [CrossRef]

47. Liu, T.; Zhang, L.; Joo, D.; Sun, S. NF-KB-signalering ved inflammation. Signaltransdukt. Mål. Ther. 2017, 2, 17023. [CrossRef] [PubMed]

48. Balic, JJ; Albargy, H.; Luu, K.; Kirby, FJ; Jayasekara, WSN; Mansell, F.; Garama, DJ; De Nardo, D.; Baschuk, N.; Louis, C. STAT3 serinphosphorylering er påkrævet til TLR4 metabolisk omprogrammering og IL-1-ekspression. Nat. Commun. 2020, 11, 3816. [CrossRef]

49. Hongisto, V.; Vainio, JC; Thompson, R.; Courtney, MJ; Coffey, ET Wnt-puljen af ​​glykogensyntasekinase 3beta er afgørende for trofisk-deprivation-induceret neuronal død. Mol. Celle. Biol. 2008, 28, 1515-1527. [CrossRef]

50. Eom, T.; Jope, RS Blokeret inhiberende serin-phosphorylering af glycogensyntase kinase-3 / svækker in vivo neurale precursorcelleproliferation. Biol. Psykiatri 2009, 66, 494-502. [CrossRef] 5

1. Franceschi, C.; Campisi, J. Kronisk inflammation (inflammation) og dens potentielle bidrag til aldersrelaterede sygdomme. J. Gerontol. Ser. En Biomed. Sci. Med. Sci. 2014, 69, S4–S9. [CrossRef]

52. Enioutina, EY; Bareyan, D.; Daynes, RA En rolle for umodne myeloidceller i immunforældelse. J. Immunol. 2011, 186, 697-707. [CrossRef] [PubMed]

53. Tang, Y.; Le, W. Differentielle roller af M1 og M2 mikroglia i neurodegenerative sygdomme. Mol. Neurobiol. 2016, 53, 1181-1194. [CrossRef] [PubMed]

54. Hoogland, IC; Houbolt, C.; van Westerloo, DJ; van Gool, WA; van de Beek, D. Systemisk inflammation og mikroglial aktivering: Systematisk gennemgang af dyreforsøg. J. Neuroinflamm. 2015, 12, 114. [CrossRef] [PubMed]

55. Furube, E.; Kawai, S.; Inagaki, H.; Takagi, S.; Miyata, S. Hjerneregionsafhængig heterogenitet og dosisafhængig forskel i forbigående mikroglia-populationsstigning under Lipopolysaccharid-induceret inflammation. Sci. Rep. 2018, 8, 2203. [CrossRef]

56. Brandi, E.; Torres-Garcia, L.; Svanbergsson, A.; Haikal, C.; Liu, D.; Li, W.; Li, J. Hjerneregionsspecifik mikroglial og astrocytisk aktivering som reaktion på systemisk eksponering af lipopolysaccharider. Foran. Aldrende Neurosci. 2022, 14, 910988. [CrossRef]

57. Radulovic, K.; Mak'Anyengo, R.; Kaya, B.; Steinert, A.; Niess, JH Injektioner af lipopolysaccharid i mus for at efterligne indgang af mikrobielt afledte produkter efter brud på tarmbarrieren. J. Vis. Exp. 2018, 135, e57610. [CrossRef]

58. Fink, MP Dyremodeller af sepsis. Virulens 2014, 5, 143-153. [CrossRef]

59. Zhou, H.; Andonegui, G.; Wong, CH; Kubes, P. Endotelial TLR4's rolle til neutrofil rekruttering til mikrokar i centralnervesystemet ved systemisk inflammation. J. Immunol. 2009, 183, 5244-5250. [CrossRef]

60. Beurel, E. HDAC6 regulerer LPS-tolerance i astrocytter. PLoS ONE 2011, 6, e25804. [CrossRef]

61. Yao, L.; Li, P.; Chen, Q.; Hu, A.; Wu, Y.; Li, B. Beskyttende virkninger af endotoksin-tolerance på perifer lipopolysaccharid-induceret neuroinflammation og dopaminerg neuronal skade. Immunopharmacol. Immunotoxikol. 2022, 44, 326-337. [CrossRef] 62. Park, SH; Park-Min, KH; Chen, J.; Hu, X.; Ivashkiv, LB Tumornekrosefaktor inducerer GSK3-kinase-medieret krydstolerance over for endotoksin i makrofager. Nat. Immunol. 2011, 12, 607-615. [CrossRef] [PubMed]

63. Yamawaki, Y.; Shirawachi, S.; Mizokami, A.; Nozaki, K.; Ito, H.; Asano, S.; Oue, K.; Aizawa, H.; Yamawaki, S.; Hirata, M. Phospholipase C-relateret katalytisk inaktivt protein regulerer lipopolysaccharid-induceret hypothalamus inflammation medieret anoreksi i mus. Neurochem. Int. 2019, 131, 104563. [CrossRef] [PubMed]

64. Shah, SA; Khan, M.; Jo, M.; Jo, MG; Amin, FU; Kim, MO Melatonin stimulerer SIRT 1/Nrf2-signalvejen, der modvirker lipopolysaccharid (LPS)-induceret oxidativ stress for at redde postnatal rottehjerne. CNS Neurosci. Ther. 2017, 23, 33-44. [CrossRef] [PubMed]

65. Cho, YJ; Lee, YA; Lee, JW; Kim, JI; Han, JS Kinetik af proinflammatoriske cytokiner efter intraperitoneal injektion af tribromethanol og en tribromethanol/xylazin-kombination i ICR-mus. Lab. Anim. Res. 2011, 27, 197-203. [CrossRef] [PubMed]

66. Posel, C.; Møller, K.; Boltze, J.; Wagner, DC; Weise, G. Isolering og flowcytometrisk analyse af immunceller fra den iskæmiske musehjerne. J. Vis. Exp. 2016, 108, 53658. [CrossRef] [PubMed]

67. Serrano-Perez, MC; Martin, ED; Vaquero, CF; Azcoitia, I.; Calvo, S.; Cano, E.; Tranque, P. Respons af transkriptionsfaktor NFATc3 på excitotoksiske og traumatiske hjernefornærmelser: Identifikation af en underpopulation af reaktive astrocytter. Glia 2011, 59, 94-107. [CrossRef]

68. Fradejas, N.; Serrano-Perez Mdel, C.; Tranque, P.; Calvo, S. Selenoprotein S-ekspression i reaktive astrocytter efter hjerneskade. Glia 2011, 59, 959-972. [CrossRef]