Guy JM Cameron, et al

Akut nyreskade(AKI) kan være dødelig og er en veldefineret risikofaktor for udvikling afkronisknyresygdom. Gruppe 2 medfødte lymfoide celler (ILC2'er) er medfødte producenter af type -2 cytokiner og er kritiske regulatorer af homeostase i perifere organer. Men vores viden om deres funktion inyreer relativt begrænset. Nylige beviser tyder på, at øget ILC2-tal ved systemisk administration af rekombinant interleukin (IL)-25 eller IL-33 beskytter mod nyreskade. Mens ILC2'er kan induceres til at beskytte mod iskæmisk eller kemisk-induceret AKI, er virkningen af ​​ILC2-mangel eller -depletering på sværhedsgraden af ​​nyreskaden ukendt. For det første fænotypen og placeringen af ​​ILC2'er inyreblev vurderet under homøostatiske forhold.NyreILC2'er udtrykte konstitutivt høje niveauer af IL-5 og var lokaliseret i umiddelbar nærhed af den renale vaskulatur. For at teste den funktionelle rolle af ILC2'er inyre, blev der brugt en eksperimentel model for nyreiskæmi-reperfusionsskade (IRI), og sværhedsgraden af ​​skaden blev vurderet i vildtype, ILC2-reduceret, ILC2-deficient og ILC{{4} }udtømte mus. Overraskende nok var der ingen forskelle i histopatologi, kollagenaflejring eller mRNA-ekspression af skadesassocierede (Lcn2), inflammatoriske (Cxcl1, Cxcl2 og Tnf) eller ekstracellulære matrixfaktorer (Col1a1, Fn1) efter IRI i fravær af ILC2'er. Disse data tyder på, at fraværet af ILC2'er ikke ændrer sværhedsgraden afnyreskade, hvilket tyder på mulig redundans. Derfor kompenserer andre mekanismer af typen 2-medieret immuncelleaktivering sandsynligvis i fravær af ILC2'er. Derfor er det usandsynligt, at et tab af ILC2'er øger modtageligheden for eller sværhedsgraden af ​​AKI.

Nøgleord:ILC2, gruppe 2 medfødt lymfoid celle, IL-5, IL-13,nyre, nyre, IRI, iskæmi-reperfusionsskade

For mere information kontakt venligst:emily.li@wecistanche.com

Cistanche tubulosa forebygger nyresygdom, klik her for at få prøven

INTRODUKTION

Akut nyreskade(AKI) og dets associerede patologier har dybtgående virkninger på menneskers sundhed (1). En almindelig årsag til AKI er renal iskæmi, som primært påvirker det tubulære epitel på grund af den høje mitokondrielle tæthed og metaboliske aktivitet i disse celler (2); anmeldt i Devarajan (3) og Bonventre og Yang (4). Akut tubulær nekrose svækker affaldsudskillelse, ændrer vand- og elektrolyt-ubalance og forårsager robuste inflammatoriske reaktioner; anmeldt i Bonventre og Yang (4). Tilstrømningen af ​​neutrofiler og monocytter bidrager til skaden, men andre medfødte immunceller kan lette tilbagevenden til homeostase (5); anmeldt i Friedewald og Rabb (6). Medfødte lymfoide celler (ILC'er) er en nylig tilføjelse til denne familie og er kategoriseret i 3 grupper baseret på de transkriptionsfaktorer, der er nødvendige for deres udvikling og af de effektorcytokiner, de producerer (7). Gruppe 2 ILC'er (ILC2'er) er potente producenter af type 2 cytokiner, overvejende interleukin (IL)-5 og IL-13 (8, 9). Disse celler fremmer også vævsgendannelse efter fornærmelse i flere organer og har forskellige funktioner in vivo (10). For eksempel, efter respiratorisk viral infektion med influenzavirus, koordinerer ILC2'er reparation af luftvejsepitelet ved at producere vækstfaktoren amphiregulin (AREG) (11). For nylig er ILC2'er blevet undersøgt i modeller for nyreskade, herunder iskæmi-reperfusionsskade (IRI) og nefrotoksisk kemisk-induceret skade med doxorubicin eller cisplatin (12-16). Renal IRI opnås typisk ved midlertidigt at begrænse blodgennemstrømningen til nyren i 20-30 minutter, modellering af traumer fra transplantation eller kirurgisk indgreb (17-21). Samlet viser disse undersøgelser, at in vivo-administration af rekombinante musecytokiner, der aktiverer ILC2'er, nemlig IL-25 eller IL-33, er tilstrækkelig til at reducere sværhedsgraden af ​​tubulær epitelcelleskade (12-16). Lignende resultater er opnået med adoptiv overførsel af ex vivo aktiverede ILC2'er (12, 15). Mens ILC2'er kunstigt kan induceres til at proliferere og beskytte mod de skadelige konsekvenser af eksperimentel nyreskade, er virkningen af ​​ILC-2-mangel stadig ufuldstændig forstået. Faktisk er andre immunceller, som har komplekse interaktioner med ILC2'erne, såsom regulatoriske T-celler (Treg) og alternativt aktiverede makrofager (AAM; også kendt som M2) kritiske for denne genbeskyttende effekt (22-25). I denne undersøgelse søgte vi yderligere at karakterisere ILC2'er i nyrerne, deres placering i dette organ og bestemme deres funktionelle rolle i IRI ved hjælp af en funktionstabstilgang. Her fandt vi detnyreILC2'er udtrykker konstitutivt IL- 5 og er primært placeret i umiddelbar nærhed af den renale vaskulatur i adventitia. Derudover viser vi, at en reduktion, mangel eller udtømning af ILC2'er havde minimal indvirkning på sværhedsgraden af ​​IRI. Mens aktivering af ILC2'er og den associerede amplifikation af lokal type 2-immunitet tidligere har vist sig at reducere de skadelige konsekvenser af AKI, afslører vores resultater, at sammenlignelig skade opstår i fravær af ILC2'er, hvilket tyder på, at ILC2'er kan være overflødige i IRI, når andre kompenserende immunforsvar celler såsom T-celler er til stede.

MATERIALER OG METODER

Mus

Otte til tolv uger gammel han vildtype (WT; C57BL/6JAusb), vehikel (saltvandsbehandlet Icosdtr/ plus Cd4cre/ plus ), ILC2-reduceret (Roraflfl/ plus Il7rcre/ plus ), ILC{{ 8}}deficient (Roraflfl/flfl Il7rcre/ plus ), ILC2- udtømt (Difteritoksoid-behandlet [DTx] Icosdtr/ plus Cd4cre/ plus ), og IL-5/IL-13 dobbeltreportermus (Il5venus/plus Il13td tomat/plus)-mus blev opnået fra Australian Bioresources (Moss Vale, Australien). Il5td tomatCre; Rosa26-CAG-RFP reporter-tracker-mus blev opnået fra Jackson Labs (ref# 030926 og 007914). Alle mus, der gennemgik operation, blev anbragt under specifikke patogenfrie, fysiske indeslutningsforhold 2 i individuelt ventilerede bure. Mus blev udsat for normal rumluft i et steriliseret miljø under operationen. Mus fik lov til at akklimatisere sig i 1 uge, før eksperimenter blev startet, og de blev holdt på en 12-h dag/nat-cyklus med adgang til standard laboratoriefoder og vand ad libitum.

Flowcytometri og t-SNE-analyse

Nyrerog lunger blev opsamlet fra reportermus. Enkeltcellesuspensioner blev fremstillet som beskrevet i "Fremstilling af enkeltcellesuspensioner fra muselunge med Collagenase D-behandling" (Miltenyi Biotec GmbH, 2008; Bergisch Gladbach, Tyskland). Celler blev blokeret med Fc-blok (oprenset anti-mus CD16/32; Biolegend, San Diego, USA) i 30 minutter og farvet med fluorescenskonjugerede antistoffer mod målcelleoverfladeantigener (Supplerende tabel 1). Farvnings- og vasketrin blev udført med BSA-farvningsbuffer (BD Biosciences, North Ryde, Australien). Prøver blev erhvervet på et BD LSR Fortessa X20 flowcytometer. Flowcytometridata blev analyseret under anvendelse af FlowJo v10.5.3 (Tree Star, Ashland, USA). Den t-distribuerede stokastiske naboindlejring (t-SNE) blev udført på ILC2'er (CD45 plus Lineage [TCR [TCR TCR δ CD8 CD4 ]CD11b GR-1 B220 TER-119 CD3 NK-1 .1] IL7R plus CD90.2 plus ST2 plus FSClowSSClow enkeltceller). Ved at bruge det tilfældige ned-sampling-plugin blev antallet af hændelser i hver prøve normaliseret til at svare til den laveste, rundet ned til de nærmeste 10 hændelser. Alle populationer blev kombineret til én .fcs-fil ved at sammenkæde de nedsamplede populationer. t-SNE-analysen blev udført på den sammenkædede prøve indeholdende de lukkede populationer fra alle nyre- og lungeprøver kombineret. Til dette blev de kompenserede kanaler, der ikke blev brugt til gating, vurderet under følgende t-SNE-indstillinger: Iteration 1000, Perplexity 20, Eta 224. Histogrammer blev brugt til at vise den differentielle ekspression af celleoverfladeantigener og cytokiner i lungen ognyre

Immunfluorescens Il5td tomatCre; Rosa26-CAG-RFP reporter-tracker-mus blev aflivet og perfunderet intrakardialt med fosfatbufret saltvand (PBS) og derefter 4 procent paraformaldehyd (PFA) i PBS. Nyrerne blev fjernet og holdt i frisk 4 procent PFA i 24 timer ved 4◦C og derefter vasket i PBS. Tre hundrede mikrometer sektioner blev fremstillet under anvendelse af en vibratom. Efterfølgende blev vævssnit inkuberet i permeabiliseringsbuffer (PBS/0,2 procent Triton X-100/0,3M glycin) og derefter blokeret i PBS/0,2 procent Triton X- 100/5 procent æselserum ved 4◦C natten over. Prøver blev vasket i PBS/0,2 procent Tween-20 én gang og derefter inkuberet med primære antistoffer fortyndet i PBS/0,2 procent Tween-20/3 procent æselserum ved stuetemperatur til næste dag. Derefter blev prøver vasket i PBS/0.2 procent Tween-20 i 30 min, 3-4 gange, derefter inkuberet med sekundære antistoffer fortyndet i PBS/0 0,2 procent Tween-20/3 procent æselserum ved stuetemperatur i 6-8 timer. Prøver blev vasket i PBS/0,2 procent Tween-20 i 1 dag og derefter dehydreret i en stigende ethanolserie (20, 30, 50, 70, 95, 100 procent), 10 minutter hvert trin . Til sidst blev nyresektioner renset ved gennemblødsætning i methylsalicylat (M-2047; Sigma-Aldrich, Castle Hill, Australien) og derefter monteret i frisk methylsalicylat på et konkavt dækglas eller kammer. Billeder blev taget med Nikon A1R laserscanning konfokal inklusive 405, 488, 561 og 650 laserlinjer til excitation og billeddannelse med 16X/0,8 eller 25X1,1, NA Plan Apo langtidsholdbare vandnedsænkningsobjektiver. Z trin blev erhvervet for hver 6 µm. Billeder blev behandlet med ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) og Bitplane Imaris software v8 (Andor Technology PLC, Belfast, N. Ireland). Overfladerekonstruktioner af alfa-glat muskel actin-mærkede blodkar blev udført med Imaris og pseudofarvet baseret på deres karakteristiske arkitektur og volumen for at visualisere store arterier og vener. Følgende antistoffer og fortyndinger blev brugt: Living Colors anti-DsRed Rabbit polyklonalt panantistof (1:500; TaKaRa, Mountain View, USA), gede polyklonalt anti-alfa-glat muskel actin-antistof (1:200; Abcam, Cambridge, UK) ), eFluor 660 LYVE1 monoklonalt antistof (1:300, klon ALY7, eBioscience), armensk hamster anti-mus CD3 antistof (1:100, klon 145-2C11, Biolegend), Alexa Fluor R 488 æsel anti-ged IgG (H plus L), Alexa Fluor R 555 æsel anti-kanin IgG (H plus L) Alexa Fluor R 647 gede anti-hamster IgG (H plus L) krydsadsorberet (1:400, ThermoFisher Scientific).

Unilateral iskæmi-reperfusionsskade

Kirurgisk anæstesi blev induceret af 4 procent isofluraninhalation og opretholdt med kontinuerlig 1-1,5 procent isofluraninhalation gennem en næsekegle. Under hele proceduren blev mus holdt på en kirurgisk platform holdt ved 37 ± 1◦C af en digital termostatstyret varmemåtte. Nefrektomi af højre nyre blev udført hos alle dyr. For at inducere unilateral iskæmi blev karrene i den venstre nyre klemt fast nær nyrepedikelen i 29-min. ved hjælp af en ikke-traumatisk steril vaskulær klemme (Coherent Scientific; Hilton, Australien) med tilstrækkelig kraft til at forhindre blodkar til og franyreuden uoprettelig skade på karrene. Ensartet og hurtig reperfusion afnyreblev observeret efter fjernelse af den vaskulære klemme i alle mus. Muskel- og hudsår blev lukket ved hjælp af en 5/0 vicryl sutur (Johnson & Johnson Medical, North Ryde, Australien), huden blev derefter forseglet med dermal klæbemiddel (Provet, Charlestown, Australien) for at beskytte såret og forebygge infektion. Kontroldyr blev udsat for en falsk operation med identisk anæstesitid og modtog kun en kontralateral nefrektomi. For effektiv analgesi fik mus 0,1 mg/kg buprenorphin subkutant 30 min før operationen og derefter 0,05-0,1 mg/kg hver 8.-12. time, som krævet. Dyr blev typisk vænnet fra analgesi 4 dage efter operationen uden nogen tegn på smerte eller angst som defineret af ansigtskarakteristika ved anvendelse af standard musegrimasseskalaen; som beskrevet (26). Alle mus overlevede til det forudbestemte endepunkt.

Udtømning af ILC2'er in vivo

ILC2'er blev udtømt i Icosdtr/ plus Cd4cre/ plus mus ved intraperitoneal injektion af 0.025 mg/kg DTx (Sigma-Aldrich) som tidligere beskrevet (27). DTx blev administreret 30 minutter før operationen og dagligt derefter indtil endepunktet. For at bekræfte ILC2--depletering modtog en undergruppe af naive dyr DTx i 3 dage. Kontrol Icosdtr/ plus Cd4cre/ plus mus modtog en intraperitoneal saltvandsinjektion.

Histologi

Udskåretnyrerblev straks delt i halve på langs gennem hilum. Halvdelen blev fikseret i 10 procent bufret formalin, indeholdende 4 procent formaldehyd i 24 timer før midlertidig opbevaring i 10 procent ethanol, paraffinindstøbning og sektionering. Fire mikrometer, langsgående udskårne sektioner blev farvet med periodic acid-Schiff (PAS) og Massons trichrom. Histopatologi blev kvantificeret ved at visualisere dilatation af tubuli, apoptose eller gipsdannelse af en enkelt-blindet investigator ved hjælp af en veletableret semikvantitativ metode (28), med mindre ændringer som beskrevet (15). Et gennemsnit blev taget af scoren fra dobbelte PAS-farvede snit fra hvert dyr. En score på 0=0 procent af tubuli var påvirket af ovenstående histopatologiske træk; 1=1–10 procent ; 2=11–25 procent ; 3=26–50 procent ; 4=51–75 procent ; 5=76–100 procent. Kollagenaflejring blev vurderet ved hjælp af Massons trichrom, og kollagen blev identificeret som indhold af methylblåt mellem tilstødende tubuli.

RNA-ekstraktion, omvendt transkription og qPCR

Halvdelen af ​​en nyre blev tilbageholdt til genekspressionsanalyse. Vævet blev homogeniseret i 400 µl PBS under anvendelse af en TissueLyser LTTM (Qiagen, Chadstone Centre, Australien) gennem 50 oscillationer pr. sekund i 2 minutter. To hundrede mikroliter af prøven blev fjernet til andre analyser. En milliliter TRI Reagent R (Sigma-Aldrich) blev tilsat til de resterende 200 µl af prøven, som modtog yderligere 50 oscillationer pr. sekund i 1-2 minutter, indtil den var fuldstændig homogeniseret. Efter 5 minutters inkubation ved stuetemperatur og centrifugering ved 12,000xgi 10 minutter, blev supernatanten ekstraheret og vortexbehandlet med 250 µl chloroform (Sigma-Aldrich). Efter inkubering i 10 minutter ved stuetemperatur og centrifugering ved 12,000xgi 15 minutter, blev supernatanten ekstraheret og vortexbehandlet med 500 µl 70 procent isopropanol (Sigma-Aldrich). Prøven blev inkuberet igen i 10 minutter ved stuetemperatur og blev derefter centrifugeret ved 12,000xgi 10 minutter. Supernatanten blev kasseret uden at afbryde den RNA-rige pellet. Pelleten blev vasket to gange med 1 ml 75 procent ethanol af RNA-kvalitet (Sigma-Aldrich), centrifugeret ved 10, 000 xgi 5 minutter, og supernatanten blev kasseret hver gang. Pelleten blev lufttørret ved stuetemperatur kort før den blev resuspenderet i 80-100 µl UltraPureTM DNase/RNase-frit dobbeltdestilleret vand (ddH2O; Thermo-Fisher Scientific) og blev derefter opbevaret ved 80◦C før omvendt transkription . Umiddelbart før omvendt transkription blev RNA-udbyttet bestemt ved spektrofotometrisk vurdering under anvendelse af en Nanodrop2000TM (Thermo-Fisher Scientific). Fem mikroliter af hver prøve blev fortyndet i ddH2O, således at 1.000 ng RNA blev fyldt pr. prøve. Efter DNAse (Sigma-Aldrich) behandling blev cDNA genereret under anvendelse af M-MLV (Thermo-Fisher Scientific, North Ryde, Australien) enzymstandard operationsprocedurer ved anvendelse af en T100TM termisk cykler (BioRad Laboratories, Gladesville, Australien). Ved hjælp af SYBR-baseret metodik blev qPCR udført ved hjælp af CFX384 TouchTM (BioRad Laboratories) i henhold til standard driftsprocedurer. Hvert primersæt blev gradienttestet for at bestemme den optimale temperatur for amplifikation (Supplerende tabel 2). Cykluskvantificering blev fortolket ved hjælp af en regression for hvert mål, genekspression blev normaliseret i forhold til hypoxanthin-guanin-phosphoribosyltransferase (Hprt). Smeltekurver blev vurderet for tegn på primerdimerisering og ikke-specifik amplifikation. På hver plade blev der brugt mindst én negativ kontrol og ingen skabelonkontrol for hvert mål for at sikre, at der ikke var kontaminering til stede i hver mastermix eller den anvendte ddH2O.

RT2 Profiler Array

RT² ProfifilerTM PCR Array Mouse Extracellular Matrix & Adhesion Molecules (Qiagen) blev udført i henhold til producentens instruktioner, og data blev uploadet og derefter analyseret af onlineværktøjet, tilgængeligt fra https://dataanalysis. qiagen.com/pcr/arrayanalysis.php. Dette array tillader profilering af 84 gener i maksimalt 4 prøver, derfor blev lige store mængder cDNA for hvert replikat i en gruppe samlet fra WT-mus på dag 1, 3 eller 7 efter IRI, og sham-poolet fra hvert replikat fra hver af disse tidspunkter. For hvert mål blev foldændringen efter IRI sammenlignet med sham-ekspression.

Statistisk analyse

Alle data blev analyseret med Graphpad Prism software v8.02 ved hjælp af ikke-parametriske uparrede t-tests (Mann-Whitney U-test). P < 0.05="" blev="" sat="" som="" tærsklen="" for="" bestemmelse="" af="" statistisk="" signifikante="" forskelle.="" ∗p="">< 0,05,="" ns="" ikke="" signifikant.="" alle="" data="" er="" udtrykt="" som="" middelværdi="" ±="" sem.="" i="" hver="" analyse="" var="" der="" n="4-8" replikater="" pr.="" gruppe,="" og="" resultaterne="" var="" repræsentative="" for="" mindst="" to="" eksperimenter.="" prøvestørrelsen="" for="" hvert="" eksperiment="" er="" beskrevet="" i="" den="" tilsvarende="">

RESULTATER

Renale ILC2'er udtrykker konstitutivt IL-5 og er lokaliseret til nyrevaskulaturen under homøostatiske forhold

En detaljeret analyse af renal ILC2-fænotype og lokalisering under homøostatiske forhold blev udført. Der var signifikant flere ILC2'er (CD45 plus Lineage IL- 7R plus CD90.2 plus ST2 plus FSClowSSClow enkeltceller) i nyren sammenlignet med lungen, når repræsenteret som en procentdel af total CD45 plus enkeltceller (figur 1A; Supplerende figurer 1A, B). t-SNE-analyse af nyre- og lunge-ILC2'er viste unik clustering, selvom disse klynger ikke var helt adskilte fra hinanden (figur 1B). Nyre-ILC2'er havde imidlertid markant lavere ekspression af CD25, konsistent ekspression af ICOS og KLRG1, men højere ekspression af IL-5 sammenlignet med lunge-ILC2'er (figur 1C). Nyre-ILC2'er havde et højere konstitutivt udtryk for IL-5 end IL-13 (figur 1D; supplerende figurer 1C, D). ILC2'er blev bestemt til at være den primære IL-5-producerende celletype i nyren med et ubetydeligt bidrag fra T-hjælpertype-2 (TH2)-celler (figur 1E, supplerende figurer 1E, F). Derfor blev IL-5 brugt som en surrogatmarkør til at identificere placeringen af ​​ILC2'er i musenyren, som er blevet beskrevet for flere perifere organer (29-31). Dette blev opnået ved at bruge mus, der udtrykker en IL-5-koblet Cre-rekombinase krydset til en Rosa-tomat-afstamningssporer (30, 31). IL-5 plus-celler (overvejende ILC2'er) blev fundet gennem helenyremen var primært lokaliseret til hovedvaskulaturen, som visualiseret med alfa-glat muskel actin (-SMA) positiv farvning (figur 2A; Supplerende figurer 2A, B), i overensstemmelse med vores nylige rapport (29). ILC2'er blev fundet at være forbundet med både interlobulære og buede nyrekar i cortex og medullære regioner, som vist ved lymfatisk endothelial hyaluronan-receptor-1 (LYVE1)-ekspression (figur 2B). Yderligere billeddannelse viste, at meget få af CD3 plus-cellerne (overvejende TH2-celler) bidrog til det endogene IL-5 plus-signal (figur 2C). ILC2'er blev identificeret i karrets adventitia under anvendelse af pseudofarvede overfladerekonstruktioner af den arterielle -SMA.

Reduktion, mangel eller udtømning af ILC2'er ændrer ikke sværhedsgraden af ​​eksperimentel nyreiskæmi-reperfusionsskade hos mus

Given ILC2s were present in the kidney and localized to the renal vasculature, the impact of ILC2 reduction, deficiency, or depletion on the severity of experimental renal IRI was assessed. This was achieved by using ILC2-reduced (Roraflfl/+Il7rcre/+)-deficient (Roraflfl/flfl Il7rcre/+), and -depleted (DTx-treated Icosdtr/+Cd4cre/+) mice compared to WT and vehicle (saline-treated Icosdtr/+Cd4cre/+) controls. These mice have been previously described as appropriate tools for assessing ILC2 function in vivo in other organs such as the lung (27, 32). Here we show that these tools are also appropriate for assessing ILC2 function in the kidney. Indeed, kidney ILC2s were significantly lower in the ILC2-reduced, -defificient, and -depleted groups compared to WT or saline-treated controls (Figure 3A). Time-course analysis of IRI in wild-type mice identified day 7 as the most appropriate time point for the assessment of injury severity due to the presence of histopathological features of acute tubular necrosis, collagen deposition and increased mRNA expression of extracellular matrix, injury-associated, and inflflammatory factors (Supplementary Figures 3, 4). At day 7, 25/84 extracellular matrix factors were increased >2-fold sammenlignet med falske kontroller, mens 1/84 og 6/84 var øget på henholdsvis dag 1 og 3 (Supplerende figur 4A). IRI inducerede akut tubulær nekrose karakteriseret ved dilaterede tubuli og gipsdannelse sammenlignet med falske kontroller (figur 3B, supplerende figurer 3A, 4B). Dette blev kvantificeret som en tubulær skadescore, og sværhedsgraden af ​​skaden var ens i alle genotyper (figur 3C). IRI inducerede også kollagenaflejring, markeret af methylblåt indhold mellem tubuli i medulla og cortex, sammenlignet med falske kontroller (figur 3D; Supplerende figur 3B). Kollagenaflejring var upåvirket af fraværet af ILC2'er. IRI øgede også mRNA-ekspressionen af ​​skadesassocierede faktorer, kemokiner og pro-inflammatoriske cytokiner (figur 3E-J, supplerende figurer 4C-K). Neutrofil gelatinase-associeret lipocalin, (Lcn2; NGAL), en biomarkør for nyreskade (33, 34), blev øget af IRI og upåvirket af ILC2-reduktion, -mangel eller -depletering (Figur 3E). CXC-motiv kemokinligand 1 (Cxcl1) og Cxcl2 blev også signifikant forøget af IRI i alle genotyper (figur 3F, G). Tilsvarende blev den pro-inflammatoriske cytokintumornekrosefaktor (Tnf) øget af IRI sammenlignet med falske kontroller (figur 3H). I overensstemmelse med synlig kollagenaflejring blev mRNA-ekspression af de ekstracellulære matrixfaktorer kollagen type I alpha 1 kæde (Col1a1) og fibronectin 1 (Fn1) øget af IRI i alle genotyper (figur 3I, J).

DISKUSSION

ILC2'er er kritiske regulatorer af vævshomeostase, men deres rolle i nyrerne mangler at blive fuldt belyst. Mens ILC2'er kan induceres til at proliferere og beskytte mod de skadelige konsekvenser af eksperimentel nyreskade, er det endnu ikke kendt, hvad der sker i fravær af disse celler. Vi undersøgte først, om ILC2-tal, som en andel af CD45 plus hæmatopoietiske celler, er forskellige i lunge og nyre. ILC2'er tegnede sig for en større andel af CD45 plus-celler i nyrerne end i lungerne. t-SNE-analyse grupperede ILC2'er fra begge steder forskelligt, men klyngerne var ikke helt adskilte mellem disse væv. Der var forskelle i deres celleoverfladeantigen og type 2-cytokinekspression, hvor nyre-ILC2'er udtrykte større mængder IL-5. Faktisk udtrykte nyre-ILC2'er konstitutivt høje niveauer af IL-5 under homøostatiske forhold. ILC2'er var også hovedkilden til IL-5 i nyrerne, med ubetydeligt bidrag fra TH2-celler. Derfor blev IL-5 brugt som en surrogatmarkør til at bestemme placeringen af ​​disse celler i nyren. ILC2'er blev identificeret i nyren og var lokaliseret næsten udelukkende langs nyrevaskulaturen. I disse undersøgelser blev en IL-5-koblet Cre-recombinase brugt sammen med en flox-stop-flox-sekvens opstrøms for en CAG-RFP-WPRE-kassette i det konstitutivt udtrykte ROSA26-locus for at lokalisere ILC2'erne. LYVE1, som udtrykkes af renale lymfatiske endotelceller, blev brugt til yderligere at definere placeringen af ​​disse celler i musenyren (35). Som forventet var LYVE1-farvning indlejret i bindevævet i nyrearterierne i cortex, men ikke i medulla, da der ikke eksisterer noget mærkbart lymfatisk netværk i denne region af nyren (35-37). Formentlig er ILC2'er placeret tæt på det vaskulære, da nyreendotelceller er en væsentlig kilde til IL -33 i nyren (38, 39). Som bekræftelse af vores observation fra FACS af enkeltcellede nyresuspensioner, blev ILC2'er igen fundet at være de største producenter af IL-5 i nyrevævssnit med minimalt bidrag fra CD3 plus T-celler. Selvom disse undersøgelser viser placeringen af ​​ILC2'er i nyrerne ved hjælp af reportermus, skal det stadig fastslås, om ILC2'er også er lokaliseret ved siden af ​​vaskulaturen i den menneskelige nyre, og om placeringen af ​​ILC2'er ændres som reaktion på nyreskade. Selvom flere rapporter har fundet ILC2-tal er uændrede af nyreskade, kræver deres fænotype og aktiveringstilstand efter skade yderligere belysning (12-16). Dernæst karakteriserede vi den funktionelle rolle af ILC2'er i nyren ved hjælp af en tab-af-funktion tilgang. For at opnå dette benyttede vi os af ILC2-reducerede og -deficiente mus og mus, der kan være betinget udtømt for ILC2'er efter administration af DTx (27). Vi validerede brugen af ​​disse værktøjer til knockdown eller ablation af ILC2'er i nyrerne. En eksperimentel model af IRI blev valgt, givet ILC2'ernes nærhed til den renale vaskulatur. Selvom træk ved skade var synligt tydeligt efter IRI, ændrede en reduktion, mangel eller udtømning i ILC2'er ikke den grove histopatologi i nyrerne, og det forårsagede heller ikke dødelighed. Faktisk forekom IRI-induceret ombygning og kollagenaflejring uafhængigt af ILC2'er. Selvom det er muligt, at et tidligere tidspunkt efter skade kan have identificeret forskelle i histopatologi og genekspression, tillod tidspunktet i vores undersøgelse også vurdering af kollagenaflejring, et vigtigt træk ved remodellering, der er reguleret af ILC2'er (16, 32, 40) –44). Det er også sandsynligt, at en reduktion i ILC2s under

AKI kan være skadeligt for nyrernes struktur og funktion, når det vurderes på senere tidspunkter på grund af potentielle maladaptive reparationsresponser i fravær af ILC2'er. For at løse dette vil fremtidige undersøgelser skulle undersøge ILC2s rolle i udviklingen af ​​AKI til kronisk nyresygdom (45, 46).

Samlet viser denne undersøgelse, at en reduktion, mangel eller udtømning i ILC2'er ikke ændrer sværhedsgraden af ​​eksperimentel AKI hos mus. Mens aktivering af ILC2'er og den tilhørende amplifikation af lokal type 2-immunitet tidligere har vist sig at reducere de skadelige konsekvenser af AKI, opstår sammenlignelige skader, når ILC2'er er reduceret, fraværende eller udtømt, hvilket tyder på mulig redundans og kompensation fra andre immunceller, såsom Treg , AAM og TH2 celler. Dette koncept understøttes af undersøgelser med Rag1 / eller Rag2 / mus, der mangler modne T- og B-celler, i modeller afnyreskade(13, 15, 47, 48). I en undersøgelse blev anti-CD90.2-administration brugt til at udtømme ILC2'er, men disse dyr var også mangelfulde i Treg- og TH2-celler (15). I dette modelsystem er kompensation fra T-cellerummet ikke mulig på trods af udtømningen af ​​ILC2'er med anti-CD90.2. Vores data viser, at et tab af ILC2'er, når T-cellerummet forbliver intakt, har minimal indvirkning på sværhedsgraden af ​​IRI. Vores data understøtter konceptet om, at ILC2'erne ud over andre immunceller, såsom Treg og AAM, bidrager til AKI. Faktisk forværrede Treg-depletion histopatologien efter IRI (15). På samme måde fremmer makrofagpolarisering mod AAM opløsningen af ​​skade (5, 12, 46, 49, 50). Yderligere undersøgelser er påkrævet for at klarlægge årsagen til tilstedeværelsen af ​​ILC2'er i nyrerne, herunder stigende urinvejsinfektioner og andre nyrefornærmelser samt i progression afkronisk sygdom.

ETISK ERKLÆRING

Alle kirurgiske procedurer blev godkendt af University of Newcastles Animal Care and Ethics Committee i overensstemmelse med Australian Code for pleje og brug af dyr til videnskabelige formål. Procedurer for immunfluorescerende billeddannelse blev godkendt og udført i overensstemmelse med retningslinjer fastsat af UCSF Animal Care and Use Committee og Laboratory Animal Resource Center.

FORFATTERS BIDRAG

Det præsenterede arbejde er udført i samarbejde med alle forfattere. GC udførte den kirurgiske model, flowcytometri, histologisk vurdering, genekspressionsanalyse og analyserede dataene. KC og ABM udførte immunfluorescenseksperimenterne. SL hjalp med dyreovervågning og flowcytometri. SJ og AD gav klinisk indsigt i studiedesign og kirurgisk teknik. ANM oprettede, leverede og rådgav om brugen af ​​ILC2-deficient & -depleted og Il13td tomatmus. PF leverede og rådgav om brugen af ​​Il5venus reporter line. PF og PH rådgav om eksperimentelt design. MS designede, overvågede og faciliterede alle aspekter af undersøgelserne. Alle forfattere deltog i fortolkning af data, forberedelse og redigering af manuskripter til intellektuelt indhold.

FINANSIERING

MS er støttet af et Australian Research Council (ARC) Discovery Early Career Researcher Award (DECRA) stipendium og stipendier fra National Health and Medical Research Council (NHMRC), Hunter Medical Research Institute og Hunter Children's Research Foundation.

REFERENCER

1. Susantitaphong P, Cruz DN, Cerda J, Abulfaraj M, Alqahtani F, Koulouridis I, et al. Verdensforekomst af AKI: en metaanalyse.Clin J Er Soc Nephrol. (2013) 8:1482–93.

2. Hall AM, Unwin RJ, Parker N, Duchen MR. Multifoton-billeddannelse afslører forskelle i mitokondriefunktion mellem nefronsegmenter.J Am Soc Nephrol. (2009) 20:1293–302.

3. Devarajan P. Opdatering om mekanismer for iskæmisk akut nyreskade.J Am Soc Nephrol. (2006) 17:1503–20. 

4. Bonventre JV, Yang L. Cellulær patofysiologi af iskæmisk akut nyreskade.J Clin Invest.(2011) 121:4210-21. DOI: 10.1172/JCI 45161

5. Lee S, Huen S, Nishio H, Nishio S, Lee HK, Choi BS, et al. Distinkte makrofagfænotyper bidrager til nyreskade og reparation.J Am Soc Nephrol. (2011) 22:317–26. 

6. Friedewald JJ, Rabb H. Inflammatoriske celler ved iskæmisk akut nyresvigt.Nyre Int.(2004) 66:486–91. 

7. Spits H, Artis D, Colonna M, Diefenbach A, Di Santo JP, Eberl G, et al. Medfødte lymfoide celler - et forslag til ensartet nomenklatur.NatRev Immunol.(2013) 13:145–9. 

8. Moro K, Yamada T, Tanabe M, Takeuchi T, Ikawa T, Kawamoto H, et al. Medfødt produktion af T(H)2-cytokiner af fedtvævsassocierede c-Kit( plus )Sca-1( plus ) lymfoide celler.Natur. (2010) 463:540–4. 

9. Neill DR, Wong SH, Bellosi A, Flynn RJ, Daly M, Langford TKA, et al. Nuocytter repræsenterer en ny medfødt effektor leukocyt, der medierer type-2 immunitet.Natur. (2010) 464:1367–70. 

10. Loering S, Cameron GJM, Starkey MR, Hansbro PM. Lungeudvikling og nye roller for type 2-immunitet.J Pathol.(2018) 247:686–96. 

11. Monticelli LA, Sonnenberg GF, Abt MC, Alenghat T, Ziegler CG, Doering TA, et al. Medfødte lymfoide celler fremmer lungevævshomeostase efter infektion med influenzavirus.Nat Immunol. (2011) 12:1045–54. 

12. Huang Q, Niu Z, Tan J, Yang J, Liu Y, Ma H, et al. IL-25 fremkalder medfødte lymfoide celler og multipotente progenitor type 2-celler, der reducerer nyreiskæmisk/reperfusionsskade.J Am Soc Nephrol.(2015) 26:2199–211. 

13. Riedel JH, Becker M, Kopp K, Duster M, Brix SR, Meyer-Schwesinger C, et al. IL-33-medieret ekspansion af type 2 medfødte lymfoide celler beskytter mod progressiv glomerulosklerose.J Am Soc Nephrol.(2017) 28:2068–80. 

14. Stremska ME, Jose S, Sabapathy V, Huang L, Bajwa A, Kinsey GR, et al. IL233, et nyt IL-2- og IL-33-hybridcytokin, afhjælper nyreskade.J Am Soc Nephrol. (2017) 28:2681–93. 

15. Cao Q, Wang Y, Niu Z, Wang C, Wang R, Zhang Z, et al. Potentiering af vævsresidente type 2 medfødte lymfoide celler med IL-33 for at forhindre nyreiskæmi-reperfusionsskade.J Am Soc Nephrol.(2018) 29:961–76. 

16. Sabapathy V, Cheru NT, Corey R, Mohammad S, Sharma R. Et nyt hybrid cytokin IL233 medierer regenerering efter doxorubicin-induceret nefrotoksisk skade.Sci Rep. (2019) 9:3215. 

17. Cameron GJM, Jiang SH, Loering S, Deshpande AV, Hansbro PM, Starkey MR. Emerging terapeutisk potentiale af gruppe 2 medfødte lymfoide celler i akut nyreskade.J Pathol. (2019) 2019:5242. 

18. Singh AP, Junemann A, Muthuraman A, Jaggi AS, Singh N, Grover K, et al. Dyremodeller for akut nyresvigt.Pharmacol Rep. (2012) 64:31–44. 

19. Ramesh G, Ranganathan P. Musemodeller og metoder til undersøgelse af menneskelig sygdom, akut nyreskade (AKI).Metoder Mol Biol.(2014) 1194:421–36. 

20. Skrypnyk NI, Harris RC, de Caestecker MP. Iskæmi-reperfusionsmodel for akut nyreskade og post-skade fibrose hos mus.J VisExp.(2013) 9:78. 

21. Wei Q, Dong Z. Musemodel af iskæmisk akut nyreskade: tekniske noter og tricks.Am J Physiol Renal Physiol.(2012) 303:F1487–94? 

22. Starkey MR, McKenzie ANJ, Belz GT, Hansbro PM. Pulmonal gruppe 2 medfødte lymfoide celler: overraskelser og udfordringer.Mucosal Immunol.(2019) 12:299–311. 

23. Jang HR, Rabb H. Immunceller ved eksperimentel akut nyreskade.Nat Rev Nephrol.(2015) 11:88-101. DOI: 10.1038/nrneph.2014.180

24. Turner JE, Becker M, Mittrucker HW, Panzer U. Vævsresidente lymfocytter i nyren.J Am Soc Nephrol.(2018) 29:389–99. 

25. Jang HR, Rabb H. Det medfødte immunrespons ved iskæmisk akut nyreskade.Clin Immunol. (2009) 130:41–50. 

26. Langford DJ, Bailey AL, Chanda ML, Clarke SE, Drummond TE, Echols S, et al. Kodning af ansigtsudtryk af smerte i laboratoriemusen.NatMetoder.(2010) 7:447–9.

27. Oliphant CJ, Hwang YY, Walker JA, Salimi M, Wong SH, Brewer JM, et al. MHCII-medieret dialog mellem gruppe 2 medfødte lymfoide celler og CD4 plus T-celler forstærker type 2-immunitet og fremmer parasitisk helminthuddrivelse.Immunitet. (2014) 41:283–95. 

28. Shih W, Hines WH, Neilson EG. Virkninger af cyclosporin A på udviklingen af ​​immunmedieret interstitiel nefritis.Nyre Int. (1988) 33:1113–8.

29. Dahlgren MW, Jones SW, Cautivo KM, Dubinin A, Ortiz-Carpena JF, Farhat S, et al. Adventitielle stromaceller definerer gruppe 2 medfødte lymfoide cellevævsnicher.Immunitet. (2019) 50:707–22. 

30. Molofsky AB, Nussbaum JC, Liang HE, Van Dyken SJ, Cheng LE, Mohapatra A, et al. Medfødte lymfoide type 2-celler opretholder visceralt fedtvæv eosinofiler og alternativt aktiverede makrofager.J Exp Med.(2013) 210:535–49. 

31. Nussbaum JC, Van Dyken SJ, von Moltke J, Cheng LE, Mohapatra A, Molofsky AB, et al. Type 2 medfødte lymfoide celler styrer eosinofil homeostase.Natur.(2013) 502:245–8. 

32. Donovan C, Starkey MR, Kim RY, Rana BMJ, Barlow JL, Jones B, et al. Roller for T/B-lymfocytter og ILC2'er i eksperimentel kronisk obstruktiv lungesygdom.J Leukoc Biol.(2019) 105:143–50. 

33. Mishra J, Ma Q, Prada A, Mitsnefes M, Zahedi K, Yang J, et al. Identifikation af neutrofil gelatinase-associeret lipocalin som en ny tidlig urin biomarkør for iskæmisk nyreskade.J Am Soc Nephrol.(2003) 14:2534–43. 

34. Supavekin S, Zhang W, Kucherlapati R, Kaskel FJ, Moore LC, Devarajan P. Differentiel genekspression efter tidlig nyreiskæmi/reperfusion.Nyre Int.(2003) 63:1714–24. 

35. Skorecki K, Chertow GM, Marsden PA, Taal MW, Alan SL, Luyckx V. Anatomy of the kidney: Lymphatics. I:Brenner ogRektorsNyre e-bog. 10. udg. Amsterdam: Elsevier (2015). s. 80-1.

36. Banerji S, Ni J, Wang SX, Clasper S, Su J, Tammi R, et al. LYVE-1, en ny homolog af CD44-glykoproteinet, er en lymfespecifik receptor for hyaluronan.J Celle Biol. (1999) 144:789–801. 

37. Lee HW, Qin YX, Kim YM, Park EY, Hwang JS, Huo GH, et al. Ekspression af lymfatisk endotel-specifik hyaluronan-receptor LYVE-1 i den udviklende musenyre.CelleVævRes.(2011) 343:429–44.

38. Shelite TR, Liang Y, Wang H, Mendell NL, Trent BJ, Sun J, et al. IL- 33-afhængig endotelaktivering bidrager til apoptose og nyreskade hos orienterede tsutsugamushi-inficerede mus.PLoS Negl Trop Dis.(2016) 10:e0004467.

39. Ferhat M, Robin A, Giraud S, Sena S, Goujon JM, Touchard G, et al. Endogen IL-33 bidrager til nyreiskæmi-reperfusionsskade som et alarmin.J Er Soc Nephrol. (2018) 29:1272–88. 

40. Mchedlidze T, Waldner M, Zopf S, Walker J, Rankin A, Schuchmann M, et al. Interleukin-33-afhængige medfødte lymfoide celler medierer hepatisk fibrose.Immunitet. (2013) 39:357–71. 

41. Moretti S, Renga G, Oikonomou V, Galois C, Pariano M, Iannitti RG, et al. En mastcelle-ILC2-Th9-vej fremmer lungebetændelse ved cystisk fibrose.Nat Commun. (2017) 8:14017. 

42. Hams E, Armstrong ME, Barlow JL, Saunders SP, Schwartz C, Cooke G, et al. IL-25 og type 2 medfødte lymfoide celler inducerer lungefibrose.ProcNatlAcad Sci USA. (2014) 111:367–72.

43. Wohlfahrt T, Usherenko S, Englbrecht M, Dees C, Weber S, Beyer C, et al. Type 2 medfødte lymfoide celletal er øget hos patienter med systemisk sklerose og korrelerer med omfanget af fibrose.Ann Rheum Dis.(2016) 75:623–6. 

44. Li D, Guabiraba R, Besnard AG, Komai-Koma M, Jabir MS, Zhang L, et al. IL-33 fremmer ST2-afhængig lungefibrose ved induktion af alternativt aktiverede makrofager og medfødte lymfoide celler i mus.J Allergy Clin Immunol. (2014) 134:1422–32. 

45. Sharp CN, Doll MA, Megyesi J, Oropilla GB, Beverly LJ, Siskind LJ. Subklinisk nyreskade induceret af gentagen cisplatin-administration resulterer i progressiv kronisk nyresygdom.Am J Physiol Renal Physiol.(2018) 315:F161–72? 

46. ​​Liu J, Kumar S, Dolzhenko E, Alvarado GF, Guo J, Lu C, et al. Molekylær karakterisering af overgangen fra akut til kronisk nyreskade efter iskæmi/reperfusion.JCI Indsigt.(2017) 2:94716. 

47. Li L, Huang L, Sung SJ, Lobo PI, Brown MG, Gregg RK, et al. NKT-celleaktivering medierer neutrofil IFN-gamma-produktion og nyreiskæmi-reperfusionsskade.J Immunol.(2007) 178:5899–911.

48. Chan AJ, Alikhan MA, Odobasic D, Gan PY, Khouri MB, Steinmetz OM, et al. Medfødt IL-17A-producerende leukocytter fremmer akut nyreskade via inflammasom- og Toll-lignende receptoraktivering.Am J Pathol.(2014) 184:1411–8? 

49. Cao Q, Wang C, Zheng D, Wang Y, Lee VWS, Wang YM, et al. IL-25 inducerer M2-makrofager og reducerer nyreskade ved proteinurisk nyresygdom.J Am Soc Nephrol. (2011) 22:1229–39.

50. Chung S, Overstreet JM, Li Y, Wang Y, Niu A, Wang S, et al. TGF-beta fremmer fibrose efter alvorlig akut nyreskade ved at øge nyremakrofaginfiltrationen.JCI Indsigt.(2018) 3:123563.