Gomisin N hæmmer melanogenese gennem regulering af PI3K/Akt og MAPK/ERK signalvejene i melanocytter

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstrakt: Gomisin N, har en af ​​lignanforbindelserne fundet i Schisandra Chinensis vist sig at have antioxidative, anti-tumorogene og anti-inflammatoriske aktiviteter i forskellige undersøgelser. Her rapporterer vi for første gang den anti-melanogene effekt af Gomisin N hos pattedyr celler såvel som i zebrafiskembryoner. Gomisin N reducerede melaninindholdet signifikant uden cellulær toksicitet. Selvom det ikke var i stand til at modulere den katalytiske aktivitet af svampetyrosinasein vitro,Gomisin Nnedregulerede ekspressionsniveauerne af nøgleproteiner, der fungerer imelanogenese. Gomisin N nedreguleret melanocortin 1-receptor (MC1R), adenylylcyclase 2, mikroftalmi-associeret transkriptionsfaktor (MITF), tyrosinase,tyrosinase-relateret protein-1(TRP-1) og tyrosinase-relateret protein-2 (TRP-2). Derudover udviste Gomisin N-behandlede Melan-A-celler øgede p-Akt- og p-ERK-niveauer, hvilket indebærer, at aktiveringen af ​​PI3K/Akt- og MAPK/ERK-vejene kan fungere til at hæmmemelanogenese. Vi validerede også, at Gomisin Nreducerede melaninproduktionen ved at undertrykke udtrykket af MITF,tyrosinase, TRP-1 og TRP-2i muse- og menneskeceller samt i udvikling af zebrafiskembryoner. I fællesskab konkluderer vi detGomisin Nhæmmer melaninsyntesen ved at undertrykke ekspressionen af ​​MITF og melanogenicenzymer, sandsynligvis gennem modulering af PI3K/Akt- og MAPK/ERK-vejene.

Nøgleord:Schisandra Chinensis;Gomisin N; lignan;melanogenese; hudblegning

cistanche har hudblegningsfunktion

1. Introduktion

Melanin er et pigment, der findes i de fleste dyreorganer, herunder hud, hår, øjne, indre øre, knogler, hjerte og hjerne [1,2].Melanogeneseer en kompleks proces, hvor flere signalveje er involveret. Melanocortin 1-receptoren (MC1R) er en nøgleregulator imelanogenese, der signalerer gennem dets ligander såsom melanocytstimulerende hormon (MSH) og adrenokortikotropt hormon (ACTH) [3]. Hudmelanin biosyntetiseres af melanocytter i epidermis og overføres derefter til keratinocytter, hvor de spiller en vigtig rolle i hudbeskyttelse ved at absorbere UV-stråling fra sollys og fjerne reaktive frie radikaler [4,5]. Melaninsyntese og -overførsel i huden og hårfolliklerne reguleres af tilgængeligheden af ​​dets forstadier [6]. L-tyrosin og L-dihydroxyphenylalanin (L-DOPA), hovedsubstrater for melanogene enzymer, fungerer også som hormonlignende regulatorer i melanogenese [7]. På den anden side resulterer overproduktionen af ​​melanin i uønskede hudproblemer såsom fregner og melasma [8,9]. Melanogenese kan påvirke adfærden af ​​normale og maligne melanocytter ved at modulere cellernes elastiske egenskaber [10]. Selvom receptorerne for serotonin og melatonin udtrykt i kutane celler spiller en nøglerolle i opretholdelsen af ​​cellulær homeostase, kan den overdrevne produktion af melanin via ukontrollerede hormonelle ændringer forårsage patologiske tilstande i huden [11].

Der har således været omfattende bestræbelser på at belyse molekylære mekanismer, der kontrollerer melanogenese som det primære trin til behandling af hyperpigmentære hudlidelser. Derudover forskellige typer afhudblegningmidler, der hæmmer melaninsyntese, er blevet identificeret fra planteekstrakter og ikke-planteekstrakter og kommercielt anvendt i kosmetik [12,13]. De mest anvendte hvidtemidler omfatter hydroquinon, mequinol, arbutin, kojinsyre, ascorbinsyre og retinosyre [12,14]. Der er imidlertid forskellige begrænsninger af deres anvendelse til behandling af akutte eller kroniske symptomer på hyperpigmentering hos mennesker. For eksempel kan hydroquinon, selvom det længe har været brugt til depigmentering siden 1960'erne, forårsage hudirritation og kontaktdermatitis [15,16]. Det fører også til DNA-skade ved at øge produktionen af ​​reaktive oxygenarter og udviklingen af ​​eksogen ochronose i pattedyrsceller [17,18]. Andre velkendtetyrosinaseinhibitorer som kojinsyre og ascorbinsyre har ikke kun dårlig hudpenetration, stabilitet og blegningseffekt, men kan også forårsage cytotoksicitet, dermatitis og erytem ved langvarig brug [19,20]. I denne henseende er der et stigende behov for at udvikle sikrere og mere effektive blegemidler til behandling af human hudhyperpigmentering. Naturlige urter, der bruges i traditionel medicin, kan give alternative kilder til at identificere nye blegemidler, der kontrollerer nøgletrin imelanogenesemed færre eller ingen bivirkninger [21].

Schisandra chinensis, også kendt som nordlige finsmagsbær, findes naturligt i det nordøstlige Kina, det fjerne østlige Rusland, Japan og Korea [22]. Denne plante har længe været brugt til behandling af natblindhed, hudforbrændinger, aseptisk betændelse og leversygdomme i traditionel orientalsk medicin [23,24]. S. chinensis frugtekstrakt og dets lignanforbindelser har vist sig at have forskellige farmakologiske virkninger i murine cellelinjer. For eksempel har Schisandra A og C antioxidative virkninger, mens Schisandra B har anti-fibrotiske, anti-inflammatoriske, antioxidante og anti-apoptotisk aktiviteter [25]. En anden lignanforbindelseGomisin N(Figur 1A) er blevet rapporteret at undertrykke oxidativ stress-induceret apoptose ved at hæmme frigivelsen af ​​cytochrom C fra mitokondrier til cytoplasmaet, spaltningen af ​​caspase 3 og PARP og Ca2 plus-induceret mitokondriel permeabilitetsovergang i H9c2 rotte-kardiomyocytter [7,8]. Interessant nok har adskillige undersøgelser, der anvender musemodeller og humane hudcellelinjer, afsløret det terapeutiske potentiale af S. chinensis til behandling af hudsygdomme. Lee et al. rapporterede, at methanolekstraktet af S. chinensis-frugt lindrede kontaktdermatitis-symptomer ved at reducere produktionen af ​​pro-inflammatoriske cytokiner såsom TNF- og IFN- ved topisk påføring [8,24]. Kang et al. viste, at Schisandra Fructus-vandekstrakt hæmmede IκB-aktivering og derved undertrykte produktionen af ​​TNF-, IL-6 og GM-CSF i den humane mastcellelinje HMC-1 [26]. Disse fund fik os til at postulere at S. chinensis lignans kan påvirke hudcellefunktioner mere bredt. I denne undersøgelse søgte vi at undersøge de formodede roller afGomisin N, en af ​​de vigtigste lignanforbindelser i S. Chinensis, i reguleringmelanogenese, hvorved dets potentielle anvendelse som akosmeceutisk middel vurderes. Her melder vi detGomisin Nhæmmer melaninbiosyntesen uden cellulær toksicitet i menneske- og museceller såvel som i zebrafiskembryoner.

2. Resultater

2.1. Effekter af Gomisin N på melanindannelse og cellelevedygtighed

For at verificere virkningerne af Gomisin N påmelanogenese, behandlede vi musemelanocytter med forskellige koncentrationer afGomisin Ni 72 timer og vurderede derefter ændringer i melaninindholdet. Gomisin-behandling reducerede melaninindholdet både i den normale melanocytcellelinje Melan-A og i B16F10-melanomceller på en dosisafhængig måde uden cellulær toksicitet (figur 1B, C). Vi observerede, at Gomisin N hæmmede -MSH-induceret melaninproduktion i B16F10-celler, hvilket var sammenligneligt med resultaterne opnået ved PTU-behandling [27] (figur 1C). For at vurdere, om reduktionen af ​​melanin påGomisin Nbehandling skyldes nedsat aktivitet af tyrosinase, udførte vi et L-DOPA-farvningsassay i normale humane epidermale melanocytceller (NHEM). Som vist i figur 1E udviste NHEM-celler behandlet med Gomisin N reducerede niveauer af L-DOPA sammenlignet med ubehandlede celler. Den hæmmende effekt af Gomisin N på melaninproduktion var imidlertid ikke signifikant i humanmelanom MNT-1-celler (figur 1D) .

2.2. Effekter af Gomisin N på Tyrosinase-aktivitet

At undersøge omGomisin Nhæmmertyrosinaseaktivitet in vitro brugte vi svampetyrosinase og B16 melanomcellelysater. Kojic acid, en velkendt tyrosinaseinhibitor, blev brugt som en positiv kontrol. Ved behandling med svampetyrosinase, hvorimod Kojic syre signifikant reducerede den enzymatiske aktivitet, inducerede Gomisin N ikke nogen ændring i omdannelsen af ​​L-DOPA til dopakrom (Figur 2A). Ved behandling med B16 melanomceller resulterede Gomisin N imidlertid i et fald. ityrosinaseaktiviteten af ​​cellelysatet på en dosisafhængig måde (figur 2B). Desuden, når det behandles sammen med -MSH inB16-celler,Gomisin Nvendte stigningen i dopakromdannelse stimuleret af -MSH (Figur 3C). Det er bemærkelsesværdigt, at Gomisin N syntes at være mere effektiv end Kojic-syre til at hæmme det cellulæretyrosinase aktivitetaf B16-celler efter -MSH-stimulus. Disse resultater indebærer, at den hæmmende virkning af GomisinN på melaninproduktion observeret i muse- og humane celler (figur 1) ikke skyldes dets funktion til direkte at hæmme den katalytiske aktivitet af tyrosinase. Det er dog stadig muligt, at Gomisin Nregulerer ekspressionen af ​​tyrosinase eller andre proteiner, der spiller nøgleroller imelanogenese.

2.3. Effekter af Gomisin N på inaktiveringen af ​​MC1R-signalvejen

Vi søgte at belyse den underliggende mekanisme, der er ansvarlig for den hæmmende virkning af GomisinN på melaninproduktion. Det begrundede viGomisin Nkan regulere signalproteiner, der er involveret imelanogeneseog derved hæmme melaninsyntesen. Melanocortin 1-receptor (MC1R) er amelanocytisk G-proteinkoblet receptor, der fungerer som en nøgleregulator i melaninsyntesen. Aktiveringen af ​​MC1R med dets ligand -MSH eller adrenokortikotropt hormon (ACTH) fører til en stigning i adenylylcyclase, som igen opregulerer intracellulære cAMP-niveauer [2,3]. Som følge heraf øges det transkriptionelle niveau af MITF via proteinkinase-C (PKA)/responsive element-bindingprotein (CREB)-vejen [2,28]. For at evaluere den regulatoriske effekt af Gomisin N på MC1R-signalvejen tjekkede vi ekspressionsniveauerne af MC1R og dets nedstrøms signalmolekyler efter behandling af Melan-A-celler med Gomisin N. Vi observerede, at Gomisin N signifikant nedregulerede proteinniveauerne af både MC1R og adenylylcyclase 2 på en dosisafhængig måde (figur 3A-C). Som forventet,Gomisin N-behandlede celler udviste også nedsatte proteinniveauer af MITF og dets kendte mål tyrosinase, TRP-1 og TRP-2 (figur 3A, D-G). Disse resultater tyder på, at Gomisin N hæmmer melanin-producerende enzymer ved at inaktivere MITF via MC1R-signalvejen.

2.4. Effekter af Gomisin N på phosphoryleringen af ​​Akt og ERK1/2 i Melan-A-celler

PI3K/Akt- og MAPK/ERK-vejene er kendt for at være involveret i melanogenese ved transkriptionelt eller post-transkriptionelt regulerende MITF [29,30]. For at evaluere, om GomisinN påvirker disse signalveje, vurderede vi phosphoryleringsstatus for Akt og ERK1/2 byWestern blot-analyse. Som vist i figur 3H-J, højdosisbehandling (30 µM) afGomisin Nforbedrede phosphoryleringen af ​​både Akt og ERK markant. Disse data indikerer, at den hæmmende effekt af Gomisin N påmelanogeneseer sandsynligvis forbundet med P13K/Akt- og MAPK/ERK-vejene.

2.5. Gomisin N hæmmede melanogenese i zebrafiskembryoer

Vi havde dernæst til formål at undersøge, om Gomisin N er effektiv til at hæmmemelanogenesein vivo. Til denne ende behandlede vi zebrafiskembryoner med Gomisin N i 72 timer i koncentrationer på 1, 10, 20 og 30 µM og målte derefter ekspressionsniveauer af melanogene proteiner. Vi observerede, at Gomisin N-behandling hæmmede melanindannelse ved udvikling af zebrafiskembryoner.Gomisin N-behandlede embryoner viste en reduktion i melaninindholdet på en koncentrationsafhængig måde sammenlignet med den ubehandlede kontrol (figur 4). Vi fandt også, at proteinniveauerne aftyrosinase, MITF, TRP-1 og TRP-2 blev reduceret ved Gomisin N-behandling (figur 5). Disse resultater viser, at Gomisin N hæmmer melanogenese in vivo ved at regulere transkriptionsfaktoren MITF og dens måltyrosinase, TRP-1 og TRP-2.

2.6. Gomisin N reverserede Rapamycin-induceret melanogenese i humant MNT-1

Selvom Gomisin N signifikant hæmmedemelanogenesei Melan-A- og B16-celler samt inzebrafiskembryoner, så vi ikke dets virkning på humane MNT-1-melanomceller. Vi forventede, at effekten af ​​Gomisin N kunne påvises i MNT-1-celler under den tilstand, hvor melanogenese opreguleres af en passende stimulus. Rapamycin har vist sig at inducere melanogenese ved at øge tyrosinaseaktivitet og proteinniveauer af MITF, tyrosinase, TRP-1 og TRP-2 [31], delvist gennem aktivering af autofagi [32]. Vi overvågede niveauerne aftyrosinase, MITF,TRP-1 og TRP-2 i MNT-1-celler ved Western blot-analyse efter samtidig behandling med Gomisin N andrapamycin. Rapamycin-behandling inducerede signifikant MITF-, TRP-1- og TRP-2-niveauer, men havde ingen effekt påtyrosinaseniveauer (figur 6). Gomisin N-behandling vendte imidlertid signifikant virkningerne af rapamycin på MITF, TRP-1 og TRP-2 på en koncentrationsafhængig måde. Den omvendte effekt afGomisin Nmod rapamycin var mere lovende ved koncentrationen på 20 og 30 µM end 10 µM. Disse resultater tyder på, at Gomisin N hæmmermelanogenesei de humane MNT-1 melanomceller ved at regulere transkriptionsfaktoren MITF og dens mål TRP-1 og TRP-2.

3. Diskussion

Melanins hovedfunktion er at beskytte hudceller mod UV-stråling [33-35]. Hyperpigmentering, resultatet af en overproduktion af melanin i huden, forårsager uønskede kosmetiske bekymringer og er forbundet med dermatitis og hudkræft. Flere rapporter har foreslåetmelanogenesesom et vigtigt mål for behandling af metastatisk melanom [36,37]. Der er således et stigende behov for at udvikle anti-melanogene midler, der regulerer melanogenese uden cellulær toksicitet [38]. Der er flere veje involveret i hudmelanogenese [39,40]. Efter ligandbinding øger MC1R aktiviteten af ​​adenylylcyclase, som efterfølgende øger intracellulære niveauer af cAMP [41,42]. Den cAMP-afhængige aktivering af PKA/CREB-vejen er i vid udstrækning blevet rapporteret for at opregulere transkriptionelle niveauer af MITF og derved øge melaninsyntesen [43]. MITF fungerer som en masterregulator for de tre store melanogene enzymer tyrosinase, TRP-1 og TRP-2i hvirveldyr [3,21,44]. Disse enzymer er transmembrane proteiner placeret i melanosomalmembranen af ​​melanocytter. Tyrosinase regulerer det hastighedsbegrænsende trin indmelanogeneseved at omdanne L-tyrosinase til L-DOPA [23]. TRP-1 og TRP-2 spiller også vigtige roller i melaninsyntesen, selvom deres funktioner ikke er fuldt ud forstået.

I denne undersøgelse viste Gomisin N, en lignanforbindelse af S. chinensis, depigmenterende aktivitet uden cellulær toksicitet. Gomisin N hæmmede melaninsyntese i dyrkede pattedyrcellelinjer såvel som i zebrafiskembryoner. Gomisin N syntes at være mere effektiv end den positive kontrol-PTU, der hæmmer melaninproduktionen i Melan-A-celler (figur 1B). Gomisin N reducerede melaninindholdet på en koncentrationsafhængig måde. Sammenlignet med den ubehandlede kontrolgruppe, 10 µM afGomisin Nreducerede melaninindholdet med omkring 40 procent uden cellulær toksicitet. Den anti-melanogene aktivitet af 10-µM Gomisin N var sammenlignelig med aktiviteten af ​​100-µM PTU i Melan-A-celler. På samme måde så Gomisin Na sig ud til at være mere potent end PTU i -MSH-aktiverede B16F10-celler, hvor virkningerne af 5- og 10-µM Gomisin N var sammenlignelige med virkningerne af 10- og {{12 }}µM PTU, henholdsvis (figur 1C). NHEM-celler behandlet med Gomisin N udviste reducerede niveauer af L-DOPA, hvilket tyder på, at GomisinN hæmmertyrosinaseaktivitet i dyrkede celler (figur 1E). Disse resultater førte os til yderligere at undersøge den underliggende mekanisme, hvorved Gomisin N hæmmer melanogenese.

Vi undersøgte omGomisin Nmodulerer direkte den katalytiske aktivitet aftyrosinasein vitro. I modsætning til Kojic-syre viste Gomisin N ikke hæmmende virkninger på svampe-tyrosinase-aktivitet (figur 2A). Imidlertid blev den cellulære tyrosinaseaktivitet i B16 melanomcellelysater signifikant nedreguleret af Gomisin N både med og uden -MSH-behandling (figur 2B,C). Inhibering af cellulær tyrosinaseaktivitet af Gomisin N efter -MSH-stimulus viste sig at være mere signifikant end den for den positive kontrol Kojic-syre (figur 2C).

Vi postulerede, at den anti-melanogene funktion af Gomisin N kan forekomme gennem transkriptionel eller post-transkriptionel regulering af tyrosinase og tyrosinase-relaterede proteiner (TRP'er). For at validere dette målte vi ekspressionsniveauer af signalmolekyler i MC1R-vejen, en væsentlig determinant for kvantitet og kvalitet af melaninproduktion i melanocytter. Forventet observerede vi, at Gomisin N reducerede niveauerne af MC1R og adenylylcyclaser 2 i Melan-A-celler (figur 3A-C). Desuden,Gomisin Nnedregulerede ekspressionen af ​​MITF og dets målproteiner, herunder tyrosinase, TRP-1 og TRP-2 (figur 3A,D–G). Disse resultater tyder på, at de reducerede niveauer af melaninindhold efter Gomisin N-behandling skyldes deaktivering af MC1R-vejen.

På den anden side kan PI3K/Akt- og MAPK/ERK-vejene phosphorylere MITF og kan derved post-transkriptionelt modulere dens aktivitet [45]. Imidlertid er den samlede effekt af aktiveringen af ​​PI3K/Akt- og MAPK/ERK-vejene imelanogeneseer kontroversiel. Både PI3K/Akt- og MAPK/ERK-vejene aktiveres konstitutivt i humane melanomer på grund af akkumulerede mutationer [46]. C2-ceramid-medieret depigmentering i Mel-Ab-celler er kendt for at finde sted gennem en reduktion i p-Akt-niveauer [47]. Der er flere naturlige forbindelser, der aktiverer melanogenese ved at opregulere p-ERK-niveauer i B16-melanomceller [28]. I modsætning hertil er der også bevis for, at forhøjede p-ERK- og p-Akt-niveauer hæmmer melaninsyntesen [28,48]. Kompleksitetsinreguleringen af ​​melanogenese kan delvist forklares af det faktum, at phosphorylering øger den transkriptionelle aktivitet af MITF, men samtidig inducerer ubiquition-proteosom-afhængig nedbrydning af MITF [26,49-51]. Vores data viste, at både p-Akt- og p-ERK-niveauer blev opreguleret i Gomisin N-behandlede Melan-A-celler (figur 3H-J). Dette indebærer, at PI3K/Akt- og MAPK/ERK-vejene kan bidrage til hæmningen af ​​melaninproduktionen.

Vi validerede yderligere den anti-melanogene aktivitet af Gomisin N i zebrafisken in vivo-modellen. Gomisin N-behandlede zebrafiskembryoner viste en signifikant reduktion i melaninpigmentering (figur 4). Derudover sænkede Gomisin N markant niveauerne aftyrosinase, MITF, TRP-1 og TRP-2 i udvikling af zebrafiskembryoner. Disse resultater tyder samlet på detGomisin Ninducerer depigmentering ved at nedregulere ekspressionen af ​​MITF og melanogene enzymer in vivo. Den anti-melanogene aktivitet af Gomisin N blev yderligere bekræftet i humane melanom MNT-1 celler stimuleret af rapamycin. Selvom Gomisin N kun resulterede i små ændringer i melaninindholdet i MNT-1-celler (figur 1D), var det effektivt til at vende rapamycin-induceret opregulering af MITF, TRP-1 og TRP-2 i en koncentrationsafhængig måde (figur 6A,C-E). Samlet set er den regulatoriske effekt afGomisin Npå MITF og melanogene enzymer blev reproducerbart fundet i muse- og menneskeceller såvel som i zebrafiskembryoner.

For at opsummere antyder dette arbejde, at Gomisin N kan have et højt potentiale som romanhudblegningagent. Gomisin N ser ud til at hæmmemelanogeneseved at undertrykke udtrykkelsen af ​​MITF via MC1R-vejen, i stedet for direkte at modulere den katalytiske aktivitet aftyrosinaseog TRP'er. Selvom detaljerede mekanismer stadig mangler at blive belyst, er Gomisin N-induceret depigmentering sandsynligvis forbundet med aktiveringen af ​​PI3K/Akt- og MAPK/ERK-vejene (figur 7).

4. Materialer og metoder

4.1. Materialer

RPMI1640 blev købt fra Gibco-BRL (Gaithersburg, MD, USA). Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM), føtalt bovint serum (FBS) og penicillin-streptomycin (PS) blev købt fra Hyclone (Carlsbad, CA, USA). Melanocytvækstmedium blev købt fra PromoCell (Heidelberg, Tyskland). Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetat(TPA), Kojic syre, 1-phenyl-2-thiourea (PTU), svampetyrosinase, 3,{{ 9}}dihydroxy-l-phenylalanin(L-DOPA), -MSH, dimethylsulfoxid (DMSO) og paraformaldehyd blev købt fra SigmaChemical Co. (St. Louis, MO, USA).Gomisin Nforbindelsen blev leveret af Chul Young Kim (Hanyang University, Ansan, Korea). Rapamycin blev købt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

4.2. Cellekultur

Musemelanomcellelinjen B16F10 blev leveret fra Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea). Murine melanocyt Melan-A-celler [52] var en generøs gave fra Dr. Byeong Gon Lee (SkinResearch Institute, Amore Pacific Co., Yongin) -si, Korea). Humane MNT-1 melanomceller blev generøst leveret af Aeyeong Lee (Collage of Medicine i Dongguk University, Goyang-si, Korea). Primære normale humane epidermale melanocytter (NHEM) blev købt fra PromoCell (Heidelberg, Tyskland). Melan-A-celler blev dyrket i RPMI 1640-medium (Gibco, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 10 procent FBS, 1 procent PS og 200 nM TPA. DMEM suppleret med 10 procent FBS og 1 procent PS blev brugt til at opretholde Melan-A-celler og NHEM-celler. Alle celler blev inkuberet ved 37 ◦C i en 5 procent CO2-inkubator.

4.3. Måling af melaninindhold

Melan-A-celler blev podet i en 24-brøndsplade (1 × 105 celler/brønd), behandlet medGomisin Nog derefter inkuberet i 72 timer. Efter 72 timer blev melaninindholdet målt som tidligere beskrevet [53]. Kort efter fjernelse af dyrkningsmediet blev cellerne vasket tre gange med PBS. Derefter blev natriumhydroxidopløsning (1 ml, 1 N) tilsat til hver brønd for at opløse melanin. Absorbansen ved 405 nm blev målt under anvendelse af en mikropladelæser. Denne analyse blev gentaget med B16F10-celler (2 × 104 celler/brønd) og MNT-1-celler ved at følge den samme metode.

4.4. Western Blot Analyse

Melan-A-celler blev podet i 100 mm skåle (1 × 106 celler/skål) og behandlet med 1, 5 eller 10 µMGomisin Ni tre dage ved 37 ◦C. Celler blev vasket med PBS og derefter høstet under anvendelse af en skraber. Løsne celler blev anbragt i 1 ml PBS og centrifugeret ved 75 00 rpm i 5 min. Efter fjernelse af den øvre opløsning blev cellepelleter lyseret med lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0,1 procent SDS, 150 mM NaCl, 1 procent NP-40, 0,02 procent natriumazid, 0,5 procent natriumdeoxycholat, 100 µg/ml PMSF, 1 g/ml aprotinin) i 24 timer ved 4 ◦C. Totale proteiner blev ekstraheret ved hjælp af en ultracentrifuge ved 12,000 rpm i 30 minutter ved 4◦C. Proteinindholdet blev målt under anvendelse af Bradford-assayet. Proteiner (30 µg) blev separeret under anvendelse af en 10 procent natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) gel og overført til anitrocellulosemembran. Membranen blev blokeret i 1 time med 5 procent skummetmælk i Tris-bufret saltvand med Tween-20 (TBST), og derefter inkuberet i 12 timer ved 4 ◦C med primære antistoffer rettet mod -tubulin (Santa Cruz, CA, USA ), MITF (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), tyrosinase (Cell Signaling), ERK(Cell Signaling), phospho-ERK (Cell Signaling), AKT (Cell Signaling), phospho-AKT (Cell Signaling), MC1R ( Santa Cruz), adenylylcyclaser 2 (Santa Cruz), TRP-1 (Santa Cruz) og TRP-2 (Santa Cruz). Efter fjernelse af primære antistoffer blev membranerne vasket tre gange med TBST og inkuberet med sekundære antistoffer (kanin-anti-ged-IgG-HRP; muse-anti-kanin-HRP, Santa Cruz) i 1 time. Membranerne blev behandlet med forstærket kemiluminescensreagens ved anvendelse af ChemiDoc XRS plus billeddannelsessystemet (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Densitometriske analyse af båndene blev udført ved hjælp af Image MasterTM 2D Elite-software (version 3.1, GE Healthcare, Chicago, IL, USA).

4.5. Tyrosinaseaktivitetsanalyse

For at vurdere den hæmmende effekt af Gomisin N på svampetyrosinaseaktivitet blev tyrosinase inkuberet med 1, 5 eller 10 µMGomisin Neller den positive kontrol Kojic acid. Hver prøve blev opløst i methanol. L-DOPA (8,3 mM) og svampetyrosinase (125 U) blev fortyndet i 80 mM phosphatbuffer (pH 6,8). 40 µL af hver prøve og 120 µL L-DOPA blev blandet i en 96-brøndsplade, efterfulgt af tilsætning af 40 µL fortyndet svampetyrosinase. Pladerne blev derefter inkuberet i 15 minutter, og absorbansen blev målt ved 490 nm under anvendelse af en mikropladelæser.

Tyrosinaseaktivitet i B16 melanomcellelysater blev målt med eller uden -MSH-behandling, som tidligere beskrevet af Ohguchi et al. [54], med små ændringer. Cellelysat blev fremstillet som beskrevet ovenfor i Western Blot-analysedelen. Totale proteiner i supernatanten blev målt ved Bradford-assay under anvendelse af bovint serumalbumin som standard [55]. En lige stor mængde proteiner blev fortyndet og brugt til tyrosinaseaktivitetsassayet.

hæmmer tyrosinaseaktivitet

4.6. L-DOPA-farvning i NHEM-celler

NHEM-celler blev podet i en {{0}}brøndsplade og inkuberet i 72 timer med Gomisin N. Celler blev fikseret med 4 procent paraformaldehyd i 40 min, efterfulgt af behandling med 0,1 procent Triton X{ {6}} i 2 min. L-DOPA (0,1 procent) blev tilsat til hver brønd, efterfulgt af inkubation i 2 timer. Efter fjernelse af opløsningen blev cellerne vasket to gange med PBS. Billeder blev fotograferet med mikroskop.

4.7. Zebrafisk eksperimenter

Zebrafiskembryoner blev opnået fra Zebrafish Resource Bank (Daegu, Korea). Embryoner blev behandlet med Gomisin N i 72 timer. Den depigmenterende effekt afGomisin Npå zebrafisk blev embryoner observeret under stereomikroskopet. Til Western blot-analyse blev Gomisin N-behandlede embryoser lyseret under anvendelse af lysisbuffer, hvorfra totale proteiner blev fremstillet som nævnt ovenfor.

5. Konklusioner

Vores resultat understøtter synspunktet om, at Gomisin N har et højt potentiale for brug som en funktionel fødevare oghudblegningagent.Gomisin Ner en af ​​de vigtigste lignanforbindelser i S. Chinensis. Faktisk, S. Chinensis er et naturlægemiddel, der bruges til at helbrede mange menneskelige sygdomme. Yderligere epidemiologiske undersøgelser er imidlertid nødvendige for at bevise sikkerheden af ​​Gomisin N på huden. Som følge heraf vil in vivo undersøgelser og kliniske forsøg være i stand til tydeligere at demonstrere effektiviteten af ​​GomisinN. Afslutningsvis tyder denne undersøgelse på detGomisin Nkan være et potentielt hypo-pigmentært middel og naturligthudblegningkandidat til kosmetikindustrien.

cistanche forbedre blegning

Referencer

1. Alaluf, S.; Atkins, D.; Barrett, K.; Blount, M.; Carter, N.; Heath, A. Virkningen af ​​epidermal melanin på objektive målinger af menneskelig hudfarve. Pigment Cell Res. 2002, 15, 119-126. [CrossRef] [PubMed]

2. D'Mello, SA; Finlay, GJ; Baguley, BC; Askarian-Amiri, ME signalveje i melanogenese. Int. J.Mol. Sci. 2016, 17, 1144. [CrossRef] [PubMed]

3. Slominski, A.; Tobin, DJ; Shibahara, S.; Wortsman, J. Melaninpigmentering i pattedyrs hud og dens hormonelle regulering. Physiol. Rev. 2004, 84, 1155-1228. [CrossRef] [PubMed]

4. Herrling, T.; Jung, K.; Fuchs, J. Melanins rolle som beskytter mod frie radikaler i huden og dets rolle som friradikalindikator i hår. Spectrochim Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 2008, 69, 1429-1435. [CrossRef] [PubMed]

5. Brozyna, AA; Jozwicki, W.; Roszkowski, K.; Filipiak, J.; Slominski, AT Melaninindhold i melanommetastaser påvirker resultatet af strålebehandling. Oncotarget 2016, 7, 17844–17853. [CrossRef] [PubMed]

6. Slominski, A.; Wortsman, J.; Plonka, PM; Schallreuter, KU; Paus, R.; Tobin, DJ Pigmentering af hårsækkene.J. Undersøg. Dermatol. 2005, 124, 13-21. [CrossRef] [PubMed]

7. Slominski, A.; Zmijewski, MA; Pawelek, J. L-tyrosin og L-dihydroxyphenylalanin som hormonlignende regulatorer af melanocytfunktioner. Pigment Cell Melanoma Res. 2012, 25, 14-27. [CrossRef] [PubMed]

8. Lee, AY Nylige fremskridt i melasma-patogenese. Pigment Cell Melanoma Res. 2015, 28, 648-660. [CrossRef][PubMed]9. Speeckaert, R.; van Gele, M.; Speeckaert, MM; Lambert, J.; van Geel, N. Hyperpigmenteringssyndromernes biologi. Pigment Cell Melanoma Res. 2014, 27, 512-524. [CrossRef] [PubMed]

10. Slominski, RM; Zmijewski, MA; Slominski, AT Melaninpigmentets rolle i melanom. Exp. Dermatol.2015, 24, 258-259. [CrossRef] [PubMed]11. Slominski, A.; Wortsman, J.; Tobin, DJ Det kutane serotoninerge/melatoninerge system: Sikring et sted under solen. FASEB J. 2005, 19, 176-194. [CrossRef] [PubMed]

12. Sarkar, R.; Arora, P.; Garg, KV Cosmeceuticals til hyperpigmentering: Hvad er tilgængeligt? J. CutaneousAesthet. Surg. 2013, 6, 4-11. [CrossRef] [PubMed]

13. Miyamura, Y.; Coelho, SG; Wolber, R.; Miller, SA; Wakamatsu, K.; Zmudzka, BZ; Ito, S.; Smuda, C.; Passeron, T.; Choi, W.; et al. Regulering af menneskelig hudpigmentering og reaktioner på ultraviolet stråling. Pigment Cell Res. 2007, 20, 2-13. [CrossRef] [PubMed]

14. Davis, EC; Callender, VD Postinflammatorisk hyperpigmentering: En gennemgang af epidemiologien, kliniske funktioner og behandlingsmuligheder i farvet hud. J. Clin. Æstet. Dermatol. 2010, 3, 20-31. [PubMed]

15. Salgs-Campos, H.; Souza, PR; Peghini, BC; da Silva, JS; Cardoso, CR En oversigt over de modulerende virkninger af oliesyre i sundhed og sygdom. Mini. Rev. Med. Chem. 2013, 13, 201-210. [CrossRef] [PubMed]

16. Parvez, S.; Kang, M.; Chung, HS; Cho, C.; Hong, MC; Shin, MK; Bae, H. Undersøgelse og mekanisme af huddepigmenterende og lysende midler. Phytother. Res. 2006, 20, 921-934. [CrossRef] [PubMed]

17. Luo, L.; Jiang, L.; Geng, C.; Cao, J.; Zhong, L. Hydroquinon-induceret genotoksicitet og oxidativ DNA-skade i HepG2-celler. Chem. Biol. Interagere. 2008, 173, 1-8. [CrossRef] [PubMed]

18. Enguita, FJ; Leitao, AL Hydroquinon: Miljøforurening, toksicitet og mikrobielle svar. BioMed Res. Int. 2013, 2013, 542168. [CrossRef] [PubMed]

19. Draelos, ZD Hudlysende præparater og hydroquinon-kontroversen. Dermatol. Ther. 2007, 20.308-313. [CrossRef] [PubMed]

20. Koo, JH; Lee, I.; Yun, SK; Kim, HU; Park, BH; Park, JW Forsæbet natlysolie reducerer melanogenese i B16 melanomceller og reducerer UV-induceret hudpigmentering hos mennesker. Lipider 2010,45, 401-407. [CrossRef] [PubMed]

21. Cordell, GA; Colvard, MD Naturprodukter og traditionel medicin: At tænde på et paradigme. J. Nat. Prod.2012, 75, 514–525. [CrossRef] [PubMed]

22. Panossian, A.; Wikman, G. Pharmacology of Schisandra Chinensis Bail: En oversigt over russisk forskning og anvendelser i medicin. J. Ethnopharmacol. 2008, 118, 183-212. [CrossRef] [PubMed]

23. Chen, P.; Pang, S.; Yang, N.; Meng, H.; Liu, J.; Zhou, N.; Zhang, M.; Xu, Z.; Gao, W.; Chen, B.; et al. Gavnlige virkninger af Schisandrin B på hjertefunktionen i musemodel for myokardieinfarkt. PLoS ONE 2013, 8,e79418. [CrossRef] [PubMed]

24. Lee, HJ; Jo, S.; Ryu, J.; Jeong, HS; Lee, G.; Ryu, MH; Jung, MH; Kim, H.; Kim, BJ Effekter af SchisandraChinensis Turcz. frugt på kontaktdermatitis induceret af dinitrofluorbenzen hos mus. Mol. Med. Beretning 2015,12, 2135–2139. [CrossRef] [PubMed]

25. Chun, JN; Cho, M.; Så jeg.; Jeon, JH De beskyttende virkninger af Schisandra Chinensis frugtekstrakt og dets lignaner mod kardiovaskulær sygdom: En gennemgang af de molekylære mekanismer. Fitoterapia 2014, 97, 224–233.[CrossRef] [PubMed]

26. Kang, OH; Chae, HS; Choi, JH; Choi, HJ; Park, PS; Cho, SH; Lee, GH; Så HY; Choo, YK; Kweon, OH; et al. Virkninger af Schisandra Fructus-vandekstraktet på cytokinfrigivelse fra en humanmastcellelinje. J. Med. Mad 2006, 9, 480–486. [CrossRef] [PubMed]

27. Poma, A.; Bianchini, S.; Miranda, M. Inhibering af L-tyrosin-induceret mikronuclei-produktion af phenylthiourea i humane melanomceller. Mutat. Res. 1999, 446, 143-148. [CrossRef]

28. Kim, HJ; Kim, IS; Dong, Y.; Lee, IS; Kim, JS; Kim, JS; Woo, JT; Cha, BY Melanogenese-inducerende effekt af cirsimaritin gennem stigninger i mikroftalmi-associeret transkriptionsfaktor og tyrosinaseekspression. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 8772-8788. [CrossRef] [PubMed]

29. Busca, R.; Abbe, P.; Mantoux, F.; Aberdam, E.; Peyssonnaux, C.; Eychene, A.; Ortonne, JP; Ballotti, R. Rasmedierer den cAMP-afhængige aktivering af ekstracellulære signalregulerede kinaser (ERK'er) i melanocytter.EMBO J. 2000, 19, 2900-2910. [CrossRef] [PubMed]

30. Busca, R.; Ballotti, R. Cyclic AMP en nøglebudbringer i reguleringen af ​​hudpigmentering. Pigment Cell Res.2000, 13, 60-69. [CrossRef] [PubMed]

31. Hah, YS; Cho, HY; Lim, TY; Park, DH; Kim, HM; Yoon, J.; Kim, JG; Kim, CY; Yoon, TJ Induktion af melanogenese af rapamycin i humane MNT-1 melanomceller. Ann. Dermatol. 2012, 24, 151-157. [CrossRef][PubMed]

32. Yun, WJ; Kim, EY; Park, JE; Jo, SY; Bang, SH; Chang, EJ; Chang, SE Mikrotubule-associeret proteinlet kæde 3 er involveret i melanogenese via regulering af MITF-ekspression i melanocytter. Sci. Rapport.2016, 6, 19914. [CrossRef] [PubMed]

33. Spritz, RA; Høre, VJ, Jr. Genetiske pigmentforstyrrelser. Adv. Hum. Genet. 1994, 22, 1-45. [PubMed]

34. Kadekaro, AL; Chen, J.; Yang, J.; Chen, S.; Jameson, J.; Swope, VB; Cheng, T.; Kadakia, M.; Abdel-Malek, Z. -melanocyt-stimulerende hormon undertrykker oxidativt stress gennem ap53-medieret signalvej i humane melanocytter. Mol. Cancer Res. 2012, 10, 778-786. [CrossRef] [PubMed]

35. Wasmeier, C.; Hume, AN; Bolasco, G.; Seabra, MC Melanosomer på et blik. J. Cell Sci. 2008, 121,3995-3999. [CrossRef] [PubMed]

36. Brozyna, AA; Jozwicki, W.; Carlson, JA; Slominski, AT Melanogenese påvirker overordnet og sygdomsfri overlevelse hos patienter med stadium III og IV melanom. Hum. Pathol. 2013, 44, 2071-2074. [CrossRef] [PubMed]

37. Slominski, A.; Kim, TK; Brozyna, AA; Janjetovic, Z.; Brooks, DL; Schwab, LP; Skobowiat, C.; Jozwicki, W.;Seagroves, TN Melanogenesens rolle i reguleringen af ​​melanomadfærd: Melanogenese fører til stimulering af HIF-1-ekspression og HIF-afhængige ledsagende veje. Arch. Biochem. Biofys. 2014, 563,79-93. [CrossRef] [PubMed]

38. Kim, HJ; Lee, JH; Shin, MK; Hyun Leem, K.; Kim, YJ; Lee, MH Inhiberende virkning af Gastrodia elata ekstraktion på melanogenese i HM3KO melanomceller. J. Cosmet. Sci. 2013, 64, 89-98. [PubMed]

39. Hemesath, TJ; Pris, ER; Takemoto, C.; Badalian, T.; Fisher, DE MAP kinase forbinder transkriptionsfaktoren Mikrophthalmia til c-Kit-signalering i melanocytter. Nature 1998, 391, 298-301. [PubMed]

40. Pris, ER; Ding, HF; Badalian, T.; Bhattacharya, S.; Takemoto, C.; Yao, TP; Hemesath, TJ; Fisher, DElineage-specifik signalering i melanocytter. C-kit-stimulering rekrutterer p300/CBP til mikroftalmi.J. Biol. Chem. 1998, 273, 17983-17986. [CrossRef] [PubMed]

41. Bertolotto, C.; Abbe, P.; Hemesath, TJ; Bille, K.; Fisher, DE; Ortonne, JP; Ballotti, R. Microphthalmiagene-produkt som en signaltransducer i cAMP-induceret differentiering af melanocytter. J. Cell Biol. 1998, 142.827-835. [CrossRef] [PubMed]

42. Pogenberg, V.; Ogmundsdottir, MH; Bergsteinsdottir, K.; Schepsky, A.; Phung, B.; Deineko, V.; Milewski, M.; Steingrimsson, E.; Wilmanns, M. Begrænset leucin-lynlås-dimerisering og specificitet af DNA-genkendelse af melanocyt-masterregulatoren MITF. Genes Dev. 2012, 26, 2647-2658. [CrossRef] [PubMed]

43. Flaherty, KT; Hodi, FS; Fisher, DE Fra gener til lægemidler: Målrettede strategier for melanom. Nat. Rev. Cancer2012, 12, 349-361. [CrossRef] [PubMed]

44. Lee, TH; Seo, JO; Baek, SH; Kim, SY Inhiberende virkninger af resveratrol på melaninsyntese i ultraviolet B-induceret pigmentering i marsvineskind. Biomol. Ther. 2014, 22, 35-40. [CrossRef] [PubMed]

45. Su, TR; Lin, JJ; Tsai, CC; Huang, TK; Yang, ZY; Wu, MO; Zheng, YQ; Su, CC; Wu, YJ Inhibering af melanogenese af gallussyre: Mulig involvering af PI3K/Akt, MEK/ERK og Wnt/-cateninsignalvejene i B16F10-celler. Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 20443-20458. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Yajima, I.; Kumasaka, MY; Thang, ND; Goto, Y.; Takeda, K.; Yamashita, O.; Iida, M.; Ohgami, N.; Tamura, H.; Kawamoto, Y.; et al. RAS/RAF/MEK/ERK og PI3K/PTEN/AKT-signalering i malignt melanomprogression og terapi. Dermatol. Res. øv. 2012, 2012, 354191. [CrossRef] [PubMed]

47. Kim, DS; Kim, SY; Moon, SJ; Chung, JH; Kim, KH; Cho, KH; Park, KC Ceramid hæmmer celleproliferation gennem AKT/PKB-inaktivering og nedsætter melaninsyntese i Mel-Ab-celler. Pigment Cell Res. 2001, 14, 110-115. [CrossRef] [PubMed]

48. Kim, JH; Baek, SH; Kim, DH; Choi, TY; Yoon, TJ; Hwang, JS; Kim, MR; Kwon, HJ; Lee, CH Nedregulering af melaninsyntese ved at have A og dets anvendelse på in vivo lynmodel. J.Investig. Dermatol. 2008, 128, 1227-1235. [CrossRef] [PubMed]

49. Hartman, ML; Czyz, M. MITF i melanom: Mekanismer bag dets udtryk og aktivitet. Cell Mol.Life Sci. 2015, 72, 1249-1260. [CrossRef] [PubMed]

50. Kim, DS; Hwang, ES; Lee, JE; Kim, SY; Kwon, SB; Park, KC Sphingosine-1-phosphat reducerersmelaninsyntese via vedvarende ERK-aktivering og efterfølgende MITF-nedbrydning. J. Cell Sci. 2003, 116,1699-1706. [CrossRef] [PubMed]

51. Xu, W.; Gong, L.; Haddad, MM; Bischof, O.; Campisi, J.; Ja, ET; Medrano, EE Regulering af mikrophthalmi-associeret transkriptionsfaktor MITF-proteinniveauer ved association med theubiquitin-konjugerende enzym hUBC9. Exp. Cell Res. 2000, 255, 135-143. [CrossRef] [PubMed]

52. Bennett, DC; Cooper, PJ; Hart, IR En linje af ikke-tumorigene musemelanocytter, syngene med B16-melanomet og kræver en tumorpromotor for vækst. Int. J. Cancer 1987, 39, 414-418. [CrossRef][PubMed]

53. Meira, WV; Heinrich, TA; Cadena, SM; Martinez, GR Melanogenese hæmmer respiration i B16-F10-melanomceller, hvorimod mitokondriecelleindholdet forbedres. Exp. Cell Res. 2017, 350, 62-72. [CrossRef][PubMed]

54. Ohguchi, K.; Tanaka, T.; Iliya, I.; Ito, T.; Iinuma, M.; Matsumoto, K.; Akao, Y.; Nozawa, Y. Gnetol som en potenttyrosinaseinhibitor fra slægten Gnetum. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003, 67, 663-665. [CrossRef] [PubMed]

55. Uchida, R.; Ishikawa, S.; Tomoda, H. Hæmning af tyrosinaseaktivitet og melaninpigmentering af 2-hydroxytyrosol. Acta Pharm. Sinica B 2014, 4, 141-145. [CrossRef] [PubMed]