Funktionel reaktionsevne af T-hukommelsesceller fra COVID-19-patienter

for flere oplysninger:ali.ma@wecistanche.com

Ece Tavukcuoglua,, Utku Horzum1 a,, Ahmet Cagkan Inkaya1 , Serhat Unal ,bb Gunes Esendaglia, *

en afdeling for grundlæggende onkologi, Hacettepe University Cancer Institute, Ankara, Tyrkiet

b Institut for Infektionssygdomme, Det Medicinske Fakultet, Hacettepe University, Ankara, Tyrkiet

Nøgleord: SARS-CoV-2 CentralhukommelseT-celler, effektorhukommelseT-celler, Spike S1-glykoprotein Dendritiske celler T-hjælperceller Cytotoksiske T-lymfocytter

ABSTRAKT: Tilstedeværelsen afhukommelseT-celler hos COVID-19-patienter er blevet anerkendt, uanset hvilken funktionelle styrkehukommelsesvar er afgørende for beskyttelse. I denne undersøgelse, naiv, effektor, effektorhukommelse og centralhukommelseCD4 plus og CD8 plus T-celler opnået fra COVID-19 overlevende blev genudsat for autologe monocyt-afledte DC'er, der var fyldt med SARS-CoV-2 spike glycoprotein S1. Spredningskapacitet, CD25, 4-1BB og PD-1

ekspression, og IFN-, IL-6, granzyme, granulysin og FasL sekretion blev forbedret i CD4 plus og CD8 plus effektorhukommelseog centralthukommelseT-celler. Skønt det er på heterogene niveauerhukommelseT-celler fra personer med COVID-19 historie har funktionelle kapaciteter til at genoplive antiviral immunitet mod SARS-CoV-2.

Klik for atCistanche deserticola ma til forbedring af hukommelsen

1. Introduktion

På trods af de nye data om coronavirus sygdom 2019 (COVID-19), er immunresponset på det alvorlige akutte respiratoriske syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) stadig ikke bedre defineret. Styrken og varigheden af ​​de humorale og cellulære responser mod SARS-CoV-2 er blevet forbundet med neutraliserende antistoffer oghukommelseT-celler [1,2]. Især spike glycoprotein-S1 bærer betydelig immunodominans, da de neutraliserende antistoffer blokerer dets binding til det angiotensin-konverterende enzym 2 (ACE2) og hindrer den virale indtræden [3]. Desuden viste cirka 50 procent af patienterne S1-specifikke T-celleresponser [4,5].

Ikke desto mindre har den observerede heterogenitet blandt COVID-19-tilfældene en forvirrende effekt. Mens størstedelen af ​​patienterne udvikler antiviral immunitet, er selv de rekonvalescente individer muligvis ikke beskyttet mod geninfektionen, som potentielt skyldes den utilstrækkelige størrelse og/eller stabilitet af T-celle- og antistofproduktion [6-8]. Spændende nok, ved alvorlige SARS-CoV-2-infektioner, er interaktionen mellem CD4 plus hjælper-T (Th)-celler og B-celler sløvet i germinalcentret, hvilket potentielt dæmper antistofresponsets levetid [9]. Sammen med Th-aktiviteterne er robustheden af ​​CD8 plus cytotoksiske T-celler også afgørende for en vellykket anti-viral immunitet [10]. Tidligere var tilstedeværelsen af ​​CD4 plus eller CD8 plushukommelseT-celler blev rapporteret i COVID-19, ikke desto mindre skal disse cellers funktionelle kapacitet behandles grundigt [11-13]. I denne undersøgelse, den funktionelle lydhørhed af naiv, effektor, centralhukommelse, og effektorhukommelse CD4 plus eller CD8 plus T-celler, som blev opnået fra patienter med COVID-19 historie, mod monocyt-afledte dendritiske celler (DC'er), der bærer SARS-CoV-2 S1 antigen, er bekræftet.

2. Materiale og metoder

2.1. Patienter og prøvetagning

På to forskellige tidspunkter blev perifere blodprøver frisk indsamlet fra patienterne, der var kommet sig fra COVID-19 (tabel 1), og perifere mononukleære blodceller blev adskilt af 1,077 g/ml Ficoll-densitetsgradient (Sigma-Aldrich). Alle protokoller blev godkendt af de lokale etiske komiteer og Republikken Tyrkiets sundhedsministerium. informeret samtykke blev indhentet fra patienterne. Patienter med positiv RT-PCR-test og/eller seropositivitet blev inkluderet i undersøgelsen. De kliniske symptomer blev kategoriseret som milde (de ikke-indlagte patienter), moderate (de patienter, der havde moderat lungebetændelse) og alvorlige (de patienter, der havde svær lungebetændelse og var indlagt i mere end 5 dage). Blodprøver fra raske donorer [n=10 (6 kvinder, 4 mænd), medianalder 33 (min 28-max 55)] uden SARS-CoV-2 historie og seropositivitet blev brugt som kontroller.

2.2. Etablering af monocyt-afledte DC- og T-celle co-kulturer

DC'er blev genereret fra monocytter (CD14 MACS, Miltenyi) i henhold til en tidligere offentliggjort protokol [14]. Antigenladning med det rekombinante S1-protein (S1; 10 µg/ml, Abcam) eller HIV Gag-antigen (10 µg/mL, TUBITAK Marmara Research Center) [15] eller tetanustoksoidet (TT; 10 µg/ml, Turk Ilac ) blev samtidig initieret med modningen af ​​monocyt-afledte DC'er med LPS (1 µg/ml, Sigma-Aldrich). Modne monocyt-afledte DC'er genereret i fravær af en

specifikt antigen blev anvendt som kontroller. Ved afslutningen af ​​7-dag lang inkubation blev de monocyt-afledte DC'er karakteriseret som en CD11bhiCD14loCD1a plus CD83 plus population.

Fra den samme COVID-19 patient, autolog naiv T (TN), terminalt differentieret effektor T (TEMRA), centralhukommelseT (TCM) og effektorhukommelseT (TEM)-celler blev oprenset (Større end eller lig med 96 procent) af FACS (FACSaria II; Becton Dickinson) som CD3-uberørte, CD19- og CD56- negative lymfocytter ifølge til den differentielle ekspression af CD45RA-, CD45RO- og CCR7-markører (fig. 1A).

De monocyt-afledte DC'er (5x104) blev dyrket sammen med de oprensede undertyper af T-celler (10)5 i 96 timer i en rundbundet 96-brøndspladebrønd indeholdende 200 µL RPMI 1640-medier komplet med 10 procent FBS , 1 procent penicillin/streptomycin (Biological Industries), 5 ng/mL IL-2 (Bio-

Legende). Forud for samdyrkning blev T-celleundertyperne mærket med 5 µM CFSE (BioLegend). Som en positiv kontrol blev et anti-CD3-antistof (HIT3a, 25 ng/ml; BioLegend) tilsat til co-kulturerne. Den eksperimentelle opsætning er opsummeret i fig. 1A.

2.3. Immunfænotypning og funktionsrelaterede assays ved flowcytometri

Immunfænotypning blev udført med monoklonale antistoffer anti-human-CD4 (OKT4), -CD8 (RPA-T8), -CD56 (MEM-188), -CD19 (SJ25C1), -CD45RA (HI100), -CD45RO (UCHL1) ), -CCR7 (G043H7), -CD25 (M-A251), -CD38 (HIT2), -4-1BB (4B4-1), -PD-1 (NAT105), -CD14 (M5E2), -CD11b (ICRF44) (BioLegend); -CD1a (REA736), -CD83 (REA714) (Miltenyi). Median fluorescensintensitet (MFI) værdier blev bestemt på CD4 plus og CD8 plus T-celler og ifølge CFSE fortynding.

Ændringen i MFI blev beregnet ved at sammenligne dataene fra co-kulturerne med de antigenladede DC'er og kontrol DC'erne.

Procentdelen af ​​T-celler med CFSE-fortynding blev vurderet for spredning. Den antigenspecifikke proliferationskapacitet af T-celler blev beregnet som ændringen i proliferation, hvor dataene fra co-kulturerne med kontrolmonocyt-afledte DC'er blev brugt som normalisatorer. De opsamlede supernatanter blev anvendt i en multipleks ELISA (LEGEND-plex, BioLegend). Alle flowcytometriske analyser blev udført på en FACSAria II sorteringsindretning.

2.4. Statistisk analyse

Resultaterne præsenteres som median ± SEM. Kruskal-Wallis test og Bonferroni korrektion blev brugt til de statistiske analyser. AP værdi<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Resultater

Efter inkubationen med S{{0}}DC blev en lille procentdel af prolifererende T-celler identificeret (interval procent, CD4 plus, TN {{10}}.49–6.8, TEMRA 3,29–7,7, TCM 0.38–20.2, TEM 0,2– 16,7; intervalprocent , CD8 plus , TN 0,64–5,6, TEMRA 2,16– 10,3, TCM0,8– 15, TEM 1,6-19,4). Både CD4 plus og CD8 plus TCM og TEM celler udviste en betydeligt øget frekvens af proliferation end de naive eller effektor T celle populationer (fig. 1B). CD4 plus TCM-celler og CD8 plus TEM-celler udviste den højeste proliferative aktivitet. CD4 plushukommelseT-celleproliferation kunne induceres hos ~90 procent af COVID-19 patienterne, men CD8 plushukommelseT-celleproliferation blev kun påvist i ~60 procent af patienterne (fig. 1B). De monocyt-afledte DC'er blev også fyldt med et irrelevant viralt antigen, HIV Gag; forventeligt blev der ikke opnået nogen signifikant respons i T-cellerne fra COVID-19-overlevere (fig. 1C). På samme måde reagerede T-cellerne fra de raske individer ikke på S1-DC. På den anden side tjente den monocyt-afledte DC, der præsenterede TT-antigenet som en positiv kontrol for T-cellerhukommelsesvar (fig. 1C). Derudover var overfladeekspressionen af ​​visse aktiveringsrelaterede markører, især CD25, PD-1 og 4-1BB, signifikant opreguleret på S1-responsive T-celler (fig. 1D). De S1-DC-stimulerede TEM-celler udskilte de højeste niveauer af IFN- og IL-6, som i vid udstrækning produceres af type 1 CD4 plus T-celler og CD8 plus cytotoksiske T-celler. Markørerne for cytotoksisk respons, granzym A, granulysin, Fas-ligand (FasL) og især granzym B var også forhøjede i de co-kulturer, der huser TEM-celler fra COVID-19-patienter (fig. 1E). Co-kultursupernatanterne, hvorfra de opløselige faktorer blev målt, indeholdt mediatorerne udskilt af T-celler og DC'er; således, som angivet i litteraturen, kan moderate mængder af cytokinerne såsom TNF-, IL-6, IL-4 og IFN- også produceres af DC [16,17]. I nogle tilfælde reagerede de ikke-hukommelses-T-celler på S1-DC, opregulerede CD38- og 4-1BB-ekspressionen og udskillelsen af ​​IL-4 og TNF- (fig. 1) . Heterogenitet blev også bemærket mellem de undersøgte T-celleparametre og tidspunktet for blodprøvetagning efter bedring, sværhedsgraden af ​​kliniske symptomer eller niveauet af anti-S1-antistoffer (data ikke vist).

4. Diskussion

Hos COVID-19-overlevende bibeholdt de cirkulerende S1-specifikke TEM- og TCM-celler funktionel reaktionsevne og viste forøgede effektorkapaciteter såsom aktivering, proliferation og sekretion af immunmediatorer. Selvom den proliferative reaktion ihukommelseCD8 plus T-celler var ikke så potente som i CD4 plushukommelseT-celler tyder vores data på, at disse celler hurtigt kan udvikle sig til en effektortilstand, når de udsættes for SARS-CoV-2 S1-antigen. TEM-cellerne er kritiske gatekeepere, da de har en tendens til at lokalisere sig i væv, der er tilbøjelige til at invadere af den patogene mikroorganisme, hvorimod TCM-cellerne rekrutteres ind i de sekundære lymfoide organer for at accelerere immunreaktionerne, der indledes af de antigen-præsenterende DC'er [18]. Selvom det dækker et begrænset antal COVID-19-tilfælde, husede størstedelen af ​​patienterne i vores undersøgelse TEM- og TCM-celler, der funktionelt reagerede på S1-protein i form af mindst én testet parameter. Disse foreløbige resultater kan indikere en sandsynlig forskel mellem T-cellers funktionelle kompetence og COVID-19 sværhedsgrad. En tidligere undersøgelse rapporterede en højere frekvens af S1-specifikke T-celler end de T-celler, der er specifikke for N- og M-proteiner [8]. Tilsvarende mangler T-cellernes funktionelle reaktionsevne over for andre SARS-CoV-2-antigener at blive bedre belyst. For nylig offentliggjorte skelsættende arbejde viste tilstedeværelsen af ​​langsigtedehukommelsei T-cellerne fra COVID-19 patienter [19,20]. Ved at bruge en særskilt eksperimentel tilgang, hvor de autologe monocyt-afledte DC'er blev brugt som et muligt element til at teste T-celle-responset, bekræftede vores undersøgelse funktionen og karakteren af ​​T-celler, der tidligere er nævnt hos personer med COVID-19-historie. Akkumulering af beviser på immuniteten etableret hos COVID-19-overlevende ville give en bedre forståelse af sygdomspatogenese, terapeutiske tilgange og vaccineudvikling.

Fig. 1. Vurdering af funktionelle responser i T-celler fra COVID-19-overlevere. A) Grafisk oversigt over forsøgsopstillingen er vist. Monocyt-afledte dendritiske celler blev genereret fra individer med COVID-19 historie og fyldt med SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein-S1 (S1-DC); derefter autolog naiv T (TN), terminalt differentieret effektor T (TEMRA), centralhukommelseT (TCM) og effektorhukommelseT (TEM) celler blev oprenset og co-dyrket med disse DC'er. T-celleproliferation, ekspression af aktiveringsmarkører og cytokinsekretion blev målt efter 96 timers inkubation. B) Ændring i CD4 plus og CD8 plus T-celleproliferation blev plottet for hver patient sammenlignet med den opnået med kontrol co-kulturer med monocyt-afledte DC'er uden specifik antigenbelastning. Repræsentative flowcytometrihistogrammer er givet på højre side. Co-kulturerne stimuleret med et anti-CD3 monoklonalt antistof tjente som en teknisk positiv kontrol for T-celleproliferation. C) De patientafledte TCM- og TEM-cellers proliferationsrespons mod S{{1{{20}}}}DC blev sammenlignet med dem, der blev opnået med HIV Gag eller med tetanustoxoid (TT)-antigenet -belastede DC'er. T-celler og S1-DC'er opnået fra raske individer (S1(hd)) blev også brugt som kontroller. D) Ændringer i CD4 plus og CD8 plus T-celle aktiveringsmarkørniveauer blev vist i sammenligning med dem opnået med kontrol co-kulturer med monocyt-afledte DC'er uden specifik antigenbelastning. E) Mængden af ​​T-celle-associerede cytokiner udskilt i co-kultur supernatanterne blev vurderet. (*p < 0,05,="" **p=""><>

CRediT forfatterskabsbidragserklæring

Ece Tavukcuoglu: Undersøgelse, visualisering, formel analyse, skrivning - gennemgang og redigering. Utku Horzum: Undersøgelse, Visualisering, Formel analyse, Skrivning - gennemgang og redigering. Ahmet Cagkan Inkaya: Konceptualisering, ressourcer. Serhat Unal: Konceptualisering, ressourcer. Gunes Esendagli: Konceptualisering, skrivning - gennemgang og redigering, supervision.

Erklæring om konkurrerende interesse

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen kendte konkurrerende økonomiske interesser eller personlige forhold, der kunne have set ud til at påvirke det arbejde, der er rapporteret i dette papir.

Referencer

[1] A. Mazzoni, L. Maggi, M. Capone, M. Spinicci, L. Salvati, MG Colao, A. Vanni, ST Kiros, J. Mencarini, L. Zammarchi, E. Mantengoli, L. Menicacci, E. Caldini, S. Romagnani, F. Liotta, A. Morettini, GM Rossolini, A. Bartoloni, L. Cosmi, F. Annunziato, Cellemedierede og humorale adaptive immunresponser på SARS-CoV-2 er lavere i asymptomatiske end symptomatiske COVID-19-patienter, Eur. J. Immunol. 50 (2020) 2013-2024.

[2] Y. Tan, F. Liu, X. Xu, Y. Ling, W. Huang, Z. Zhu, M. Guo, Y. Lin, Z. Fu, D. Liang, T. Zhang, J. Fan, M. Xu, H. Lu, S. Chen, Holdbarhed af neutraliserende antistoffer og T-cellerespons efter SARS-CoV-2-infektion, Front. Med. 14 (2020) 746-751.

[3] C. Conte, F. Sogni, P. Affanni, L. Veronesi, A. Argentiero, S. Esposito, Vaccines against coronaviruses: The State of the Art, Vaccines (Basel) 8 (2020).

[4] CK Li, H. Wu, H. Yan, S. Ma, L. Wang, M. Zhang, X. Tang, NJ Temperton, RA Weiss, JM Brenchley, DC Douek, J. Mongkolsapaya, BH Tran, CL Lin, GR Screaton, JL Hou, AJ McMichael, XN Xu, T-celleresponser på hele SARS-coronavirus hos mennesker, J. Immunol. 181 (2008) 5490-5500.

[5] M. Koblischke, MT Traugott, I. Medits, FS Spitzer, A. Zoufaly, L. Weseslindtner,C. Simonitsch, T. Seitz, W. Hoepler, E. Puchhammer-Stockl, SW Aberle, M. Fodinger, A. Bergthaler, M. Kundi, FX Heinz, K. Stiasny, JH Aberle, Dynamics of CD4 T cell and antibody responses in COVID-19-patienter med forskellig sygdomsgrad, Front. Med. (Lausanne) 7 (2020), 592629.

[6] GA Polen, IG Ovsyannikova, RB Kennedy, SARS-CoV-2-immunitet: gennemgang og ansøgninger til fase 3-vaccinekandidater, Lancet 396 (2020) 1595-1606.

[7] R. Zhou, KK To, YC Wong, L. Liu, B. Zhou, X. Li, H. Huang, Y. Mo, TY Luk, TT Lau, P. Yeung, WM Chan, AK Wu, KC Lung, OT Tsang, WS Leung, IF Hung, KY Yuen, Z. Chen, Akut SARS-CoV-2-infektion svækker dendritiske celle- og T-celleresponser, Immunity 53 (2020) 864–877 e{ {7}}.

[8] A. Grifoni, D. Weiskopf, SI Ramirez, J. Mateus, JM Dan, CR Moderbacher, SARawlings, A. Sutherland, L. Premkumar, RS Jadi, D. Marrama, AM de Silva, A. Frazier, AF Carlin, JA Greenbaum, B. Peters, F. Krammer, DM Smith, S. Crotty, A. Sette, Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals, Cell, 181 (2020) 1489-1501 e1415.

[9] PF Canete, CG Vinuesa, COVID-19 får B-celler til at glemme, men T-celler husker, Celle 183 (2020) 13-15.

[10] I. Schulien, J. Kemming, V. Oberhardt, K. Wild, LM Seidel, S. Killmer, F. Sagar, MS Daul, A. Lago, H. Decker, B. Luxenburger, D. Binder, O Bettinger, S. Sogukpinar, M. Rieg, D. Panning, M. Huzly, G. Schwemmle, CF Kochs, A. Waller, D. Nieters, F. Duerschmied, HE Emmerich, AR Mei, S. Schulz, DA Llewellyn -Lacey, T. Price, B. Boettler, R. Bengsch, M. Thimme, C.-H. Hofmann, Karakterisering af allerede eksisterende og inducerede SARS-CoV-2-specifikke CD8(plus) T-celler, Nat. Med. 27 (2021) 78-85.

[11] I. Odak, J. Barros-Martins, B. Bosnjak, K. Stahl, S. David, O. Wiesner, M. Busch, M.

M. Hoeper, I. Pink, T. Welte, M. Cornberg, M. Stoll, L. Goudeva, R. Blasczyk, A. Ganser, I. Prinz, R. Forster, C. Koenecke, CR Schultze-Florey, Reappearance af effektor-T-celler er forbundet med genopretning fra COVID-19, EBioMedicine 57 (2020), 102885.

[12] AE Oja, A. Saris, CA Ghandour, NAM Kragten, BM Hogema, EJ Nossent, LMA Heunks, S. Cuvalay, E. Slot, F. Linty, FH Swaneveld, H. Vrielink, G. Vidarsson, T. Rispens, E. van der Schoot, RAW van Lier, A. Ten Brinke, P. Hombrink, Divergent SARS-CoV-2-specifikke T- og B-celleresponser hos svære, men ikke milde COVID-19-patienter , Eur. J. Immunol. 50 (2020) 1998-2012.

[13] B. Kratzer, D. Trapin, P. Ettel, U. Kormoczi, A. Rottal, F. Tuppy, M. Feichter, P. Gattinger, K. Borochova, Y. Dorofeeva, I. Tulaeva, M. Weber, K. Grabmeier-Pfistershammer, PA Tauber, M. Gerdov, B. Muhl, T. Perkmann, I. Fae, S. Wenda, H. Fuhrer , R. Henning, R. Valenta, WF Pickl, Immunologisk aftryk af COVID-19 på humane perifere blodleukocytpopulationer, Allergy (2020).

[14] AM Bruger, C. Vanhaver, K. Bruderek, G. Amodio, E. Tavukcuoglu, G. Esendagli,S. Gregori, S. Brandau, P. van der Bruggen, Protokol til vurdering af undertrykkelse af T-celleproliferation ved human MDSC, Methods Enzymol. 632 (2020) 155-192.

[15] SA Younes, B. Yassine-Diab, AR Dumont, MR Boulassel, Z. Grossman, JP Routy, RP Sekaly, HIV-1-viræmi forhindrer etableringen af ​​interleukin 2-, der producerer HIV-specifikkehukommelseCD4 plus T-celler udstyret med proliferativ kapacitet, J. Exp. Med. 198 (2003) 1909-1922.

[16] DM Frucht, T. Fukao, C. Bogdan, H. Schindler, JJ O'Shea, S. Koyasu, IFN-gamma-produktion af antigen-præsenterende celler: mekanismer opstår, Trends Immunol. 22 (2001) 556-560.

[17] EO Gubernatorova, EA Gorshkova, OA Namakanova, RV Zvartsev, J. Hidalgo, MS Drutskaya, AV Tumanov, SA Nedospasov, Ikke-redundante funktioner af IL-6 produceret af makrofager og dendritiske celler i allergisk luftvejsinflammation, Foran. Immunol. 9 (2018) 2718.

[18] YD Mahnke, TM Brodie, F. Sallusto, M. Roederer, E. Lugli, The who's who of T-cell differentiation: humanhukommelseT-celle undergrupper, Eur. J. Immunol. 43 (2013) 2797-2809.

[19] JM Dan, J. Mateus, Y. Kato, KM Hastie, ED Yu, CE Faliti, A. Grifoni, SI Ramirez, S. Haupt, A. Frazier, C. Nakao, V. Rayaprolu, SA Rawlings, B Peters, F. Krammer, V. Simon, EO Saphire, DM Smith, D. Weiskopf, A. Sette, S. Crotty, Immunologicalhukommelsetil SARS-CoV-2 vurderet i op til 8 måneder efter infektion, Science 371 (2021).

[20] LB Rodda, J. Netland, L. Shehata, KB Pruner, PA Morawski, CD Thouvenel, KK Takehara, J. Eggenberger, EA Hemann, HR Waterman, ML Fahning, Y. Chen,M. Hale, J. Rathe, C. Stokes, S. Wrenn, B. Fiala, L. Carter, JA Hamerman, NP King, M. Gale, Jr., DJ Campbell, DJ Rawlings, M. Pepper, Functional SARS-CoV{ {2}}specifikt immunforsvarhukommelsevedvarer efter mild COVID-19, Cell, 184 (2021) 169-183 e117.