Bestemmelse af fem komponenter i Rehmannia Glutinosa og etablering af HPLC-fingeraftryk

Abstrakt:Bestemmelsesmetoden for indholdet af fem komponenter iRehmannia glutinosa, nemligrehmannoside D, leonurin,echinacoside,cistancheside Aogverbascoside, blev etableret, og højtydende væskekromatografi (HPLC) fingeraftryk af Rehmannia glutinosa blev etableret for at give et videnskabeligt grundlag for kvalitetskontrollen af ​​Rehmannia glutinosa. Shiseido CAPCELL PAK C18 søjlen blev brugt med acetonitril-0.1% myresyreopløsning som mobil fase, gradienteluering, søjletemperatur på 30 grader, variabel bølgelængdebestemmelse og strømningshastighed på 1,0 ml/min. HPLC-fingeraftrykket af Rehmannia glutinosa blev analyseret af "Kinesisk medicin kromatografisk fingeraftryk lighed evalueringssystem (2012 Edition)" software to evaluate its quality consistency. The results showed that according to the established content determination method, the five components had a good linear relationship within their respective concentration ranges (R2>{{0}}.999 0), RSD for præcisionstest, repeterbarhedstest og stabilitetstest var 0.12%~1.58%, og den gennemsnitlige prøvegendannelsesrate var 96.5% ~98,6%; det etablerede Rehmannia glutinosa HPLC-fingeraftryk identificerede 23 almindelige toppe, og ligheden mellem Rehmannia glutinosa-prøven og kontrolfingeraftrykket var 0.904~0,950. Resultaterne tyder på, at den etablerede indholdsbestemmelsesmetode og HPLC-fingeraftryk er velegnet til evaluering af Rehmannia glutinosa kvalitet og identifikation af rå Rehmannia glutinosa og kogt Rehmannia glutinosa, med høj nøjagtighed og god reproducerbarhed, og kan yde teknisk support til kvalitetskontrol af Rehmannia glutinosa medicinske materialer.

Nøgleord:Rehmannia glutinosa; indholdsbestemmelse; fingeraftryk; kvalitetsevaluering

NY URTE CISTANCHE MEDECHINACOSIDE,CISTANCHESIDE AOGVERBASCOSIDE

Rehmannia glutinosaer den friske eller tørrede rodknold fra Scrophulariaceae-planten Rehmannia glutinosa Libosch. På grund af forskellige forarbejdningsmetoder er det hovedsageligt opdelt i frisk rehmannia, rå rehmannia og kogt rehmannia [1-2]. De vigtigste produktionsområder er Henan, Shanxi, Shaanxi osv. jord. Blandt dem har rå rehmannia glutinosa virkningerne af at fjerne varme og afkøle blod, nære yin og fremme væskeproduktion og bruges hovedsageligt til at behandle varme i blodet, varme toksiner og pletter osv.; kogt rehmannia glutinosa har virkningerne af nærende blod og yin, genopfyldning af essens og genopfyldning af marv, og bruges hovedsageligt til at behandle blodmangel, klorose osv. Hjertebanken, rastløshed osv.[1-2]. De to har forskellige egenskaber og smag, men begge tilhører lever- og nyremeridianerne. Rehmannia glutinosa indeholder komplekse kemiske komponenter, hovedsageligt inklusive iridoider, iononer, phenylethanolglycosider, flavonoider osv. [3-5].

Efter at Rehmannia glutinosa er behandlet ved forskellige behandlingsmetoder, varierer typerne, indholdet og proportionerne af kemiske komponenter i hvert forarbejdet produkt meget, hvilket resulterer i betydelige forskelle i dets farmakologiske aktivitet [6-10]. ifølge

Relaterede undersøgelser[11-12] viser, at i processen med Rehmannia glutinosa, der skifter fra "rå" til "kogt", faldt indholdet af kemiske komponenter såsom catalpol, motherwort, stachyose og aminosyrer alle væsentligt, og indholdet af fructose, 5-hydroxymethylfurfural osv. Indholdet af , isorebascosid osv. var signifikant øget. På nuværende tidspunkt bruger kvalitetskontrollen af ​​rå og kogt rehmannia glutinosa hovedsageligt indholdet af catalpol og rehmanniaside D som evalueringsindikatorer. Evalueringssystemets indikatorer er relativt enkeltstående, hvilket gør det vanskeligt at kontrollere kvaliteten af ​​rehmannia glutinosa fuldstændigt. Derudover har undersøgelser vist, at indholdet af rehmannia glutinosa D ændrer sig før og efter forarbejdning. Den er lille og har ringe specificitet til at karakterisere sammensætningsændringerne efter bearbejdning og bearbejdningsgraden [12-13].

Derfor, for at evaluere kvaliteten af ​​Rehmannia glutinosa mere omfattende, etablerede denne undersøgelse forholdet mellem rehmanniaside D og Yimu i Rehmannia glutinosa.

Bestemmelsesmetoder for indholdet af fem almindelige komponenter, herunder glucosid, echinaceaside, cistancheosid A og verbascoside, og etablerede et HPLC-fingeraftryk af Rehmannia glutinosa for at analysere indholdet af hovedkomponenterne i Rehmannia glutinosa fra forskellige produktionsområder og før og efter forarbejdning, for at give information til kvalitetskontrol af Rehmannia glutinosa. Teknisk support.

Instrumenter, reagenser og testmedicin

Agilent 1260 højtydende væskekromatograf (detektor er diodearray); elektronisk analytisk balance med variabelt interval (METTLER TOLEDO); digital ultralydsrenser (Shanghai Ultrasonic Instrument Factory, KH-500DE). Methanol (Sinopharm Group) er analytisk kvalitet; acetonitril (Merck) er kromatografisk kvalitet; vand er Watsons flaskevand. Rehmannia glutinosa D referencestof (batchnummer RFSD8401909016, renhed 98,0%), leonurus glycosid referencestof (batchnummer RFS-Y22002208010, renhed 98,0%) og cistancheside A referencestof (batch) nummer RFS-R05002009014, renhed 96,0%) blev alle købt fra Chengdu Ruifensidedan Biotechnology Co., Ltd.; echinacoside-referencestof (batchnummer 111670-201907, renhed 91,8 %) og verbascoside-referencestof (batchnummer 11530-201914, renhed 95,2 %) blev alle købt fra China Food and Drug Inspection Institutes. Rehmannia-prøver (SX1~SX4, HN1 og HN2) blev indsamlet fra forskellige produktionsområder (se tabel 1), hvoraf SX4 og HN2 blev dampet af henholdsvis SX1 og HN1, og SX2 og SX3 blev indsamlet fra det samme produktionsområde. Alle prøver blev identificeret som autentiske af Song Pingshun, kinesisk ledende læge ved Gansu Provincial Institute of Drug Control.

Tabel 1 Information om sædprøver fra Rehmanniae

2.1 Kromatografiske forhold

Shiseido CAPCELL PAK C18 (250.0 mm×4,6 mm, 5 μm) søjlen blev brugt, acetonitril blev brugt som mobil fase A, og 0,1 % myresyreopløsning blev brugt som mobil fase B Gradientelueringsbetingelserne var: 0-3 min, 1%A; 3-9 min, 1%A→5%A; 9-24 min, 5%A→35%A; 24-35 min, 35%A→65%A; 35-40 min., 65 %A→90 %A. Variabel bølgelængdedetektion (0-24 min, 203 nm; 24-40 min, 330 nm). Injektionsvolumenet var 15 μL af referenceopløsningen og 20 μL af prøveopløsningen.

2.2 Klargøring af opløsning

2.2.1 Forberedelse af referenceopløsning

Tag passende mængder af ovenstående fem referencestoffer, tilsæt 70% methanol for at fremstille en blandet referenceopløsning med en massekoncentration på 0,4 mg/ml.

2.2.2 Forberedelse af testopløsning

Vej ca. 1,0 g Rehmannia-pulver (passet gennem sigte nr. 2), vej nøjagtigt, anbring i en konisk kolbe med prop, tilsæt nøjagtigt 25 mL 70 % methanol, forsegl, vej, ultralydsbehandle (effekt 300) W, frekvens 50 kHz) i 30 min., lad det afkøle til stuetemperatur, vej igen, fyld den tabte masse op med 70 % methanol, filtrer og tag filtratet for at opnå.

2.3 Metodisk undersøgelse

2.3.1 Specificitetsundersøgelse

Tag den blandede referenceopløsning under "2.2.1" og testopløsningen (prøve SX1) under "2.2.2", og injicer og mål i henhold til de kromatografiske betingelser under "2.1". Resultaterne viser, at kromatogrammet af Rehmannia-prøven viser en kromatografisk top med samme retentionstid som referencestandarderne for Rehmannia glutinosa D, Leonurin, Echinacoside, Cistanche deserticola A og Verbascoside (se figur 1), hvilket indikerer, at denne metode har stærke specificitet.

2.3.2 Lineær sammenhængsundersøgelse

Tilsæt 70 % methanol til den blandede referenceopløsning, fortynd henholdsvis 5 gange, 10 gange, 25 gange, 50 gange, 100 gange og 250 gange, og injicer og mål i henhold til de kromatografiske betingelser under "2.1". Standardkurverne blev tegnet med massekoncentrationen af ​​hver reference som den vandrette akse (x) og det tilsvarende kromatografiske topareal som den lodrette akse (y). Resultaterne er vist i tabel 2, hvilket indikerer, at hver komponent har et godt lineært forhold inden for det tilsvarende massekoncentrationsområde.

1. rehmanniosid D; 2. leonurid; 3. echinacosid; 4. castanosid A;5. akteosid

Figur 1 Kromatogrammer af specificitetsundersøgelse

Tabel 2 Lineær sammenhæng mellem 5 komponenter i Semen Rehmanniae

2.3.3 Præcisionsundersøgelse

Tag testopløsningen (prøve SX1) under "2.2.2", og udfør injektionstesten i henhold til de kromatografiske betingelser under "2.1". Injicer prøven 6 gange kontinuerligt, noter toparealet af hver komponent, og beregn toparealet RSD for rehmannia glutinosa D, motherwort glycosid, echinacea glycosid, cistanche glycosid A og verbascoside i testprøven til at være 0. 46 %, 0,12 %, 0,85 %, 0,48 % og 0,82 %, hvilket indikerer, at instrumentet har god præcision.

2.3.4 Gentagelsesundersøgelse

Seks prøver af den samme Rehmannia-rodprøve (SX1) blev fremstillet parallelt ifølge metoden i "2.2.2" og injiceret og bestemt i overensstemmelse med de kromatografiske betingelser i "2.1". RSD'erne for indholdet af rehmannia rodglycosid D, motherwort glycosid, echinacea glycosid, cistanche glycosid A og verbascoside i de seks prøver var 0.46%, 0.69%, 1.42%, {{ 12}}, henholdsvis 48 % og 1,58 %, hvilket indikerer, at metoden har god repeterbarhed.

2.3.5 Stabilitetsundersøgelse

Tag testopløsningen (prøve SX1) under "2.2.2" og injicer og mål i henhold til de kromatografiske forhold under "2.1" ved 0 t, 2 t, 4 t, 6 t, 8 t, 1{{ henholdsvis 15}} t, 12 t, 18 t og 24 t. RSD for topområderne for rehmannia glutinosa D, motherwort glycosid, echinacosid, cistanche glycosid A og verbascoside var 0.94%, 1.04%, 0.73% hhv. 0,83 % og 0,71 %, hvilket indikerer, at testopløsningen har god stabilitet inden for 24 timer.

2.3.6 Prøvegenvindingshastighed

{{0}},5 g Rehmannia-rodprøve (SX1) med kendt indhold af 5 komponenter blev nøjagtigt vejet i en konisk kolbe med prop, og 6 parallelle portioner blev tilsat, og 5 referenceopløsninger af bestemte koncentrationer blev tilsat henholdsvis. Prøverne blev fremstillet ifølge metoden under "2.2.2", og prøverne blev injiceret og målt i overensstemmelse med de kromatografiske betingelser under "2.1". Genvindingsgraden blev beregnet, og resultaterne er vist i tabel 3. Den gennemsnitlige prøvegenvindingsrate for hver komponent var 96,5%~98,6%, og RSD var 0,73%~1,52%, hvilket indikerer, at metoden har god nøjagtighed.