Farnesyltransferasehæmmer LNK-754 dæmper aksonal dystrofi og reducerer amyloidpatologi i mus, del 1

Abstrakt

Baggrund:

Amyloid plakaflejring og aksonal degeneration er tidlige begivenheder i AD-patogenese. A forstyrrer mikrotubuli i præsynaptiske dystrofiske neuritter, hvilket resulterer i akkumulering af svækkede endolysosomale og autofagiske organeller, der transporterer -site amyloid precursor protein spaltningsenzym (BACE1). Følgelig genererer dystrofiske neuritter A42 og bidrager væsentligt til plakaflejring.

Axonal degeneration er en neurologisk lidelse, der forårsager skade på neuronernes axoner og derved påvirker nerveledning. Immunitet er en vigtig forsvarslinje for den menneskelige krop til at modstå invasionen af ​​fremmede bakterier og vira. Så er der en sammenhæng mellem aksonal degeneration og immunitet?

For det første er aksonal degeneration ikke en sygdom forårsaget af immunsystemet, så der er ingen grund til at bekymre sig om immunitet, der påvirker det negativt. Selvom den specifikke årsag til aksonal degeneration er ukendt, tyder nogle undersøgelser på, at aksonal degeneration kan være relateret til inflammatoriske reaktioner i immunsystemet. Den inflammatoriske reaktion er en beskyttende mekanisme af immunsystemet mod invasionen af ​​fremmede patogener. Men hvis det er overaktiveret, vil det forårsage inflammatorisk skade på neuroner og fremme aksonal degeneration.

For det andet kan et stærkt immunsystem forbedre kroppens modstandskraft og mindske risikoen for infektion og sygdom, hvilket er særligt vigtigt for patienter med aksonal degeneration. Fordi nervesystemet hos patienter med aksonal degeneration er blevet beskadiget, er kroppens selvreparerende evne relativt svag. Hvis de lider af andre sygdomme, vil tilstanden forværres og yderligere påvirke deres livskvalitet. Derfor kan opretholdelse af en sund kost og levevaner og øge immuniteten hjælpe med at reducere risikoen for andre sygdomme. Samtidig kan det forbedre kroppens immunrespons og fremme reparationen af ​​axoner og genoprettelse af nerveledning.

Sammenfattende, selvom der ikke er nogen nødvendig sammenhæng mellem aksonal degeneration og immunitet, kan et sundt immunsystem give den nødvendige beskyttelse og støtte til patienter med aksonal degeneration. Derfor bør vi være opmærksomme på vigtigheden af ​​at vedligeholde immunforsvaret, med udgangspunkt i aspekter som kost og levevaner, og aktivt forbedre kroppens immunniveau for at lægge et solidt fundament for sundhed og lang levetid. Det kan ses, at vi skal forbedre hukommelsen, og Cistanche deserticola kan forbedre hukommelsen markant, fordi Cistanche deserticola er et traditionelt kinesisk medicinsk materiale, der har mange unikke effekter, hvoraf en er at forbedre hukommelsen. Effektiviteten af ​​hakket kød kommer fra de forskellige aktive ingredienser, det indeholder, herunder syre, polysaccharider, flavonoider osv. Disse ingredienser kan fremme hjernens sundhed på en række forskellige måder.

Klik på kend 10 måder at forbedre hukommelsen på

Farnesyltransferase-hæmmere (FTI'er) er for nylig blevet undersøgt for repositionering mod behandling af neurodegenerative lidelser og blokerer virkningen af ​​farnesyltransferase (FTase) for at katalysere farnesylering, en post-translationel modifikation, der regulerer proteiner involveret i lysosomfunktion og mikrotubulus stabilitet. I postmortem AD hjerner opreguleres FTase og dens downstream-signalering. Imidlertid er virkningen af ​​FTI'er på amyloidpatologi og dystrofiske neuritter ukendt.

Metoder:

Vi testede virkningerne af FTIR LNK-754 og lonafarnib i 5XFAD-musemodellen for amyloidpatologi.

Resultater:

Hos 2-måneder gamle 5XFAD-mus, der blev behandlet kronisk i 3 måneder, reducerede LNK-754 amyloidplakbyrden og tau-hyperphosphorylering og svækkede akkumuleringen af ​​BACE1 og LAMP1 i dystrofiske neuritter. Hos 5-måneder gamle 5XFAD-mus, der blev behandlet akut i 3 uger, reducerede LNK-754 dystrofisk neuritstørrelse og LysoTracker-Green-akkumulering i fravær af effekter på A-aflejringer. Akut behandling med LNK-754 forbedrede hukommelse og indlæringssvigt hos hAPP/PS1 amyloidmus.

I modsætning til LNK-754 var behandling med lonafarnib mindre effektiv til at reducere plaques, tau-hyperfosforylering og dystrofiske neuritter, hvilket kunne være et resultat af reduceret styrke mod FTase sammenlignet med LNK-754. Vi undersøgte virkningerne af FTI'er på den aksonale handel med endolysosomale organeller og fandt, at lonafarnib og LNK-754 forbedrede retrograd aksonal transport i primære neuroner, hvilket indikerer, at FTI'er kunne understøtte modningen af ​​axonale sene endosomer til lysosomer. Ydermere øgede FTI-behandling niveauer af LAMP1 i primære muse-neuroner og hjernen fra 5XFAD-mus, hvilket viser, at FTI'er stimulerede biogenesen af ​​endolysosomale organeller.

Konklusioner:

Vi viser nye data, der tyder på, at LNK-754 fremmede den aksonale trafficking og funktionen af ​​endolysosomale kompartmenter, hvilket vi antager, nedsat aksonal dystrofi, reduceret BACE1-akkumulering og hæmmet amyloidaflejring i 5XFAD-mus. Vores resultater stemmer overens med tidligere arbejde, der identificerer FTase som et terapeutisk mål til behandling af proteinopatier og kan have vigtige terapeutiske implikationer i behandling af AD.

Nøgleord:

Alzheimers sygdom, Dystrofiske neuritter, Farnesyltransferasehæmmere.

Baggrund

Alzheimers sygdom (AD) er en progressiv neurodegenerativ sygdom, der er den mest almindelige årsag til demens i den aldrende befolkning og er karakteriseret ved betydelig svækkelse af indlæring og hukommelse. På molekylært niveau er kendetegn ved AD-hjernen opbygningen af ​​amyloid- (A ) plaques og tilstedeværelsen af ​​hyperphosphorylerede tau-inklusioner.

I de tidlige, asymptomatiske stadier af AD akkumuleres A i hjernen i mere end to årtier eller længere før indtræden af ​​hukommelsessvækkelse [1-3]. Følgelig har reduktion af hjernens A-niveauer været det centrale fokus i behandlingsstrategier for AD [4]. I øjeblikket er den eneste sygdomsmodificerende behandling, der er betinget godkendt af FDA, et anti-A-antistof, der fjerner aggregerede former af A fra hjernen [5], hvilket bekræfter, at målretning af A i hjernen er en lovende tilgang til AD-behandling.

De fleste kliniske forsøg med fokus på A har imidlertid mislykkedes på grund af sikkerheds- eller effektivitetsproblemer, og der er nu lagt vægt på mål baseret på forskellige hypoteser om AD, herunder tau-udbredelse, inflammation, calcium-dyshomeostase og neurovaskulære faktorer [4, 6, 7 ]. Derudover er der stigende interesse for det terapeutiske potentiale ved at aktivere lysosomale nedbrydningsveje som en metode til at reducere patogene proteiner, en funktion, der er almindelig på tværs af neurodegenerative sygdomme [8-12].

Omfattende dysfunktion af endolysosomale og autofagiske veje er veldokumenteret som en tidlig begivenhed af AD-patogenese. Mange AD-modtageligheds genetiske loci er forbundet med subcellulær endolysosomal transport og lysosomfunktion [13], og forstørrede dysfunktionelle endolysosomale og autofagiske organeller akkumuleres i AD-hjernen inden for dystrofiske neuritter [14, 15].

Dystrofiske neuritter ser ud til at blive initieret ved neuronal skade, og i AD foreslås dette at være destabilisering af mikrotubuli af A [16]. Dette resulterer i fokale aksonale hævelser, der forstyrrer de normale trafik- og nedbrydningsveje for nøgleproteiner involveret i A-produktion, inklusive BACE1 [16, 17]. Som et resultat genererer dystrofier A42 og bidrager væsentligt til ekstracellulær plakaflejring og aksonal dystrofi [18], hvilket initierer en feed-forward-vej, hvilket resulterer i synaptisk tab, neurodegeneration og kognitive underskud [16].

Terapeutiske strategier, der forbedrer transporten og aktiviteten af ​​endolysosomale og autofagiske organeller, kunne forhindre neuritisk dystrofi ved at opretholde nedbrydningen af ​​patogene proteiner og være en kritisk mekanisme til at reducere BACE1- og A-niveauer i AD.

Efterhånden som søgningen fortsætter efter en effektiv AD-behandling, er antallet af genbrugte lægemidler i kliniske forsøg for AD vokset betydeligt, da klinisk evaluerede lægemidler har kendte sikkerheds- og effektivitetsproblemer, hvilket fremskynder lægemiddeludviklingsprocessen [7, 19]. I de senere år har undersøgelser identificeret FTI'er som værende en klasse af lægemidler med potentiale til at blive genbrugt til behandling af neurodegenerative sygdomme.

FTI'er hæmmer farnesylering, en post-translationel modifikation, der regulerer proteiner, hvor farnesylpyrophosphat er kovalent modificeret til cysteinrester i proteiner, der indeholder et CAAX-motiv [20]. FTI'er blev oprindeligt designet til at blokere onkogen Ras-aktivitet ved at hæmme dets prenylering, men blev afbrudt i kliniske forsøg til cancerbehandling efter opdagelsen af ​​alternative Ras-prenyleringsveje [21, 22].

Imidlertid eksisterer mange FTase-substrater [23-25], hvilket fører til evaluering af FTI'er for en bred vifte af lidelser, herunder hjerte-kar-sygdomme, hepatitis D og progeria [20, 26]. Derudover har FTI'er vist lovende mod neurodegenerative sygdomme karakteriseret ved akkumulering af proteinaggregater. I gnaver- og cellekulturmodeller af proteinopatier inducerer FTI'er lysosomal aktivitet og proteolyse af sygdomsspecifikke toksiske proteiner [8, 9, 27, 28].\

Tidligere har vi vist, at LNK-754, en FTI testet i cancerforsøg, forbedrede lysosomal hydrolase-handel og nedsatte alfa-synuclein (-synuclein) aggregater i Parkinsons sygdom (PD) patientafledte neuroner og PD musemodeller [8 ].

Andre undersøgelser har rapporteret lignende resultater af FTI'er til at reducere proteinaggregater; behandling af cellekulturmodeller af PD med FTI-277 reduceret -synuclein [28] og lonafarnib, en FDA-godkendt FTI til behandling af progeria [29], øget lysosomal aktivitet og reducerede tau-inklusioner i en musemodel for tauopati [ 9]. Desuden viste en nylig undersøgelse, at genetisk knockout af neuronal FTase i APP/PS1 musemodellen af ​​AD forhindrede A-generation [30]. Fokus for tidligere undersøgelser, der evaluerer FTI'er for proteinopatier, har været rollen af ​​FTase-substrater i lysosomaktivitet og autofagi.

Imidlertid er FTI'er også kendt for at fremme mikrotubulus (MT) stabilitet og synergi med MT-stabiliserende lægemidler for at forbedre tubulinacetylering gennem en Ras-uafhængig vej [31-33]. MT-stabilisering hæmmer AD-patologi i APP/PS1-mus [34], og i øjeblikket undersøges adskillige MT-stabiliserende midler klinisk til behandling af AD [35]. Derfor tyder væsentlige beviser på, at FTI'er kan gavne sygdomme karakteriseret ved dysfunktionelle proteinhomeostasemekanismer såsom AD. Alligevel er de mål og veje, der forbinder proteinfarnesylering med nedsatte proteinaggregater i neurodegenerative sygdomme, ikke fuldt ud forstået.

I denne undersøgelse vurderede vi, om farmakologisk behandling med FTI'er kan forbedre A-associeret AD patologi. Vi evaluerede virkningerne af LNK-754 og lonafarnib, to FTI'er, der er kendt for at reducere proteinaggregater i neurodegenerative lidelser, på plaquebyrde og dystrofiske neuritter i 5XFAD-musemodellen for amyloidpatologi. Vores resultater giver indsigt i de veje, der påvirkes af FTase-hæmning og understøtter kraftigt yderligere undersøgelse af genanvendelse af FTI'er som et terapeutisk middel til AD og andre neurodegenerative sygdomme karakteriseret ved opbygning af proteinaggregation.

Materialer og metoder

Dyr og medicinbehandlinger

Alt dyrearbejde blev udført af Northwestern University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) godkendelse. Mus blev fodret med en standard gnaverfoder-diæt og vand ad libitum og holdt med en standard 12-timers lys/mørke-cyklus. 5XFAD-mus på en C57BL6-baggrund (Jackson Laboratories) blev opretholdt ved at krydse transgen-positive hemizygote C57BL6-hanmus med transgen-negative C57BL6-hunmus (Jackson Laboratories).

I vores kroniske behandlingsprotokol blev lægemiddelbehandlinger påbegyndt ved 2 måneders alderen, den alder, hvor plakaflejring begynder [36, 37]. I den akutte behandlingsprotokol blev lægemiddelbehandling påbegyndt ved 5 måneders alderen, hvorefter plakaflejring og aksonal degeneration er udbredt [38, 39].

LNK{{0}} blev syntetiseret af Link Medicine (Massachusetts USA), og lonafarnib blev opnået fra Cayman Chemical Company (Ann Harbor, MI). Til dyrebehandlinger blev LNK-745 og lonafarnib fremstillet i en opvarmet opløsning af 0,5 % carboxymethylcellulose (Sigma-Aldrich) som vehikel i en koncentration på 0,10 mg/ml, indtil opløsningen var opløst, og opløsningen blev klar.

Alikvoter til injektion blev frosset ved -20 grader og derefter optøet og opbevaret ved 4 grader for hver uges behandling. Mus blev behandlet efter en etableret protokol kendt for at øge lysosomaktivitet [8]. I den kroniske behandlingsprotokol blev 2-måned gamle 5XFAD-mus injiceret ved intraperitoneal (ip) injektion med enten vehikel, LNK754 eller lonafarnib dagligt ved hjælp af en 29-måler insulinsprøjte i 12 uger, indtil musene var 5 måneder gammel. I det akutte behandlingsregime blev 5-måned gamle 5XFAD-mus injiceret dagligt i 3 uger.

Efter afslutning af behandlinger blev mus bedøvet og perfunderet, og hjerner blev opsamlet til yderligere analyser (se afsnittene nedenfor). Til cellekultureksperimenter blev LNK-754 og lonafarnib opløst i DMSO og tilsat til muse primære neuronkulturer ved en koncentration på 10nM i 48 timer. Vehikelbehandlingen var en ækvivalent mængde DMSO. Celler blev opsamlet og analyseret som beskrevet nedenfor.

Antistoffer

Antistofferne anvendt til immunfluorescenseksperimenter var rotte anti-LAMP1 (#1D4B, DSHB), kanin anti-A 42 (#700254, Invitrogen), kanin anti-BACE1 (#ab108394, Abcam), kanin anti-III tubulin (#ab18207,#ab18207,#ab18207 Abcam). Til immunblotting var de anvendte antistoffer kanin anti-aktin (#926-42.210, LI-COR), kanin antip44/42 MAPK (pErk1/2) (#CS9101, Cell Signaling Technology), kanin anti-44/42 (Erk1/2) (#CS137F5, Cell Signaling Technology), kanin anti-LAMP1 (#CS3234, Cell Signaling Technology), mus anti-BACE (3D5; Zhao et al., 2007), mus anti-APP (6E10) ( #803001, BioLegend), kanin anti-p-tau (ser404) (#CS20194, Cell Signaling Technology), mus anti-Tau1 (#MAB3420, Millipore Sigma), prelamin-A, (#MABPT858, Millipore Sigma) og mus anti -HDJ-2 (#sc-59,554, Santa Cruz). Sekundære anti-kanin- eller museantistoffer fra Vector Laboratories blev anvendt til immunoblots.

Adfærdstest

Dyr og lægemiddelbehandling

Adfærdsanalyser blev udført af reMYND, Inc. under anvendelse af hAPP/PS1-musemodellen med neuronspecifik ekspression af en klinisk mutant af det humane amyloid-precursorprotein sammen med en klinisk mutant af humant presenilin 1 [40]. Denne dobbelte transgene mus viser den spontane, progressive akkumulering af A i hjernen, hvilket til sidst resulterer i amyloide plaques i subiculum, hippocampus og cortex ved 6 måneders alderen. 48 hun-hAPP/PS1-mus i FVB x C57Bl/6J-baggrund på 6 måneder blev brugt til denne undersøgelse, i kombination med 12 aldersmatchede hun-vildtypekontroller i FVB x C57Bl/6J-baggrund. Administration af 0,9 mg/kg/dag af LNK-754 blev udført pr. oral sondeernæring, én gang dagligt, i 12 på hinanden følgende dage. Aflivningen af ​​dyrene blev udført 2 timer efter den endelige dosering.

Alle mus blev genotypebestemt ved polymerasekædereaktion (PCR) i en alder af 3 uger og modtog et unikt identitetsnummer, når PCR-resultaterne var kendt. Alle mus blev dobbelttjekket ved en anden PCR før starten af ​​undersøgelsen. Alle mus blev blindrandomiseret og aldersmatchede. Mus blev givet et tilfældigt tal af computeren og tilfældigt tildelt en behandling. Dyrene blev i bur igen af ​​behandlingsgruppen 15 dage før starten af ​​undersøgelsen for at give dem mulighed for at gøre sig bekendt med den nye burkontekst. Mus havde fri adgang til forfiltreret og sterilt vand og standard musefoder (Snif® Ms-H, Snif Spezialdiäten GmbH, Soest, Tyskland). Maden blev opbevaret under tørre og kølige forhold i et godt ventileret lagerrum. Mængden af ​​vand og mad blev kontrolleret dagligt, leveret efter behov og standard opfrisket en gang om ugen. Mus blev indledningsvis anbragt under en omvendt dag-nat-rytme (14 timers lys/10 timers mørke) startende kl. 19.00 i standard metalbure type RVS T2 (areal på 540 cm2).

Burene er udstyret med solide gulve og lag af strøelse. Antallet af mus pr. bur var begrænset af lokal lovgivning om dyrevelfærd. 15 dage før behandlingens start blev mus igen buret i individuelle ventilerede macrolon T2-bure og transporteret til laboratoriet for akklimatisering til laboratoriemiljøet som forberedelse til behandling. I laboratoriet blev dag-nat-rytmen ændret til 12 timers lys/12 timers mørke med start kl.

Morris vandlabyrint

Morris Water Maze blev udført på dag 8-12 af behandlingen, og dyrene blev aflivet direkte efter sondetesten. Poolen (et hvidt, cirkulært kar på 1 m i diameter) indeholdt vand ved 20 grader med titaniumdioxid som et lugtfrit, ikke-toksisk tilsætningsstof til at skjule flugtplatformen (1 cm under vandspejlet). Svømningen af ​​hver mus blev videofilmet og analyseret (Ethovision, Noldus Information Technology, Wageningen, Holland). Før træning blev hver mus placeret oven på platformen i 15 sekunder. Til stednavigationstest blev mus trænet til at lokalisere den skjulte platform i syv blokke af tre forsøg over fire på hinanden følgende dage.

Hvert forsøg består af en tvungen svømmetest på maksimalt 120 sekunder, efterfulgt af 10 minutters hvile. Den tid, hver mus havde brug for at lokalisere platformen, blev målt. De syv på hinanden følgende blokke resulterer i en indlæringskurve. 24 timer efter den sidste træning fik hvert dyr et sondeforsøg med platformen fjernet. Mus fik lov til at søge i 60 sekunder, og kvadrantsøgningstid og krydsninger af den oprindelige platformsposition blev målt. Under den sidste probetest fik mus lov til at søge den tidligere placering af platformen i 60 sekunder efter, at platformen blev fjernet.

Primær neuronkultur

Forhjerner blev dissekeret i Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (Thermo Fisher #14185-052) fra gravide vildtype C57BL6 mus (Jackson) på E15.5 for at opnå primære neuroner. Dissekeret forhjerner blev fordøjet i 2,5% trypsin ved 37 grader i 20 minutter. En ildpoleret Pasteur-pipette blev brugt til at dissociere neuronerne i HBSS. Neuronerne blev derefter udpladet på en poly-L-lysin-coatet plade med seks brønde, 2 × 106 neuroner pr. brønd i neurobasalt medium suppleret med 2 % B-27, 500 μM glutamin, 10 % hesteserum og 2,5 μM glutamat (alt fra Thermo Fisher).

Mediet blev ændret 2 timer senere til Neurobasal med 2% B-27, 500μM glutamin og 2,5μM glutamat. 24 timer senere blev mediet ændret til Neurobasal plus 2% B-27 og 500μM glutamin. Halve medieskift blev foretaget hver 2.-3. dag. Primære neuroner blev dyrket i 7 dage og behandlet med vehikel (DMSO) eller 10 nM koncentrationer af LNK-754 eller lonafarnib i 48 timer. Neuroner blev derefter fikseret eller levende afbildet som beskrevet nedenfor.

Til fiksering blev neuroner inkuberet i 20 minutter i 4% paraformaldehyd, 0.12M saccharose i 1XPBS, permeabiliseret i 0,5% Triton X-100 og inkuberet med primære antistoffer natten over efterfulgt af æsel-anti-mus Alexafuor-konjugerede sekundære antistoffer (Molecular Probes, 1:1000) og co-farvet med 300 nM DAPI. Dækglas blev monteret ved hjælp af Prolong Gold (Molecular Probes), og billeder blev erhvervet på et Nikon A1 konfokalmikroskop med et 60X objektiv (NA 1.4) og NIS Elements-software.

Live billeddannelse af neuroner

Til eksperimenter med levende billeddannelse blev neuroner fremstillet som ovenfor og udpladet i 35 mm glasbunde (MatTek # P35G-1.5-14C) i 7 dage i kultur. 10 nM LNK-754 eller lonafarnib blev derefter tilsat til konditionerede medier, kontrolkulturer blev behandlet med DMSO som vehikel. Efter 48 timers behandling blev mediet erstattet med konditioneret medium fra ubehandlede parallelle plader af neuroner. 25 nM LysoTracker-Green DND-26 (#L7526, Invitrogen) blev tilsat til det konditionerede medium, og neuroner blev inkuberet i 30 minutter ved 37 grader.

Time-lapse billeddannelse af neuroner blev udført ved hjælp af et Ti2 widefield mikroskop. Billeddannelse begyndte straks efter 30 minutter og fortsatte i højst 30 minutter. 1-s eksponeringer blev taget hvert minut, og 20-30 separate områder pr. skål blev afbildet inden for 30 minutter. Afstands- og hastighedskvantificeringerne af LysoTracker-partikler og kymografanalyser blev udført ved hjælp af NIS Elements-software og beskrevet i detaljer nedenfor. I separate eksperimenter blev 1μM Lysosensor-Green DND-189 (#L7535, Invitrogen) føjet til konditionerede medier, og optagne billeder af levende neuroner blev taget i ikke længere end 15 minutter ved hjælp af et Nikon A1 konfokalmikroskop med et 60X objektiv (NA 1.4) og NIS Elements-software.

For more information:1950477648nn@gmail.com