Farnesyltransferase-hæmmer LNK-754 dæmper aksonal dystrofi og reducerer amyloidpatologi i mus, del 2

Live billeddannelse af neuroner

Til eksperimenter med levende billeddannelse blev neuroner fremstillet som ovenfor og udpladet i 35 mm glasbunde (MatTek # P35G-1.5-14C) i 7 dage i kultur. 10nM LNK-754 eller lonafarnib blev derefter tilsat til konditionerede medier, kontrolkulturer blev behandlet med DMSO som vehikel. Efter 48 timers behandling blev mediet erstattet med konditioneret medium fra ubehandlede parallelle plader af neuroner. 25 nM LysoTracker-Green DND-26 (#L7526, Invitrogen) blev tilsat til det konditionerede medium, og neuroner blev inkuberet i 30 minutter ved 37 grader.

Neuroner er en vigtig del af nervesystemet, der er i stand til at modtage, behandle og transmittere information, og er det materielle grundlag for menneskelig intelligens og adfærd. Immunitet er en vigtig garanti for, at den menneskelige krop kan modstå sygdom. Det kan identificere og ødelægge patogener og unormale celler og vedligeholde kroppens sundhed.

Forskning viser, at der er en stærk sammenhæng mellem neuroner og immunsystemet. Neuroner kan påvirke immunsystemet ved at frigive en række neurotransmittere, såsom noradrenalin, epinephrin osv. Disse neurotransmittere kan ændre immuncellernes aktivitet, øge immuncellernes spredning og funktion og forbedre kroppens immunitet. Samtidig kan immunsystemet også påvirke neuronernes funktion gennem forskellige veje. Immunceller kan udskille en række cytokiner og hormoner, hvilket påvirker neuronernes vækst, udvikling og funktion gennem immunbaner.

Derudover kan psykologiske og sociale faktorer påvirke immunitet og neuronal funktion. Negative følelser som stress, angst og depression kan påvirke immunsystemet og neuroner negativt, hvilket reducerer kroppens immunitet. Positive følelser, positive sociale relationer og en sund livsstil kan fremme en sund udvikling af immunitet og neuroner.

For at opsummere er der et interaktivt og gensidigt understøttende forhold mellem neuroner og immunitet. At bevare mental sundhed, se livet positivt i øjnene og tilegne sig gode levevaner kan fremme kroppens immunitet og den sunde udvikling af neuroner. Det kan ses, at vi skal forbedre vores hukommelse. Cistanche deserticola kan forbedre hukommelsen markant, fordi Cistanche deserticola også kan regulere balancen af ​​neurotransmittere, såsom at øge niveauet af acetylcholin og vækstfaktorer. Disse stoffer er meget vigtige for hukommelse og indlæring. Derudover kan kød også forbedre blodgennemstrømningen og fremme ilttilførsel, hvilket kan sikre, at hjernen får tilstrækkelige næringsstoffer og energi, og dermed forbedre hjernens vitalitet og udholdenhed.

Klik på kender måder at forbedre hjernens funktion

Time-lapse billeddannelse af neuroner blev udført ved hjælp af et Ti2 widefield mikroskop. Billeddannelse begyndte straks efter 30 minutter og fortsatte i ikke længere end 30 minutter. 1-s eksponeringer blev taget hvert minut, og 20-30 separate områder pr. skål blev afbildet inden for 30 minutter. Afstands- og hastighedskvantificeringerne af LysoTracker-partikler og kymografanalyser blev udført ved hjælp af NIS Elements-software og beskrevet i detaljer nedenfor. I separate eksperimenter blev 1μM Lysosensor-Green DND-189 (#L7535, Invitrogen) føjet til konditionerede medier, og optagne billeder af levende neuroner blev taget i ikke længere end 15 minutter ved hjælp af et Nikon A1 konfokalmikroskop med et 60X objektiv (NA 1.4) og NIS Elements-software.

Levende billeddannelse af hjernevæv

{{0}}måneder gamle 5XFAD-mus blev ip-injiceret dagligt i 3 uger, og ved afslutning af behandlingen blev mus bedøvet og perfunderet med en opløsning indeholdende 1M KCl, 1M MgCl2, 0.1mM kynurenat , 0,01 mM DL-2-amino-5-phosphonpentansyre, 5 mM glutathion, 25 mM glucose, 125 mM NaCl, 1,4 mM NaH2PO4 og 25 mM NaHCO3.

Hjerner blev derefter hurtigt dissekeret i iskoldt oxygeneret ACSF indeholdende 2,5 mM KCl, 85 mM NaCl, 1,25 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, {{10}},5 mM CaCl2, 4 mM 4 MgCl2, 75 mM glucose, 2 mM glucose, 2 mM. 50uM C6H7NaO6, 0.1mM kynurenat, 0.01mM DL-2-amino-5-phosphonopentansyre og 5mM glutathion. 300 μm koronale skiver blev opnået ved hjælp af en Compresstome VF-200 vibrerende mikrotom (Precision Instruments) og fik lov til at hvile i 30 minutter til restitution ved 32 grader i oxygeneret ACSF-opløsning indeholdende følgende 2,5 mM KCl, 85 mM NaCl, 1,25 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 0,5 mM CaCl2, 4 mM 4 MgCl2, 75 mM saccharose, 25 mM glucose, 50 µM C6H7NaO6, 0,1 mM kynurenat, 0,01 mM DL2-amino-5--amino-{{59}5-phosphos- og aminosyre,

Skiverne blev derefter overført til 35 mm glasbunde (MatTek # P35G-1.5-14C) indeholdende oxygeneret ACSF med 25nM LysoTracker-Green og en 1:10,000 fortynding på 1mg/ ml Tiazinrød (#S570435, Sigma Aldrich), der ellers var identisk med den ACSF, der blev brugt i restitutionsperioden. Skive-levedygtighed blev bekræftet ved brug af time-lapse-billeddannelse af væv. Skiver blev inkuberet med LysoTracker-Green og Tiazine Red i 15 minutter ved stuetemperatur, og derefter blev kortikale hjerneregioner afbildet med det samme i den samme opløsning ved 32 grader på et Nikon A1 konfokalmikroskop med et 60X objektiv (NA 1,4) og NIS Elements software til ikke længere end 30 minutter.

Hjerneekstraktion og immunblotting

Mus blev bedøvet ved intraperitoneal injektion af xylazin (15mg/kg) og ketamin (100mg/kg), perfunderet med fosfatbufret saltvand (1XPBS) med phenylmethylsulfonylfluorid (20ug/ml), leupeptin (0,5 ug/ml), natriumorthovanadat (20 μM) og dithiothreitol (0,1 mM), efterfulgt af hjernefjernelse. Alle buffere anvendt til proteinekstraktion indeholdt proteaseinhibitorcocktail III (#535140, Millipore) og Halt-phosphatasehæmmer (#78420, Thermo Fisher Scientific). Hemibrinevæv blev vejet og manuelt homogeniseret under anvendelse af en dounce-homogenisator 1:10 (w/v) i 1XPBS.

Efter homogenisering blev lysater centrifugeret ved 20,8{{10}}0g i 30 minutter ved 4 grader. Den opløselige fraktion (supernatant) blev fjernet, og pelleten blev resuspenderet ved pipettering i radioimmunpræcipitationsassay (RIPA) buffer [50 mM Tris, 0,15 M NaCl, 1% octylphenoxypolyethoxyethanol (IGEPAL), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,0 mM EGTA, 0,0. % natriumdeoxycholat ved pH8] for at inkubere på is i 30 minutter.

Prøverne blev sonikeret (Misonix XL{{0}}) i 20 sekunder på is og derefter centrifugeret ved 20.800 g i 30 minutter ved 4 grader. Den RIPA-opløselige fraktion (supernatant) blev fjernet, og pelleten blev resuspenderet i 5 M guanidin (pH 8,0) til analyse af uopløselige proteiner. Hver prøve blev sonikeret i 20 sekunder på isen, roteret i 1 time ved stuetemperatur og derefter centrifugeret ved 20.800 g i 30 minutter ved 4 grader. Te bicinchoninsyre (BCA) assay (#23225, Thermo Fisher Scientific) blev brugt til at måle proteinkoncentrationen af ​​hver prøve.

Til western blots blev 20 ug protein af hver prøve sat på 4-12% NuPAGE (Invitrogen) geler og adskilt ved hjælp af MOPS buffer under reducerede og denaturerede betingelser. Proteinerne blev overført til polyvinylidendifluoridmembran og udviklet ved anvendelse af Pierce ECL (forstærket kemiluminescens; Thermo Fisher Scientific). De udviklede signaler blev visualiseret ved hjælp af ProteinSimple FCR (FluorChem R), og de efterfølgende kemiluminescerende signaler blev kvantificeret ved hjælp af AlphaView-software (ProteinSimple). Alle blots blev analyseret ved hjælp af værktøjet Local Background Correction undtagen HDJ-2 blot, som blev analyseret ved hjælp af Background Link-værktøjet i forbindelse med Multi-regional Background Correction (AlphaView-software).

En 42 ELISA

For at måle A42 i hemibranehomogenater fra 5XFAD-mus blev der anvendt en kommercielt tilgængelig Enzyme-LinkedImmunosorbent-Assay (ELISA) (Thermo Fisher Scientific, KHB3441) efter producentens instruktioner til at analysere guanidin og PBS-opløselig A42 i hemibrainer. For at måle A42 i hjernen på hAPP/PS1-mus blev der anvendt en kommercielt tilgængelig ELISA (h amyloid 42 ELISA højsensitiv, Te Genetics Company, Zürich, Schweiz). ELISA blev udført i overensstemmelse med producentens protokol.

Muse hjernevæv immunfluorescens

Efter perfusion blev hjerner ekstraheret, og hemibraer blev fikseret i 10% formalin efterfulgt af kryokonservering i 30% saccharoseopløsning i 1XPBS. En frysende glidende mikrotom blev brugt til at høste 30-μm koronale eller sagittale snit. Sektioner blev seriemæssigt anbragt i en 12-brøndplade i en kryobeskyttende opløsning (1xPBS, 30% saccharose og 30% ethylenglycol) og opbevaret ved -20 grader indtil brug. Immunfluorescensfarvning blev udført ved først at vaske sektioner tre gange i 1XTBS og derefter inkubere sektioner i 16 mM glycin i 1XTBS i 1 time ved stuetemperatur. Efter 3 yderligere vaske i 1XTBS blev sektioner blokeret i 5 % gedeserum i 0,25 % Triton X-100 i 1XTBS i 2 timer ved stuetemperatur.

Sektionerne blev derefter inkuberet natten over i primære antistoffer i en opløsning af 0.25% Triton X-100, 1% bovint serumalbumin og 1XTBS ved 4 grader. Sekundær immunfarvning blev derefter udført med æsel AlexaFluor-mærkede sekundære antistoffer i en koncentration på 1:1000 (Thermo Fisher Scientific). ProLong Gold (#P36934, Thermo Fisher Scientific) blev brugt til at montere sektioner, før de blev afbildet på et Ti2 bredfeltsmikroskop eller et Nikon A1 laserscanning konfokalmikroskop til billedkvantificering ved hjælp af Nikon NIS Elements-software til erhvervelse.

Alle optagelsesindstillinger forblev de samme mellem genotyper, og alle billeder blev erhvervet inden for den samme billedbehandlingsperiode for individuelle eksperimenter (Northwestern University Center for Advanced Microscopy og Nikon Imaging Centre).

Billedkvantificering

Muse hjerner

Immunofluorescenskvantificering af immunfarvning af musehjernevæv blev udført på 3-5 sektioner pr. dyr, fra Bregma-koordinater på ca. -0.94 til -2.55 mm, som blev afbildet ved hjælp af et 10X objektiv på et Ti2 bredfeltsmikroskop. Kvantificeringsanalyser, herunder størrelses- og intensitetstærskler, blev udført ved hjælp af Nikon NIS-Elements Software (Northwestern University Nikon Imaging Center).

Afhængigt af signalet blev tærskler sat ved hjælp af værktøjet General Analysis baseret på objektstørrelse, form og kontrast, og derefter blev binære masker oprettet for hver kanal og region af interesse. Tærskelværdien blev udført separat på hver kanal for at isolere signaler af interesse ved at optimere signal-til-støj-forholdet og eliminere ikke-specifikke baggrundssignaler. Til beregning af LAMP1-, BACE1- eller LysoTracker-Green-dækket område samt LAMP1- og Lysosensor-fluorescensintensitetsmålinger i primære neuroner blev områder af interesse manuelt sporet ved hjælp af NIS-Elements, og et binært lag blev oprettet for hver region af interesse.

For at beregne forholdet mellem LAMP1 og A 42 blev arealet af LAMP1 i dystrofiske neuritter normaliseret til arealet af A 42 på individuel plakbasis, og de gennemsnitlige forhold pr. mus mellem behandlingsgrupper blev kvantificeret. Pearsons korrelationskoefficientanalyse for BACE1 og LAMP1 blev udført ved hjælp af NIS-Elements på en pr. plak-basis på maksimal intensitetsprojektioner af 30μm Z-stack billeder taget ved hjælp af et Nikon A1 laserscanning konfokalmikroskop med en 1μm trinstørrelse.

For at beregne forholdet mellem LysoTrackerGreen og Tiazinrød blev arealet af LysoTracker-Green i dystrofiske neuritter normaliseret til området af Tiazinrødt på individuel plakbasis, og det gennemsnitlige forhold pr. mus blev kvantificeret mellem behandlingsgrupper. Fire koronale sektioner fra Bregma-koordinater på ca. -1,7 0 til -2,55 mm blev brugt til at beregne arealet eller intensiteten af ​​hvert signal i hver respektive hjerneregion for hver mus. Analyse af plak-dækket område og plak-størrelse blev udført under anvendelse af gennemsnittet af fem sektioner pr. mus fra Bregma-koordinater på ca. -0,94 til -2,55 mm. Sektionsvalg, billedoptagelse, billedsporing og kvantificeringer blev udført af en person, der var blindet for behandlingsgrupper og genotyper.

Primære neuroner

Til kvantificering af LAMP1-immunfarvning i fikserede muse primære neuroner blev somas manuelt sporet baseret på morfologi ved hjælp af NIS-elementer, og en binær maske blev oprettet for hver region af interesse og kanal. Tærskelværdi blev brugt til at optimere LAMP1-signaler og skelne mellem LAMP1 i neuritter, herunder både dendritter og axoner, ved at isolere pixels af LAMP1-positive for tubulinpixel.

Cellesoma LAMP1-signalerne blev udelukket fra det samlede LAMP1-areal for at analysere LAMP1-vesikler i neuritter. Til analyse af LysoTracker-Green-motilitet i neuroner blev billeder kvantificeret ved hjælp af NISElements. Hastigheden og afstanden af ​​de samlede LysoTrackerGreen-partikler i hver ramme blev sporet ved hjælp af den automatiske bevægelsessporingsfunktion i NIS-Elements. En tærskel blev sat og anvendt på alle film baseret på størrelsen og fluorescensintensiteten af ​​LysoTracker-Green partikler for at eliminere baggrundsstøj.

Til kymografgenerering blev time-lapse-billeddannelse af enkelte neuroner udført på et 60X konfokalt mikroskop, og axoner blev identificeret morfologisk. Procentdelen af ​​frekvensen af ​​partikler, der bevæger sig i en anterograd eller retrograd retning, eller stationær, blev kvantificeret ved at dividere antallet af partikler for hver gruppe med det samlede antal partikler. Til kymografanalyser blev bevægelige partikler defineret som havende en hastighed over 0,1μM/sek.

Statistisk analyse

GraphPad Prism software v8 blev brugt til at udføre statistiske analyser, herunder variansanalyse (ANOVA) med posthoc-test ved sammenligning af mere end to prøver og uparrede t-test, når kun to prøver blev sammenlignet. Specifikke testdetaljer, herunder antallet af replikater, typen af ​​posthoc-tests og P-værdier er angivet i figurforklaringer. Alle kvantificeringer er plottet ved middelværdi ± SEM. Signifikans blev konkluderet, når P-værdien var mindre end 0.05, angivet med *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.

For more information:1950477648nn@gmail.com