Ekstra-viralt DNA i adeno-associerede virale vektorpræparater inducerer TLR9-afhængige medfødte immunresponser i humane plasmacytoide dendritiske celler

Adeno-associerede virale (AAV) vektorsuspensioner produceret i enten human-afledte HEK-celler eller i Spodoptera frugiperda (Sf9) insektceller adskiller sig med hensyn til resterende værtscellekomponenter såvel som artsspecifikke post-translationelle modifikationer vist på AAV capsidproteinerne . Her analyserede vi virkningen af ​​disse forskelle på vektorens immunogene egenskaber. Vi stimulerede humane plasmacytoide dendritiske celler med forskellige partier af HEK-celle-producerede og Sf9-celle-producerede AAVCMV-eGFP-vektorer afledt af forskellige producenter. Vi fandt ud af, at AAV8-CMV-eGFP såvel som AAV2-CMV-eGFP-vektorer inducerede partispecifikke, men ikke produktionsplatformspecifikke eller producentspecifikke inflammatoriske cytokinresponser. Disse kunne reduceres eller afskaffes ved at blokere toll-lignende receptor 9-signalering eller ved enzymatisk at reducere DNA i vektorpartierne ved hjælp af DNase. Succesfuld HEK-celletransduktion med DNase-behandlede AAV-partier og DNA-analyser viste, at DNase ikke påvirkede vektorens integritet, men nedbryde ekstraviralt DNA. Vi konkluderer, at både HEK- og Sf9-celle-afledte AAV-præparater kan indeholde immunogene ekstravirale DNA-komponenter, som kan udløse partispecifikke inflammatoriske immunresponser. Dette tyder på, at forbedrede strategier til at fjerne ekstravirale DNA-urenheder kan være medvirkende til at reducere de immunogene egenskaber af AAV-vektorpræparater.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Det sidste årti har været vidne til en enorm interesse i udviklingen af ​​nye rekombinant adenoassocieret virus (AAV)-baserede strategier til både grundforskning og kliniske anvendelser1-3. Hovedårsagen ligger i det faktum, at AAV-vektorer har været ekstremt alsidige værktøjer inden for genterapi på grund af deres evne til effektivt og sikkert at levere terapeutiske gener til målvæv4. Imidlertid rapporterer et stigende antal efterforskere uafhængigt fund, der tyder på lokale og systemiske immunresponser efter levering af AAV i prækliniske og kliniske undersøgelser5-8.

AAV-vektorer har vist sig at aktivere medfødte immunmønstergenkendelsesreceptorer såsom toll-like receptor (TLR)2 og TLR9, hvilket resulterer i frigivelse af inflammatoriske cytokiner og type I interferoner (IFN)9,10. Immunogene komponenter af AAV, der kan stimulere disse responser, omfatter capsidproteiner og vektorgenom9,10. Immunresponser efter AAV-påføring kan også udløses af urenheder i vektorsuspensionen5,11. Disse urenheder er blevet defineret som enhver komponent, der er til stede i den oprensede AAV-vektorsuspension, bortset fra det ønskede produkt12 og er et resultat af vektorens produktion. To af de vigtigste metoder til fremstilling af kliniske rekombinante AAV-vektorer involverer transfektion af plasmid-DNA til HEK-celler og infektion af Spodoptera frugiperda (Sf9) insektceller med bacoluvirus13. Følgelig kunne potentielt immunogene urenheder indeholdt i AAV-vektorsuspensioner omfatte endotoksiner, cellekulturmediekomponenter, reagenser, der anvendes til AAV-oprensning, proteiner og DNA afledt fra værtsceller og resterende baculoviralt DNA eller plasmid DNA5. Yderligere faktorer, der kan påvirke immunogeniciteten af ​​AAV-vektorsuspensioner, er post-translationelle modifikationer (PTM'er), som er præget til capsidet af de forskellige vektorproduktionsplatforme5. Det er vigtigt, at HEK-celle-afledte og Sf9-celle-afledte AAV-vektorer adskiller sig meget med hensyn til deres PTM'er, deres resterende værtscelleproteinurenheder11 og potentielt også i deres DNA-urenheder (HEK-celle-DNA vs. Sf9-celle-DNA såvel som resterende plasmid-DNA versus baculoviralt DNA)14. Plasmacytoide dendritiske celler (pCD'er) er en specialiseret medfødt immuncelletype, der udskiller store mængder type I IFN og pro-inflammatoriske cytokiner ved virusinfektioner9,15 og spiller en stor rolle i sansningen af ​​AAV-vektorer9. For at analysere, om forskellene mellem HEK-celle-producerede og Sf9--celle-producerede AAV-vektorer resulterer i forskelle i deres immunogene egenskaber, stimulerede vi humane pDC'er med forskellige partier af den samme AAV-vektor opnået fra de to produktionssystemer og forskellige producenter. Vi fandt ud af, at halvdelen af ​​de undersøgte vektorpartier fremkaldte lot-specifikke pro-inflammatoriske immunresponser, som hverken var relateret til vektorproduktionssystemet eller producenten. Disse responser blev medieret af TLR9-signalering og modtagelige for behandling af vektorpartierne med DNase. Succesfuld HEK-celletransduktion med både ubehandlede og DNase-behandlede AAV-vektorlots og DNA-analyser af AAV-præparater antydede, at DNase ikke påvirkede AAV-partikelintegriteten, men snarere målrettede ikke-indkapslet ekstraviralt DNA. Samlet tyder dette på, at AAV-vektorpræparater kan indeholde ikke-indkapslet ekstraviralt DNA, som kan påvirke de immunogene egenskaber af AAV-vektorpræparater i humane pDC'er.

Fordele ved cistanche tubulosa-styrke immunsystemet

Resultater

AAV inducerer partispecifikke medfødte immunresponser i humane pDC'er.

Undersøgelser har vist, at HEK-celle-afledte og Sf9-celle-afledte, AAV-vektorer adskiller sig med hensyn til deres PTM'er og urenheder indeholdt i de virale suspensioner11. Vi antog, at disse faktorer kunne resultere i forskelle i de immunogene egenskaber mellem HEK-celle- og Sf9-celle-afledte vektorlots. For at teste denne hypotese analyserede vi i alt otte AAV serotype 8 (AAV8) vektorlots indeholdende den identiske DNA-sekvens af cytomegalovirus promotor (CMV) og det identiske transgen for det forstærkede grønne fluorescensprotein (eGFP) (AAV8- CMV-eGFP; fem HEK- og tre Sf9-celleafledte lots) og fire AAV2-CMV-eGFP-lots (to HEK- og to Sf9-celleafledte lots) fra tre forskellige producenter [producent A; Viral Vector Core Facility ved University of Iowa (Iowa, USA), producent B; Virovek (CA, USA) og fabrikant C; Vigene Biosciences (MD, USA)]. For at maksimere lighederne mellem partierne blev de syv AAV8-partier fra producent A og producent B (tabel 1) fremstillet under anvendelse af det samme originale plasmid. Derudover blev en dråbe digital PCR (ddPCR) registrering af vektorgenomerne (vg) af AAV vektor lots udført i en side-by-side måling under anvendelse af to forskellige mål: et inden for CMV-sekvensen og det andet inden for eGFP-sekvensen af vektorerne. Resultater opnået ved kvantificeringen af ​​CMV-målet blev anvendt til titreringen af ​​AAV-vektor-partierne i de følgende eksperimenter (tabel 1). pDC'er er specialiserede virale sensorer, der massivt producerer type I IFN'er ved viral infektion15, herunder AAV-vektorer9. For at undersøge, om HEK-celle-producerede og Sf9--celle-producerede AAV-vektorer adskiller sig i deres evne til at fremkalde medfødte immunresponser i immunkompetente celler, stimulerede vi humane pDC'er med de ovenfor anførte AAV-vektorlots. Til dette formål blev pDC'er oprenset fra perifere blodmononukleære celler (PBMC'er) fra individuelle raske humane donorer ved negativ selektion under anvendelse af magnetisk aktiveret cellesortering (MACS). Flowcytometrianalyse bekræftede renheden af ​​de isolerede pDC'er på over 90% (fig. S1). Ti pDC'er fra en individuel donor blev podet og stimuleret med AAV8- og AAV2-vektorlot ved en MOI på 1:1 × 106 vg/celle i 18 timer. MOI på 1:106 vg/celle anvendt på i alt 12.500 celler i 50 ul/brønd omsættes til en titer på 2,5 x 1011 vg/ml. Vi brugte denne titer, fordi den er inden for rækkevidden af, hvad der anvendes i retinal genterapiundersøgelser hos mennesker (f.eks. 1 × 1012 vg/ml16 eller 4 × 1011-1,3 × 1012 vg/ml17) og ikke-menneskelige primater (f.eks. 5 × 1011-5 × 1012 vg/ml6). Stimulering med køretøjet fungerede som kontrol. Inkubation med AAV8- og AAV2-vektorlot resulterede ikke i nogen påviselig transgenekspression i pDC'er. Imidlertid fire af de otte AAV8-partier (partier A-HEK-1, A-HEK-2, A-HEK-3, A-Sf9-1) og to af fire AAV2-partier (partier B-Sf9-1, B-Sf9-2) inducerede reaktiv celleproliferation i de stimulerede pDC'er (fig. 1a). Dette blev ledsaget af en frigivelse af pro-inflammatoriske cytokiner (IP-10, MIP-1 og TNF-) og type I IFN (IFN-). Omvendt blev hverken celleproliferation eller cytokinfrigivelse induceret af den resterende AAV8 (partier A-Sf9-1, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK{{92} }) og AAV2-partier (partier C-HEK-1, C-HEK-2). Disse resultater blev bekræftet i tre til fire uafhængige eksperimenter hver udført med cellerne fra en individuel donor (fig. 1a-c og tabel S1). Lot-specifikke forskelle i cytokinkoncentrationerne i disse uafhængige eksperimenter blev statistisk analyseret ved hjælp af en lineær blandet effektmodel og post hoc Dunnetts test (Q=2.6) ved at sammenligne de mindste kvadraters gennemsnit af de forskellige AAV-vektorlots med køretøjets kontrol (Tabel S2 og S3). Dette viste statistisk signifikante forskelle i cytokinresponserne mellem "immunogene" AAV-vektorlot (AAV8-partier A-HEK-1, A-HEK-2, A-HEK-3, A-Sf{ {114}} eller AAV2-lot B-Sf9-1, B-Sf9-2 henholdsvis) og kontrol, men ingen signifikante forskelle mellem "ikke-immunogene" AAV-vektorlot (AAV8-lot A-Sf{{ 123}}, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK-1 eller AAV2 partier C-HEK-1, C-HEK-2 henholdsvis) og kontrol (tabel S3). Koncentrationerne af resten af ​​de målte cytokiner inkluderet i multipleksassayet var enten under assayområdet (dvs. IL-1, IL-2, IL-4, IL-5 , IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, GM-CSF, IFN-) eller hverken den "immunogene" eller de "ikke-immunogene" vektorpartier inducerede enhver signifikant stigning i deres frigivelse (dvs. IL-7, IL-8, G-CSF, MCP-1) (fig. S2), hvilket tyder på en grad af specificitet i det AAV-medierede cytokinrespons. For at undersøge cytokinresponser på et tidligere tidspunkt blev pDC'er stimuleret med det "immunogene" AAV8-vektorlot A-HEK-1. Vi observerede en signifikant stigning i koncentrationen af ​​TNF- i supernatanten allerede 2 timer efter pDC-stimulering. Dette responsmønster kunne bekræftes i tre eksperimenter, hver udført med cellerne fra en individuel donor (fig. S3). For at undersøge, om en højere dosis af et "ikke-immunogent" AAV8-vektorlot var i stand til at udløse et immunrespons, stimulerede vi pDC'er med den teknisk maksimale anvendelige MOI (1:4,61 × 106 vg). Interessant nok blev hverken reaktiv celleproliferation eller cytokinrespons påvist ved stimulering med denne øgede titer (fig. S4). I modsætning til vores hypotese viser disse resultater, at medfødte immunresponser på AAV i pDC'er var partispecifikke og ikke relateret til et specifikt produktionssystem eller producent/oprensningsmetode.

Tabel 1. Forskellige partier af AAV8- og AAV2-virale vektorer anvendt i denne undersøgelse.

Figur 1. Induktion af AAV-vektor-lot-specifikke immunresponser i humane pDC'er. Menneskelige pDC'er blev stimuleret med forskellige partier af AAV8-CMV-eGFP og AAV2-CMV-eGFP (MOI: 1:1× 106 vg) i 18 timer (a) Repræsentative lyse feltbilleder af pDC'er stimuleret med vehikelkontrol (øverste billede) eller et immunogent AAV-vektorlot (nedre billede). Skalaen er 100 μm. (b) Cytokinfrigivelse af IP-10, MIP-1, TNF- og IFN- 2 af AAV8-stimulerede pDC'er. (C) Cytokinfrigivelse af AAV2-stimulerede pDC'er. Repræsentative plot af et af tre til fire uafhængige eksperimenter. Da nogle værdier i IFN- 2-målingerne (b,c) og TNF-måling (c) faldt under analyseområdet, blev konstanten 1 tilføjet til alle målte IFN- 2- og TNF-værdier til præsentation i et semi-logaritmisk plot. Der vises medianer og interkvartilintervaller. I etiketterne for de individuelle vektorpartier er de tre producenter repræsenteret med bogstaverne A, B og C; HEK-celle-afledte og Sf9--celle-afledte vektorer er angivet med "HEK og "Sf9" og tilsvarende partier fra samme producent og samme produktionssystem er nummereret "1, 2, 3". Cirkel: HEK-afledt vektorlot; trekant: Sf9-afledt vektorlot; sort: vektorparti fra producent A; orange: vektorparti fra producent B; grønt: vektorparti fra producent C.

Immunresponset på AAV-stimulering i pDC'er er ikke påvirket af forskelle i capsid/VG-forhold.

Prækliniske undersøgelser har vist, at forskelle i antallet af fulde og tomme vektorpartikler i AAV vektorsuspensioner kan påvirke et immunrespons18. For at vurdere om forskellene i immunogene egenskaber mellem de analyserede vektorlots skyldtes forskelle i forholdet mellem fulde og tomme vektorpartikler, bestemte vi titeren af ​​vektorcapsider i alle AAV-lots ved AAV-titrerings-ELISA og beregnede capside/VG forhold. Interessant nok blev der fundet store forskelle i capsid/vg-forholdet mellem alle AAV-partier (fig. 2). Der blev fundet ca. to gange flere kapsider end vg (2:1) i AAV8-CMV-eGFP-partier A-HEK-1, A-HEK-3, A-Sf{{11} } og AAV2-CMV-eGFP B-Sf9-1; og fire gange mere (4:1) i AAV8 parti A-Sf9-1. Et forhold på 1:1 blev observeret i resten af ​​partierne. Der blev dog ikke fundet signifikante forskelle mellem capsid/vg-forhold mellem "immunogene" og "ikke-immunogene" AAV-vektorlot i AAV8 (P=0.27) eller i AAV2 (P=0.37) vektorpartier (fig. 2). Dette tyder på, at forskellene i de immunogene egenskaber af de analyserede AAV-vektorlot heller ikke var relateret til forskelle i forholdet mellem fulde og tomme vektorpartikler.

cistanche supplement fordele - hvordan man styrker immunsystemet

Genkendelse af "immunogene" AAV8 vektor lots af TLR9.

Det er blevet vist, at den medfødte immungenkendelse af AAV af murine og humane pDC'er medieres af DNA-sensing TLR99. I overensstemmelse hermed evaluerede vi, om TLR9 også var involveret i genkendelsen af ​​vores "immunogene" AAV8 vektor lots. Til dette formål blev pDC'er podet som beskrevet og dyrket med TLR9-antagonisten H154 (50 µM) efterfulgt af stimulering med de "immunogene" AAV8-vektorlot A-HEK-1, A-HEK-2, A -HEK-3 og A-Sf9-1 (MOI: 1:1× 106 vg). Efter 18 timer blev der ikke observeret tegn på celleproliferation (fig. 3a), og en signifikant reduktion i frigivelsen af ​​IP-10, MIP-1, TNF- og IFN- blev målt (fig. 3b). Dette indikerer, at immunresponser på "immunogene" AAV8-vektorpartier i humane pDC'er medieres af TLR9-signalering.

Figur 2. Sammenligning af capsid/vg-forhold mellem forskellige AAV8-CMV-eGFP og AAV2-CMV-eGFP vektorlots. Capsid/vg-forholdet stammer fra absorbansmålinger (ELISA) og ddPCR-resultater af (a) otte AAV8-vektorlot og (b) fire AAV2-vektorlot. Stiplede linjer adskiller "immunogene" fra "ikke-immunogene" AAV-vektorlots. Søjler angiver gennemsnit og standardafvigelser for replikater. Statistisk signifikans blev bestemt under anvendelse af uparret Student t-test.

Figur 3. Genkendelse af "immunogene" AAV8-CMV-eGFP vektorlots af pDC'er er TLR9-afhængig. Humane pDC'er blev behandlet med TLR9-antagonisten H154 (50 μM) efterfulgt af stimulering med "immunogene" AAV8-vektorlot (MOI: 1:1×106 vg) i 18 timer. (a) Repræsentative lyse feltbilleder af oprensede pDC'er behandlet med "immunogene" AAV-vektorlot (øverste billede) eller "immunogene" AAV-vektorpartier og H154 (nedre billede). Skalaen er 100 μm. (b) Cytokinfrigivelse af IP-10, MIP-1, TNF- og IFN- 2 af stimulerede pDC'er. Da nogle værdier i IFN- 2-målingerne faldt under analyseområdet, blev konstanten 1 tilføjet til alle målte IFN- 2-værdier til præsentation i et semi-logaritmisk plot. Vist er middelværdier og standardafvigelser. Statistisk signifikans blev bestemt ved hjælp af envejs ANOVA og Holm-Sidaks post hoc analyse. P-værdier: Mindre end eller lig med 0,05: *; Mindre end eller lig med 0,01: **; Mindre end eller lig med 0,001: ***.

DNase-behandling reducerer immunresponser af "immunogene" AAV8- og AAV2-vektorlots.

Mens "immunogene" AAV8-vektorer fremkaldte et TLR9--afhængigt immunrespons i pDC'er, blev ingen sådanne responser induceret af de "ikke-immunogene" partier. TLR9 aktiveres som reaktion på DNA, især DNA, der indeholder ikke-methylerede CpG-motiver9. Det er vigtigt, at vores ddPCR-målinger bekræftede, at de samme virale DNA-komponenter var til stede i både "immunogene" og "ikke-immunogene" vektorlots. Samlet antydede dette, at uemballeret/frit DNA i den virale suspension snarere end det intra-virale DNA kunne være årsagen til de observerede immunresponser på "immunogene" AAV-vektorlots. Derfor, hvis resterende frit DNA var til stede i den virale suspension af de "immunogene" AAV8-vektorlots, bør det medfødte immunrespons svækkes af DNase. For at teste denne hypotese blev "immunogene" AAV8- og AAV2-vektorpartier forbehandlet med DNase I (100 µg/ml) i 30 minutter før AAV-stimulering. For at udelukke ikke-specifikke virkninger af DNase-behandling på pDC'erne eller AAV-partiklerne, i AAV-kun-stimuleringerne, blev vektorerne underkastet DNasemock-behandling før pDC-stimulering. I disse falske behandlinger uden DNase blev AAV-partiklerne inkuberet ved 37 grader i et identisk DNase-fordøjelsesmedium i samme tidsrum som de DNase-behandlede AAV'er. Ti pDC'er blev podet og stimuleret med de DNase-forbehandlede eller falske-behandlede "immunogene" AAV-vektorlot (MOI: 1:1 × 106 vg). pDC'er, som kun blev inkuberet med DNase eller sham-behandlet med et vehikel, tjente som kontroller. Interessant nok reducerede DNase-behandling af de "immunogene" AAV8- og AAV2-vektorpartier reaktiv celleproliferation (fig. 4a) og enten fuldstændigt afskaffet (AAV8-partier A-HEK-2 og A-Sf9-1; AAV2-partier B-Sf9-1 og B-Sf9-2) eller betydeligt reduceret (AAV8-partier A-HEK-1 og A-HEK-3) udgivelsen af ​​IP{{40} }, MIP-1, TNF- og IFN- efter AAV-stimulering (fig. 4b, c). For at bekræfte, at den observerede DNase-effekt faktisk var forårsaget af fordøjelsen af ​​ekstraviralt DNA og ikke af en effekt af DNasen på vektorens integritet, undersøgte vi, om DNase-behandling af AAV-vektorpartier påvirkede transduktionskapaciteten af ​​AAV. Da AAV-applikationen ikke resulterede i nogen påviselig pDC-transduktion, blev HEK-celler brugt til disse assays, da HEK-celler er en velkendt cellemodel til at analysere transduktionseffektivitet efter AAV-transduktion19. Vi stimulerede HEK293T-celler med DNase-behandlede og sham-behandlede AAV8- og AAV2-vektorlot (MOI: 1:8 × 104 vg) og evaluerede transduktionseffektiviteten ved fluorescensmikroskopi 3 dage efter vektorpåføring. Som beskrevet viste AAV2-vektorer en højere transduktionsstyrke sammenlignet med AAV8-vektorer. Det er desuden vigtigt, at forbehandling med DNase hverken reducerede transduktionseffektiviteten i de HEK-afledte eller i Sf9--celle-afledte AAV8- og AAV2-vektorlot (fig. S5a,b). Disse resultater giver yderligere bevis for, at DNase-effekten på de immunogene egenskaber af vektorpartierne skyldes nedbrydningen af ​​det ekstravirale DNA. Selvom TLR9-antagonisten H154 i det væsentlige ophævede frigivelsen af ​​pro-inflammatoriske cytokiner for alle fire immunogene AAV8-partier (fig. 3), kunne DNase-forbehandling også eliminere det pro-inflammatoriske cytokin-respons for AAV8-partierne A-HEK{{75} } og A-Sf9-1, mens det ikke fjernede det helt for AAV8-partierne A-HEK-1 og A-HEK-3 (fig. 4). For at teste, om en øget DNase-behandlingstid kunne ophæve dette cytokin-respons, gentog vi simuleringseksperimenterne med pDC'er efter en tidobling af DNase-inkubationstid for de respektive lots (A-HEK-1 og A-HEK{{87} }). Vi observerede, at efter DNase-behandling af vektorerne i 5 timer faldt de gennemsnitlige cytokinkoncentrationer i supernatanten af ​​de AAV-stimulerede celler yderligere og var ikke længere signifikant forskellige fra vehikelkontrol. Dette responsmønster kunne bekræftes i tre eksperimenter, hver udført med cellerne fra en individuel donor (fig. S6). Dette tyder på, at den centrale årsag til det TLR9-afhængige pro-inflammatoriske immunrespons i pDC'er faktisk er ekstraviralt DNA. For at teste, om frigivelsen af ​​intra-viralt DNA øger den immunstimulerende aktivitet af AAV-vektorer, åbnede vi bevidst de virale kapsider af det "immunogene" AAV8-lot A-HEK-1 ved varmebehandling ved 95 grader i 10 min. . Det varmebehandlede vektorlot blev derefter brugt til at stimulere pDC'er. Selvom der ikke var nogen forskelle i den reaktive celleproliferation ved AAV8 lot A-HEK-1-stimulering med og uden varmebehandling, var der en signifikant stigning i frigivelsen af ​​IP-10, MIP-1 , TNF- og IFN- i den opvarmede behandlede tilstand, hvilket indikerer, at frigivelsen af ​​indkapslet viralt DNA i vektorsuspensionen kan bidrage til induktionen af ​​immunresponser (fig. 5). Tilsammen indikerer disse data, at AAV-vektorpræparater kan indeholde ekstravirale DNA-kontaminanter, der kan udløse lotspecifikke immunresponser i pDC'er. Disse responser medieres af TLR9-signalering og kan reduceres/ophæves ved behandling af vektorpartierne med DNase.

Figur 4. DNase-forbehandling reducerer immunresponser induceret af "immunogene" AAV8-CMV-eGFP og AAV2-CMV-eGFP vektorlots. Humane pDC'er blev stimuleret med DNase-behandlede "immunogene" AAV8-vektorlot i 18 timer (MOI: 1:1 × 106 vg). (a) Repræsentative lyse feltbilleder af oprensede pDC'er stimuleret med "immunogene" AAV-vektorlot (øverste billede) og "immunogene" AAV-vektorpartier forbehandlet med 1{{30}}0 ug/ml DNase I (nederste billede). Skalaen er 500 μm. (b) Cytokinfrigivelse af IP-10, MIP-1, TNF- og IFN- 2 af AAV8-stimulerede pDC'er. (c) Cytokinfrigivelse af AAV2-stimulerede pDC'er. Da nogle værdier i IFN- 2-målingerne (b og c) og TNF-måling (b), faldt under analyseområdet, blev konstanten 1 tilføjet til alle målte IFN- 2- og TNF-værdier for præsentation i et semi-logaritmisk plot. Vist er middelværdier og standardafvigelser. Statistisk signifikans blev bestemt ved hjælp af envejs ANOVA og Holm-Sidaks post hoc analyse. P-værdier: Mindre end eller lig med 0,05: *; Mindre end eller lig med 0,01: **; Mindre end eller lig med 0,001: ***.

Explorativ analyse af ekstravirale DNA-kontaminanter i AAV8 vektorpræparater.

For at udføre den første eksplorative karakterisering af de ekstra-virale DNA-komponenter i AAV-vektor-partierne, en repræsentativ "immunogen" (A-HEK-1) og "ikke-immunogen" (B-HEK-1) HEK-celle-afledt vektorlot blev analyseret. Disse partier blev enten DNase-behandlet i pDC-medium i 30 minutter ved 37 grader som beskrevet ovenfor, eller blev mock-behandlet og ultrafiltreret ved hjælp af en 100 kDa cut-of-filtreringsenhed, eller blev kun mock-behandlet (fig. S7a– g). Konsekutiv Bioanalyzer LabChip-separation og vurdering af det oprensede DNA afslørede tilstedeværelsen af ​​sammenlignelige mængder vektor-DNA (fig. S7b-g) i behandlede og falske-behandlede prøver af hvert parti, hvilket bekræfter, at hverken ultrafiltrering eller DNase-behandling påvirkede DNA-indholdet inde i kapsiden. Derudover viste det, at kun det "immunogene" (fig. S7a–d), men ikke det "ikke-immunogene" vektorparti (fig. S7a,e–g) indeholdt yderligere DNA-molekyler i størrelse fra 100 til 450 bp (fig. S7a, e–g) S7c,d og h). Det er vigtigt, at disse yderligere DNA-molekyler kunne påvises i den mock-behandlede prøve og den ultrafiltrerede prøve, men var praktisk talt fraværende i den DNase-behandlede prøve (fig. S7a-d). Dette indikerer, at disse DNA-molekyler repræsenterer ekstravirale DNA-kontaminanter, der kan nedbrydes af DNase, men som ikke kan fjernes fra vektorsuspensionen ved ultrafiltrering. Finansieringen af, at disse kontaminanter kun kunne påvises i det "immunogene", men ikke i det "ikke-immunogene" vektorparti, beviser, at forekomsten af ​​disse ekstra-virale DNA-molekyler er lot-specifik og kan desuden tyde på, at disse molekyler inducerer eller bidrager til vektorens immunstimulerende egenskaber. For at vurdere den potentielle kilde til det kontaminerende DNA i de "immunogene" (A-HEK-1) og "ikke-immunogene" (B-HEK-1) partier af kvantitativ (q)PCR-analyse af HEK celle-DNA, plasmid-DNA og AAV-vektor-DNA blev udført. Template-DNA fra DNase-behandlede, mock-behandlede og ultrafiltrerede og kun mock-behandlede prøver af hvert lot blev brugt til amplifikation af Alu-gentagelse, nuklear genom-multikopi NPIP-gen og mitokondrielle 16S rRNA-gensekvenser (mt16S) af HEK-celleoprindelse , til amplifikation af et AAV8-omvendt terminal gentagelses-amplikon (ITR2; vektor- og transgenplasmid-DNA-oprindelse) og til amplifikation af et amplikon for blah-genet (ampicillinresistens) (Amp; plasmid-DNA-oprindelse) (tabel S4). Sammenligning af forholdet mellem ΔCt-værdierne af HEK-celle-DNA-specifikke amplikon vs. ITR2-amplikonet (dvs. Alu vs. ITR2, NPIP vs. ITR2 og mt16S vs. ITR2) og det plasmid-DNA-specifikke amplikon versus ITR2-amplikonet (Amp. vs. ITR2), angiver henholdsvis, at de to lots indeholder ubetydelige mængder HEK-cellekerne- og mitokondrie-DNA. I modsætning hertil afslørede analysen en anstændig mængde plasmid-DNA i både det "immunogene" og det "ikke-immunogene" vektorlot (henholdsvis ca. 1/32 og 1/50, hvad angår kopiantal i forhold til AAV-DNA). en andel, der er godt inden for rækkevidden af ​​værdier, der er rapporteret for andre AAV-vektorer12 (fig. S7). Ikke desto mindre var der ingen åbenlyse forskelle i den relative andel af vektor-DNA til plasmid- og HEK-celle-DNA mellem de DNase-behandlede og mock-behandlede eller ultrafiltrerede og mock-behandlede prøver af begge vektorpartier (fig. S8). Dette kan tyde på, at det ikke-pakkede kontaminant-DNA i målsekvenssammensætning svarer til det pakkede DNA. En begrænsning af qPCR-analysen er imidlertid størrelsen af ​​det kontaminerende DNA (100-450 bp), som vil indeholde en anstændig fraktion af fragmenter med ufuldstændig målsekvens.

Figur 5. Frigivelsen af ​​intraviralt DNA ved varmebehandling af vektorer øger pro-inflammatoriske cytokinresponser i pDC'er. Cytokinfrigivelse af IP-10, MIP-1, TNF- og IFN- 2 af pDC'er 18 timer efter stimulering med varmebehandlet AAV8-lot A-HEK-1 (MOI: 1:1× 106 vg). Vandrette linjer angiver middelværdier og standardafvigelser. Statistisk signifikante forskelle mellem cytokinresponser induceret af varmebehandlede og ubehandlede vektorer blev bestemt ved at anvende Student t-testen. P-værdi: Mindre end eller lig med 0.01: **; Mindre end eller lig med 0,001: ***.

Diskussion

AAV-vektorer er et af de mest lovende værktøjer inden for genterapi. Akkumulering af beviser udfordrer imidlertid synspunktet om, at immunogeniciteten af ​​AAV er ubetydelig5. I lyset af dette er det blevet mere og mere vigtigt at bedre forstå de mekanismer, hvorved immunreaktioner på AAV opstår. I denne undersøgelse demonstrerer vi, at (1) AAV8 og AAV2 inducerer partispecifikke medfødte immunresponser i humane pDC'er, som hverken er specifikke for capsid/vg-forholdet eller produktionsplatformen eller producent/oprensningsmetoden; (2) medfødte immunresponser i pDC'er er afhængige af TLR9-signalering og kan reduceres ved forbehandling med DNase; (3) DNase-behandling påvirker ikke integriteten af ​​vektorpartiklen, da den ikke reducerer transduktionshastigheden af ​​AAV8- og AAV2-vektorlot i HEK293T-celler; og (4) AAV-vektorlot kan omfatte ekstravirale DNA-molekyler, som kan fjernes ved behandling af vektorpartiet med DNase. Dette tyder på, at både HEK- og Sf9-celle-afledte AAV-præparater kan indeholde ekstravirale DNA-urenheder, der stimulerer et medfødt immunrespons. I en nylig undersøgelse blev der udført en sammenlignende analyse ved anvendelse af AAV-vektorer fra forskellige værtscellearter (HEK-celler og Sf9-celler)11. Forfatterne fandt ud af, at HEK- og Sf9-afledte vektorer adskiller sig med hensyn til deres PTM'er og deres resterende værtscelleproteinurenheder på tværs af alle AAV-serotyper og producenter, de testede. Desuden analyserede de cytokinresponset fra primære humane fibroblaster på AAV-transduktion og fandt ud af, at HEK- og Sf9--afledte vektorer kan afvige i deres immunogene egenskaber. I vores undersøgelse sammenlignede vi også disse to hovedproduktionssystemer ved hjælp af forskellige partier af den samme AAV-konstruktion fra forskellige producenter og to forskellige serotyper. Imidlertid var de vektorinducerede immunresponser, vi observerede i vores humane pDC-model, ikke specifikt relateret til et givet produktionssystem, producent eller serotype, i stedet var de partispecifikke. Tidligere prækliniske og kliniske undersøgelser af retinal genterapi har rapporteret, at immunresponser på AAV-vektorer, såsom okulær inflammation eller immuncelleinfiltration, kan være påvirket af forskelle i capsid/vg-forhold18 eller dosisforskelle5. Timmers et al.18 viste, at fjernelse af tomme AAV-capsider fra den virale suspension reducerede inflammation og forbedrede viral transduktion i et præklinisk studie med ikke-menneskelige primater. Alligevel viste vores resultater, at forhøjede capsid/vg-forhold var til stede blandt både "immunogene" og "ikke-immunogene" AAV-vektorlot, hvilket betyder, at et højere antal capsider (tomme capsider) i den virale suspension ikke var ansvarlig for induktionen af de vektorlot-specifikke immunresponser i vores humane pDC-model. Udover det har vi tidligere vist, at AAV8 inducerer immunresponser på en dosisafhængig måde hos ikke-menneskelige primater6,8. Øgning af dosis af de "ikke-immunogene" AAV-vektorer i denne undersøgelse var imidlertid ikke tilstrækkelig til at udløse et immunrespons i humane pDC'er. For at forstå årsagen til forskellene i vektorernes immunogene egenskaber undersøgte vi derfor mekanismen involveret i genkendelsen af ​​de "immunogene" AAV-partier. Brugen af ​​in vitro immunkompetente cellemodeller har gjort det muligt for forskere at mere præcist studere rollen af ​​TLR-veje i medfødte immunresponser genereret af AAV-vektorer9,10. Zhu et al.9frst beskrev, at pDC'er, men ikke konventionelle DC'er eller ikke-pDC'er, frigiver store mængder type I IFN og pro-inflammatoriske cytokiner som reaktion på AAV-stimulering og demonstrerede involveringen af ​​TLR9-vejen i genkendelsen af ​​AAV8 og AAV2 ved hjælp af mus pDC'er. Forfatterne observerede også, at AAV2 inducerede TLR9-afhængige immunresponser i humane pDC'er. I vores undersøgelse, med brug af en af ​​de mest specifikke TLR9-antagonister, H1549,21-24, har vi indirekte vist, at ikke kun AAV2, men også AAV8-vektorer inducerer TLR9-afhængige medfødte immunresponser i humane pDC'er, men på en meget specifik måde. Da TLR9 er en DNA-receptor, antydede dette, at immunreaktionerne på "immunogene" AAV-vektorlot blev induceret af DNA-komponenter. Men selvom vores ddPCR-målinger havde bekræftet, at de samme pakkede DNA-komponenter var til stede i både "immunogene" og "ikke-immunogene" vektorlots, udløste de "ikke-immunogene" partier ikke immunresponser i pDC'er. Derudover reducerede eller ophævede DNase-behandling de immunstimulerende egenskaber af de "immunogene" AAV-vektorlots, men reducerede ikke transduktionsstyrken af ​​disse vektorer i HEK-celler, hvilket tyder på, at DNase-behandling af AAV målrettede ikke-indkapslet ekstraviralt DNA i vektorsuspension, men påvirkede ikke integriteten af ​​vektorgenomet i det intakte capsid. Dette blev yderligere bekræftet ved sammenlignende DNA-analyser af repræsentative DNase-behandlede og falske-behandlede "immunogene" og "ikke-immunogene" vektorpartier.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Samlet indikerer alle disse eksperimenter, at immunresponset på "immunogene" vektorpartier i pDC'er ikke var orkestreret af DNA indeholdt i AAV-partiklerne (dvs. vektorgenom eller potentielle DNA-urenheder pakket i AAV-kapsiderne), men af ​​tilgængeligt ekstraviralt DNA komponenter indeholdt i de virale suspensioner (dvs. DNA uden for eller ubeskyttet af det virale capside). Vi observerede også, at når DNA'et indeholdt i de virale kapsider af et "immunogent" vektorparti blev eksponeret for cellerne ved varmebehandling af vektoren, var der en stigning i immunresponset. Det er ikke klart, om stigningen i immunstimulerende aktivitet efter åbning af capsiderne skyldtes vektorens enkeltstrengede DNA eller på grund af potentielle urenheder pakket i AAV-capsiderne, såsom resterende værtscellenukleinsyrer, resterende hjælper-DNA-sekvenser, rygradssekvens fragmenter pakket sammen med kassetten eller omvendt priming fra ITR'er, hvilket resulterer i små rygradsfragmenter pakket ind i AAV12,25. Den nøjagtige mekanisme for ekstraviral DNA-optagelse af pDC'er forbliver ukendt. Reaktionsevne af pDC'er over for CpG-oligonukleotider viser, at pDC'er kan reagere på frit DNA26. Dette tyder på, at immunresponset i pDC'er kan udløses af optagelsen af ​​frit kontaminerende DNA indeholdt i vektorsuspensionen. Derudover er det blevet vist, at pDC'er kan optage AAV-vektorer27, hvilket alternativt tyder på, at potentielt capsid-bundet DNA kunne transporteres ind i cellen under optagelsen af ​​AAV-partikler. Tilstedeværelsen af ​​ekstra-viral DNA-kontamination i AAV-vektorpræparater kan enten være en iboende egenskab ved det respektive vektorlot, der er et resultat af vektorernes produktion og oprensning, eller det kan skyldes frigivelsen af ​​indkapslet DNA på grund af uhensigtsmæssige opbevaringsbetingelser . Alle vektorlots undersøgt i disse eksperimenter blev opnået i samme tidsrum (5 af de 8 undersøgte AAV8 vektorlots, hvoraf to var "immunogene" (A-HEK-2; A-HEK-3) og tre var "ikke-immunogene" (A-Sf9-2; B-Sf9-1; B-Sf9-2) blev endda produceret parallelt specifikt til denne undersøgelse), partierne fra hver producent blev sendt i de samme transportkasser, og ved modtagelsen blev alle partier opbevaret side om side i den samme skuffe i en temperaturalarmbeskyttet -80 graders fryser, før alikvoter af alle partier blev optøet samtidigt og påført pDC'erne i side-by-side eksperimenter. Dette tyder kraftigt på, at AAV-produktion og -rensningsprocessen snarere end uhensigtsmæssig opbevaring var ansvarlig for forskellene i ekstraviralt DNA-indhold og immunstimulerende egenskaber af disse partier. Tidligere var AAV-vektorlots af klinisk kvalitet produceret til genterapi (alipogen tiparvovec, Glybera) ikke længere godkendt på grund af høje mængder af urenheder, herunder potentielt immunogen resterende værtscelle DNA28. Fjernelsen af ​​DNA-urenheder fra de virale suspensioner udføres normalt under produktionsprocessen. Her anvendes Benzonase29- eller DNase30-behandling rutinemæssigt for at eliminere resterende DNA fra den endelige virale suspension. Denne behandling, afhængigt af protokollen, varer mellem 30 minutter og 3 timer, og derefter inaktiveres enzymet af kemikalier såsom cæsiumchloridsalte30. I vores eksperimenter blev fire af de fem AAV8-lots afledt fra Viral Vector Core Facility ved University of Iowa, og begge AAV2-vektorlots fra Virovek fundet at være immunogene i pDC'er. Som beskrevet i afsnittet "Materialer og metoder" involverer oprensningsprocessen for vektorpartierne fra begge disse producenter adskillige oprensningstrin, hvoraf nogle adskiller sig meget fra hinanden. Oprensningsprocessen på Core Facility i Iowa omfatter således turbonukleasebehandling efterfulgt af iodixanolgradient-ultracentrifugering, anionbyttersøjlekromatografi, flagersterilisering og bufferudveksling ved hjælp af centrifugalfiltre. I modsætning hertil anvender Virovek Benzonase-behandling, ultracentrifugering i CsCl efterfulgt af afsaltning og filtersterilisering. Oprensningsprocessen af ​​Vigene omfatter på den anden side ikke DNase-behandling, men, som det bruges af Core Facility i Iowa, inkluderer iodixanol-gradient-ultracentrifugering. Overraskende nok inducerede ingen af ​​de tre vektorlots afledt af Vigene (AAV8: C-HEK-1; AAV2: C-HEK-1 og 2) immunresponser i pDC'er, hvilket tyder på, at "ikke-immunogene " Vektorpartier kan også genereres med produktionsprocesser, der ikke involverer DNase-behandling.

cistanche supplement fordele - hvordan man styrker immunsystemet

Samlet set gør de delvist ens og delvist forskellige oprensningstrin, som anvendes af de tre producenter, det vanskeligt at koble de immunogene egenskaber af vektorerne observeret i pDC til et enkelt trin i fremstillingsprocessen. I kliniske forsøg anvendes vektorer af god fremstillingspraksis (GMP), som er underkastet streng kvalitetskontrol. Ingen af ​​vektorerne fra de tre producenter, der er brugt i denne undersøgelse, er af god laboratoriepraksis (GLP) kvalitet og kan derfor være af lavere renhed end vektorer af klinisk kvalitet. Det er således vigtigt at erkende, at GMP-vektorer, der anvendes i kliniske forsøg med mennesker, kan eller måske ikke udviser de forskelle, vi observerede i denne undersøgelse, og at relevansen af ​​vores resultater for den kliniske brug af genterapier ikke er klar. Det er vores egen erfaring, at betydelige partispecifikke forskelle i koncentrationen af ​​kontaminerende komponenter såsom værtscelleproteiner kan forekomme selv med GMP-grade vektorer, og selv i GMP-grade vektorer er der ingen ensartet aftalte specifikationer for, hvilke niveauer der er acceptabelt 5. Samlet set er forbedring af fremstillingsprocessen af ​​AAV-vektorer nøglen til at undgå tilstedeværelsen af ​​resterende urenheder i de virale suspensioner for at minimere potentialet for utilsigtede immunresponser. Som konklusion viste vi, at ekstravirale DNA-urenheder kan påvirke de immunogene egenskaber af AAV-vektorer i humane pDC'er. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at undersøge konsekvenserne af disse fund for sikkerheden af ​​AAV-medieret genterapi i dyremodeller eller humane patienter.

Referencer

1. Gaj, T., Epstein, BE & Schafer, DV Genomteknik ved hjælp af Adeno-associeret virus: Grundlæggende og kliniske forskningsapplikationer. Mol. Ter. 24, 458-464 (2016).

2. Garita-Hernandez, M. et al. AAV-medieret genlevering til 3D retinale organoider afledt af humane inducerede pluripotente stamceller. Int. J. Mol. Sci. 21, 994 (2020).

3. Russell, S. et al. Effekt og sikkerhed af voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) hos patienter med RPE65-medieret arvelig retinal dystrofi: Et randomiseret, kontrolleret, åbent fase 3-studie. Lancet 390, 849–860 (2017).

4. He, X., Urip, BA, Zhang, Z., Ngan, CC & Feng, B. Udvikling af AAV-leverede terapier mod ultimative helbredelser. J. Mol. Med. 99, 1-25. https://doi.org/10.1007/s00109-020-02034-2 (2021).

5. Bucher, K., Rodríguez-Bocanegra, E., Dauletbekov, D. & Fischer, MD Immunreaktioner på retinal genterapi ved hjælp af adeno-associerede virale vektorer - Implikationer for behandlingssucces og sikkerhed. Prog. Retin. Øjen Res. 83, 100915 (2020).

6. Reichel, FF et al. AAV8 kan inducere medfødte og adaptive immunresponser i primatøjet. Mol. Ter. 25, 2648-2660 (2017).

7. Boyd, RF et al. Reduceret retinal transduktion og øget transgen-rettet immunogenicitet med intravitreal levering af rAAV efter posterior vitrektomi hos hunde. Gene Ter. 23, 548-556 (2016).

8. Rodríguez-Bocanegra, E. et al. Longitudinel evaluering af hyperrefektive foci i nethinden efter subretinal levering af adenoassocieret virus i ikke-humane primater. Overs. Vis. Sci. Teknol. 10, 15 (2021).

9. Zhu, J., Huang, X. & Yang, Y. Te TLR9-MyD88-vejen er afgørende for adaptive immunresponser på adenoassocierede virusgenterapivektorer hos mus. J. Clin. Undersøg. 119, 2388-2398 (2009).

10. Hösel, M. et al. Toll-lignende receptor 2-medieret medfødt immunrespons i humane ikke-parenkymale leverceller mod adenoassocierede virale vektorer. Hepatology 55, 287-297 (2012).

11. Rumachik, NG et al. Metoder betyder noget: Standardproduktionsplatforme for rekombinant AAV producerer kemisk og funktionelt adskilte vektorer. Mol. Ter. Metoder Clin. Dev. 18, 98-118 (2020).

12. Wright, JF Produktrelaterede urenheder i rekombinante AAV-vektorer af klinisk kvalitet: Karakterisering og risikovurdering. Biomedicines 2, 80-97 (2014).

13. Clément, N. & Grieger, JC Fremstilling af rekombinante adeno-associerede virale vektorer til kliniske forsøg. Mol. Ter. Metoder Clin. Dev. 3, 16002 (2016).

14. Penaud-Budloo, M., François, A., Clément, N. & Ayuso, E. Farmakologi af rekombinant adeno-associeret virusproduktion. Mol. Ter. Metoder Clin. Dev. 8, 166-180 (2018).

15. Ye, Y., Gaugler, B., Mohty, M. & Malard, F. Plasmacytoid dendritiske cellebiologi og dens rolle i immunmedierede sygdomme. Clin. Overs. Immunol. 9, e1139 (2020).

16. Fischer, MD et al. Effekt og sikkerhed af retinal genterapi ved hjælp af adeno-associeret virusvektor til patienter med choroideremia: Et randomiseret klinisk forsøg. JAMA Oftalmol. 137, 1247-1254 (2019).

17. Weleber, RG et al. Resultater 2 år efter genterapi for RPE65-defekt Leber medfødt amaurose og svær retinal dystrofi i tidlig barndom. Ophthalmology 123, 1606-1620 (2016).

18. Timmers, AM et al. Okulært inflammatorisk respons på intravitreal injektion af adeno-associeret virusvektor: Relativt bidrag af genom og capsid. Hum. Gene Ter. 31, 80-89 (2020).

19. Ran, G. et al. Sted-rettet mutagenese forbedrer transduktionseffektiviteten af ​​capsidbibliotek-afledte rekombinante AAV-vektorer. Mol. Ter. Metoder Clin. Dev. 17, 545-555 (2020).

20. Ellis, BL et al. En undersøgelse af ex vivo/in vitro transduktionseffektivitet af primære pattedyrceller og cellelinjer med ni naturlige adeno-associerede vira (AAV1-9) og en konstrueret adeno-associeret virusserotype. Virol. J. 10, 1-10 (2013).

21. Yamada, H. et al. Virkning af suppressivt DNA på CpG-induceret immunaktivering. J. Immunol. 169, 5590-5594 (2002).

22. Zhang, P. et al. Toll-lignende receptor 9-antagonist undertrykker humoral immunitet i eksperimentel autoimmun myasthenia gravis. Mol. Immunol. 94, 200-208 (2018).

23. Chan, YK et al. Konstruktion af adeno-associerede virale vektorer for at undgå medfødte immun- og inflammatoriske reaktioner. Sci. Overs. Med. 13, eabd3438 (2021).

24. Bayik, D., Gursel, I. & Klinman, DM. Struktur, mekanisme og terapeutisk anvendelighed af immunsuppressive oligonukleotider. Pharmacol. Res. 105, 216-225 (2016).

25. Brimble, MA et al. 547. AAV-præparater indeholder kontaminering fra DNA-sekvenser i produktionsplasmider direkte uden for ITR'erne. Mol. Ter. 24, S218-S219 (2016).

26. Latz, E. et al. TLR9-signaler efter translokation fra ER til CpG DNA i lysosomet. Nat. Immunol. 5, 190-198 (2004).

27. Veron, P. et al. Større undergrupper af humane dendritiske celler transduceres effektivt af selvkomplementære adeno-associerede virusvektorer 1 og 2. J. Virol. 81, 5385-5394 (2007).

28. Vurderingsrapport: Glybera. https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/glybera-epar-public-assessment report_en.pdf. Tilgået 3. marts 2022 (2012)

29. Arden, E. & Metzger, J. Billig, serotype-uafhængig protokol til naturlig og biokonstrueret rekombinant adeno-associeret virusoprensning. J. Biol. Metoder 3, e38 (2016).

30. Grieger, JC, Choi, VW & Samulski, RJ Produktion og karakterisering af adeno-associerede virale vektorer. Nat. Protoc. 1, 1412-1428 (2006).

31. Kimura, T. et al. Produktion af adenoassocierede virusvektorer til in vitro og in vivo applikationer. Sci. Rep. 9, 13601 (2019).

32. Ayuso, E. et al. Høj AAV-vektorrenhed resulterer i serotype- og vævsuafhængig forbedring af transduktionseffektiviteten. Gene Ter. 17, 503-510 (2010).