Udforskning af rollen af ​​en ny interleukin-17 homolog fra hvirvelløse marinemuslinger Mytilus Coruscus i medfødt immunrespons: Er negativ regulering af Mc-Novel_miR_145 nøglen?

Abstrakt: Interleukin-17 (IL-17) repræsenterer en klasse af proinflammatoriske cytokiner involveret i kroniske inflammatoriske og degenerative lidelser. Før denne undersøgelse blev det forudsagt, at en IL-17-homolog kunne målrettes af Mc-novel_miR_145 for at deltage i immunresponset fra Mytilus coruscus. Denne undersøgelse anvendte en række forskellige molekylær- og cellebiologiske forskningsmetoder til at udforske sammenhængen mellem Mc-novel_miR_145 og IL-17-homolog og deres immunmodulerende virkninger. Bioinformatik-forudsigelsen bekræftede tilknytningen af ​​IL-17-homologen til muslinge-IL-17-familien efterfulgt af kvantitative realtids-PCR-assays (qPCR) for at demonstrere, at McIL-17-3 var stærkt udtrykt i immun-associerede væv og reagerede på bakterielle udfordringer. Resultater fra luciferase-reporter-assays bekræftede potentialet af McIL-17-3 til at aktivere nedstrøms NF-kb og dets målretning ved hjælp af Mc-novel_miR_145 i HEK293-celler. Undersøgelsen producerede også McIL-17-3-antiserum og fandt, at Mc-novel_miR_145 negativt regulerer McIL-17-3 via western blotting og qPCR-assays. Ydermere indikerede flowcytometrianalyse, at Mc-novel_miR_145 negativt regulerede McIL-17-3 for at lindre LPS-induceret apoptose. Samlet set viste de nuværende resultater, at McIL-17-3 spillede en vigtig rolle i molluscans immunforsvar mod bakterieangreb. Desuden blev McIL- 17-3 negativt reguleret af Mc-novel_miR_145 for at deltage i LPS-induceret apoptose. Vores resultater giver ny indsigt i ikke-kodende RNA-regulering i hvirvelløse modeller.

cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet

Nøgleord: Mytilus couscous; interleukin-17; mikroRNA; apoptose; medfødt immunitet

1. Introduktion

Immunsystemet spiller en afgørende rolle i organismens forsvar mod invasionen af ​​eksogene patogener. Konventionelt er forsvarssystemet opdelt i medfødt immunitet og erhvervet immunitet. Medfødt immunitet repræsenterer kroppens første forsvarslinje mod patogener, som kan detektere patogeninvasion og delvist eliminere dem [1]. Medfødt immunitet medieres af en lang række celler, herunder naturlige dræberceller, monocytter, neutrofiler, eosinofiler, basofiler og cirkulerende dendritiske celler, som tilsammen er kendt som medfødte immunceller. Disse celler frigiver et stort antal cytokiner, der er involveret i cellulær kommunikation og hjælper derved med at koordinere immunresponser [2]. I tilfælde af infektion og betændelse fungerer cytokiner som modulatorer: nogle cytokiner gør sygdommen værre (proinflammatorisk), mens andre fremmer sundheden (anti-inflammatorisk) [3]. Cytokiner er underlagt høje niveauer af evolutionært tryk og udviser således sekvensdiversifikation [4], hvorimod IL-17 cytokinfamilien udviser høj konservering, hvilket manifesteres af en cystein-knudefold i den funktionelle arkitektur dannet gennem interaktioner mellem fire konserverede cysteinrester [5]. Nylige undersøgelser har vist, at IL-17 er en klasse af proinflammatoriske cytokiner involveret i kroniske inflammatoriske og degenerative lidelser [6]. IL-17'erne fungerer ved at binde specifikt til receptorer for at fremme inflammationsudvikling, immunafstødning og hæmatopoiese. IL-17-familien af ​​cytokiner hos mennesker består af seks medlemmer (IL-17A til IL-17F), som produceres af aktiverede T-lymfocytter og andre medfødte cellepopulationer som reaktion på IL -1 og IL-23 [7,8]. En voksende mængde af beviser tyder dog på, at IL-17-familien oplevede en markant udvidelse i marine bløddyr og pighuderarter. I genomet af den lilla søpindsvin Strongylocentrotus purpuratus blev omkring 30 IL-17 gener påvist [9]. Tilsvarende blev 31 blæksprutte IL -17-lignende gener fundet i Coleoid blæksprutter, hvor 27 gener har et mægtigt udtryk i suckers og hud [10]. Saco et al. [11] hentede 379 unikke IL-17-sekvenser fra 15 gensekventerede muslingegenomer og M. galloprovincialis referencegenomet [12] og opdelte dem i 23 isoformer gennem fylogenetisk analyse. Yderligere fandt de, at IL-17-isoformer fra Mytilidae-arter blev bevaret blandt individer og delt mellem nært beslægtede arter. Ud over Mytilidae-arter blev de store IL-17-familier også fundet i andre bløddyrarter, herunder Crassostrea gigas, Mizuhopecten yessoensis og Pinctada fucata martensii [13]. Havvand vrimler med patogener, og marine bløddyr er i konstant kontakt med dem, og derfor er der brug for et kraftigt arsenal af immunmolekyler, hvorefter udvidelsen af ​​IL-17-familien udstyrer disse dyr med mere effektive immunresponser.

Der har været adskillige undersøgelser, der indikerer den betydelige rolle, som IL-17 spiller i bløddyrs medfødte immunitet. For eksempel har forskning fundet, at efter infektion med Vibrio harveyi var mRNA-niveauet af IL-17D kraftigt opreguleret i Tegillarca granulosa [14], mens CgIL17-5 i C. gigas viste en tydelig reaktion på Vibrio splendidus [15]. Derudover har molluscan IL-17'er vist sig at reagere på mange patogenassocierede molekylære mønstre (PAMP'er), såsom lipopolysaccharid (LPS), polyinosin: polycytidylsyre (polyI: C) og peptidoglycan (PGN). LPS er en vigtig bestanddel af den ydre væg af gramnegative bakterielle cellevægge og repræsenterer en af ​​de mest almindeligt anvendte immunstimulerende midler. På den anden side er polyI: C en dobbeltstrenget RNA-analog, der ofte bruges som virussimulator i videnskabelig forskning. Efter stimulering med LPS blev den transkriptionelle ekspression af IL-17-familiegener hurtigt udløst i stillehavsøstersen C. gigas og perleøstersen P. fucata [16,17]. Også i perleøsters blev PfIL-17 fundet at være involveret i immunresponset på polyI:C-stimulering [17].

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Derudover viste et dobbelt luciferaseassay, at PfIL-17 var i stand til at aktivere hvirveldyrsmålgener indeholdende NF-kB-bindingssteder og deltage i NF-kB-signalvejen i HEK293-celler [17]. PGN er til stede i cellevæggen af ​​Gram-positive bakterier og bruges ofte som en efterligning af Gram-positive bakterier. Det rekombinante C. gigas IL17-5 viste sig at have en stærk affinitet til PGN, som aldrig var blevet rapporteret i hvirveldyr-interleukiner [18]. Disse undersøgelser gav en optakt til at afsløre den IL-17 immunmodulerende funktion i bløddyr. Som en klasse af pro-inflammatoriske cytokiner kan den overdrevne ekspression af IL-17 inducere alvorlig skade på celler. Organismerne har udviklet forskellige mekanismer til at kontrollere overreaktionen af ​​IL-17, hvoraf mikroRNA'er (miRNA'er) repræsenterer den mest potente og velundersøgte klasse af ikke-kodende RNA'er. MiRNA'er er en familie af korte RNA'er med en længde på omkring 22 nt, der kan regulere ekspressionen af ​​målgener ved translationel undertrykkelse eller mRNA-nedbrydning [19]. Den nuværende forskning i miRNAs regulering af IL-17 fokuserer hovedsageligt på deres synergiske virkninger i humane autoimmune sygdomme såsom dissemineret sklerose, reumatoid arthritis, psoriasis og andre [20]. Teknikudviklingen af ​​high-throughput sekventering og biologisk beregning gør det muligt at scanne molluscan miRNA'er på genomisk niveau, og et stort antal konserverede og nye miRNA'er er blevet identificeret fra bløddyrsarter såsom flad østers Ostrea edulis, stillehavsøsters C. gigas , Lymnaea stagnalis, musling M. galloprovincialis, etc. [21-29]. Disse undersøgelser giver grundlæggende data og stor støtte til den funktionelle fortolkning af miRNA'er i bløddyr. Med hensyn til den immunregulerende rolle af visse miRNA'er i bløddyr, Tian, ​​et al. [30] fandt, at Pm-miR-29a positivt kunne regulere IL-17 i Pinctada martensii; efter overekspressionen af ​​Pm-miR-29a blev ekspressionen af ​​IL-17 i artens kappe og gælle opreguleret. I C. gigas øgede cgi-miR-2d østershæmocytfagocytose ved negativt at regulere CgIκB2 [31] og negativt regulere ekspressionen af ​​et cholintransporter-lignende gen i det tidlige infektionsstadium, som var involveret i sofistikeret immunmodulering [32].

cistanche planteforøgende immunsystem

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Under udtørring blev cgi-miR-365 fundet at være induceret af noradrenalin og direkte fremmet CgHSP90AA1-ekspression [33]. Nylige undersøgelser viste, at miRNA-stillads659_26519 målretter mod calmodulin for at regulere IL-17-ekspression i den tidlige fase af immunresponset af C. gigas [34]. Derudover er specifikke funktioner af visse miRNA'er blevet beskrevet i andre hvirvelløse dyr, såsom havagurk Apostichopus japonicus [35-39] og reje Litopenaeus vannamei [40]. Disse undersøgelser har åbnet sløret for de underliggende mekanismer af miRNA'er i hvirvelløse dyr og har også givet tekniske og metodiske referencer til vores nuværende forskning. I vores tidligere undersøgelse blev 26 miRNA'er og 667 gener af M. coruscus biologisk beregnet for differentiel ekspression efter Vibrio alginolyticus-udfordringen, hvoraf Mcnovel_miR_145 kan målrette en IL-17-homolog og være involveret i immunresponset på bakteriel infektion [41]. Formålet med denne undersøgelse er at identificere IL-17-genet og undersøge dets potentielle rolle i medfødt immunitet og dets regulering af miRNA Mcnovel_miR_145 i M. coruscus. Gennem denne undersøgelse sigter vi mod at opnå en bedre forståelse af bløddyrs immunresponsmekanismer og kaste lys over det molekylære grundlag for deres immunforsvar mod patogener. Denne forskning kan også give indsigt i ikke-kodende RNA-regulering i hvirvelløse modeller.

2. Resultater

2.1. Karakterisering af McIL-17-3

McIL-17-3 cDNA-sekvensen indeholdende den komplette ORF, 30 -UTR og delvis 50 - UTR blev i silico klonet fra M. coruscus fuldlængde transkriptomet (accessionsnummer: PRJNA798880, F{ {5}}transskription_12404). McIL-17-3 indeholder en 585 bp ORF-region, der koder for 194 aminosyrer. Den forudsagte molekylvægt er 21,77 kDa, og det isoelektriske punkt er 5,21. SMART-analyse afslørede et typisk IL-17-domæne i dette protein (figur 1A). Et fylogenetisk træ blev konstrueret ved at rekruttere IL-17-medlemmer af hvirveldyr og Mytilidae-arter, og IL2'er blev brugt som udgruppen. Som vist i figur 1B er disse IL-17'er samlet i en specifik gren for at skelne dem fra IL-2'er. Inden for IL-17-klyngen blev to tilsyneladende klader vist, den ene sammensat af hvirveldyr-IL-17'er og den anden sammensat af muslinge-IL-17'er. I muslinge-IL-17-gruppen klyngede McIL-17-3 først sammen med det tilsvarende molekyle fra en anden Mytilus-art, M. galloprovincialis (figur 1B).

2.2. Multipel justering og tertiær struktur forudsigelse

Kernen i McIL-17-3 er sammensat af to par antiparallelle -strenge; det ene par inkluderer strenge 1 (rest 52-58) og 2 (rest 66-72 og 77-79), mens det andet inkluderer strenge 3 (rest 89-103) og 4 (rest 110-125) (Figur 2B, C) . To disulfidbroer (Cys97/Cys134 og Cys125/Cys169) forbinder strengene henholdsvis 1 og 3, 2 og 4 (figur 2A, C). Konsekvent har andre bløddyr IL-17 også disse to disulfidbroer mellem strenge 1 og 3, 2 og 4 (figur 2A, C). Det er bemærkelsesværdigt, at selvom hvirveldyr IL-17 også har to disulfidbroer, eksisterer de mellem 2 og 4 (figur 2A, C).

2.3. Transskriptionel udtryk for McIL-17-3

Profilen for vævsfordeling af McIL{{0}}-transkripter blev vurderet ved qPCR. Transkripterne af McIL-17-3 blev udtrykt i alle testede væv, og ekspressionsniveauer i hæmocytter og gæller var signifikant højere end dem i adduktormuskel (figur 3A). Temporal ekspression af hæmocyt McIL-17-3-transkripter som svar på V. alginolyticus-challenge blev også vurderet. mRNA-niveauet af McIL-17-3 var signifikant opreguleret ved henholdsvis 3 og 12 HPC (3.13- eller 4.35-fold stigning sammenlignet med 0 HPC), men der var ingen indlysende tidsmæssig regelmæssighed generelt (figur 3B).

Figur 1. Molekylær karakterisering af McIL-17-3. (A) Arkitekturanalyse af bevarede domæner i McIL-17-3 ved hjælp af SMART. Et bevaret IL-17-domæne blev vist. (B) Fylogenetisk analyse af McIL-17-3. Det fylogenetiske træ blev konstrueret ved hjælp af MEGAX-software med 2000 replikationer af bootstrapping ved hjælp af nabo-sammenføjningsmetoden. McIL-17-3 blev mærket med en grøn trekant. Arter inkluderet i det fylogenetiske træ blev alle hentet fra Genebank-databasen, og accessionsnumre blev også opført i træet. Grøn trekant på vegne af McIL-17-3. (For fortolkning af referencerne til farve i denne figurforklaring henvises læseren til webversionen af ​​denne artikel.)

2.4. Aktiveringen af ​​downstream af McIL-17-3

Som vist i figur 4 øgede rekombinant McIL-17-3 luciferaseaktiviteten af ​​pGLNF-KB-luc på en dosisafhængig måde. Ved 0.5 og 1.0 µg/brønd steg luciferaseaktiviteten af ​​pGLNF-κB-luc henholdsvis 2.07- og 11.07-fold.

2.5. Bekræftelse af McIL-17-3 som et målgen for Mc-roman_miR_145

Gennem bioinformatik-forudsigelse indeholder McIL{{0}}-genet en standardmålsekvens for Mc-novel_miR_145 ved dets 30 UTR (figur 5A). Mc-novel _miR_145 mimik og inhibitor blev co-transficeret med vildtype McIL-17-3-30 UTR-reporterplasmidet ind i HEK293-celler for at bekræfte deres korrelation. Som vist i figur 5B kan Mc-novel_miR_145-mimik hæmme luciferaseaktiviteten af ​​McIL-17-3-30 UTR-WT (0.{{2{{58} }}}fold fald sammenlignet med kontrol), mens Mc-novel_miR_145-hæmmer lindrer virkningerne bemærkelsesværdigt (1.64-fold stigning sammenlignet med Mc-novel_ miR_145 mimik som en blot tilføjet gruppe). For at vurdere, om Mc-novel{{30}}miR_145 direkte målretter mod McIL-17-3-genet gennem målstedet i 30 UTR, konstruerede vi mutantversionen af ​​luciferase-reporterplasmider der muterede Mc-romanen_miR_145-målretningssekvenserne i McIL-17-3 30 UTR. Som vist i figur 5C reducerede Mc-novel_miR_145 mimik signifikant luciferaseaktiviteten af ​​cellerne transficeret med McIL-17-3-30 UTR-WT (0.27-fold) fald), mens der ikke blev observeret nogen ændring i luciferaseaktivitet i celler transficeret med McIL-17-3-30 UTR-MUT. Derudover efterligner de dosisafhængige virkninger af Mc-romanen_miR_145 inhiberingen af ​​McIL-17-3-30 UTR-WT luciferaseaktiviteten også observeret 24 timer efter transfektion (0 .71-, 0.43- og 0.20-fold fald sammenlignet med henholdsvis kontrol, figur 5D).

Figur 2. Flere justeringer af McIL-17-3 med andre IL-17-familiemedlemmer. (A) Aminosyresekvensen for McIL-17-3 blev justeret med den for andre IL-17'er hentet fra muslinger og hvirveldyr, inklusive mus og zebrafisk. Disse cysteiner, som danner en kanonisk knude, var markeret med grønt, med erstattede aminosyrerester markeret med rødt. Cysteinknuden er angivet med farvelinjer, blå betyder deres tilstedeværelse i bløddyr og rød betyder deres tilstedeværelse hos hvirveldyr. Bemærk: Kun den anden halvdel af sekvensjusteringen er bevaret til visualisering. (B) Den tertiære struktur af McIL-17-3-proteinet blev forudsagt ved hjælp af den schweiziske model og pyMol-software. Disse cysteiner, som danner en kanonisk knude, blev markeret. (C) En tegneserierepræsentation af den kanoniske cystein-knudefold. Cysteinrester blev angivet med udfyldte cirkler; de tilstedeværende i IL-17-proteiner var gule, mens de to savnede var grå. (For fortolkning af referencerne til farve i denne figurforklaring henvises læseren til webversionen af ​​denne artikel.)

Figur 3. Ekspressionsprofilanalyse af McIL-17-3-transskriptioner. (A) Fordeling af McIL-17-3-transkripter i almindeligt muslingevæv. (B) Temporale udtryksændringer af McIL-17-3-transkripter som svar på V. alginolyticus-udfordring. Resultaterne blev udtrykt som middelværdi ± SD (n=3, * p < 0.05, ** p < 0,01). (For fortolkning af referencerne til farve i denne figurforklaring henvises læseren til webversionen af ​​denne artikel.)

Figur 4. Aktiveringen af ​​NF-KB-reporter af McIL-17-3. Den rekombinante vektor pEGFP-McIL- 17-3 i tre koncentrationer (0.1, 0.5 og 1.{{10}} µg/brønd) blev cotransficeret ind i HEK293-celler ved hjælp af Lipo6000TM i 24 timer. De relative luciferaseaktiviteter blev beregnet ved at normalisere til pRLTK-værdien. De eksperimentelle resultater blev udtrykt som foldændringer ved at sammenligne luciferaseaktiviteterne af rekombinante vektor-inducerede celler med dem af tomme vektor-inducerede celler i samme koncentration. Hver værdi blev vist som middelværdi ± SD (n=3), og søjler med et stjernesymbol var signifikant forskellige (* p < 0,05, ** p < 0,01).

Figur 5. Mc-roman_miR_145 målrettet McIL-17-3. (A) McIL-17-3 30 UTR-sekvensen blev indsat i pmiR-RB-Report™-vektoren, henholdsvis konstruerede vildtype- og mutantplasmider. Mcnovel_miR{{10}}-sekvens og McIL-17-3-30 UTR-målsted og mutantstedsekvens blev mærket med røde markører. (B) McIL-17-3-30 UTR-WT-plasmid blev co-transficeret med Mc-novel_miR_145-mimik eller Mc-novel_miR{{{37} }}} inhibitor ind i HEK293-celler. (C) HEK293-celler blev transficeret med McIL-17-3-30 UTR-WT eller mutanttypen af ​​McIL-17-3-30 UTR-MUT sammen med Mc-novel_miR_145 eller NC , i 24 timer. Luciferaseaktiviteten blev målt under anvendelse af dual-luciferase reporter assaysystemet. (D) Koncentrationsgradienteksperimenterne blev udført for Mc-novel_miR_145 transfektion. Alle data er præsenteret som middelværdier ± SD fra mindst tre uafhængige tredobbelte eksperimenter. **, p < 0,01, *, p < 0,05 i forhold til kontrollerne. (For fortolkning af referencerne til farve i denne figurforklaring henvises læseren til webversionen af ​​denne artikel.)

2.6. Mc-roman_miR_145 regulerer udtrykket af McIL negativt-17-3

M. coruscus-hæmocytterne blev transficeret med Mc-novel_miR_145-mimik, Mcnovel_miR_145-hæmmer og deres respektive kontroller og ændringerne i McIL{{ 5}}-ekspression blev vurderet på transkriptions- og proteinniveauerne. Som vist i figur 6A var udtrykket af Mc-novel_miR_145 signifikant opreguleret (8.83-fold stigning) af dens mimik og nedreguleret ({{14 }}.41-fold fald) af dets repressor i hæmocytter, hvilket tyder på effektive virkninger af disse syntetiske sammensatte stoffer. I figur 6B blev ekspressionen af ​​endogen McIL-17-3 signifikant hæmmet (0.51-fold fald) af Mc-novel_miR_145 mimik ved transkriptionsniveau og signifikant induceret (2.42-fold stigning) af Mcnovel_miR_145-hæmmer. For at undersøge virkningerne af Mc-novel_miR_145 på ekspressionen af ​​McIL-17-3 på proteinniveau blev der produceret et polyklonalt antistof mod McIL-17-3. Som vist i bane 2 og 3 i figur 6C blev det rekombinante McIL-17-3-protein med succes udtrykt i E. coli. Antistofspecificiteten blev undersøgt med muslingeproteinet fra hæmocytter ved Western blot. Et enkelt bånd på ca. 22 kDa, svarende til molekylmassen af ​​McIL -17-3, blev observeret (bane 4 i figur 6C). Resultaterne af Western blot i figur 6D viste den negative regulering af McIL-17-3 på proteinniveau ved Mc-novel_miR_145.

Ffigur 6. Mc-novel_miR_145 hæmmede ekspressionen af ​​McIL-17-3 i M. coruscus-hæmocytter. (A) Ekspressionen af ​​Mc-novel _miR_145 blev vurderet ved qPCR i hæmocytter transficeret med 145 mimik, 145 inhibitorer og deres respektive kontrol. (B) Efter transfektion i 24 timer blev transkriptionsniveauerne af McIL-17-3 bestemt ved qPCR. (C) Rekombinant ekspression, oprensning og antiserumpræparatet til McIL-17-3. Bane M, standard protein molekylvægt markør. Bane 1, negativ kontrol (uden induktion). Bane 2, induceret rekombinant protein McIL-17-3. Bane 3, renset McIL- 17-3. Bane 4, Western blot med anti-McIL{{20}} antistof i hæmocytterne af M. coruscus. (D) Efter transfektion i 24 timer blev proteinniveauerne af McIL -17-3 bestemt ved Western blot. ** p < 0,01 i forhold til kontrollerne

2.7. Apoptose af hæmocytter

Den hæmocytapoptotiske hastighed for fire grupper, dvs. NC+LPS, McIL-17-3+LPS, Mcnovel_miR_145+McIL-17-3+LPS og Mc-novel{{6} }miR_145-i+McIL-17-3+LPS blev analyseret ved flowcytometri under anvendelse af dobbeltfarvning. Efter at McIL-17-3 var overudtrykt, var apoptosehastigheden for hæmocytter udfordret med LPS signifikant opreguleret sammenlignet med kontrolgruppen (figur 7A(a,b), B). Når McIL-17-3 blev cotransficeret med Mc-novel_miR_145, faldt hæmocyt-apoptosehastigheden induceret af LPS signifikant sammenlignet med McIL-17-3 transficeret alene (figur 7A( b, c), B). I modsætning hertil viste den hæmocyt-apoptotiske rate en bemærkelsesværdig stigning i Mc-novel_miR_145-i+ McIL-17-3+LPS-gruppen sammenlignet med McIL-17-3+LPS-gruppen (Figur 7A) (b,d), B).

Figur 7. Den hæmocyt-apoptotiske hastighed blev vurderet ved flowcytometri under anvendelse af propidiumiodid (PI) og FITC-Annexin-V-farvning

3. Diskussion

IL-17 er anerkendt for at være en af ​​de vigtige pro-inflammatoriske cytokinfamilier, som effektivt kan deltage i patogenesen af ​​forskellige sygdomme [42]. I vores tidligere undersøgelse viste en M. coruscus IL-17-homolog differentiel ekspression før og efter V. alginolyticus-infektion gennem transkriptom-sekventering [41], hvilket tyder på dens potentielle rolle i det medfødte immunrespons på bakteriel udfordring. Her karakteriserede vi denne IL-17-homolog og kaldte den McIL-17-3. Den funktionelle domæne-forudsigelse afslørede et typisk IL-17-domæne, der giver den aktuelt identificerede gentilknytning til IL-17-cytokinfamilien. I det fylogenetiske træ viste dette nye IL-17-gen et meget tæt slægtskab med IL-17- 3 fra en anden Mytilus-art, M. galloprovincialis. Derudover delte de en meget høj 95 % aminosyreidentitet, og derfor nominerede vi det nuværende nye IL-17-gen som McIL-17-3 for at følge den navnekonvention, der bruges i Mytilus-arter. IL-17-familien består af seks medlemmer og fem receptorer hos mennesker [43], men den har oplevet en enorm genetisk ekspansion i marine hvirvelløse dyr, især i muslinger [11]. Baseret på dette antydede vores data, at McIL-17-3 ikke var direkte relateret til bestemte gener i den menneskelige IL-17-familie. Cystein-knudefolden placeret ved -sheets er det typiske kendetegn for IL-17-familien [5]. Forventningen af ​​den tertiære struktur afslørede en cystein-knudefoldning i McIL-17-3-proteinet, hvilket yderligere uddybede tilskrivningen af ​​McIL-17-3 til IL-17-cytokinfamilien. For yderligere at udforske differentieringen af ​​IL-17-aminosyresekvenser blandt forskellige arter, nogle typiske muslinge-IL-17 og Mus musculus IL-17-A til IL-17-F og Danio rerio IL-17-1 til IL-17-3 blev valgt til at udføre multipeljusteringsanalysen. Resultaterne viste en interessant konstatering af, at disulfidbindingspositionen af ​​IL-17'er i muslinger og hvirveldyr var inkonsekvent: disse to disulfidbindinger eksisterede mellem -strenge 1 og 3, 2 og 4, henholdsvis i muslinger, men kun mellem -strenge 2 og 4 hos hvirveldyr. Ved det første og fjerde cysteinsted erstatter hvirveldyr IL-17 cystein med serin; på det andet cysteinsted erstatter muslinge-IL-17'er cystein med threoninentiering ved disulfidbinding i muslinger og hvirveldyr, og dens underliggende mekanisme er uklar og kræver yderligere undersøgelse. I betragtning af polymorfien af ​​IL-17 i muslinger er disulfidbindingen mellem -strenge 1 og 3 muligvis ikke så stærk som den mellem 2 og 4, hvilket giver dem større plasticitet i muslinger. Under alle omstændigheder tyder analyse af funktionelle domæner og tertiær struktur på, at det identificerede McIL-17-3 i øjeblikket er typisk for muslinge-IL-17-cytokinet og kan spille en lignende funktionel rolle som dets modstykker i bløddyr. Ekspressionen af ​​IL-17-gener i humane væv varierer meget, hvor nogle kun udtrykkes i nogle få celler og andre i et stort antal væv [44,45]. De fleste undersøgelser af bløddyr viste, at IL-17'er havde en konstitutiv ekspressionsprofil [13,15,17,46,47]. Ikke desto mindre viste Li, Zhang, Zhang, Xiang, Tong, Qu og Yu [47] et inkonsekvent resultat i C. gigas IL-17s: CgIL-17-2, -3, {{ 65}} og -6 var stærkt udtrykt i C. gigas gæller, fordøjelseskirtler og kappe, men næppe udtrykt i andre væv. Her blev McIL-17-3-transkriptioner fundet i alt undersøgt væv, hvilket tyder på dets mange funktionelle roller i en række fysiologiske aktiviteter. Men de høje ekspressionsniveauer af McIL-17-3 i nogle molluscanske immunrelaterede væv, såsom hæmocytter, gæller og fordøjelseskirtler, tyder på dets tættere involvering med immunrespons. Efterfølgende uddyber dens hurtige reaktion på V. alginolyticus-angreb dette punkt. Injektionen af ​​V. alginolyticus opregulerede signifikant ekspressionen af ​​McIL-17-3, og lignende resultater er også blevet observeret i andre molluscan IL-17. Injektion af V. anguillarum i C. gigas inducerede en hurtig stigning i CgIL-17-transkriptoverflod i hæmocytter, hvilket tyder på, at det var et immunt tidligfasegen [46]. Da C. gigas led et angreb af et andet patogen, V. splendidus, var mRNA-niveauet af CgIL-17-5 i hæmocytter også signifikant forhøjet [15]. Stimuleringen af ​​LPS, den vigtigste patogene komponent i bakterier, øgede dramatisk ekspressionen af ​​PfIL-17 i fordøjelseskirtlerne i perleøstersen P. fucata [17]. Derudover kunne LPS inducere ekspressionen af ​​CgIL-17-3 i C. gigas [47] og PmIL-17-2 i P. fucata martensii [13]. Disse resultater viste samlet, at IL-17 spillede en vigtig rolle i molluscans immunforsvar mod bakterieangreb. I denne undersøgelse viste McIL-17-3 aktiveringskapaciteten af ​​nedstrøms NF-KB-vejen. Lignende resultater blev også observeret i nogle bløddyrarter. I perleøstersen P. fucata udviste PfIL-17 også aktivering af NF-KB-vejen i HEK293-celler ved luciferase-reporter-assays [17]. I C. gigas fremmede CgIL-17-5 aktiveringen af ​​CgMAPK'er og den nukleære translokation af CgRel og CgAP-1 for at fremme mRNA-ekspressionen af ​​cytokiner og antibakterielle peptider [15]. Det er blevet påvist, at virkningsmåden for IL-17 er baseret på dets forening i dimerer (homodimerer eller heterodimerer), hvis aktivitet er meget afhængig af deres tilknytning til receptorerne (IL-17Rs), de mål. Disse receptorer indeholder et konserveret cytoplasmatisk domæne (SEFIR), der interagerer med adapterproteiner for at initiere nedstrøms signaltransduktionsveje til aktivering af transkriptionsfaktorer såsom NF-KB og fremme ekspressionen af ​​immune og pro-inflammatoriske målgener, såsom cytokiner og antimikrobielle peptider [ 11, 48, 49].

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Disse resultater tyder på, at bløddyr IL-17 kan have samme virkningsmåde som deres modstykker hos hvirveldyr. Dette skal bekræftes i fremtidige undersøgelser. Korrelationerne mellem miRNA'er og IL-17'er er blevet fundet i flere humane sygdomsmodeller. Niimoto, et al. [50] bekræftede den positive sammenhæng mellem miR-146a og IL-17a udtryk i mononukleære celler i perifert blod og synovium fra patienter med reumatoid arthritis og opsummerede den vitale funktion af miR-146a i differentiering af IL-17-producerende celler. Hos psoriasispatienter virker miR-146a en potent hæmmer af IL-17-drevet hudbetændelse, og dets lave niveauer kan bidrage til tidlig sygdomsdebut hos genetisk følsomme individer [51]. MiR-146a kan lindre parodontitis ved at nedregulere ekspressionen af ​​IL-17 og hæmme proliferationen af ​​humane parodontale ligamentstamceller [52]. MiR-155 regulerer negativt ekspressionen af ​​IL-17 for at deltage i værtens immunrespons på postviral bakteriel lungebetændelse i muselunge; miR-155-hæmmede mus viser stærkere ekspression af IL-17 i lungen, ledsaget af forbedret bakteriel clearance [53]. Disse undersøgelser tyder på, at IL-17 er reguleret af flere miRNA'er og varierer med sygdom og celletype [20]. I en tidligere undersøgelse udførte vi en integreret analyse af miRNAomet og transkriptomet for at udforske den interaktive regulering af miRNA-mRNA af M. coruscus som reaktion på V. alginolyticus-infektion. Resultaterne forudsagde, at Mc-novel_miR_145 kunne målrette McIL-17-3 for at deltage i det medfødte immunrespons på bakteriel infektion [41]. Med henblik på at udforske den underliggende mekanisme bag Mcnovel_miR_145-regulering af McIL-17-3 i dybden, blev en række laboratorieforsøg udført i de nuværende undersøgelser. Beregningen forudsagde, at Mc-novel_miR_145 kunne målrette mod 30 UTR af McIL-17-3. Følgende luciferase-reporter-assays udført i HEK293-celler co-transficeret af Mc-novel_miR_145 efterligner, efterligner NC, inhibitor, inhibitor NC med McIL-17-3-30 UTR-WT, -MUT-reporter plasmider bekræftede yderligere dette punkt. Yderligere blev Mc-novel _miR_145 mimic, mimic NC, inhibitor og inhibitor NC transficeret ind i M. coruscus-hæmocytter for at evaluere deres virkninger på McIL-17-3-ekspression ved transkriptionelle og proteinniveauer . Udtrykket af McIL-17-3 var signifikant nedreguleret i Mc-romanen_miR_145-mimi-transfektionsgruppen, mens det var signifikant opreguleret i Mc-romanen_miR _145 inhibitor transfection group, hvilket tyder på en negativ regulering af McIL-17-3 af Mc-novel_miR_145. De nuværende resultater var i modstrid med en tidligere undersøgelse. I Pinctada martensii fandt Tian, ​​Zheng, Huang, Jiao og Du [30], at selvom Pm-miR-29a kunne målrette mod IL-17, var reguleringen positiv som udtryk for IL{{ 65}} i kappen og gællen af ​​Pinctada martensii blev opreguleret efter overekspressionen af ​​Pm-miR-29a. I betragtning af at P. martensii og M. coruscus begge tilhører toskallede og er relativt nært beslægtede, tyder disse inkonsistente resultater på, at reguleringen af ​​IL-17'er i bløddyr kan variere med miRNA'er. Bortset fra dette har ingen litteratur rapporteret korrelationen mellem miRNA'er og IL-17'er i bløddyr, og derfor er der ikke flere parallelle undersøgelser til at sammenligne de nuværende resultater. Imidlertid har nogle få undersøgelser rapporteret målretningsforhold mellem specifikke miRNA'er og specifikke immunrelaterede gener i bløddyr.

For eksempel øger cgi-miR-2d østershæmocytfagocytose ved negativt at regulere CgIκB2 i Crassostrea gigas [31]. Derudover regulerer cgi-miR-2d også negativt ekspressionen af ​​et cholin-transporter-lignende gen for at deltage i den sofistikerede immunmodulering af østershæmocytter under det tidlige stadium af infektion [32]. Disse undersøgelser tyder i det mindste på, at miRNA'er spiller en potentiel rolle i medfødt immunsignalering ved at målrette mod specifikke gener i bløddyr, ligesom de gør i hvirveldyr. Dernæst forsøgte vi at udforske den potentielle funktion af interaktionen mellem Mcnovel_miR_145 og McIL{{10}} i den medfødte immunitet hos M. coruscus og deres rolle i LPS-induceret apoptose er i fokus for vores opmærksomhed. LPS er et stærkt proinflammatorisk molekyle, der er en del af den ydre kappe af alle gramnegative bakterier. LPS har vist sig at inducere apoptose i forskellige celler og væv, såsom makrofager [54], endotelceller [55] og muselunge [56]. Et foreløbigt eksperiment har vist, at LPS-eksponering ved en nominel koncentration på 0,1 mg/ml i 24 timer signifikant inducerede apoptose af hæmocytter fra M. coruscus. Efter McIL-17-3-overekspression var apoptoseniveauet af M. coruscus-hæmocytter signifikant øget sammenlignet med kontrolgruppen, hvilket tyder på, at McIL-17-3 kan styrke LPS-induceret apoptose af hæmocytter i M. coruscus. De nuværende resultater var i overensstemmelse med nogle tidligere undersøgelser. I humane neutrofiler kunne IL-17A mindske de anti-apoptotiske virkninger medieret af granulocyt makrofag-koloni-stimulerende faktor [57]. IL-17 inducerer apoptose af vaskulære endotelceller, som er en potentiel mekanisme for akut koronarsyndrom [58]. Genetisk deletion af IL -17A reducerer alveolær type II celle apoptose og lindrer dermed kronisk obstruktiv lungesygdom [59]. Der er dog stadig nogle modsatte argumenter. Når mus er inficeret med Theilers murine encephalomyelitis-virus, fremmer IL-6 og IL-17 synergistisk viral persistens ved at hæmme cellulær apoptose [60]. Disse konflikter tyder på, at den underliggende mekanisme for IL-17-medieret apoptose er kompleks, og IL-17'er kan spille modsatte funktioner afhængigt af typen af ​​infektion.

Da McIL-17-3 blev co-transficeret med Mc-novel_miR_145, var niveauet af apoptose induceret af LPS signifikant nedreguleret sammenlignet med den eneste transficerede McIL-17-3 gruppe, tilsvarende var apoptoseniveauet signifikant opreguleret efter McIL-17-3 blev co-transficeret med Mc-novel_miR_145-hæmmer. Mc-novel_miR_145 har vist sig at regulere McIL-17-3 negativt, og derfor konkluderede vi, at McIL-17-3 forværrede hæmocytapoptose induceret af LPS, mens Mc-novel _miR_145 lindrede virkningerne. Adskillige miRNA'er, der har vist sig at være involveret i menneske- og musecelleapoptose, blev identificeret i bløddyr i de sidste par år. For eksempel blev miR-125b og miR- 335 fundet i flad østers Ostrea edulis [21], miR-184 blev fundet i hæmocytter af østers Crassostrea gigas [23] og miR{{ 26}}, -29, -96, -182 og -193 blev fundet i det regenererende centralnervesystem i L. stagnalis [25]. Disse apoptose-relaterede miRNA'er identificeret gennem high-throughput sekventering og biologiske beregninger bekræfter eksistensen af ​​miRNA-medieret apoptose i bløddyr. Chen et al. rapporterede en opregulering af miR-2d efter Vibrio splendidus challenge i hæmocytterne i Crassostrea gigas. Overekspressionen af ​​miR-2d var korreleret med en knock-down-ekspression af IκB2 og en signifikant stigning i hæmocytfagocytosehastigheden, forbundet med en undertrykkelse af apoptose [31]. Resultaterne var i overensstemmelse med vores nuværende undersøgelse, kollektivt, og synes at antyde, at miRNA'er udøver en hæmmende funktion på celleapoptose i bløddyr. Faktisk har de fleste af de apoptose-relaterede miRNA'er hos mennesker vist hæmmende effekter på apoptose. MiR-146 beskytter A549- og H1975-celler mod LPS-induceret apoptose og inflammationsskade via opregulerende Sirt1 og blokerer derved NF-KB- og Notch-veje [61]. Endvidere dæmper miR-146 bestrålings- og LPS-induceret hepatocytapoptose gennem inhibering af TLR4-vejen [62]. MiR-93 hæmmer chondrocytapoptose ved slidgigt ved at målrette TLR4/NF-KB-signalvejen [63]. MiR-129-5p lindrer rygmarvsskade hos mus via undertrykkelse af apoptose gennem HMGB1/TLR4/NF-KB-vejen [64]. Der er dog stadig nogle specifikke miRNA'er, der viser forstærkende virkninger på apoptose. For eksempel blev miR-203 fundet at accelerere LPS-induceret apoptose ved at målrette PIK3CA i alveolære epitelceller [65]. Disse resultater tyder på kompleksiteten af ​​den underliggende mekanisme af miRNA-medieret apoptose.

4. Materialer og metoder

4.1. Eksperimentelt design

For det første blev McIL-17-3 identificeret og karakteriseret fra M. coruscus gennem bioinformatisk analyse. Efter dette blev vævsfordelingen af ​​McIL-17-3-transkripter såvel som dets respons på bakteriel udfordring vurderet ved kvantitative real-time PCR (qPCR) assays. Dernæst blev sammenhængen mellem McIL-17-3 og Mc-novel_miR_145 bestemt ved luciferase-reporteranalyse udført i HEK293-celler og M. coruscus-hæmocytter. Derudover blev deres funktionelle rolle i LPS-induceret apoptose vurderet ved flowcytometri.

4.2. Kunstigt havvand

Efter tre dages beluftning af kommunalt postevand blev øjeblikkelig havkrystal (Haiding LTD, Ji'an, Kina) tilsat, omrørt grundigt og smeltet for at nå en saltholdighed på 30‰. Det konfigurerede kunstige havvand skal luftes i 2 timer, før det bruges.

4.3. Dyr

Den tykskallede musling M. coruscus (skallængde, 9,82 ± 0,53 cm; skalbredde, 4,68 ± 0,45 cm; vådvægt, 71,2 ± 2,7 g) blev købt på Donghe-markedet i Zhoushan, Zhejiang-provinsen, Kina. Alle muslinger blev holdt i tanke fyldt med en ASW på omkring 25 ◦C og saltholdighed på 30‰ i mere end en uge før efterfølgende forsøg.

4.4. McIL-17-3 cDNA-identifikation

En IL-17-homolog (McIL-17-3) blev i silico klonet fra transkriptomet i fuld længde af M. coruscus (adgangsnummer: PRJNA798880, F01_transkript_12404). Blast-proceduren blev udført for at forudsige den formodede McIL-17-3-aminosyresekvens, efterfulgt af funktionel domæneanalyse med SMART og fylogenetisk sammenhængsvurdering med MEGA-X. Den multiple justering blev udført ved hjælp af ClustalW-proceduren. Den schweiziske model og pool blev brugt til at forudsige den tertiære struktur af McIL-17-3-proteinet. Den detaljerede procedure var ifølge vores tidligere undersøgelse [66].

4.5. Kvantitative realtids-PCR-analyser

Kvantitative real-time PCR-assays (qPCR) er et kraftfuldt værktøj til påvisning og måling af genekspressionsniveauer. Her blev vævsfordelingen af ​​McIL-17-3 evalueret ved hjælp af qPCR-metoden. Derudover blev ændringer i ekspressionen af ​​McIL-17-3 mRNA som reaktion på bakteriel infektion også påvist ved qPCR. Vævsfordelingsprofilen for McIL-17-3 blev bestemt i gæller, kappe, fordøjelseskirtler, gonader, adduktormuskel og hæmocytter ved hjælp af qPCR programmeret ved 95 ◦C i 10 min, efterfulgt af 40 cyklusser af 95 ◦C i 10 s, 60 ◦C i 45 s. Disse væv blev dissekeret fra ni muslingeindivider og samlet for at lindre individuel differentiering. I det bakterielle udfordringsforsøg blev levende V. alginolyticus brugt som immunstimuli. Et volumen på 100 µL bakterier opløst i havvand (1 × 108 CFU mL−1) blev injiceret i muslingers adduktor. Ingen injicerede muslinger blev brugt som kontrol. Ni muslinger blev tilfældigt udtaget fra hver gruppe 0, 3, 6, 12, 24 og 36 timer efter udfordring (hpc). Hæmocytterne fra tre muslinger blev samlet for at blive betragtet som én prøve, og der var tre prøver for hvert tidspunkt. MikroRNA'er blev ekstraheret ved hjælp af miRNA Extraction Kit (HaiGENE, Kat. Nr.: B1802), og cDNA'et blev syntetiseret ved hjælp af miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit (Tiangen, Kat. Nr.: 4992786), og qPCR blev udført ved hjælp af miRcute Plus miRNA qPCR Kit (Tiangen, Kat. nr.: 4992887). U6- og -actingener blev brugt som de interne referencer for henholdsvis qPCR og miRNAs qPCR. De specifikke primerpar anvendt i dette eksperiment er anført i tabel 1. De relative ekspressionsniveauer blev målt ved hjælp af 2−∆∆Ct-metoden [67].

Tabel 1. PCR-primerpar blev anvendt i den foreliggende undersøgelse.

4.6. Cellekultur

Pattedyrs-HEK293-cellerne (RiboBio Ltd., Guangzhou, Kina) blev brugt til at udføre luciferase-reporter-assays for at bestemme downstream-aktiveringen af ​​McIL- 17-3 samt sammenhængen mellem Mc-novel_miR{{ 4}} og McIL-17-3. HEK293-celler blev dyrket i OPTI-MEM-medium (GIBCO) ved 37 ◦C, 5% CO2. For yderligere at udforske reguleringen af ​​McIL-17-3 af Mc-novel_miR_145 og deres funktionelle rolle i LPS-induceret apoptose, blev hæmocytter af M. coruscus hentet fra adduktormusklen i hver musling med en 0,5 mm diameter (25 G) engangsnål indeholdende 0,5 ml af antikoagulanten. Hæmocytter blev opsamlet ved centrifugering i 5 minutter ved 3000 rpm, 4 ◦C, og 0,25 % trypsin (Solarbio) blev tilsat. Hæmocytter blev suspenderet i et L-15-medium indeholdende 15 % føtalt bovint serum (Solarbio) og dyrket ved 26 ◦C med 5 % CO2.

4.7. Syntese af miRNA Mimic og Inhibitor

Mc-romanen_miR_145 mimik-, inhibitor- og kontrolnukleotider blev sammensat af GenePharma (Shanghai). Deres sekvens er som følger: Mc-roman_miR_145 mimik, 52032- UCCAGAAAAGCGCUUCGGACG-30; Mc-novel_miR_145-hæmmer, 50 -CGUCCGAAGCG CUUUUCUGGA-30 (kemisk modificeret af 20 Ome); negativ kontrol mimik, 50 -UUGUA CUACACAAAAGUACUG-30; og negativ kontrolhæmmer, 50 -CAGUACUUUUGUGU AGUACAA-30 (kemisk modificeret af 20 Ome).

4.8. Luciferase Reporter Analyse

Luciferase reporter-assays bruges i vid udstrækning til at studere genekspression og regulatorisk aktivitet. Mængden af ​​genereret lys er proportional med mængden af ​​produceret luciferaseenzym, som igen afspejler aktiviteten af ​​det regulerende element. Luciferaseaktiviteten måles derefter ved hjælp af et luminometer, og resultaterne analyseres og fortolkes for at bestemme den regulatoriske aktivitet af det undersøgte element. Luciferase reporter-assays blev anvendt til at analysere nedstrømsaktiveringen af ​​McIL{{0}}. I dette eksperiment blev pEGFP-McIL-17-3-plasmidet (0.1, 0.5 og 1.0 µg/brønd) sammen med pGLNF-κb- luc reporterplasmid (0,25 µg/brønd) blev cotransficeret ind i HEK293-celler ved anvendelse af Lipo6000TM i 24 timer. Et blankt pEGFP-N1-plasmid blev anvendt som kontrol. Luciferaseaktivitet blev målt under anvendelse af Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega, Madison, WI, USA) i henhold til specifikationen, med Renilla luciferase anvendt som interkontrol. Mc-novel_miR_145 målrettet mod McIL-17-3 blev også bekræftet af luciferase reporter-assays. Den bioinformatiske beregning forudsagde, at Mc-novel_miR_145 kan målrette mod 30 -UTR af McIL-17-3, og efterfølgende klonede 30 -UTR af McIL{{ 29}} ind i pmiR-RB-ReportTM luciferase-reportervektoren for at konstruere det vilde McIL-17-3-30 UTR-WT-reporterplasmid. Mutant-type McIL -17-3-30 UTR-MUT reportervektor blev konstrueret ved at mutere nukleotidet på 1023-1040 steder: TCCGAAGCGCTTTTCTGG til AGGCTTCGCGAAGACC. RNA-oligo (Mc-novel_miR_196 NC, mimic, NCi, inhibitor) blev transficeret sammen med McIL-17-3- 3 0 UTR-WT eller McIL-17-3-30 UTR-MUT til HEK293 celler ved hjælp af Lipo6000TM.

4.9. Rekombinant ekspression, oprensning og antiserumpræparation

For at vurdere effekten af ​​Mc-novel_miR_145 på ekspressionen af ​​McIL-17-3-proteinet blev et antiserum af McIL-17-3 fremstillet. cDNA-fragmentet, der dækker den åbne læseramme (ORF) af McIL-17-3, blev amplificeret med ét specifikt primerpar (tabel 1) og indsat i pET-32a-vektoren. Det rekombinante plasmid pET-32a-McIL{{10}} blev transformeret ind i Escherichia coli (DE3) (Takara) og inkuberet i LB-medium (indeholdende 50 mg L−1 kanamycin) ved 37 ◦C under omrystning ved 13 0 rpm i 4 timer. Efter at den optiske tæthed nåede absorbans 0.6 ved 600 nm, blev isopropyl-beta-D-thiogalaktopien (IPTG) med en slutkoncentration på 1 mM tilsat til bakterieopløsningen for at inducere ekspressionen af ​​rekombinant McIL{ {24}} protein (rMcIL-17-3). Efter inkubation ved 37 ◦C i 6 timer blev mediet centrifugeret ved 8000 rpm i 30 minutter for at opsamle bakterierne, efterfulgt af suspension i TBS-buffer (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8,0). rMcIL -17-3 blev oprenset ved Ni-nitrilotrieddikesyre (NI-NTA) affinitetschromatografi, og det oprensede protein blev dialyseret ud af imidazol i 24 timer. Det resulterende protein blev isoleret ved at reducere 12% SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Det oprensede protein blev genfoldet i en gradient urea-TBS glycerolbuffer (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM reduceret glutathion, 10% glycerol, 0,2 mM oxidglutathion, en gradient urinstofkoncentration på 6, 4, 3, 2 , 1 og 0 M urinstof i hver gradient, pH 7,4, hver gradient ved 4 ◦C i 12 timer). Derefter blev det resulterende protein brugt til at immunisere 6-ugegamle mus for at erhverve polyklonale antistoffer.

4.10. Western Blotting

Proteinprøver blev ekstraheret fra hæmocytter med RIPA-lysebuffer (Beyotime), og derefter blev koncentrationen påvist med et BCA-kit. Efter isolering med SDS-PAGE blev proteinet overført til PVDF-membraner med forsegling med 5% skummetmælkspulver i TBST (20 Mm Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% Tween-20, pH 8.0), efterfulgt af antistoffet mod McIL-17-3-inkubation natten over. Efterfølgende blev membranerne inkuberet med en fortyndet opløsning af gede-anti-muse-IgG-antistof og alkalisk phosphatase-konjugat (Thermo Fisher Scientific, kat.nr.: 31324) i den sekundære antistoffortyndingsbuffer (Beyotime, P0258) i 3 timer. Endelig blev de immunreaktive proteiner påvist af ECL-detektionssystemet.

4.11. Apoptose

Hæmocytapoptose blev vurderet ved hjælp af flowcytometri i henhold til manualen til FITC-Annexin-V Apoptosis Detection Kit (Beyotime). Kort fortalt blev de indsamlede hæmocytter behandlet i 24 timer med LPS (0,1 mg/ml), 20 nM pEGFP-McIL-17-3-plasmid, Mc-ny_miR{{9} } mimic og Mc-novel_miR_145-hæmmer. Efter vask med PBS blev cellerne resuspenderet i L15-mediet i en slutkoncentration på 1 × 106 celler mL−1 og blev farvet med FITC-Annexin-V og PI ved at blive inkuberet ved stuetemperatur i 25 minutter i mørke. . Endelig blev flowcytometriinstrumentet (Beckman CytoFLEX FCM) anvendt til at detektere celleapoptose, og data blev analyseret ved hjælp af FlowJoTM 10-software. 4.12. Statistisk analyse Eksperimentelle resultater blev præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse (SD). Resultaterne blev behandlet ved hjælp af en tovejs ANOVA-variansanalyse med Tukeys multiple sammenligningstest, og Origin2021-softwaren blev brugt til at analysere dataene og konstruere figurer.

cistanche planteforøgende immunsystem

5. Konklusioner

I denne undersøgelse blev en ny IL-17-homolog, McIL-17-3, identificeret fra M. coruscus og fundet at spille en afgørende rolle i molluscans immunforsvar mod bakterieangreb. Desuden blev det opdaget, at McIL-17-3 er negativt reguleret af Mc-novel_miR_145, som bidrager til dets deltagelse i LPS-induceret apoptose. Resultaterne af denne undersøgelse giver værdifuld indsigt i den regulerende rolle af IL-17 i muslingers immunrespons og fremhæver potentialet af ikke-kodende RNA til regulering af hvirvelløse immunforsvarsmekanismer. Det er dog vigtigt at bemærke, at der er nogle begrænsninger i denne undersøgelse. Specifikt blev mekanismen, der ligger til grund for handlingstilstanden for McIL-17-3, ikke undersøgt og kræver yderligere undersøgelse. Derudover fokuserede denne undersøgelse kun på interaktionen mellem Mc-novel_miR_145 og McIL-17-3 og udforskede ikke den mulige involvering af andre miRNA'er i immunresponset. Samlet set understreger denne undersøgelse den vigtige rolle af ikke-kodende RNA i immunforsvarsmekanismer og antyder, at deres modulering kunne tjene som en potentiel strategi for målrettede terapier for forskellige sygdomme.

Referencer

1. Medzhitov, R.; Janeway, C., Jr. Medfødt immunitet. N. Engl. J. Med. 2000, 343, 338-344. [CrossRef] [PubMed]

2. Lacy, P.; Stow, JL Cytokinfrigivelse fra medfødte immunceller: Association med forskellige membranhandelsveje. Blood J. Am. Soc. Hæmatol. 2011, 118, 9-18. [CrossRef] [PubMed]

3. Dinarello, CA Proinflammatoriske cytokiner. Chest 2000, 118, 503-508. [CrossRef] [PubMed]

4. Rauta, PR; Nayak, B.; Das, S. Immunsystem og immunresponser hos fisk og deres rolle i sammenlignende immunitetsundersøgelse: En model for højere organismer. Immunol. Lett. 2012, 148, 23-33. [CrossRef]

5. Hymowitz, SG; Filvaroff, EH; Yin, J.; Lee, J.; Cai, L.; Risser, P.; Maruoka, M.; Mao, W.; Foster, J.; Kelley, RF IL-17 adopterer en cystin-knudefold: Struktur og aktivitet af et nyt cytokin, IL-17F, og implikationer for receptorbinding. EMBO J. 2001, 20, 5332-5341. [CrossRef]

6. Buckley, KM; Ho, ECH; Hibino, T.; Schrankel, CS; Schuh, NW; Wang, GZ; Rast, JP IL17 faktorer er tidlige regulatorer i tarmepitelet under det inflammatoriske respons på Vibrio i søpindsvinslarven. eLife 2017, 6, e23481. [CrossRef]

7. Cua, DJ; Tato, CM Medfødte IL-17-producerende celler: Immunsystemets vagtposter. Nat. Rev. Immunol. 2010, 10, 479-489. [CrossRef]

8. Mills, KH IL-17 og IL-17-producerer celler i beskyttelse mod patologi. Nat. Rev. Immunol. 2022, 10, 479-489. [CrossRef]

9. Hibino, T.; Loza-Coll, M.; Messier, C.; Majeske, AJ; Cohen, AH; Terwilliger, DP; Buckley, KM; Brockton, V.; Nair, SV; Berney, K. Immungen-repertoiret er kodet i det lilla søpindsvin-genom. Dev. Biol. 2006, 300, 349-365. [CrossRef]

10. Albertin, CB; Simakov, O.; Mitros, T.; Wang, ZY; Pungor, JR; Edsinger-Gonzales, E.; Brenner, S.; Ragsdale, CW; Rokhsar, DS Blækspruttens genom og udviklingen af ​​blæksprutte neurale og morfologiske nyheder. Natur 2015, 524, 220–224. [CrossRef]

11. Saco, A.; Rey-Campos, M.; Rosani, U.; Novoa, B.; Figueras, A. Udviklingen og mangfoldigheden af ​​interleukin-17 fremhæver en udvidelse i marine hvirvelløse dyr og dets bevarede rolle i slimhindeimmuniteten. Foran. Immunol. 2021, 12, 692997. [CrossRef] [PubMed]

12. Gerdol, M.; Moreira, R.; Cruz, F.; Gómez-Garrido, J.; Vlasova, A.; Rosani, U.; Venier, P.; Naranjo-Ortiz, MA; Murgarella, M.; Greco, S. Massiv gentilstedeværelse-fravær variation former et åbent pan-genom i middelhavsmuslingen. Genom Biol. 2020, 21, 1-21. [CrossRef]

13. Cao, Y.; Yang, S.; Feng, C.; Zhan, W.; Zheng, Z.; Wang, Q.; Deng, Y.; Jiao, Y.; Du, X. Evolution og funktionsanalyse af interleukin-17-genet fra Pinctada fucata martensii. Fisk Skaldyr Immunol. 2019, 88, 102-110. [CrossRef] [PubMed]

14. Wang, Q.; Xiao, G.; Knus.; Chen, R.; Li, M.; Teng, S. Interleukin-17D medierer Vibrio harveyi-infektionsrelaterede ændringer i Tegillarca granulosa gennem aktivering af aktivatorprotein 1 in vivo. Aquaculture 2023, 566, 739178. [CrossRef]

15. Lv, X.; Sun, J.; Li, Y.; Yang, W.; Wang, L.; Leng, J.; Yan, X.; Guo, Z.; Yang, Q.; Wang, L. CgIL17-5 regulerer mRNA-ekspressionerne af immuneffektorer ved at inducere phosphoryleringen af ​​CgMAPK'er og den nukleare translokation af CgRel og CgAP-1 i stillehavsøstersen Crassostrea gigas. Dev. Comp. Immunol. 2022, 127, 104263. [CrossRef] [PubMed]

16. Wang, L.; Sun, J.; Wu, Z.; Lian, X.; Han, S.; Huang, S.; Yang, C.; Wang, L.; Song, L. AP-1 regulerer udtrykket af IL17-4 og IL17-5 i stillehavsøstersen Crassostrea gigas. Fisk Skaldyr Immunol. 2020, 97, 554-563. [CrossRef]

17. Wu, S.-Z.; Huang, X.-D.; Li, Q.; Han, M.-X. Interleukin-17 i perleøsters (Pinctada fucata): Molekylær kloning og funktionel karakterisering. Fisk Skaldyr Immunol. 2013, 34, 1050-1056. [CrossRef]

18. Xin, L.; Zhang, H.; Zhang, R.; Li, H.; Wang, W.; Wang, L.; Wang, H.; Qiu, L.; Song, L. CgIL17-5, et gammelt inflammatorisk cytokin i Crassostrea gigas, der udviser heterogenitetsfunktioner sammenlignet med hvirveldyrs interleukin17-molekyler. Dev. Comp. Immunol. 2015, 53, 339-348. [CrossRef]

19. Denli, AM; Toppe, BB; Plasterk, RH; Ketting, RF; Hannon, GJ Behandling af primære mikroRNA'er af mikroprocessorkomplekset. Nature 2004, 432, 231-235. [CrossRef]

20. Khan, D.; Ansar Ahmed, S. Regulering af IL-17 i autoimmune sygdomme ved hjælp af transkriptionelle faktorer og mikroRNA'er. Foran. Genet. 2015, 6, 236. [CrossRef]

21. Martín-Gómez, L.; Villalba, A.; Kerkhoven, RH; Apollo, E. MikroRNAs rolle i immunitetsprocessen af ​​den flade østers Ostrea edulis mod bona miosis. Inficere. Genet. Evol. 2014, 27, 40-50. [CrossRef] [PubMed]

22. Xu, F.; Wang, X.; Feng, Y.; Huang, W.; Wang, W.; Li, L.; Fang, X.; Que, H.; Zhang, G. Identifikation af konserverede og nye mikroRNA'er i stillehavsøstersen Crassostrea gigas ved dyb sekventering. PLoS ONE 2014, 9, e104371. [CrossRef]

23. Zhou, Z.; Wang, L.; Sang, L.; Liu, R.; Zhang, H.; Huang, M.; Chen, H. Identifikationen og karakteristika af immun-relaterede mikroRNA'er i hæmocytter af østers Crassostrea gigas. PLoS ONE 2014, 9, e88397. [CrossRef] [PubMed]

24. Burgos-Aceves, MA; Cohen, A.; Smith, Y.; Faggio, C. Potentiel mikroRNA-regulering af immunrelaterede gener i hvirvelløse hæmocytter. Sci. Samlet miljø. 2018, 621, 302-307. [CrossRef]

25. Walker, SE; Spencer, GE; Necakov, A.; Carlone, RL Identifikation og karakterisering af mikroRNA'er under retinsyre-induceret regenerering af et molluskisk centralnervesystem. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 2741. [CrossRef] [PubMed]

26. Abo-Al-Ela, HG; Faggio, C. MicroRNA-medieret stressrespons hos toskallede arter. Ecotoxicol. Environ. Saf. 2021, 208, 111442. [CrossRef] [PubMed]

27. Huang, S.; Yoshitake, K.; Asaduzzaman, M.; Kinoshita, S.; Watanabe, S.; Asakawa, S. Opdagelse og funktionel forståelse af miRNA'er i bløddyr: En genom-dækkende profileringstilgang. RNA Biol. 2021, 18, 1702-1715. [CrossRef]

28. Rosani, U.; Bortoletto, E.; Bai, C.-M.; Novoa, B.; Figueras, A.; Venier, P.; Fromm, B. Graving i toskallede miRNAomer: Mellem bevaring og innovation. Philos. Trans. R. Soc. B 2021, 376, 20200165. [CrossRef]

29. Sun, X.; Zhang, T.; Li, L.; Tu, K.; Yu, T.; Wu, B.; Zhou, L.; Tian, ​​J.; Liu, Z. MicroRNA-ekspressionssignatur i de tværstribede og glatte adduktormuskler i Yesso-musling Patinopecten yessoensis. Genomics 2022, 114, 110409. [CrossRef]

30. Tian, ​​R.; Zheng, Z.; Huang, R.; Jiao, Y.; Du, X. miR-29a deltog i dannelsen af ​​nacre og immunrespons ved at målrette Y2R i Pinctada martensii. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 29436-29445. [CrossRef]

31. Chen, H.; Zhou, Z.; Wang, H.; Wang, L.; Wang, W.; Liu, R.; Qiu, L.; Song, L. En hvirvelløse dyr-specifik og immun-responsiv mikroRNA øger østers hæmocyt fagocytose ved at målrette CgIκB2. Sci. Rep. 2016, 6, 1-10. [CrossRef] [PubMed]

32. Chen, H.; Zhou, Z.; Wang, L.; Wang, H.; Liu, R.; Zhang, H.; Song, L. En hvirvelløse specifik miRNA var rettet mod det gamle kolinerge neuroendokrine system af østers. Åbn Biol. 2016, 6, 160059. [CrossRef]

33. Chen, H.; Xin, L.; Sang, X.; Wang, L.; Wang, W.; Liu, Z.; Zhang, H.; Wang, L.; Zhou, Z.; Qiu, L. Et noradrenalin-responsivt miRNA fremmer direkte CgHSP90AA1-ekspression i østershæmocytter under udtørring. Fisk Skaldyr Immunol. 2017, 64, 297-307. [CrossRef] [PubMed]

34. Han, Z.; Li, J.; Wang, W.; Li, J.; Zhao, Q.; Li, M.; Wang, L.; Song, L. Et calmodulin målrettet af miRNA-stillads659_26519 regulerer IL-17-ekspression i det tidlige immunrespons af østers Crassostrea gigas. Dev. Comp. Immunol. 2021, 124, 104180. [CrossRef] [PubMed]

35. Lv, Z.; Li, C.; Zhang, P.; Wang, Z.; Zhang, W.; Jin, C.-H. miR-200 modulerer coelomocytters antibakterielle aktiviteter og LPS-priming via målretning af Tollip i Apostichopus japonicus. Fisk Skaldyr Immunol. 2015, 45, 431-436. [CrossRef]

36. Li, C.; Zhao, M.; Zhang, C.; Zhang, W.; Zhao, X.; Duan, X.; Xu, W. miR210 modulerer respiratorisk udbrud i Apostichopus japonicus coelomocytter via målretning af Toll-lignende receptor. Dev. Comp. Immunol. 2016, 65, 377-381. [CrossRef]

37. Lv, M.; Chen, H.; Shao, Y.; Li, C.; Zhang, W.; Zhao, X.; Jin, C.; Xiong, J. miR-92a regulerer coelomocyters apoptose i havagurk Apostichopus japonicus via målretning af Aj14-3-3ζ in vivo. Fisk Skaldyr Immunol. 2017, 69, 211-217. [CrossRef]

38. Shao, Y.; Li, C.; Xu, W.; Zhang, P.; Zhang, W.; Zhao, X. miR-31 forbinder lipidmetabolisme og celleapoptose i bakterieudfordret Apostichopus japonicus via målretning mod CTRP9. Foran. Immunol. 2017, 8, 263. [CrossRef]

39. Guo, M.; Wang, Y.; Fu, X.; Tao, W.; Li, C. circRNA1149 fra Apostichopus japonicus undertrykker coelomocytapoptose fungerer som miR-92en svamp til at regulere Bax-ekspression som svar på Vibrio splendidus-infektion. Aquaculture 2023, 562, 738812. [CrossRef]

40. Zuo, H.; Weng, K.; Luo, M.; Yang, L.; Weng, S.; Han, J.; Xu, X. A MicroRNA-1-medieret hæmning af NF-KB-vejen af ​​JAK-STAT-vejen i hvirvelløse dyr Litopenaeus vannamei. J. Immunol. 2020, 204, 2918-2930. [CrossRef]

41. Yang, H.; Xu, Z.; Guo, B.; Zhang, X.; Liao, Z.; Qi, P.; Yan, X. Integreret analyse af miRNAome og transkriptom afslører miRNA-mRNA-netværksregulering i Vibrio alginolyticus-inficeret tykskalmusling Mytilus coruscus. Mol. Immunol. 2021, 132, 217-226. [CrossRef] [PubMed]

42. de Morales, JMGR; Puig, L.; Daudén, E.; Cañete, JD; Pablos, JL; Martin, AO; Juanatey, CG; Adán, A.; Montalbán, X.; Borruel, N. Critical role of interleukin (IL)-17 i inflammatoriske og immunforstyrrelser: En opdateret gennemgang af beviserne med fokus på kontroverser. Autoimmun. Rev. 2020, 19, 102429. [CrossRef] [PubMed]

43. Kawaguchi, M.; Adachi, M.; Oda, N.; Kokubu, F.; Huang, S.-K. IL-17 cytokinfamilie. J. Allergy Clin. Immunol. 2004, 114, 1265-1273. [CrossRef] [PubMed]

44. Starnes, T.; Broxmeyer, HE; Robertson, MJ; Hromas, R. Nyskabende: IL-17D, et nyt medlem af IL-17-familien, stimulerer cytokinproduktion og hæmmer hæmopoiese. J. Immunol. 2002, 169, 642-646. [CrossRef] [PubMed]

45. Gaffen, SL; Kramer, JM; Jeffrey, JY; Shen, F. IL-17 cytokinfamilien. Vitam. Horm. 2006, 74, 255-282. [PubMed]

46. ​​Roberts, S.; Gueguen, Y.; de Lorgeril, J.; Goetz, F. Hurtig akkumulering af et interleukin 17 homolog transkript i Crassostrea gigas hæmocytter efter bakteriel eksponering. Dev. Comp. Immunol. 2008, 32, 1099-1104. [CrossRef] [PubMed]

47. Li, J.; Zhang, Y.; Zhang, Y.; Xiang, Z.; Tong, Y.; Qu, F.; Yu, Z. Genomisk karakterisering og ekspressionsanalyse af fem nye IL-17 gener i stillehavsøstersen, Crassostrea gigas. Fisk Skaldyr Immunol. 2014, 40, 455-465. [CrossRef]

48. Gaffen, SL Struktur og signalering i IL-17-receptorfamilien. Nat. Rev. Immunol. 2009, 9, 556-567. [CrossRef]

49. Hata, K.; Andoh, A.; Shimada, M.; Fujino, S.; Bamba, S.; Araki, Y.; Okuno, T.; Fujiyama, Y.; Bamba, T. IL-17 stimulerer inflammatoriske responser via NF-KB- og MAP-kinaseveje i humane colon-myofibroblaster. Er. J. Physiol. - Mave-tarm. Lever Physiol. 2002, 282, G1035-G1044. [CrossRef]

50. Niimoto, T.; Nakasa, T.; Ishikawa, M.; Okuhara, A.; Izumi, B.; Deie, M.; Suzuki, O.; Adachi, N.; Ochi, M. MicroRNA-146a udtrykkes i interleukin-17-producerende T-celler hos patienter med reumatoid arthritis. BMC bevægeapparat. Uorden. 2010, 11, 1-11. [CrossRef]

51. Srivastava, A.; Nikamo, P.; Lohcharoenkal, W.; Li, D.; Meisgen, F.; Landén, NX; Ståhle, M.; Pivarcsi, A.; Sonkoly, E. MicroRNA- 146a undertrykker IL-17-medieret hudbetændelse og er genetisk forbundet med psoriasis. J. Allergy Clin. Immunol. 2017, 139, 550-561. [CrossRef] [PubMed]

52. Zhao, S.; Cheng, Y.; Kim, JG microRNA-146a nedregulerer IL-17 og IL-35 og hæmmer proliferation af humane parodontale ligamentstamceller. J. Cell. Biochem. 2019, 120, 13861-13866. [CrossRef] [PubMed]

53. Podsiad, A.; Standiford, TJ; Ballinger, MN; Eakin, R.; Park, P.; Kunkel, SL; Moore, BB; Bhan, U. MicroRNA-155 regulerer værtens immunrespons på postviral bakteriel lungebetændelse via IL-23/IL-17-vejen. Er. J. Physiol. -Lungecelle. Mol. Physiol. 2016, 310, L465-L475. [CrossRef]

54. Xaus, J.; Comalada, M.; Valledor, AF; Lloberas, J.; López-Soriano, F.; Argilés, JM; Bogdan, C.; Celada, A. LPS inducerer apoptose i makrofager for det meste gennem den autokrine produktion af TNF-. Blood J. Am. Soc. Hæmatol. 2000, 95, 3823-3831.

55. Bannerman, DD; Goldblum, SE Mekanismer for bakteriel lipopolysaccharid-induceret endotel apoptose. Er. J. Physiol.-Lungecelle. Mol. Physiol. 2003, 284, L899-L914. [CrossRef]

56. Messing, DM; Hollingsworth, JW; Cinque, M.; Li, Z.; Potts, E.; Toloza, E.; Foster, WM; Schwartz, DA Kronisk LPS-inhalation forårsager emfysem-lignende ændringer i muselunge, der er forbundet med apoptose. Er. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2008, 39, 584-590. [CrossRef]

57. Dragon, S.; Saffar, AS; Shan, L.; Gounni, AS IL-17 dæmper de anti-apoptotiske virkninger af GM-CSF i humane neutrofiler. Mol. Immunol. 2008, 45, 160-168. [CrossRef] [PubMed]

58. Zhu, F.; Wang, Q.; Guo, C.; Wang, X.; Cao, X.; Shi, Y.; Gao, F.; Ma, C.; Zhang, L. IL -17 inducerer apoptose af vaskulære endotelceller - En potentiel mekanisme for humant akut koronarsyndrom. Clin. Immunol. 2011, 141, 152-160. [CrossRef]

59. Chang, Y.; Al-Alwan, L.; Audusseau, S.; Chouiali, F.; Carlevaro-Fita, J.; Iwakura, Y.; Baglole, CJ; Eidelman, DH; Hamid, Q. Genetisk deletion af IL-17A reducerer cigaretrøg-induceret inflammation og alveolær type II celle apoptose. Er. J. Physiol. -Lungecelle. Mol. Physiol. 2014, 306, L132-L143. [CrossRef]

60. Hou, W.; Jin, Y.-H.; Kang, HS; Kim, BS Interleukin-6 (IL-6) og IL-17 fremmer synergistisk viral persistens ved at hæmme cellulær apoptose og cytotoksisk T-cellefunktion. J. Virol. 2014, 88, 8479-8489. [CrossRef]

61. Wang, Q.; Li, D.; Han, Y.; Ding, X.; Xu, T.; Tang, B. MicroRNA-146 beskytter A549- og H1975-celler mod LPS-induceret apoptose og inflammationsskade. J. Biosci. 2017, 42, 637-645. [CrossRef] [PubMed]

62. Chen, Y.; Wu, Z.; Yuan, B.; Dong, Y.; Zhang, L.; Zeng, Z. MicroRNA-146a-5p dæmper bestrålingsinduceret og LPS-induceret hepatisk stellatcelleaktivering og hepatocytapoptose gennem inhibering af TLR4-vejen. Celledød Dis. 2018, 9, 1-16. [CrossRef] [PubMed]

63. Ding, Y.; Wang, L.; Zhao, Q.; Wu, Z.; Kong, L. MicroRNA-93 hæmmer chondrocytapoptose og inflammation ved slidgigt ved at målrette TLR4/NF-KB-signalvejen. Int. J. Mol. Med. 2019, 43, 779-790. [CrossRef]

64. Wan, G.; Nogen.; Tao, J.; Wang, Y.; Zhou, Q.; Yang, R.; Liang, Q. MicroRNA-129-5p lindrer rygmarvsskade hos mus ved at undertrykke apoptosen og inflammatorisk respons gennem HMGB1/TLR4/NF-KB-vejen. Biosci. Rep. 2020, 40, BSR20193315. [CrossRef] [PubMed]

65. Ke, X.-F.; Fang, J.; Wu, X.-N.; Yu, C.-H. MicroRNA-203 accelererer apoptose i LPS-stimulerede alveolære epitelceller ved at målrette mod PIK3CA. Biochem. Biofys. Res. Commun. 2014, 450, 1297-1303. [CrossRef] [PubMed]

66. Qi, P.; Tang, Z. Nrf2-molekylet udløser antioxidantforsvar mod akut benzo(a)pyreneksponering i den tykke musling Mytilus coruscus. Aquat Toxicol 2020, 226, 105554. [CrossRef]

67. Schmittgen, TD; Livak, KJ Analyse af PCR-data i realtid ved den sammenlignende CT-metode. Nat. Protoc. 2008, 3, 1101-1108. [CrossRef]