Udforskning af mekanismen for Cistanche-formel, der regulerer NLRP3-inflammator-medieret pyroptose i behandlingen af kronisk prostatitis
Jun 05, 2025
Objektiv:
Denne undersøgelse havde til formål at undersøgemekanisme, hvorved en Cistanche-baseret urteformelregulerer aktiveringen afNLRP3 inflammasomog hæmmerpyroptosei behandlingen afType III kronisk prostatitis (CP/CPPS).
Metoder:
(1) Dyreforsøg:
Halvtreds SD-hanrotter blev tilfældigt fordelt i fem grupper: kontrol-, model- og Cistanche-formelbehandlede grupper kl.lav (4,9 g/kg), medium (9,8 g/kg) og høj (19,6 g/kg)doser med 10 rotter i hver gruppe. Bortset fra kontrolgruppen blev alle rotter induceret medType III prostatitisvia intraprostatisk injektion af prostataproteinekstrakt kombineret med CFA. Efter vellykket modellering modtog rotter daglig intragastrisk administration af enten normalt saltvand (kontrol- og modelgrupper) ellerCistanche-baseret formeli 30 dage.
Prostatavævsbetændelse blev vurderet afHæmatoxylin-Eosin (HE) farvning. SerumIL-1ogIL-18blev målt vedELISAmens oxidative stressmarkører (MDA, SOD, ogGSH-Px) blev evalueret biokemisk.NLRP3 udtryki prostatavæv blev påvist afimmunhistokemi, ogNLRP3, Caspase-1 og GSDMD proteinniveauerblev analyseret vhaWestern blot.
(2) Celleeksperiment:
Humane prostataepitelceller (RWPE-1)blev opdelt i kontrol, model,Cistanche formel, ogNLRP3-hæmmer (MCC950)grupper. Bortset fra kontrolgruppen blev alle celler stimuleret medLPS (100 ng/ml, 4 timer)ogATP (5 mmol/ml, 30 min)at fremkalde pyroptose. Efter modellering modtog kontrol- og modelgrupperne blankt serum, mensCistanche gruppemodtaget6,25 ug/ml lægemiddelholdigt serum. Inhibitorgruppen blev behandlet medMCC950.
PI optagelseogCaspase-1 udtrykblev vurderet viaflowcytometri. LDH frigivelseblev målt biokemisk.Supernatant IL-1 og IL-18 niveauerblev kvantificeret ved ELISA.Western blotblev brugt til at opdageNLRP3, Caspase-1 og GSDMDudtryk.
Resultater:
(1) Dyreforsøg:
Sammenlignet med kontrolgruppen udviste modelgruppen signifikant inflammatorisk celleinfiltration, epiteldegeneration og interstitielt ødem i prostatavæv. DeCistanche-behandlede grupperviste dosisafhængige reduktioner i disse patologiske ændringer.
Serum IL-1 og IL-18 niveauervar signifikant øget i modelgruppen (P<0.01) og faldt betydeligt iCistanche lav-, mellem- og højdosisgrupper (P<0.01).
MDA niveauervar forhøjet i modelgruppen (P<0.01) men væsentligt reduceret ved Cistanche-behandling (P<0.01).
SOD og GSH-Px niveauervar faldet i modelgruppen (P<0.05) og signifikant øget i alle Cistanche-behandlede grupper (P<0.01, P<0.05).
Immunhistokemiviste sig forhøjetNLRP3 udtryki modelgruppen, som blev signifikant reduceret ved Cistanche-behandling.
Western blotresultater afslørede øgede proteinniveauer afNLRP3, Caspase-1 og GSDMDi modelgruppen (P<0.01), som alle blev signifikant hæmmet af Cistanche (P<0.01).
(2) Celleeksperiment:
DePI-optagelseshastighed, Caspase-1 udtryk, ogLDH frigivelsevar signifikant øget i modelgruppen (P<0.01), men væsentligt reduceret i bådeCistancheogMCC950grupper (P<0.01).
IL-1 og IL-18 niveaueri supernatanten var signifikant forhøjet i modelgruppen (P<0.01) og faldt betydeligt iCistancheoginhibitorgrupper (P<0.01).
Western blotviste signifikant øget NLRP3, Caspase-1 og GSDMD proteinekspression i modelgruppen (P<0.01), som blev væsentligt nedreguleret iCistancheoginhibitorgrupper (P<0.01).
Konklusion:
DeCistanche-baseret urteformeludøver terapeutisk effekt påType III kronisk prostatitisvedhæmmer NLRP3-inflammasomaktivering, og derved reducereCaspase-1 aktivering, forebyggelseGSDMD-spaltning og pyroptoseog undertrykkepro-inflammatorisk cytokinfrigivelse. Disse resultater tyder på detCistanchekan være lovendenaturligt naturlægemiddel mod CP/CPPS, tilbyderanti-inflammatorisk, antioxidant, ogpyroptose-hæmmendeeffekter via modulering afNLRP3/Caspase-1/GSDMDsignalvej.
nøgleord: kronisk prostatitis; Guihuang formel;NLRP3 inflammatom; pyroptose; programmeret celledød
cistanche drager fordel af prostatasundhed
Cistanche-baseret urteformel til kronisk prostatitis: Eksperimentel undersøgelse af mekanisme og effektivitet
Kronisk prostatitis (CP)er en af de mest almindelige tilstande i urologi og mænds sundhed. Epidemiologiske undersøgelser viser, at ca8.4%af voksne mænd i Kina oplever symptomer på prostatitis [1]. IfølgeNational Institutes of Health (NIH)klassificering, er prostatitis kategoriseret i fire typer, medType III prostatitis (kronisk bækkensmertesyndrom, CP/CPPS)står for mere end90%af alle kroniske tilfælde [2]. Type III prostatitis fører til bækkensmerter og urindysfunktion og er ofte ledsaget af psykiske lidelser såsom angst og depression, hvilket væsentligt forringer livskvaliteten [3-4].
I Traditionel Kinesisk Medicin (TCM) svarer kronisk prostatitis til syndromer som "Lin Syndrome" eller "Jing Zhuo", og er primært forårsaget af patogene faktorer som f.eks.fugt, varme, blodstase og stagnation[5-7]. DeGuihuang formel, traditionelt brugt til at behandle CP/CPPS med fugtig varme og blodstase, er blevet modificeret i denne undersøgelse til at brugeCistanchesom en kernekomponent, der danner en romanCistanche-baseret urteformel. Denne modificerede formel har til formål at forbedre urinvejssymptomer og bækkenbetændelse med beggeklinisk effekt og sikkerhed [8–10].
Cistanche tubulosa i ørkenen
cistanche formel baseret piller med 75% glycosid
Understøttende service af Wecistanche-The Kontakt os for at få en engrospris
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tlf.:+86 15292862950
Baggrund og mekanisme
Vores tidligere undersøgelser viste, at den Cistanche-baserede urteformel signifikant lindrede prostatitis-lignende læsioner i rottemodeller ved at reducere patologisk inflammation og undertrykke pro-inflammatoriske cytokiner. Denne effekt er forbundet med hæmning afPI3KogNF-KBsignalveje [11].
Yderligere opmærksomhed er blevet rettet modNLRP3 inflammasom, et multiproteinkompleks, der regulerer inflammatoriske reaktioner. Aktivering af NLRP3-inflammasomet fører til frigivelse af inflammatoriske cytokiner såsom IL-1 og IL-18, hvilket bidrager til den inflammatoriske kaskade i CP/CPPS [12-13]. Undersøg omCistanchekan modulere NLRP3-inflammasomaktivering er afgørende for at forstå densanti-inflammatorisk mekanismei behandling af kronisk prostatitis.
1. Materialer
1.1 Dyr og celler
SD-hanrotter (6 uger gamle, 240-260 g) blev hentet fra SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. [SCXK (Jing) 2019-0010], opstaldet i SPF-forhold med fri adgang til mad og vand. Rumtemperaturen blev holdt på (23±2) grader og fugtigheden på (60±5)%. Alle dyreprocedurer blev godkendt af Animal Ethics Committee på Xiyuan Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences (Ethics No: 2020XLC005-3). normale prostata epitelceller (RWPE-1, ATCC, katalognr. IM-H299) blev brugt til in vitro-eksperimenter ved passage 5.
1.2 Urteformel
DeCistanche-baseret formelbestår af følgende traditionelle urter (i gram):
Cistanche 12 g
Curcuma longa (Gurkemeje) 10 g
Angelica sinensis 12 g
Magnolia officinalis 10 g
Boswellia carteri (Røgelse) 5 g
Commiphora myrrha (Myrra) 5 g
Lonicera japonica (kaprifolier) 15 g
Hedyotis diffusa 15 g
Plantago asiatica (Plantain Herb) 15 g
Citrus reticulata (mandarinskræl) 10 g
Urtegranulatet blev leveret af Pharmacy Department of Xiyuan Hospital og fremstillet af Kangrentang Pharmaceutical Co., Ltd. (batchnr.: 19018391).
SEO søgeord:
Cistanche til kronisk prostatitis, naturlægemidler til CPPS, TCM for bækkensmertesyndrom, Cistanche prostata betændelse, naturlige antiinflammatoriske urter til mænd, Cistanche immunmodulation.
1.3 Reagenser og sæt
BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Kat # P0010)
IL-1 og IL-18 ELISA-sæt (Bioswamp, Cat# ZN2877, ZN2883)
Pyroptosis/Caspase-1 Assay Kit (Immunokemi, Kat # 9145)
NLRP3-antistof (Novus, kat.nr. NBP2-12446)
CFA (komplet Freunds adjuvans, Sigma, Kat # C104202)
Almindelige reagenser: Xylen, absolut ethanol, neutral gummi (Sinopharm)
Oxidativ stress-sæt: SOD, MDA, GSH-Px, LDH (Nanjing Jiancheng, Cat# A001-3, A003-2, BC1190, 20121225)
Antistoffer: Anti-GSDMD, Caspase-1, GAPDH (Abcam, Cat# ab219800, ab179515, ab8245)
MCC950 (NLRP3-hæmmer, Selleck, Cat# S8930)
PYCARD/ASC-antistof (Thermo, kat.nr. PA5-95826)
1.4 Instrumenter
Optisk mikroskop (Nikon Eclipse Ti-SR, Japan)
Mikrotom (Leica RM2016, Shanghai)
Digital diasscanner (3D HISTECH Pannoramic MIDI, Ungarn)
Højhastigheds kølecentrifuge (Thermo Fisher IECCL31R, USA)
Elektroforeseudstyr (CAVOY PP-1150, MP-8001, MP-3030, Beijing)
Shaker inkubator (Qilinbeier TS-2000A, Jiangsu)
Kryogen kværn (Jingxin JXFSTPRP-CL-BSC, Shanghai)
CO₂-inkubator (Sanyo MCO-20AIC, Japan)
Mikropladelæser (Bio-Rad DNM-9602, Beijing)
Biokemisk analysator (Rayto Chemray 800, Shenzhen)
Flowcytometer (Beckman CytoFLEX S, USA)
2. Metoder
2.1 Modeletablering
(1) Dyremodel
Baseret på tidligere modelleringserfaring, en rottemodel af autoimmunType III kronisk prostatitisblev etableret afintraprostatisk injektionaf oprenset prostataproteinekstrakt blandet med Complete Freund's Adjuvans (CFA) [14]. Succesfuld modellering blev bestemt af patologiske træk, herunder: fortykkelse af prostatakapslen, forsvinden af kirtelfolder, ødelæggelse af acini, signifikant stromalt ødem, sløret struktur, massiv infiltration af lymfocytter, monocytter og plasmaceller. Glatte muskelceller og bindevævshyperplasi blev observeret i prostatasepta, med mærkbarvaskulær udvidelse og overbelastning. Biokemisk blev modellen bekræftet aføgede leukocytterognedsatte lecithinlegemeri prostata homogenat.
(2) Cellemodel
Efter litteraturrapporter og tidligere præeksperimenter [15-17], ato-trins stimuleringsmetodeblev brugt til at aktivereNLRP3 inflammasomi RWPE-1 celler. Trin 1: Celler blev behandlet medLPS (100 ng/ml)i 4 timer for at starte inflammasom-priming. Trin 2: Celler blev derefter behandlet medATP (5 mmol/ml)i 30 minutter som aktiveringssignal. De optimale modelforhold blev screenet vhaPI-optagelseshastighedsom markør.
2.2 Gruppering
(1) Dyreundersøgelsesgrupper
Rotter blev tilfældigt opdelt ifem grupperved hjælp af en tabel med tilfældige tal:
Kontrolgruppe
Modelgruppe
Cistanche formel lavdosis gruppe
Cistanche formel medium-dosis gruppe
Cistanche formel højdosis gruppe
Hver gruppe bestod af 10 rotter. Alle grupper undtagen kontrolgruppen blev udsat for modellering. Detilsvarende human dosisaf den Cistanche-baserede formel blev beregnet som 109 ÷ 70 × 6.3=9.8 g/kg formedium dosis, medlav dosisved 4,9 g/kg oghøj dosisved 19,6 g/kg [11]. Fradag 3 efter modellering, modtog behandlingsgrupperne daglig intragastrisk administration af de respektive doser afCistanche-baseret urteformelfor30 dage i træk, mens kontrol- og modelgrupper modtog lige store mængder saltvand.
(2) Celleundersøgelsesgrupper
RWPE-1 celler blev opdelt i fire grupper:
Kontrolgruppe: dyrket med blankt serum
Modelgruppe: behandlet med LPS (100 ng/ml, 4 timer) og ATP (5 mmol/ml, 30 min)
Cistanche gruppe: behandlet med6,25 ug/ml Cistanche formel medicineret serum
MCC950 gruppe: model +NLRP3 inflammasomhæmmer MCC950
2.3 Prøveindsamling
Efter 30 dages behandling blev rotter bedøvet med isofluran. Blod blev opsamlet fra abdominal aorta og centrifugeret ved 3000 rpm i 10 minutter for at isolere serum, som blev opbevaret ved -80 grader iELISAog biokemiske analyser.
Venstre prostatalap: fikseret i 4 % paraformaldehyd til histopatologi, immunhistokemi og immunfluorescens.
Højre prostatalap: bevaret iflydende nitrogenforWestern blot analyse.
2.4 Dyreindeksdetektion
2.4.1 HE-farvning
Hæmatoxylin og Eosin (HE) farvning blev brugt til at observere inflammatorisk infiltration i prostatavæv. Morfologiske ændringer i kirtler, kanaler og interstitielle strukturer blev evalueret under et lysmikroskop.
2.4.2 ELISA for IL-1 og IL-18
ELISA-kits blev brugt til at kvantificereIL-1ogIL-18niveauer i rotteserum. Prøver blev behandlet efter standard ELISA-protokol og analyseret kl450 nmved hjælp af en mikropladelæser.
2.4.3 Biokemisk påvisning af MDA, SOD, GSH-Px
Serum niveauer afMDA, SOD, ogGSH-Pxblev målt ved hjælp af kommercielle kits til at vurdere oxidativ stress i prostatavæv.
2.4.4 Immunhistokemi (IHC) for NLRP3
Prostatavævssnit gennemgik afparaffinering, antigenudvinding, blokering og inkubation medanti-NLRP3 antistof (1:1000). DAB-farvning blev udført og modfarvet med hæmatoxylin. NLRP3-ekspression blev observeret mikroskopisk.
2.4.5 Immunfluorescens for GSDMD
Frosne prostatasnit blev inkuberet medanti-GSDMD antistof (1:100), efterfulgt af fluorescerende sekundært antistof og DAPI nuklear modfarvning. GSDMD-ekspression blev visualiseret ved hjælp af fluorescensmikroskopi.
2.4.6 Western Blot til NLRP3, Caspase-1, GSDMD
Protein blev ekstraheret fra prostatavæv forWestern blot analyse. Udtryksniveauer afNLRP3 (1:1000), GSDMD (1:2000), ogCaspase-1 (1:2000)blev detekteret. -aktin tjente som intern kontrol. Kvantificering blev udført vhaImageJsoftware.
2.5 Cellulær indeksdetektion
2.5.1 Flowcytometri for PI-optagelse
Celler blev vasket, resuspenderet ved 1 x 106 celler/ml og farvet med propidiumiodid (PI). PI-optagelseshastigheder blev analyseret vhaflowcytometriogFlowJosoftware.
2.5.2 LDH-frigivelsesassay
Efter behandling,LDHniveauer i kultursupernatanter blev vurderet som en markør for cellemembranskade ved anvendelse af et kolorimetrisk assay kl.490 nm.
2.5.3 Flowcytometri for Caspase-1
Celler blev fikseret, permeabiliseret og farvet medCaspase-1 antistof (1:1000). Udtrykket blev målt vedflowcytometri.
2.5.4 ELISA for IL-1 og IL-18 i supernatant
Kulturmedier blev indsamlet for at detektereIL-1ogIL-18niveauer via ELISA. Proteinindhold i cellelysater blev kvantificeret under anvendelse af BCA-assayet for at normalisere cytokinniveauer.
2.5.5 Western Blot til NLRP3, Caspase-1, GSDMD
Western blot blev udført på cellelysater med antistoffer imodNLRP3 (1:1000), GSDMD (1:2000), ogCaspase-1 (1:2000). Detektion blev udført ved hjælp af ECL, og billeddannelsessystemer. -aktin blev brugt som belastningskontrol.
2.6 Statistisk analyse
Data blev analyseret vhaGraphPad Prism 8.0. Resultater er udtrykt sommiddel ± SD. Gruppesammenligninger blev foretaget vhauafhængige prøve t-testsellerEnvejs ANOVA. A P-værdi < 0,05blev betragtet som statistisk signifikant.
