Eksperiment 3 Virkning af Cistanche Deserticola Phenylethanol Glycosid på rotter Perimenopausal model Ⅲ

Eksperiment 3 Virkning af Cistanche deserticola phenylethanolglycosid på perimenopausal rottemodel

1 Eksperimentelle materialer

1.1 Forsøgsdyr

Wistar-rotter, SPF-kvalitet, hun, leveret af Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd., rottecertifikatnummer for denne batch: 0017216; laboratoriecertifikat nummer SYXK (Yu) 2010-001.

1.2 Eksperimentelle lægemidler

Cistanche deserticola phenylethanolglycosidblev fremstillet ifølge metoden fra forsøg 1, og indholdet nåede 66,47%. Gengnian'an Capsule, ingredienser: Rehmannia glutinosa, Rehmannia glutinosa, Alisma, Ophiopogon japonicus, Scrophulariaceae, pæonbark, Poria cocos, perlemor, curculigo, Schisandra chinensis, magnetit, Polygonum multiflorum vinstokke, polygonum multiflorum, floating Unflorum-vinstok . Funktioner og indikationer:Giv yin næring og dæmp yang, lindre problemerog berolige sindet. Bruges til overgangsalderens hedeture og svedtendens, svimmelhed, tinnitus, irritabilitet og søvnløshed. Specifikationer: 0,3g pr. kapsel. Anvendelse og dosering: Oral, 3 kapsler ad gangen, 3 gange dagligt. Producent: Shanxi Tianxing Pharmaceutical Co., Ltd. Produktionsbatchnummer: 121104. Godkendelsesnummer: National Drug Approval No. Z14021848.

Sojaisoflavoner og bløde E-vitaminkapsler, ingrediensliste: Sojaisoflavonpulver, E-vitamin, solsikkeolie, gelatine, glycerin, vand, tartrazin, titaniumdioxid. Ikoniske ingredienser og indhold: Hver 100 g indeholder 55,2 mg sojaisoflavoner (beregnet som genistein) og 608,5 mg E-vitamin. Sundhedsfunktioner: Øger knogletætheden. Instruktioner og dosering: Tag 1 kapsel 2 gange dagligt med varmt vand. Specifikationer: 500mg×100 kapsler. Producent: Weihai Ziguang Biotechnology Development Co., Ltd. Produktionsbatchnummer: 13070302. Godkendelsesnummer: National Food Health G20080032.

HVOR LANG TAGE DET FOR CISTANCHE AT ARBEJDE?

1.3 Eksperimentelle reagenser

Carboxymethylcellulosenatrium, Tianjin Hengxing Chemical Reagent Manufacturing Co., Ltd., batchnummer: 20120418; penicillinnatrium til injektion, North China Pharmaceutical Co., Ltd., specifikation: 4 millioner enheder, produktionsbatchnummer: c1206807;

Formaldehydopløsning (analytisk ren), Yantai Shuangshuang Chemical Co., Ltd., produktionsbatchnummer: 20130902; 0,9% natriumchloridinjektion, Henan Shuanghe Huali Pharmaceutical Co., Ltd.; specifikation: 250ml, produktionsbatchnummer: 13082405B;

Klorhydrat, Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute, batchnummer 20120827; Rotte E2 ELISA detektionskit, R&D Company, batchnummer: 20140101A; Rat T ELISA detektionskit, R&D Company, batchnummer: 20140101A; Rotte LH ELISA-detektionskit, R&D Company, batchnummer: 20140101A; Rotte FSH ELISA detektionskit, R&D Company, batchnummer: 20140101A;

2 Eksperimentelle metoder

2.1 Modellering og lægemiddeladministration

Modelleringsmetode: Tag 100 wistar-hunrotter med en kropsvægt på 210~230g, udvælg tilfældigt 12 rotter som en tom gruppe og gennemgå en falsk operation, og de resterende rotter vil blive brugt til at skabe overgangsalderen modeller. Efter at rotterne var vejet, blev rotterne bedøvet ved intraperitoneal injektion af 10% chloralhydrat (0,3 ml/100 g), og den abdominale position blev fikseret. Derefter blev rotterne trimmet fra under det sidste ribben på ryggen ved skæringspunktet mellem den midterste aksillære linje og ca. 2 cm fra den laterale side af rygsøjlen og derefter desinficeret. Hud- og rygmusklerne er indskåret omkring 1 cm, og der ses en mælkehvid skinnende fedtmasse i synsfeltet til snittet, og æggestokken er indlejret i den. Brug en lille pincet til forsigtigt at tage fat i fedtmassen og trække den ud af snittet, adskille fedtmassen, og du vil se en gruppe tynde, uregelmæssige, gul-røde æggestokke. Når du skærer, skal du først ligere æggelederen (inklusive fedt) under æggestokken med en tynd tråd, fjerne venstre æggestok fuldstændigt og fjerne 80 % af højre æggestok. Efter operationen blev livmoderhornene sat tilbage i bughulen, muskler og hud blev syet, og begge æggestokke blev fjernet på samme måde. Efter operationen blev dyrene omhyggeligt rejst op og intramuskulært injiceret med 200,000 u/kg penicillin (0,1 ml hver) for at forhindre infektion, én gang dagligt i 3 på hinanden følgende dage. 5 dage efter operationen påbegyndtes vaginal udstrygning af rotter én efter én én gang dagligt i 5 på hinanden følgende dage. Rotter med østrosreaktioner i udstrygningen blev kasseret. 72 fuldstændigt kastrerede rotter blev udvalgt og tilfældigt opdelt i 6 grupper. Til eksperimentelle formål er de modelgruppen, Gengnianan-gruppen, sojaisoflavongruppen og Cistanche deserticola-phenylethanolglycosidgruppen med stor, mellem og lille dosis.

Fremstillingsmetode: Fremstillingsmetode: {{0}},5 % CMC Fremstillingsmetode: Vej 4 g carboxymethylcellulosenatrium og bland det med destilleret vand til 800ml. Doserne af store, mellemstore og små doser af Cistanche deserticola phenylethanolglycosidgruppe var henholdsvis 133,33 mg/kg, 66,67 mg/kg og 33,33 mg/kg (administrationsvolumen 1 ml/100 g). Fremstillingsmetode: Vej henholdsvis 1333,3 mg, 666,7 mg og 333,3 mg total hindbærflavonoider, opløs dem med en lille mængde 0,5% CMC, juster derefter volumen til 100 ml, bland godt, og det er det. Gengniangan-kapsler (450 mg/kg, blandet med destilleret vand til 45 mg/ml, 1 ml/100 g, svarende til 10 gange den kliniske dosis); Fremstillingsmetode: Tag 15 Gengniangan-kapsler, opløs dem først med en lille mængde 0,5% CMC, juster derefter volumen til 100 ml og bland godt, hvilket er dosen af ​​Gengnianan-kapselsuspension (450 mg/kg). Sojabønne Isoflavon Vitamin E bløde kapsler (166,67mg/kg, brug destilleret vand til at lave 16,67mg/ml, 1ml/100g, svarende til 10 gange den kliniske dosis); Fremstillingsmetode: Tag 4 Sojabønneisoflavoner Vitamin E bløde kapsler, opløs først med en lille mængde 0,5% CMC, juster derefter volumen til 120 ml, og bland godt for at opnå dosen af ​​sojaisoflavon vitamin E blød kapselsuspension (16,67 mg/kg) ).

Administrationsmetode: Dyr i hver gruppe fik tilsvarende lægemidler på den 10 dag efter operationen. Blindgruppen og modelgruppen blev indgivet med sonde med det samme volumen 0,5 % CMC-opløsning (sondevolumenet var 1 ml/100 g), og Gengnianan-gruppen blev givet med Gengnianan kapselsuspension (450 mg/kg, svarende til 10 gange den kliniske dosis) ). ), blev sojabønneisoflavongruppen oralt administreret sojabønneisoflavonvitamin E blød kapselsuspension (166,67 mg/kg, svarende til 10 gange den kliniske dosis), og den store, mellemstore og lille dosisCistanche deserticola phenylethanolglycosidgrupper blev administreret oralt i henhold til gruppen. Store, mellemstore og små doser af Cistanche deserticola phenylethanolglycosid (doseringerne er henholdsvis 133,33 mg/kg, 66,67 mg/kg og 33,33 mg/kg, dosisvolumen er 1 ml/100 g), administreret én gang dagligt ved kontinuerlig intragastrisk administration . medicin i 30 dage.

2.2 Observationspunkter og detektionsmetoder

De horisontale-lodrette bevægelsesscorer for rotter i hver gruppe blev målt 29 dage efter administration. 2 timer efter den sidste gastriske administration (fastende i 15 timer), fjern øjeæblerne for at opsamle blod, adskille serum ogPlasmaog måle indholdet af E2, T, LH, FSH, GnRH og BGP i serumet og indholdet af -EP i plasmaet; rotterne blev dissekeret. Fjern thymus, milt, livmoder og de resterende 20 % af ovarievævet, vej deres våde vægte og beregn organindekset for thymus, milt og livmoder (organindeks=organvådvægt mg/rottevægt g) , og fjern derefter hjernen. Til hypothalamus og hypofyse blev der fremstillet vævshomogenater fra hypothalamus, hypofyse og 1/2 af livmoderen, og indholdet af østrogenreceptorer i hypothalamus, hypofyse og livmodervæv homogeniserede og androgenet. receptorindholdet i de hypothalamusvævshomogenater blev bestemt. Thymus, milt, livmoder og æggestok blev fikseret i 10% formaldehydopløsning, indlejret i paraffin, sektioneret og farvet med HE. Dethistomorfologiske ændringeri hver gruppe blev observeret under et lysmikroskop.

2.2.1 Open field metodetest

Det eksperimentelle apparat er en kubisk åben kasse med en højde på 40 cm og en længde og bredde på 80 cm. De omkringliggende vægge og bund er sorte. Bunden er sammensat af 25 blokke med lige areal, divideret med hvide linjer. Under forsøget blev rotten placeret i firkanten i midten af ​​den åbne boks, og den horisontale aktivitetsscore for antallet af blokke, som rotten krydsede på bunden inden for 5 minutter (firkanter med alle fire poter indtastet kan tælles). og antallet af gange, bagbenene stod oprejst (to forpoter var i luften). (eller klamrer sig til en væg) lodret aktivitetsscore. Afføringen skal fjernes fuldstændigt efter hvert forsøg, og hver rotte måles en gang 2 timer efter administration. Dette eksperiment blev udført i et stille rum.

2.2.2 Kitbestemmelsesmetode

Få serumprøver: Brug reagensglas, der er fri for pyrogener og endotoksiner. Undgå cellestimulering under operationen. Efter opsamling af blodet, centrifuger det ved 3000 rpm i 10 minutter for hurtigt og forsigtigt at adskille serum og røde blodlegemer. Få plasmaprøver: antikoaguleret med heparin-antikoagulerende rør. Centrifuger ved 3000 rpm i 30 minutter og tag supernatanten. Få vævshomogenatprøver: Tilsæt en passende mængde fysiologisk saltvand til vævet og mos det. Centrifuger ved 3000 rpm i 10 minutter og tag supernatanten.

Bestemmelsesmetoden for rotte (rotte) østradiol (E2) ELISA kit er den samme som i eksperiment 2. Koncentrationerne af standarder (S0-S5) er 0, 4, 8, 16, 32 og 64 pmol/L.

Analysemetoden for rotte (rotte) Testosteron (T) ELISA Kit er den samme som analysemetoden for Estradiol ELISA Kit. Koncentrationerne af standarder (S{{0}}S5) er {{10}}, 2{{20}}, 40, 80, 160 og 320 pg /ml. Bestemmelsesmetoden for rotte (rotte) luteiniserende hormon (LH) ELISA-detektionskit er den samme som bestemmelsesmetoden for østradiol ELISA-detektionskittet. Koncentrationerne af standarder (S0-S5) er 0, 3, 6, 12, 24 og 48 ml/ml. Analysemetoden for rotte (rotte) follikelstimulerende hormon (FSH) ELISA kit er den samme som assaymetoden for estradiol ELISA kit. Koncentrationerne af standarder (S0-S5) er 0, 0,75, 1,5, 3, 6 og 12 IE/L. Bestemmelsesmetoden for rotte (rotte) gonadotropin-frigivende hormon (GnRH) ELISA-detektionskit er den samme som bestemmelsesmetoden for østradiol ELISA-detektionskittet. Koncentrationerne af standarder (S0-S5) er 0, 5, 10, 20, 40 og 80 mlU/ml.

Bestemmelsesmetoden for rotte (rotte) osteocalcin (BGP/OCN) ELISA-detektionskit er den samme som bestemmelsesmetoden for estradiol ELISA-detektionskittet. Koncentrationerne af standarder (S{{0}}S5) er 0, 0.75, 1.5, 3, 6 og 12 ng/ml. Bestemmelsesmetoden for rotte (rotte) -endorfin (-EP) ELISA-detektionskittet er den samme som bestemmelsesmetoden for østradiol ELISA-detektionskittet. Koncentrationerne af standarder (S0-S5) er 0, 3, 6, 12, 24 og 48 pg/mL. Bestemmelsesmetoden for rotte (rotte) østrogenreceptor (ER) ELISA-detektionskit er den samme som bestemmelsesmetoden for østradiol ELISA-detektionskittet. Koncentrationerne af standarder (S{{20}}S5) er 0, 4, 8, 16, 32 og 64 pg/mL. Bestemmelsesmetoden for rotte (rotte) androgenreceptor (AR) ELISA-detektionskit er den samme som bestemmelsesmetoden for østradiol ELISA-detektionskittet. Koncentrationerne af standarder (S0-S5) er 0, 25, 50, 100, 200 og 400 pg/ml.

2.3 Statistiske behandlingsmetoder

Til dataanalyse blev SPSS17.0 medicinsk statistisk pakke brugt til statistisk behandling af data. Måledata blev udtrykt som middel ± standardafvigelse (-x±s). En-vejs variansanalyse blev brugt til sammenligning mellem grupper. LSD-metoden blev brugt til at teste for homogenitet af varianser. , Games-Howell-testen blev brugt til ujævne varianser, og Ridit-testen blev brugt til karakterdata.

Det kan ses fra tabel 11 og figur 14, at sammenlignet med den tomme gruppe var thymusindekset, miltindekset og uterusindekset for rotterne i modelgruppen signifikant reduceret (P<0.01), indicating that the perimenopausal rat model was caused by incomplete removal of the ovaries. Atrophy of the thymus, spleen, and uterus occurs. Compared with the model group, each medication group can significantly improve the thymus and spleen index of perimenopausal model rats (P<0.01), and the Gengnianan, soy isoflavones, large and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside groups can significantly improve The uterine index of perimenopausal model rats was increased (P<0.01), and the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group significantly increased the uterine index of perimenopausal model rats (P<0.05).

3 Effekter på blodets biokemiske indeksniveauer i perimenopausale modelrotter

Serum-E2-, T-, LH-, FSH-, GnRH- og BGP-indholdet og plasma-EP-indholdet i rotter i hver gruppe er vist i tabel 12~13 og figur 15~17.

Det kan ses fra tabel 12~13 og figur 15~18, at sammenlignet med den blanke gruppe var serum E2 og T niveauerne af rotter i modelgruppen signifikant faldet (P<0.01), and the LH and FSH levels were significantly increased (P<0.01 ), indicating that incomplete ovarian removal causes sex hormone disorders in the perimenopausal rat model, and the perimenopausal rat model was successfully replicated. Compared with the model group, each medication group could significantly increase serum E2 and T levels (P<0.01) and reduce FSH levels; the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside, soybean isoflavones, and menganianan groups could significantly reduce the elevated levels. The LH level in the high-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group can be significantly reduced (P<0.05); the elevated LH level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group has a decreasing trend.

Tabel 14 Virkning af Cistanche deserticola phenylethanolglycosid på serum-GnRH- og plasma-EP-niveauer i perimenopausal rottemodel (-x±s)

Det kan ses fra tabel 14 og figurer 19-20, at sammenlignet med den tomme gruppe var serum-GnRH-niveauet for rotter i modelgruppen signifikant forøget, og plasma-EP-niveauet var signifikant reduceret (P<0.01), indicating that incomplete removal of the ovaries caused The perimenopausal rat model has sex hormone disorders, and related hormones secreted by the hypothalamus are also disordered due to negative feedback regulation. Compared with the model group, the GnRH levels in each medication group were significantly reduced (P<0.01), and the β-EP levels in the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group, soybean isoflavones group, and menanianan group were significantly increased (P<0.01). 0.01), the plasma β-EP level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group could be significantly increased (P<0.05).

4 Effekter på ER- og AR-indhold i væv fra perimenopausale modelrotter

Indholdet af ER og AR i relevante væv fra rotter i hver gruppe er vist i tabel 16~17 og figur 22~23.

Det kan ses af tabel 17 og figur 23, at sammenlignet med den tomme gruppe var AR-niveauet i hypothalamus i modelgruppen signifikant lavere (P<0.01), indicating that the androgen receptors distributed in the hypothalamus of the perimenopausal rat model caused by incomplete ovary removal body, thereby reducing the biological effects of androgens. Compared with the model group, the AR levels in the hypothalamus of the large- and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, Gengnianan group, and soybean isoflavone group were significantly increased (P<0.01). The hypothalamic AR level of the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group was rising trend.

5 Effekter på organvævsmorfologi hos perimenopausale modelrotter

De patologiske og histologiske observationsresultater af uterus, thymus og milt hos rotter i hver forsøgsgruppe er som følger. De patologiske fotos er vist i bilag 1 for de patologiske fotos af perimenopausale modelrotter.

5.1 Effekt på livmodervævsmorfologi hos perimenopausale modelrotter

I henhold til de varierende grader af ændringer i endometrium, kirtler og myometrium hos rotterne i hver forsøgsgruppe, blev semikvantitative standarder brugt til at opdele den patologiske vævsmorfologi i fire niveauer, og rotternes livmoder i hver forsøgsgruppe blev målt. Observationsresultaterne er vist i tabel 18.

"-" Endometrieepitelceller, kirtler, myometrium og serosa er alle normale; "+" endometrieepitelcellerne og kirtlerne atrofieres, og myometrium og serosa er normale; "++" endometrieepitel Celler og kirtler er delvist atrofieret, muskellaget er let atrofieret, og serosa er normal; "+++" endometriale epitelceller og kirtler er signifikant atrofieret, og serosa er normal.

Efter Ridit-test kan det ses fra tabel 18, at sammenlignet med den blanke gruppe viste uterus hos rotter i modelgruppen signifikante patologiske vævslæsioner (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the uterine pathological tissue lesions of mice (P<0.01).

5.2 Effekt på ovarievævsmorfologi hos perimenopausale modelrotter

Ifølge de forskellige grader af ændringer i follikler, corpus luteum, granulosaceller og blodkar i æggestokkene hos rotter i hver gruppe af eksperimenter, blev semikvantitative standarder brugt til at opdele den patologiske vævsmorfologi i fire niveauer. Ovarierne på rotter i hver gruppe af eksperimenter blev målt og observeret. Resultaterne er vist i tabel 19.

Tabel 19 Virkning af Cistanche deserticola phenylethanolglycosid på ovariepatologiske ændringer hos perimenopausale modelrotter Enhed: Kun

"-" kan vise voksende follikler, modne follikler og corpus luteum på alle niveauer. Corpus luteum er veludviklet med mange lag granulosaceller, rig follikulær væske og rige blodkar; "+" kan vise voksende follikler, modne follikler og corpus luteum, men antallet af modne follikler og corpus luteum er lille. , folliklerne er mindre, og granulosacellerne er mindre lagdelte; "++" kan vise modne follikler og corpus luteum med flere corpus luteum, færre granulosaceller og færre blodkar; "+++" har ingen follikler, mere corpus luteum og æggestokken atrofisk, avaskulær.

Efter Ridit-test kan det ses af tabel 19, at sammenlignet med den tomme gruppe viste æggestokkene på modelgrupperotterne signifikante patologiske vævslæsioner (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the ovarian pathological tissue lesions of rats (P<0.01).

5.3 Virkninger på thymus og miltvævsmorfologi hos perimenopausale modelrotter

Brug et mikrometer til at måle tykkelsen af ​​de tykkeste og smalleste dele af thymuscortex af hver rotte i hver forsøgsgruppe for at opnå gennemsnittet; Brug mikrometerets basislinje til at falde på miltknuderne, mål tykkelsen af ​​miltknuderne på begge sider med den centrale arterie som centrum, og beregn gennemsnittet. De målte resultater er vist i tabel 20 og figur 24.

Det kan ses af tabel 20 og figur 24, at sammenlignet med den blanke gruppe, var tykkelsen af ​​thymus cortex og volumen af ​​miltknuder i modelgruppen signifikant reduceret (P<0.01), indicating that the thymus and spleen volumes atrophied after the perimenopausal model was created in rats. Compared with the model group, each medication group could significantly increase the thickness of the thymus cortex (P<0.01). Except for the low-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, all medication groups could significantly increase the volume of splenic nodules (P<0.01).