Evaluering af slimhindeimmunitetseffekten af ​​bovin viral diarrévirus underenhedsvaccine E2Fc og E2Ft

Abstrakt:

Klassificeret som en klasse B infektionssygdom af Verdensorganisationen for Dyresundhed (OIE), bovin viral diarré/slimhindesygdom er en akut, meget smitsom sygdom forårsaget af bovin viral diarrévirus (BVDV). Sporadiske endemier af BVDV fører ofte til enorme økonomiske tab for mejeri- og oksekødsindustrien. For at kaste lys over forebyggelsen og kontrollen af ​​BVDV udviklede vi to nye underenhedsvacciner ved at udtrykke bovint viral diarrévirus E2-fusionsrekombinante proteiner (E2Fc og E2Ft) gennem suspenderede HEK293-celler. Vi evaluerede også vaccinernes immuneffekter. Resultaterne viste, at begge underenhedsvacciner inducerede en intens slimhindeimmunrespons hos kalve. Mekanistisk bundet E2Fc til Fc-receptoren (Fc RI) på antigen-præsenterende celler (APC'er) og fremmede IgA-sekretion, hvilket førte til en stærkere T-celle-immunrespons (Th1-type). Den neutraliserende antistoftiter stimuleret af den slimhindeimmuniserede E2Fc-underenhedsvaccine nåede 1:64, hvilket var højere end den for E2Ft-underenhedsvaccinen og den for den intramuskulære inaktiverede vaccine. De to nye underenhedsvacciner til slimhindeimmunitet udviklet i denne undersøgelse, E2Fc og E2Ft, kan yderligere bruges som nye strategier til at kontrollere BVDV ved at øge cellulær og humoral immunitet.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Nøgleord: BVDV; underenhedsvaccine; slimhindevaccination; molekylære adjuvanser; Fc-receptor; ferritin

1. Introduktion

Bovint viral diarrévirus (BVDV) tilhører sammen med grænsesygdomsvirus (BDV) og svinepestvirus (CSFV) Pestivirus-slægten af ​​Flaviviridae-familien [1]. En kombination af vedvarende infektion (PI) og cytopatisk infektion hos kalve resulterer ofte i alvorlig slimhindesygdom med dødelighed op til 100 % [2]. BVDV distribuerer bredt i verden med en relativt høj antistof-positiv rate. I Kina er de fremherskende typer 1B, 1M og 1Q af typen -1 BVDV [3-5]. Fylogenetisk analyse afslørede, at bovin viral diarrévirus type 1 blev importeret til Kina i 1960'erne, og at mindst otte BVDV-1-genotyper er i omløb i Kina. Blandt dem er 1B og 1m de vigtigste genotyper [6]. Dette er i overensstemmelse med vores epidemiologiske undersøgelse af BVDV i Tibet. Den sfæriske virion af BVDV er cirka 40-60 nm i diameter og er omsluttet af en kapsel. Det enkelt plusstrengede virale RNA-genom af BVDV er ca. 12,5 KB i længden. Det virale polyprotein spaltes efterfølgende af en kombination af værts- og virale proteaser til fire strukturelle (C, E0, E1, E2) og otte ikke-strukturelle (Npro, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) proteiner [7, 8]. BVDV-E2 besidder stærk immunogenicitet, og beviser har vist, at neutraliserende antistoffer (NAb'er) induceret i inficerede dyr hovedsageligt målretter mod E2 [9]. I mellemtiden kan multivalente E2-underenhedsvacciner rettet mod større cirkulerende stammer af BVDV give delvis beskyttelse mod homologe stammer. En rekombinant herpesvirusvaccine konstrueret med BVDV E2-protein og bovint herpesvirus 1 (BoHV-1) D-protein inducerede specifikke immunresponser på begge vira i værten efter intranasal forstøvning [10]. Derfor kan det være en god strategi at kontrollere BVDV ved at anvende det immundominante BVDV E2-protein som en underenhedsvaccine. Næsehulen er rig på lymfocytter og antigenpræsenterende celler, giver et passende mikromiljø til slimhindeimmunisering og beskytter proteinvacciner mod at blive destabiliseret af syrer og baser. Derudover er intranasal vaccine-induceret immunoglobulin A (IgA) og resident memory B og T-lymfocytter i de øvre luftveje i stand til effektivt at blokere viral replikation [11]. Immunisering gennem næsehulen inducerer ikke kun slimhindeimmunitet, men stimulerer også systematiske immunresponser, som udøver immunbeskyttende virkninger. Tidligere undersøgelser har fundet ud af, at antigener kunne leveres fuldstændigt ind i slimhindeepitelet ved at målrette underenhedsvacciner til den neonatale Fc-receptor (FcRn) af M-celler på slimhindeepitelet og derved effektivt stimulere specifikke immunresponser [12-14]. Immuniseringseffekterne af næsespray forstærkes væsentligt ved at anvende en opløselig rekombinant vaccine dannet ved fusion af molekylært adjuvans og immunantigen [15]. IgGFc interagerer med FcRn på overfladen af ​​immunceller for at deltage i transporten af ​​IgG gennem slimhindeoverflader, hvilket forbedrer immunogeniciteten af ​​Fc-fusionerede proteiner i pattedyr [16]. IgGFc-fusionsproteiner blev rapporteret at danne stabile dimerer gennem disulfidbindinger i Fc-hængselregionen for at øge halveringstiden og stabiliteten af ​​rekombinante proteiner og dermed forbedre de cellulære, slimhinde- og humorale immunresponser [17,18]. Nye vacciner medieret af IgGFc er med succes blevet anvendt til influenza A-virus (HA-HuFc) [19] og svinepestvirus (CSFV-E2Fc) [20].

Fordele ved cistanche tubulosa-styrke immunsystemet

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Den passende overflademodifikation gør det muligt for nanopartikler at opholde sig stabilt i blodcirkulationssystemet [21]. Karakteriseret ved et stort overfladeareal og en hul sfærisk struktur blev Ferritin (Ft) rapporteret at danne nanopartikler af 24 identiske polypeptider ved selvsamling med en række udtrykte fusionsproteiner, som fremmede antigengenkendelse og optagelse af antigenpræsenterende celler, derved inducerer et stærkt immunrespons [22,23]. Ferritin anvendes i vid udstrækning i vaccineudvikling. Kovalent integration af det receptorbindende domæne (RBD)-antigen af ​​SARS-CoV-2-spidsproteinet og selvmonteret Helicobacter pylori non-heme ferritin resulterer i en potent produktion af neutraliserende antistoffer. Ferritinproteinnanopartikler har også en stærk evne til at forbedre antigenstabiliteten, overvinde biologiske barrierer og opnå målrettet levering. Da nano-vacciner effektivt kan fanges af dendritiske celler og makrofager [24], er ferritin-nanopartikler en ny og lovende platform for antigenlevering. I øjeblikket er de vigtigste tilgængelige vacciner til BVDV inaktiverede vacciner og subunit-vacciner, som begge kræver tidskrævende og arbejdskrævende vaccination ved intramuskulær injektion. I mellemtiden er inaktiverede vacciner produceret gennem MDBK-celler tilbøjelige til at inducere bovin neonatal pancytopeni (BNP) [25]. Imidlertid har underenhedsvacciner vist overlegne sikkerhedsprofiler [26]. Intranasal immunisering har vist sig at målrette antigener til FcR-receptoren, hvilket forårsager slimhinde- og systemiske immunresponser [15,16]. Imidlertid forbliver immuneffekterne af intranasal immunisering med BVDV-vacciner og effektiviteten af ​​BVDV-E2 kombineret med molekylære adjuvanser (IgGFc og Ft) dårligt undersøgt. Derfor er udviklingen af ​​slimhindevacciner med BVDV-E2-protein for at forbedre deres immuneffekt en topprioritet på dette område. I den aktuelle undersøgelse blev E2-proteinfusionerede Fc- eller Ft-underenhedsvacciner genereret i HEK293-celler. Resultaterne viste, at næsevaccination med BVDV E2Fc-underenhedsvaccinen var mere effektiv end næsevaccination med E2Ft-underenhedsvaccinen, hvilket yderligere understøttede indikationerne af, at E2Fc-fusionsproteinet er en mere potent underenhedsvaccinemulighed.

cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet

2. Resultater

2.1. Ekspressionen af ​​rekombinante proteiner i suspenderede HEK293-celler

Strukturelle diagrammer af E2, E2Ft og E2Fc er vist i figur 1A. Indirekte immunfluorescensassays blev først udført under anvendelse af konserveret monoklonalt antistof (mAb) BVDVE2 for at verificere immunekspressionen af ​​rekombinante fusionsproteiner. Celler transficeret med plasmider indeholdende E2-, E2Ft- eller E2Fc-gener udsendte et fluorescerende signal, mens mock-behandlede celler ikke udviste et fluorescerende signal (figur 1B). Dette indikerede stærk ekspression af E2, E2Ft og E2Fc i HEK293-celler. For at bestemme, om disse proteiner var sekretorisk udtrykt, blev supernatanterne af HEK293-celler transficeret med plasmider indeholdende E2-, E2Ft- eller E2Fc-gener opsamlet efter 6 dage. Immunekspressionsniveauerne for hvert protein blev analyseret ved Western blot med BVDV-E2-antistof. Resultaterne viste, at celler transficeret med plasmider indeholdende gener af E2, E2Ft og E2Fc udtrykte tilsvarende proteiner med molekylmasser på henholdsvis 45 kDa, 60 kDa og 80 kDa (figur 1C). SDS-PAGE og Coomassie blå farvningsresultater viste, at båndene af hver prøve var i overensstemmelse med blotting-resultaterne (figur 1D). For at sikre specificiteten og nøjagtigheden til påvisning af proteinimmuno-ekspressionen blev præ-absorptionsassays af BVDV-E2 mAb først udført og efterfulgt af virale replikationsassays og Western blot for at vidne om specificiteten af ​​BVDV E2 mAb. Resultaterne afslørede, at antistoffet kun kan reagere på BVDV-E2-proteinet (figur S1). Samlet viste beviserne, at rekombinante proteiner E2, E2Fc og E2Ft blev udtrykt rigeligt i HEK293-celler.

Figur 1. Immunekspression og identifikation af E2-, E2Ft- og E2Fc-proteiner i HEK293-celler. (A) Konstruktionsdiagrammerne for BVDV-E2, BVDV-E2Ft og BVDV-E2Fc. (B) Påvisning af immunekspression af rekombinante proteiner ved IFA; 48 timer efter transficering med E2, E2Fc eller E2Ft blev HEK293-celler fikseret til IFA. BVDV E2 monoklonalt antistof og FITC-ged anti-muse IgG blev anvendt som henholdsvis det primære og sekundære antistof. Kernen blev farvet med DAPI (blå). Skalaen repræsenterer 20 µm. (C) Påvisning af oprensede rekombinante proteiner ved Western blot. (D) Identifikation af oprensede rekombinante proteiner ved SDS-PAGE.

2.2. Aktivering af APC-Fc RI ved BVDV-E2Fc

Antigengenkendelse af BVDV-E2Fc (E2, E2Ft) af makrofager spiller en vigtig rolle i aktiveringen af ​​immunresponset. For at påvise aktiveringseffekten af ​​fusionsproteinet på immunsystemet, blev genkendelsesfunktionen og fagocytisk aktivitet af fusionsproteinet af bovine alveolære makrofager (BAM) verificeret in vitro. Resultaterne viste, at CD64 (Fc RI), detekteret af Cy3--mærket gede-anti-kanin IgG-antistof (røde) markører, var lokaliseret i cytoplasmaet og cellemembranen i bovine makrofager. E2Fc blev påvist under anvendelse af gede-anti-muse IgG (grøn fluorescens). Billeder blev slået sammen til analyse af co-lokalisering af CD64 (Fc RI) og E2Fc i bovine alveolære makrofager (gul farve; figur 2A). I modsætning hertil co-lokaliserede CD64 ikke med E2 eller E2Ft. Resultaterne viste, at translokation af E2Fc-fusionsproteinet over slimhindebarrieren blev medieret af FcRI.

Figur 2. Aktivering af APC-Fc RI ved BVDV-E2Fc. (A) Co-lokaliseringsanalyse af CD64 (Fc RI) med E2Fc-protein på BAM blev påvist ved konfokal mikroskopi. CD64 (Fc RI) på BAM blev farvet med kanin-anti-CD64 og Cy3-mærket gede-anti-kanin IgG som henholdsvis det primære og sekundære antistof.

Fagocytose, optagelsen af ​​partikler af makrofager, blev målt som fagocytosehastigheden. Fagocytosehastighederne for FITC-konjugerede mikrosfærer, E2-protein, E2Ft og E2Fc af de bovine alveolære makrofager var henholdsvis 28,9 %, 55,6 %, 57,1 % og 65,6 %. Med andre ord var fagocytosehastigheden for E2Fc højere end den for E2Ft, hvilket yderligere beviste, at indfangningen af ​​antigener med monocytter blev fuldført ved binding af en specifik receptor på dens overflade med tilsvarende ligander. Imidlertid havde bovine alveolære makrofager ingen receptorer for E2- og E2Ft-proteiner, og de fjernede kun fremmedlegemer gennem fagocytose, som er kroppens mest basale forsvarsmetode (figur 2B).

2.3. Potente slimhinde- og humorale immunresponser induceret af E2Fc in vivo

Kalveimmuniseringsproceduren er afbildet i figur 3A. Niveauerne af IgA og SIgA produceret af kalve immuniseret med fusionsproteinet blev påvist ved indirekte ELISA. Serum-, afførings- og næseslimhindeprøver blev opsamlet og påvist med et kommercielt ELISA-kit. Den E2Fc-immuniserede gruppe udviste de højeste niveauer af IgA og SIgA i serum og slimhinder, både hos intramuskulært og slimhindeimmuniserede dyr (p < 0.01) (Figur 3B, C). Der blev ikke observeret nogen signifikante forskelle i IgA-niveauer mellem den E2- E2-immuniserede gruppe og den E2Ft-immuniserede gruppe, men de var forskellige i SIgA-niveauerne (p < 0,05). Som konklusion var E2Fc-fusionsproteinet i stand til at inducere mere potente slimhinde- og humorale immunresponser end andre proteiner.

2.4. E2Fc kan inducere stærkere T-celle-immunresponser (Th1-type) mod BVDV sammenlignet med E2Ft In Vivo

Th{{0}}-cytokinet IFN- udtrykt af T-celler og NK-celler medierer cellulær immunitet, som er afgørende for virusclearance. For at påvise fordelingen af ​​IFN-udtrykkende CD4+ og CD8+ T-celler i kalve blev lymfocytter isoleret fra PBMC af kalve 35 dage efter immunisering. Lymfocytter blev stimuleret med inaktiveret BVDV, og flowcytometri blev efterfølgende anvendt for at identificere de IFN- -udskillende CD4+ og CD8+ T-celler. Slimhindeimmuniserede grupper med E2Fc og E2Ft udviste signifikant højere andele af IFN- -udskillende CD4+ og CD8+ T-celler sammenlignet med E2-gruppen. Gruppen, der var slimhindeimmuniseret med E2Fc havde et højere niveau af IFN- -udskillende CD3+-afledte CD8+ T-celler end gruppen immuniseret med inaktiveret BVDV (p < 0,05) (figur 4). Der blev imidlertid ikke observeret nogen signifikant forskel i IFN- -udskillende CD3+-afledte CD4+ T-celler mellem grupperne med slimhindeimmuniseret E2Fc og med inaktiveret BVDV. Sammenfattende inducerer både intramuskulær injektion og slimhindeimmunisering med E2Fc stærkere T-celle immunresponser (Th1-type) mod BVDV sammenlignet med E2Ft.

Figur 3. Kalveimmuniseringsforsøgs flowdiagram og slimhinde- og humorale immunresponser induceret af E2Fc in vivo. (A) BVDV-underenhedsvaccinekonstruktion og kalveimmuniseringseksperimentflowdiagram. (B, C) Måling af (B) IgA- og (C)-sekretoriske IgA-niveauer i næsepodninger, fæces og serumprøver indsamlet på dag 14 efter sekundær immunisering med ELISA. n=5, * p < 0.05 og ** p < 0,01

Figur 4. T-celle immunresponser mod BVDV in vivo. Procentdel af (A) CD4+ IFN- + T-celler og (B) CD8+ IFN- + T-celler efter stimulering i mononukleære bovine perifere blodceller. n=5, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001 og ** ** p < 0,0001.

2.5. Immunisering med rekombinante underenhedsvacciner øger indholdet af 1-cytokiner af typen

For at verificere effekten af ​​rekombinant underenhedsvaccine på cellulære immunresponser analyserede vi lymfocyt- og cytokinproliferationsniveauer i det perifere blod fra immuniserede kalve. Først blev antikoagulanter opsamlet fra kalve 49 dage efter immuniseringen. Lymfocytter blev stimuleret af den ultraviolet-inaktiverede BVDV efter adskillelse, og korrelerede indekser blev målt. Sammenlignet med PBS-gruppen var lymfocytstimuleringsindekserne (SI) for grupper immuniseret med underenhedsvaccinerne (E2, E2Fc og E2Ft) alle øget i forskellige grader med det højeste lymfocytstimuleringsindeks (p < 0). 001) i de E2Fc-immuniserede og de inaktiverede vaccinegrupper (figur 5A). Derudover blev kommercielle dobbelt antistof sandwich ELISA kits mod bovin IFN-, IL-2 og IL-4 anvendt til at påvise Th1- og Th2-type cytokinniveauer i perifert blod fra immuniserede kalve. Sammenlignet med PBS-behandlede kalve var niveauerne af IFN- og IL-2 udtrykt i immuniserede kalve signifikant højere end IL-4 49 dage efter immunisering. Niveauerne af IFN- var højere i IN-E2Fc-gruppen end i den inaktiverede vaccinegruppe (p < 0,05), men der var ingen forskel i IL-2 og IL-4 mellem IM-E2Fc og de inaktiverede vaccinegrupper (figur 5B-D). Disse resultater antydede, at IN-E2Fc-underenhedsvaccinen signifikant fremmede Th1--typen cellulære immunrespons hos kalve.

Figur 5. Indholdsforøgelsen af ​​Th1-type cytokiner efter immunisering med rekombinante underenhedsvacciner. (A) Celleproliferationen af ​​perifere blodlymfocytter fra kalve efter immunisering 49 dage blev detekteret ved hjælp af lymfocytproliferationassay-kit. (B-D) Th1- og Th2-cytokiner i lymfocyt-supernatanter blev påvist med bovint IFN-, IL-2, IL-4 dobbelt-antistof-sandwich ELISA-kit. n=5, * p < {{10}}.05, ** p < 0,01 og *** p < 0.00

2.6. BVDV-specifikke antistoffer kan induceres kraftigt af rekombinante E2Ft- og E2Fc-underenhedsvacciner in vivo

BVDV-specifikke antistoffer blev påvist ved ELISA for at udforske det humorale immunrespons induceret af E2-, E2Ft- og E2Fc-underenhedsvaccinerne. BVDV-specifikke antistoffer kunne ikke påvises i alle kalve før immunisering. Niveauerne af antistoffer induceret af E2Ft- og E2Fc-underenhedsvacciner var signifikant højere end niveauerne for E2-gruppen 21 dage efter påbegyndelsen (første dosis) af immuniseringen (p < 0.00 1). Antistofniveauer for slimhindeimmunitet efter 35 dage (14 dage efter anden dosis) og 49 dage (14 dage efter tredje dosis) var signifikant forskellige mellem E2Ft- og E2-grupperne (p < 0,05). Derudover var E2Fc signifikant højere end E2 (p < 0,001). Antistofniveauet i slimhindeimmuniseringsgruppen (IN-E2Ft- og IN-E2Fc-grupper) var højere end for den intramuskulære injektionsgruppe (IM-E2Ft- og IM-E2Fc-grupper), og antistofniveauet i den inaktiverede vaccinegruppe var ikke signifikant forskellig fra IN-E2Fc-gruppen (figur 6). Tilsammen var rekombinante E2Ft- og E2Fc-underenhedsvacciner i stand til at inducere stærke humorale immunresponser, og slimhindeimmuniteten var overlegen i forhold til den intramuskulære injektion, hvilket indikerer, at rekombinante E2Fc- og E2Ft-underenhedsvacciner var stærkt antigene.

Figur 6. Påvisning af antistoffer i serumprøverne fra immuniserede kalve ved ELISA på dag 0, 21, 35 og 49 efter immunisering. n=5, * p < 0.05 og *** p < 0,001

2.7. Neutraliserende antistoffer mod BVDV induceret af rekombinante underenhedsvacciner in vivo

Blodprøver blev indsamlet fra halsvenen hos kalve ved 0, 21, 35 og 49 dage efter den første immunisering. Serumprøver blev adskilt aseptisk og inaktiveret i et vandbad ved 56 ◦C i 30 min. Neutraliseringsassays blev udført for at bestemme antistofniveauerne i det adskilte serum. De neutraliserende antistoffer mod BVDV blev påvist i slimhindeimmuniserede grupper med rekombinante underenhedsvacciner, med titeren af ​​det E2Fc-neutraliserende antistof op til 1:64. Dette er sammenligneligt med den inaktiverede vaccine og bedre end de intramuskulært injicerede E2Ft- og E2Fc-rekombinante underenhedsvacciner (figur 7).

Figur 7. Påvisning af neutraliserende antistoffer i serumprøverne fra immuniserede kalve på dag 0, 21, 35 og 49 efter immunisering. Inaktiverede serumprøver blev ratiofortyndet og præ-inkuberet med 200 TCID50 BVDV XZ02 i 1 time. Serumprøver blev efterfølgende tilsat til celler i 96-brøndsplader og inkuberet i 72 timer. Kanin-anti-E2-antistof og FITC-konjugeret gede-anti-kanin IgG blev anvendt som de primære og sekundære antistoffer. n=5, * p < 0,05 og ** p < 0,01

3. Diskussion

Det er blevet rapporteret, at E2-proteinet udtrykt i pattedyrsceller er mere effektivt til at neutralisere beskyttelse mod BVDV end E2-proteinet opnået fra baculovirus-insektekspressionssystemet (brE2) [27]. Suspensionskulturen af ​​pattedyrceller er karakteriseret ved en enklere proces og et højere udbytte [28]. Suspenderede HEK293-celler er i stand til at vokse under serumfrie forhold, og celleantallet er flere gange større end antallet af den adhærente kultur, som kan bruges til storstilet produktion af antistoffer [29]. Ekspressionseffektiviteten af ​​pcDNA3.1 kombineret med det transiente ekspressionssystem for eukaryote suspensionsceller anvendt i denne undersøgelse var relativt høj, og det rekombinante protein kunne opsamles seks dage efter transfektion med en koncentration på op til 30 mg·L -1, hvilket var tilstrækkelig til efterfølgende dyreanvendelse.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Den bovine virale diarrévirus invaderer hovedsageligt de øvre luftveje og fordøjelseskanalen, hvilket forårsager rhinoré, hoste, åndenød, forhøjet kropstemperatur og leukopeni, og det efterfølges af viræmi, når virussen kommer ind i blodet. Derfor kunne inhaleret intranasal vaccination give mere effektiv beskyttelse end vacciner, der leveres direkte til virusinfektionssteder. For nylig blev det vist, at intranasal immunisering kan præsentere antigener til FcR-receptorer og fremkalde slimhinde- og systematiske immunresponser [16]. Ydermere var bovint IgG1Fc i stand til at binde til det bovine FcR, en højaffinitetsreceptor for IgG [30]. Vores resultater gav bevis for, at Fc fra bovint IgG1 kunne binde med FcRI på bovine alveolære makrofager (BAM) for at opnå transmucosal transport. Dette kan forlænge levetiden af ​​fusionsproteinet i kroppen og fremme produktionen af ​​specifikke antistoffer. Vores resultater afslørede, at niveauet af SIgA induceret af slimhindeimmuniseret E2Fc var signifikant højere end niveauet af slimhindeimmuniseret E2 (p < 0.{{30}}1). Der blev dog kun observeret en lille forskel mellem den intramuskulært injicerede E2Fc-gruppe og den slimhindeimmuniserede E2-gruppe. Dette kan være forårsaget af det faktum, at tyndtarmens slimhinde og mesenteriske lymfeknuder begge ville frigive en lille mængde SIgA som reaktion på intramuskulær injektion med E2Fc adjuvans med 1313VG. Niveauerne af IFN- fremkaldt ved slimhindeimmunisering med E2Fc var signifikant højere end niveauerne af slimhindeimmunisering med E2 (p < 0,01), intramuskulær immunisering med E2Fc og slimhindeimmunisering med E2Ft. Niveauerne af IL-2 fremkaldt af slimhindeimmunisering med E2Fc var signifikant højere end niveauerne af slimhindeimmunisering med E2 og intramuskulær immunisering med E2Ft (p < 0,01). I det næste trin blev de samlede antistofniveauer påvist efter den tredje immunisering. Resultaterne viste, at slimhindeimmuniseringen med E2Fc inducerede signifikant højere niveauer af overordnede antistoffer sammenlignet med slimhindeimmuniseringen med E2 (p < 0,001), hvorimod antistofniveauerne induceret af den intramuskulære injicerede E2Fc og slimhindeimmuniserede E2 var sammenlignelige med den intramuskulære injicerede E2Ft. gruppe. De samlede immuneffekter af slimhindeimmuniseringen af ​​E2Fc-underenhedsvaccinen var overlegne i forhold til den intramuskulære immunisering. Slimhindeimmunisering af E2Fc inducerede ikke kun sekretionen af ​​SIgA, men fremkaldte også specifik Th1--type cellulær immunrespons og humoral immunrespons.

Det blev rapporteret, at CSFV E2-glycoproteinet vist på overfladen af ​​ferritin-nanocages inducerede potent ekspression af de medfødte immuncytokiner IL-4 og IFN- i kaniner [31]. En nanopartikelvaccine udviklet ved kovalent binding af selvsamlet ferritin til receptorbindingsdomænet (RBD) af SARS-CoV-2 viste sig også at fremkalde et robust humoralt og cellulært immunrespons [24]. Næsehulen er rig på slimhinde-associeret lymfoidt væv, og vi viste, at SIgA-niveauerne induceret af slimhindeimmuniseret E2Ft var højere end dem for E2 (p < 0.05). CD4+ og CD8+ T-celler var signifikant højere i den slimhindeimmuniserede E2Ft-gruppe end i E2-gruppen (p < 0,01). CD4+ og CD8+ T-celler spiller en afgørende rolle i forsvaret mod virusinfektion [32]. Neutraliseringstest og antistofassayresultater viste også, at slimhindeimmunisering med E2Ft var mere effektiv end immunisering med intramuskulær E2Ft og E2. Dette skyldtes sandsynligvis, at organismens antigengenkendelses- og præsentationssystem effektivt fagocyterede ferritin (E2Ft) med 24 subunit-polymerer, hvilket resulterede i et følsomt og effektivt antistofrespons in vivo. Antistoffer udskilles af plasmaceller, og neutraliserende antistofniveauer er en vigtig indikator for påvisning af immuneffekter. Når BVDV-vaccinens neutraliserende antistofstyrke er større end 1:24, indikerer det, at vaccinen er immunogen [33].

I denne undersøgelse blev neutraliseringsassays udført for at evaluere de neutraliserende antistofniveauer induceret af E2-rekombinante proteiner. Derfor blev halsveneblodet fra immuniserede kalve opsamlet for at påvise niveauet af IgG-antistoffer i serum. Resultaterne viste, at alle immuniserede kalve producerede forskellige grader af neutraliserende antistoffer 14 dage efter den anden immunisering. De neutraliserende antistofniveauer i kalve fra den slimhindeimmuniserede E2Fc-gruppe og den inaktiverede vaccinegruppe steg signifikant og forblev på 1:64 14 dage efter den tredje immunisering (neutraliserende antistoftitre blev påvist indtil den sjette uge). Det er dog værd at bemærke, at de neutraliserende antistofniveauer af slimhindeimmuniserede E2 og E2Ft og intramuskulært immuniserede E2Fc og E2Ft grupper blev opretholdt mellem 1:8 og 1:16. Vi udleder, at antigener fra den rekombinante E2Fc-vaccine frigives langsomt af Fc-receptoren, hvilket derfor forårsager forlængede humorale og cellulære immunresponser. I modsætning hertil opholder de andre fire underenhedsvacciner sig kort tid i kroppen på grund af manglen på en tilsvarende receptor. Derfor kan en boostervaccination eller en ændring af adjuvans være nødvendig for at opnå de forventede immuneffekter.

cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet

4. Materialer og metoder

4.1. Virus og celler

Type 1b BVDV XZ02-stamme (GenBank accessionsnummer: MF278652) blev isoleret fra Tibet og dyrket under anvendelse af Madin-Darby bovine nyreceller (MDBK). Porcin epidemisk diarrévirus (PEDV) blev bevaret i vores laboratorium. MDBK-celler blev købt fra ATCC (ATCC- CCL-22) og opretholdt i DMEM (Cat NO. SH302403.01, HyClone, Shanghai, Kina), og bovine alveolære makrofagceller (BAM) blev opretholdt i RPMI{ {8}} (Cat NO. SH30027, Cytiva, Shanghai, Kina); alle medierne indeholdt 10 % varmeinaktiveret hesteserum (Cat NO. 16050122, Gibco, Carlsbad, CA, USA) og blev inkuberet ved 37 ◦C i en befugtet inkubator med 5 % CO2. Suspenderede HEK293-celler blev købt fra ATCC (ATCC CRL-1573) og dyrket i et serumfrit KOP293-medium (Cat NO. M21201121A, KAIRUI-biotech, Zhuhai, Kina).

4.2. Antistoffer og testsæt

Følgende antistoffer og testsæt blev anvendt i denne undersøgelse: anti-BVDV E2-antistof (Cat NO. orb312169, Biorbyt, Cambridge, UK); HRP-gede-anti-muse-antistof (kat. nr. ab205719, Abcam, Cambridge, UK); Cy3-gede-anti-muse-antistof (kat. nr. AS008, ABclonal, Boston, MA, USA); FITC-ged-anti-muse-antistof (kat. nr. ab150117, Abcam, Cambridge, UK); CD64 (FcRI) antistof (Cat NO. abs135850, Absin, Shanghai, Kina); Alexa Fluor® 488 gede-anti-muse IgG-antistof (kat. nr. ab150113, Abcam, Cambridge, UK); Cy3-gede-anti-kanin IgG-antistof (kat. nr. ab6939, Abcam, Cambridge, UK); FITC-konjugerede mikrosfærer (Kat. nr. 17155, Polysciences, Warrington, PA, USA); FITC-CD4-antistof (kat. nr. MCA1653, BIO-RAD, Hercules, CA, USA); PE-CD8-antistof (kat. nr. MCA837, BIO-RAD, Hercules, CA, USA); IFN-antistof (kat. nr. MCA1783A, BIORAD, Hercules, CA, USA); FITC-gede-anti-kanin IgG-antistof (kat. nr. AS011, ABclonal, Boston, MA, USA). Kits og reagenser inkluderer BVDV-E2 antistofdetektionskit (Kat. nr. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., LTD, Shanghai, Kina); IgA-detektionskit (kat. nr. 177090b, CAMILO, Nanjing, Kina); SIgA-detektionskit (kat. nr. 177053b, CAMILO, Nanjing, Kina); IFN-detektionskit (kat. nr. 177020b, CAMILO, Nanjing, Kina); IL-2 detektionskit (kat. nr. 177028b, CAMILO, Nanjing, Kina); IL-4 detektionskit (kat. nr. 1770131b, CAMILO, Nanjing, Kina); TA-293 transfektionsreagens (kat. nr. R21203107A, KAIRUI biotech, Zhuhai, Kina); Lymfocytseparationsmedium (kat. nr. RNBJ9540, SIGMA, Saint Louis, MO, USA).

4.3. Plasmidkonstruktion

Trunkeret E2 (benævnt E2 herefter) blev genereret ved at fjerne den transmembrane region af E2 (gensekvens accessionsnummer: MF278652) ved hjælp af TMHMM-webværktøjet (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ tilgået den 12. januar 2023) og tilføjelse af et histidinmærke til C-terminalen (figur 1A). Gensekvensen er vist i supplerende materiale S1. E2Fc-plasmid blev konstrueret ved at tilføje et Fc-fragment indeholdende hængselregionen af ​​det bovine IgG1 (adgangsnummer: x62916.1) til C-terminalen af ​​E2 med den ordinære position af E2-syntetisk fleksibelt peptid-hængselregion -CH2-CH3-domæne-6 × His [20]. Gensekvensen er vist i Supplerende Materiale S2. E2Ft-plasmidet blev konstrueret ved at forbinde E2 til Helicobacter pylori ferritin (rest 5-167) via linkeren (Gly)3Ser [34]. Gensekvensen er vist i Supplerende Materiale S3. IL-2-signalpeptidet blev tilføjet til N-terminalen af ​​E2, E2Fc og E2Ft for at lette sekretorisk ekspression [35]. Målgenerne (E2, E2Ft og E2Fc) blev klonet ind i pcDNA3.1 med henholdsvis BamHI og XhoI.

4.4. Proteinekspression og oprensning

Ca. 10{{30}} mL suspenderede HEK293-celler på det eksponentielle stadium (ca. 2~4 × 106 celler/mL) blev transficeret med tilsvarende plasmider. Kort fortalt blev 5 ml KPM (transfektionsbuffer) og 100 µg sterilt plasmid-DNA tilsat til et sterilt centrifugerør og 5 ml KPM og 500 µL TA-293 (Kat. nr. R21203107A, KAIRUI biotech, Zhuhai, Kina Transfektionsreagenser blev tilsat til et andet sterilt centrifugerør. Derefter blev et fortyndet transfektionsreagens tilsat til det fortyndede plasmid og blandet grundigt. Efter inkubation i 10 minutter ved stuetemperatur blev et DNA-transfektionsreagenskompleks tilsat til cellerne, ledsaget af omrystning. Celler blev inkuberet i en fugtig inkubator ved 37 ◦C med 5% CO2 ved en rystehastighed på 140 rpm/min. Celler blev høstet seks dage efter transfektion ved centrifugering i 30 minutter ved 12, 000 rpm/min og filtreret med et 0,22 mm filter for at fjerne resterende cellerester. Nikkelaffinitetskromatografisøjlerne (Cat NO. 17531801, GE, Boston, MA, USA) blev anvendt til histidin (His) mærket affinitetsoprensning af E2-, E2Ft- og E2Fc-proteiner [36]. Kort fortalt blev 100 ml prøver tilsat til affinitetssøjler med en hastighed på 1 ml/min. Søjlerne blev efterfølgende vasket med fem søjlevolumener (CV) buffer A (0,1 M PBS, 300 mM NaCI, 5 mM) med en hastighed på 1 ml/min. Endelig fik koncentrationsgradienter af imidazol (fra 0 til 500 mM) lov til at strømme gennem søjlen med en hastighed på 1 ml/min for at opsamle væsken svarende til hovedtoppen. Proteinkoncentrationer blev kvantificeret med et BCA-proteindetektionskit. Opsamlede proteiner blev yderligere anvendt til Western blot-analyse.

cistanche planteforøgende immunsystem

4.5. Western Blot

Proteiner blev separeret under anvendelse af SDS-PAGE. Efter at være blevet overført til NC-filtermembranen blev proteiner blokeret med 2% skummetmælkspulver natten over ved 4 ◦C og efterfølgende inkuberet med anti-BVDV E2-antistof (Cat NO. orb312169, Biorbyt, Cambridge, UK) i 2 timer ved stuetemperatur . Efter at være blevet vasket tre gange med TBS-T, blev membranerne inkuberet med HRP-gede-anti-mus (Cat NO. ab205719, Abcam, Cambridge, UK) antistoffer i 1 time ved stuetemperatur. Efter at være blevet vasket tre gange med TBS-T, blev ECL-kemiluminescenssystemet anvendt til at detektere proteinimmuno-ekspression.

4.6. Indirekte immunfluorescens

Til immunfluorescenspåvisning af immunekspressionen af ​​rekombinante proteiner blev HEK293-celler transficeret med plasmider, der udtrykker E2, E2Ft og E2Fc; 48 timer efter transfektion blev celler fikseret med paraformaldehyd i 15 minutter. Efter at være blevet vasket tre gange med PBS, blev cellerne permeabiliseret med 0,5% Trition-X100 i 15 min. Efter en intensiv vask med PBS blev cellerne efterfølgende blokeret med 2% BSA og inkuberet med et 1:500 fortyndet BVDV E2 monoklonalt antistof (fremstillet i vores laboratorium) ved 37 ◦C i 2 timer. Cy3 (kat. nr. AS008, ABclonal, Boston, MA, USA) eller FITC-konjugerede gede-anti-muse-antistoffer (kat. nr. ab150117, Abcam, Cambridge, UK) blev anvendt som det sekundære antistof. Kernerne blev farvet med DAPI i 10 minutter ved stuetemperatur. Proteiner blev visualiseret ved konfokal mikroskopi (LSM 510, Zeiss, Oberkochen, Tyskland) [37].

4.7. APC-målretning af det rekombinante E2Fc-fusionsprotein

Immunofluorescenskolokaliseringsanalyse blev udført for at bekræfte bindingen af ​​BVDV-E2Fc-fusionsproteinet til FcRI på bovine alveolære makrofager (BAM). Kort fortalt blev 3 µg oprenset E2, E2Ft eller E2Fc tilsat til bovine alveolære makrofager. Efter inkubation i 12 timer ved 37 ◦C blev celler vasket med 0,1 % BSA i fosfatpufret saltvand (PBS) og fikseret med methanol/acetone (1:1) ved 20 ◦ C. Celler blev efterfølgende permeabiliseret med 0,5% Trition-X100 i 15 minutter og blokeret med 2% BSA ved 37 ◦C i 2 timer. Derefter blev cellerne vasket tre gange med PBS og inkuberet med BVDV E2 monoklonalt antistof (musekilde; fremstillet i vores laboratorium) og bovint CD64 (Fc RI) polyklonalt antistof (Cat NO. abs135850, Absin, Shanghai, Kina) i 2 h. Cellerne blev vasket tre gange med PBS og dækket med Alexa Fluor® 488 gede-anti-muse-IgG (kat. nr. ab150113, Abcam, Cambridge, UK) og Cy3-mærket gede-anti-kanin-IgG-antistof (kat. nr. ab6939, Abcam, Cambridge, UK) i 1 time ved stuetemperatur. Kernerne blev farvet med DAPI. Billederne blev fotograferet ved hjælp af immunfluorescens-kolokalisering (LSM 880, Zeiss, Oberkochen, Tyskland).

4.8. Bestemmelse af den fagocytiske hastighed af bovine alveolære makrofager

For at bestemme virkningerne af rekombinante proteiner E2, E2Ft og E2Fc på fagocytose af bovine alveolære makrofager (BAM), blev bovine alveolære makrofager i en koncentration på 1 × 106 celler/ml præinkuberet med rekombinante proteiner E2, E2Ft eller E2Fc (koncentrationerne blev alle justeret til 35 0 ng/ml) i 4 timer. Efter vask tre gange med PBS blev 10 µL FITC-konjugerede mikrosfærer (Cat NO. 17155, Polysciences, Warrington, PA, USA) og 990 µL af RPMI-1640-mediet tilsat til hver brønd . Efter 2 timers inkubation blev celler vasket med PBS for at fjerne ekstracellulære FITC-konjugerede mikrosfærer. Adhærerende makrofager blev fordøjet med trypsin (Gibco) indeholdende 0,05% EDTA, og fordøjelsen blev afsluttet med 1640 komplet medium efter fuld fordøjelse. Celler blev derefter tilsat til det øverste lag af 10 ml PBS med 0,45 g glucose og 0,3 g BSA, efterfulgt af gradientcentrifugering ved 400 x g i 10 minutter. Separerede celler blev vasket to gange med PBS og resuspenderet med 800 µl PBS. Fluorescensintensitet ved 488 nm blev bestemt af Beckman flowcytometeret (MoFloAstrios EQ, BECKMAN, Pasadena, CA, USA).

4.9. Vaccineforberedelse og vaccinationsprocedure

HEK{0}}udtrykt E2, E2Ft og E2Fc blev emulgeret med IMS 1313VG adjuvans (Seppic, Frankrig) i lige store forhold til en endelig proteinkoncentration på 200 µg/ml og opbevaret ved 4 ◦C efter kvalitetskontrol. BVDV-E0 og BVDV-E2 antistof-negative (kat. nr. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Kina) 3-måned gamle kalve (n=35) var opdelt i syv lige store grupper. Kalve i fire grupper blev næseslimhindeimmuniseret (in) med henholdsvis PBS, E2, E2Ft og E2Fc. Kalve i de resterende tre grupper blev intramuskulært injiceret (im) med E2Ft-, E2Fc- og BVDV-inaktiverede vacciner som den positive kontrol (Cat NO. 202002003, Huaweit, Jiangsu, Kina). Kalve blev vaccineret på dag 1, 21 og 35 af forsøget, og hver kalv blev podet med 1 ml vaccine med en proteinkoncentration på 200 µg/ml. Blod blev opsamlet fra kalve på dag 1, 21, 35 og 49 af eksperimentet for andre indekser (figur 3A). Alle eksperimentelle protokoller blev godkendt af den forskningsetiske komité ved College of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University, Hubei, Kina (nr. HZAUCA-2022-0011).

4.10. Produktion af IgA i fæces og serum

Næsepodninger, fæces og serumprøver fra kalve blev opsamlet på dag 14 efter den sekundære immunisering. Den friske ko-fæces blev fortyndet i en 15 % fækal suspension med PBS, suspensionen blev centrifugeret ved 18,000× g ved 4 ◦C i 30 minutter, og supernatanten blev opsamlet til senere brug. Næsepodningerne blev opsamlet ved at rotere den sterile vatpind dybt ind i koens næsehule i 6-8 omgange. Podninger blev sat i et PBS-rør indeholdende 1% penicillin-streptomycin og blandet grundigt. Prøver blev centrifugeret ved 18,000× g ved 4 ◦C i 10 minutter, og supernatanten blev opsamlet til senere brug. Bovine blodprøver blev opsamlet med et ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA)--holdigt antikoagulantrør, og serumprøverne blev opnået ved at centrifugere blodprøverne ved 4 ◦C og 400 g i 5 minutter. IgA (kat. nr. 177090b, CAMILO, Nanjing, Kina) og SIgA blev påvist med ELISA-kittet (kat. nr. 177053b CAMILO, Nanjing, Kina) i henhold til producentens instruktioner.

4.11. Flowcytometrianalyse

Hyppigheden af ​​IFN- -producerende CD3+ CD4+ og CD3+ CD8+ T-celler blandt CD3+ lymfocytterne i blodet var analyseret ved hjælp af flowcytometri. Prøver blev indsamlet 14 dage efter booster-immuniseringen [36]. Mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) blev resuspenderet og fortyndet til 1 × 106 celler/ml med komplet RPMI-1640-medium, stimuleret med UV-inaktiveret BVDV XZ02 (MOI=0.1) og inkuberet ved 37°C ◦C med 5 % CO2 i 72 timer. Concanavalin A (Con A) (5 µg/ml; Sigma) blev anvendt som en positiv kontrol. Proteintransporthæmmeren brefeldin A (BFA, 3 µg/ml, eBioscience) blev tilsat til alle prøver 12 timer før cellehøst for at blokere IFN-sekretion. En mængde på 200 µL af cellen blev overført til FCM-rør og farvet med det FITC-mærkede CD4-antistof (Kat. nr. MCA1653, BIO-RAD, Hercules, CA, USA) i 30 minutter ved 4 ◦C i mørke. Efter at være blevet vasket tre gange med PBS, blev celler inkuberet med R-PE-mærket CD8-antistof (Kat. nr. MCA837, BIO-RAD, Hercules, CA, USA). Efter at være blevet vasket tre gange, blev celler inkuberet med muse-anti-bovint IFN-antistof (kat. nr. MCA1783A, BIO-RAD, Hercules, CA, USA) i 20 minutter i mørke til intracellulær cytokinfarvning. Efter vask blev cellerne resuspenderet i PBS indeholdende 1% FBS. Flowcytometri blev udført med FACS Caliber flowcytometer (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA), og data blev indsamlet og analyseret som tidligere beskrevet [38].

4.12. Lymfocytproliferation og cytokindetektion

De antikoagulerede perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra hver kalv blev isoleret under anvendelse af et lymfocytseparationsmedium (Cat NO. RNBJ9540, SIGMA, Saint Louis, MO, USA) på dag 49 efter immunisering. Bovine perifere blodlymfocytter blev fortyndet med 10 % FBS 1640-mediet til 1 x 106 celler/ml. Derefter blev 100 µL fortyndede celler tilsat til hver brønd i en 96-brøndsplade og stimuleret med henholdsvis UV-inaktiveret BVDV, concanavalin (positiv kontrol) eller dyrkningsmedium (negativ kontrol). Efter 72 timers inkubation ved 37 ◦C med 5 % CO2, blev 30 µL MTS tilsat til hver brønd, og cellerne fortsatte med at blive dyrket ved 37 ◦C i 1 time i henhold til producentens instruktioner. Absorbansen ved 492 nm blev målt med en automatiseret mikropladeanalysator. Lymfocytproliferationstiteren for hver prøve blev bestemt ved stimulationsindeks (SI). Beregnet SI=(OD for prøve-OD af blindprøvekontrol)/(OD for negativ prøve-OD for blindkontrol) [39]. Interferon (IFN)-, interleukin (IL)-2 og interleukin (IL)-4 blev påvist ved hjælp af ELISA-kits. Kort fortalt blev PBMC'er isoleret og fortyndet til 4 × 106 celler/ml med RPMI 1640-medium indeholdende 10% FBS og anbragt i 24-brøndsvævskulturplader. Celler blev stimuleret med inaktiveret BVDV XZ02 (MOI=1) i 48 timer ved 37 ◦C, og supernatanten blev efterfølgende opsamlet. IFN- (kat. nr. 177020b, CAMILO, Nanjing, Kina), IL-2 (kat. nr. 177028b, CAMILO, Nanjing, Kina) og IL-4 (kat. nr. 1770131b, CAMILO, Nanjing, Kina) niveauer blev påvist ved hjælp af tilsvarende ELISA-sæt i henhold til producentens instruktioner. Indholdet af IFN-, IL-2 og IL-4 i prøven blev beregnet ved hjælp af standardkurven.

4.13. Serologiske tests

For at påvise E2/E0-antistoffer blev der udtaget blodprøver fra hver kalv på dagene 0, 21, 35 og 49 efter immunisering. Serumprøver blev opsamlet ved at centrifugere blodprøver ved 1000 x g i 20 min. Serumprøver blev behandlet i overensstemmelse med kravene i BVDV E2-antistofdetektionskittet (Kat. nr. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Kina). Mikroplader coatet med BVBV E2-antigenet blev ækvilibreret i 20 minutter ved stuetemperatur. Derefter blev 50 µL negativ kontrol, positiv kontrol og serumprøver tilsat til henholdsvis mikropladen. En mængde på 50 µL peberrodsperoxidase (HRP)-mærket detektionsantistof blev efterfølgende tilsat til mikropladen og inkuberet ved 37 ◦C i 60 min. Efter at være blevet vasket fem gange med en vaskebuffer, blev en kromogen opløsning tilsat for at måle absorbansen af ​​mikropladelæseren ved 450 nm for at bestemme niveauet af E2-antistof i hver immuniseringsgruppe. Den fikserede virusfortyndingsserummetode blev anvendt til at påvise det neutraliserende antistofniveau i serumprøver. Kort fortalt blev de fuldstændigt inaktiverede immunserumprøver fortyndet med 2−1 til 2−12, og 50 µL serum ved hver fortyndingstiter blev tilsat til 96-brøndsplader. Efterfølgende blev 50 µL fortyndet virusopløsning indeholdende 200 TCID50- BVDV XZ02-viruset tilsat til hver brønd. Pladerne blev forsigtigt rystet og blandet. Efter 1 times inkubation ved 37 ◦C blev MDBK-celler med en koncentration på 5 × 105 celler/ml tilsat til 96-brøndsplader og inkuberet ved 37 ◦C i en befugtet inkubator med 5 % CO2 i 72 timer. For at påvise den neutraliserende effekt af serumprøver blev celler behandlet med det E2-specifikke antistof som det primære antistof (Cat NO. orb312169, Biorbyt, Cambridge, UK) og FITC-konjugeret gede-anti-kanin-IgG som det sekundære antistof, (kat. nr. AS011, ABclonal, Boston, MA, USA). Et typisk grønt fluorescerende signal indikerede fravær af neutralisering. Fotografier blev taget under et fluorescensmikroskop (TE2000, Nikon, Tokyo, Japan). Serumneutraliseringstiteren blev beregnet i henhold til Reed-Muench-metoden, og den maksimale fortynding af serum, der fuldstændigt kunne inhibere fluorescens, blev bestemt som neutralisationstiteren for serumet.

4.14. Specificitetspåvisning af BVDV E2 monoklonalt antistof

Præ-absorptionsassays af BVDV E2 monoklonalt antistof blev først udført, efterfulgt af virale replikationsassays og Western blot for at vidne om specificiteten af ​​BVDV E2 mAb. Til viral replikationsassay blev 400 TCID50 af BVDV præ-inkuberet med henholdsvis PBS og 100 µg eller 200 µg E2 mAb ved 37 ◦C i 1 time. Efter inkubation blev den forbehandlede BVDV inokuleret til MDBK-celler, og cellerne blev dyrket ved 37 ◦C i en befugtet inkubator. Celler blev opsamlet ved 18 eller 24 hpi (time efter infektion), og RNA blev ekstraheret med TRIZOL-reagens. RT-qPCR blev udført for at bestemme den relative ekspression af BVDV E2-genet. Til Western blot-assay blev E2-mAb præ-inkuberet med Tween20, PEDV S-protein eller BVDV E2-protein i TBS-T i 2 timer ved henholdsvis 4 ◦C. Forbehandlet E2-mAb blev udsat for Western blot-assay som det primære antistof for at påvise reaktionen på BVDV E2- eller PEDV S-proteinet.

4.15. Statistisk analyse

Det statistiske program GraphPad Prism blev brugt til alle analyser. Den to-hale uparrede t-test blev brugt til at analysere dataene og producere p-værdierne (*, p < 0.05; **, p < 0.{{ 8}}1; ***, p < 0,001, **** p < 0,0001). Medmindre andet er angivet, er data vist som middelværdi ± SD.

5. Konklusioner

I vores undersøgelse blev tre rekombinante proteiner, BVDV-E2, BVDV-E2Ft og BVDV-E2Fc, udtrykt, og tilsvarende underenhedsvacciner blev genereret. In vivo-tests viste, at E2Fc-underenhedsvaccinen var mere effektiv end E2Ft og E2, både i slimhinde- og intramuskulær immunisering. Vi bekræftede, at de neutraliserende antistoftitre induceret af de slimhindeimmuniserede E2Fc og E2Ft var henholdsvis 1:64 og 1:16, hvilket yderligere indikerer, at E2Fc bandt med FcRI på bovine alveolære makrofager for at opnå transmucosal transport. Slimhindevaccination af den multivalente E2Fc-underenhedsvaccine af den epidemiske hovedstamme af BVDV forbedrede immuneffekterne væsentligt, og den er velegnet til praktisk brug. Vores undersøgelse giver en løsning på den tidskrævende og arbejdskrævende konventionelle vaccination ved at anvende en slimhindevaccine. BVDV E2-protein er et ideelt mål til neutralisering af antistoffer, og E2Fc- og E2Ft-fusionsproteinerne konstrueret i denne undersøgelse forventes at blive yderligere anvendt som sikre og effektive underenhedsvacciner mod BVDV-infektion.

Referencer

1. Truyers, IG; Mellor, DJ; Norquay, R.; Gunn, GJ; Ellis, KA Udryddelsesprogram for bovin viral diarrévirus i Orkney 2001 til 2008. Dyrlæge. Rec. 2010, 167, 566-570. [CrossRef]

2. Peterhans, E.; Schweizer, M. BVDV: Et pestivirus, der inducerer tolerance af det medfødte immunrespons. Biologisk 2013, 41, 39-51. [CrossRef]

3. Zhong, F.; Li, N.; Huang, X.; Guo, Y.; Chen, H.; Wang, X.; Shi, C.; Zhang, X. Genetisk typning og epidemiologisk observation af bovin viral diarrévirus i det vestlige Kina. Virusgener 2011, 42, 204-207. [CrossRef]

4. Deng, Y.; Shan, TL; Tong, W.; Zheng, XC; Guo, YY; Zheng, H.; Cao, SJ; Wen, XT; Tong, GZ Genomisk karakterisering af et bovint viralt diarrévirus 1-isolat fra svin. Arch. Virol. 2014, 159, 2513-2517. [CrossRef] [PubMed]

5. Deng, Y.; Sun, CQ; Cao, SJ; Lin, T.; Yuan, SS; Zhang, HB; Zhai, SL; Huang, L.; Shan, TL; Zheng, H.; et al. Høj forekomst af bovin viral diarrévirus 1 i kinesiske svinebesætninger. Dyrlæge. Microbiol. 2012, 159, 490-493. [CrossRef] [PubMed]

6. Wang, L.; Wu, X.; Wang, C.; Sang, C.; Bao, J.; Du, J. Oprindelse og transmission af bovin viral diarrévirus type 1 i Kina afsløret ved fylodynamisk analyse. Res. Dyrlæge. Sci. 2020, 128, 162-169. [CrossRef] [PubMed]

7. Tautz, N.; Tews, BA; Meyers, G. Pestiviras molekylære biologi. Adv. Virus Res. 2015, 93, 47-160.

8. Becher, P.; Tautz, N. RNA-rekombination i pestivira: Cellulære RNA-sekvenser i virale genomer fremhæver værtsfaktorernes rolle for viral persistens og dødelig sygdom. RNA Biol. 2011, 8, 216-224. [CrossRef]

9. Li, Y.; Wang, J.; Kanai, R.; Modis, Y. Krystalstruktur af glycoprotein E2 fra bovin viral diarrévirus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2013, 110, 6805-6810. [CrossRef]

10. Williams, LBA; Fry, LM; Herndon, DR; Franceschi, V.; Schneider, DA; Donofrio, G.; Knowles, DP En rekombinant bovin herpesvirus-4-vektorvaccine leveret via intranasal forstøvning fremkalder virale neutraliserende antistoftitre hos kvæg. PLoS ONE 2019, 14, e0215605. [CrossRef]

11. Ainai, A.; van Riet, E.; Ito, R.; Ikeda, K.; Senchi, K.; Suzuki, T.; Tamura, SI; Asanuma, H.; Odagiri, T.; Tashiro, M.; et al. Humane immunresponser fremkaldt af en intranasal inaktiveret H5-influenzavaccine. Microbiol. Immunol. 2020, 64, 313-325. [CrossRef] [PubMed]

12. Kang, H.; Yan, M.; Yu, Q.; Yang, Q. Karakteristika for nasal-associeret lymfoidt væv (NALT) og nasal absorptionskapacitet hos kylling. PLoS ONE 2013, 8, e84097. [CrossRef] [PubMed]

13. Ye, L.; Zeng, R.; Bai, Y.; Roopenian, DC; Zhu, X. Effektiv slimhindevaccination medieret af den neonatale Fc-receptor. Nat. Biotechnol. 2011, 29, 158-163. [CrossRef] [PubMed]

14. Pabst, R. Slimhindevaccination ad den intranasale vej. Næse-associeret lymfoidt væv (NALT) - Struktur, funktion og artsforskelle. Vaccine 2015, 33, 4406-4413. [CrossRef]

15. Zhang, Y.; Zhou, Z.; Zhu, SL; Zu, X.; Wang, Z.; Zhang, LK; Wang, W.; Xiao, G. En ny RSV F-Fc fusionsproteinvaccine reducerer lungeskade induceret af respiratorisk syncytial virusinfektion. Antivir. Res. 2019, 165, 11-22. [CrossRef]

16. Wiedinger, K.; McCauley, J.; Bitsaktsis, C. Isotype-specifikke resultater i Fc-gamma-receptor-målretning af PspA ved hjælp af fusionsproteiner som en vaccinationsstrategi mod Streptococcus pneumoniae-infektion. Vaccine 2020, 38, 5634-5646. [CrossRef]

17. Czajkowsky, DM; Hu, J.; Shao, Z.; Pleas, RJ Fc-fusionsproteiner: Nye udviklinger og fremtidsperspektiver. EMBO Mol. Med. 2012, 4, 1015-1028. [CrossRef]

18. Chen, X.; Zeng, F.; Huang, T.; Cheng, L.; Liu, H.; Gong, R. Optimering af Fc til forbedring af stabilitet og aggregeringsmodstand. Curr. Pharm. Biotechnol. 2016, 17, 1353-1359. [CrossRef]

19. Loureiro, S.; Ren, J.; Phapugrangkul, P.; Colaco, CA; Bailey, CR; Shelton, H.; Molesti, E.; Temperton, NJ; Barclay, WS; Jones, IM Adjuvansfri immunisering med hæmagglutinin-Fc-fusionsproteiner som en tilgang til influenzavacciner. J. Virol. 2011, 85, 3010-3014. [CrossRef]

20. Li, J.; Li, X.; Ma, H.; Ren, X.; Hao, G.; Zhang, H.; Zhao, Z.; Fang, K.; Li, X.; Rong, Z.; et al. Effektiv slimhindevaccination af et nyt klassisk svinepestvirus E2-Fc-fusionsprotein medieret af neonatal Fc-receptor. Vaccine 2020, 38, 4574-4583. [CrossRef]

21. Zhen, Z.; Tang, W.; Todd, T.; Xie, J. Ferritiner som nanoplatforme til billeddannelse og lægemiddellevering. Ekspert udtalelse. Drug Deliv. 2014, 11, 1913–1922. [CrossRef] [PubMed]

22. Lopez-Sagaseta, J.; Malito, E.; Rappuoli, R.; Bottomley, MJ Selvsamlende proteinnanopartikler i design af vacciner. Comput. Struktur. Biotechnol. J. 2016, 14, 58-68. [CrossRef] [PubMed]

23. Jacob, SI; Khogeer, B.; Bampos, N.; Sheppard, T.; Schwartz, R.; Lowe, CR Udvikling og anvendelse af syntetiske affinitetsligander til oprensning af ferritin-baserede influenzaantigener. Biokonjugat Chem. 2017, 28, 1931-1943. [CrossRef] [PubMed]

24. Ma, X.; Zou, F.; Yu, F.; Li, R.; Yuan, Y.; Zhang, Y.; Zhang, X.; Deng, J.; Chen, T.; Sang, Z.; et al. Nanopartikelvacciner baseret på receptorbindingsdomænet (RBD) og Heptad-gentagelse (HR) af SARS-CoV-2 fremkalder robuste beskyttende immunresponser. Immunitet 2020, 53, 1315-1330.e1319. [CrossRef] [PubMed]

25. Benedictus, L.; Bell, CR Risiciene ved at bruge allogene cellelinjer til vaccineproduktion: Eksemplet med Bovin Neonatal Pancytopenia. Ekspert Rev. Vaccines 2017, 16, 65-71. [CrossRef]

26. Pecora, A.; Aguirreburualde, MS; Aguirreburualde, A.; Leunda, MR; Odeon, A.; Chiavenna, S.; Bochoeyer, D.; Spitteler, M.; Filippi, JL; Dus Santos, MJ; et al. Sikkerhed og effektivitet af en E2-glycoprotein-underenhedsvaccine produceret i pattedyrsceller for at forhindre eksperimentel infektion med bovin viral diarrévirus hos kvæg. Dyrlæge. Res. Commun. 2012, 36, 157-164. [CrossRef]

27. Thomas, C.; Young, NJ; Heaney, J.; Collins, ME; Brownlie, J. Evaluering af effektiviteten af ​​pattedyr- og baculovirus-udtrykte E2-underenhedsvaccinekandidater til bovin viral diarrévirus. Vaccine 2009, 27, 2387-2393. [CrossRef]

28. Arena, TA; Harms, PD; Wong, AW High Throughput Transfektion af HEK293-celler til forbigående proteinproduktion. Metoder Mol. Biol. 2018, 1850, 179-187.

29. Venereo-Sanchez, A.; Gilbert, R.; Simoneau, M.; Caron, A.; Chahal, P.; Chen, W.; Ansorge, S.; Li, X.; Henry, O.; Kamen, A. Hæmagglutinin og neuraminidase indeholdende viruslignende partikler produceret i HEK-293 suspensionskultur: En effektiv influenzavaccinekandidat. Vaccine 2016, 34, 3371-3380. [CrossRef]

30. Yan, Y.; Li, X.; Wang, A.; Zhang, G. Molekylær kloning og identifikation af cDNA i fuld længde, der koder for højaffinitets-Fc-receptor for bovint IgG (Fc gamma RI). Dyrlæge. Immunol. Immunopathol. 2000, 75, 151-159. [CrossRef]

31. Zhao, Z.; Chen, X.; Chen, Y.; Li, H.; Fang, K.; Chen, H.; Li, X.; Qian, P. En selvsamlende ferritin-nanoplatform til design af klassisk svinepestvaccine: fremkaldelse af potent neutraliserende antistof. Vacciner 2021, 9, 45. [CrossRef] [PubMed]

32. Hsieh, MS; Hsu, CW; Tu, LL; Chai, KM; Yu, LL; Wu, CC; Chen, MIN; Chiang, CY; Liu, SJ; Liao, CL; et al. Intranasal vaccination med rekombinant antigen-FLIPr fusionsprotein alene inducerer langvarige systemiske antistofresponser og brede T-celleresponser. Foran. Immunol. 2021, 12, 751883. [CrossRef] [PubMed]

33. Bellido, D.; Baztarrica, J.; Rocha, L.; Pecora, A.; Acosta, M.; Escribano, JM; Parreno, V.; Wigdorovitz, A. En ny MHC-II-målrettet BVDV-underenhedsvaccine inducerer et neutraliserende immunologisk respons hos marsvin og kvæg. Transbound. Emerg. Dis. 2021, 68, 3474-3481. [CrossRef] [PubMed]

34. Ma, H.; Li, X.; Li, J.; Zhao, Z.; Zhang, H.; Hao, G.; Chen, H.; Qian, P. Immunisering med en rekombinant fusion af porcint reproduktivt og respiratorisk syndromvirus modificeret GP5 og ferritin fremkalder øget beskyttende immunitet hos grise. Virology 2021, 552, 112-120. [CrossRef] [PubMed]

35. Nyon, MP; Du, L.; Tseng, CK; Seid, CA; Pollet, J.; Naceanceno, KS; Agrawal, A.; Algaissi, A.; Peng, BH; Tai, W.; et al. Konstruktion af en stabil CHO-cellelinje til ekspression af et MERS-coronavirus-vaccineantigen. Vaccine 2018, 36, 1853-1862. [CrossRef]

36. Bellini, M.; Riva, B.; Tinelli, V.; Rizzuto, MA; Salvioni, L.; Colombo, M.; Mingozzi, F.; Visioli, A.; Marongiu, L.; Frascotti, G.; et al. Konstruerede ferritin-nanopartikler til bioluminescenssporing af nanodrug-levering i kræft. Lille 2020, 16, e2001450. [CrossRef]

37. Zhang, H.; Li, X.; Peng, G.; Tang, C.; Zhu, S.; Qian, S.; Xu, J.; Qian, P. Glycoprotein E2 fra klassisk svinepestvirus udtrykt af baculovirus inducerer de beskyttende immunresponser hos kaniner. Vaccine 2014, 32, 6607-6613. [CrossRef]

38. Yuan, L.; Wen, K.; Azevedo, MS; Gonzalez, AM; Zhang, W.; Saif, LJ Virusspecifik intestinal IFN-gamma-producerende T-celle-respons induceret af human rotavirusinfektion og vacciner er korreleret med beskyttelse mod rotavirusdiarré hos gnotobiotiske grise. Vaccine 2008, 26, 3322-3331. [CrossRef]

39. Wang, YP; Liu, D.; Guo, LJ; Tang, QH; Wei, YW; Wu, HL; Liu, JB; Li, SB; Huang, LP; Liu, CM Forstærket beskyttende immunrespons på PCV2-underenhedsvaccine ved samtidig administration af rekombinant svine-IFN-gamma i mus. Vaccine 2013, 31, 833-838. [CrossRef]