Forbedring af phenylethanoid glycosider biosyntese i cellekulturer af Cistanche Deserticola ved osmotisk stress
Mar 11, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Chun-Zhao Liu. Xi-Yu Cheng
AbstraktEffekten af osmotisk stress på cellevækst og phenylethanoid glycosider (PeGs) biosyntese blev undersøgt i cellesuspensionskulturer afCistanche deserticolaYC Ma, en ørkenmedicinsk plante dyrket i den vestlige del af Kina. Forskellige initiale saccharosekoncentrationer påvirkede signifikant cellevækst og PeGs-biosyntese i suspensionskulturerne, og den højeste tørvægt og PeGs-akkumulering nåede henholdsvis 15,9 gl–1-DW og 20,7 mg g–1-DW ved den initiale osmotiske stress på 300 mOsm kg-1, hvor saccharosekoncentrationen var 175,3 mM. Støkiometrisk analyse med forskellige kombinationer af saccharose og ikke-metabolisk sukker (mannitol) eller ikke-sukker osmotiske midler (PEG og NaCl) afslørede, at osmotisk stress i sig selv var en vigtig faktor for at øge PeGs biosyntese i cellesuspensionskulturer afCistanche deserticola. Det maksimale PeGs-indhold på 26,9 og 23,8 mg g-1-DW blev opnået efter 21 dage ved kombinationerne af 87,6 mM saccharose med 164,7 mM mannitol (henholdsvis 303 mOsm kg-1) eller 20 mM PEG, hvilket var højere end den for C. deserticola-cellekulturer dyrket under en initial saccharosekoncentration på 175,3 mM efter 30 dage. Den stimulerede PeGs-akkumulering i cellesuspensionskulturerne var korreleret til stigningen i phenylalanin ammonium lyase (PAL) aktivitet induceret af osmotisk stress.
Nøgleord Cistanche deserticola, Ørken lægeplante, Phenylethanoid glycosider, Osmotisk stress, Phenylalanin ammoniak-lyase
Cistanchetubulosahar mange effekter, klik her for at vide mere
Introduktion
Cistanche deserticolaYC Ma, en dyrebar kinesisk urt, snylter rødderne af Haloxylon ammodendrun og vokser i ørkenområder i det vestlige Kina. Phenylethanoidglycosider (PeG'er), de vigtigste bioaktive komponenter isoleret fra C. deserticola, har markante aktiviteter til at fjerne frie radikaler, forbedre immuniteten, forbedre seksuel funktion osv. (Zong et al. 1996; Lu 1998; Wang et al. 2001). På grund af ukontrolleret udnyttelse og udnyttelse afCistanche deserticola, naturressourcen afCistanche deserticola var på kanten af udmattelse. I lyset af disse problemer er PeGs-produktion af cellesuspensionskulturer af C. deserticola blevet betragtet som et lovende alternativ til at løse manglen påCistanche deserticolaplantematerialer (Lu og Mei 2003; Ouyang et al. 2003; Cheng et al. 2005a).
Osmotisk stress er en vigtig faktor, der påvirker plantevækst, udvikling, morfogenese og dannelsen af sekundære metabolitter. Forøget produktion af sekundære metabolitter fra in vitro vævskulturer under optimal osmotisk stress er blevet rapporteret i nogle få medicinske plantearter (Kim et al. 2001; Wang et al. 1999; Wu et al. 2005). Saccharose er et sædvanligt osmotisk stressmiddel, der anvendes i disse tilfælde, og tjener også som en vital kulstof- og energikilde. Derfor er det meget vanskeligt at adskille effekten af osmotisk stress og sukkerarters ernæringsmæssige rolle som kulstofkilder. En stigning i initial osmotisk stress med ikke-metabolisk mannitol, sorbitol og PEG forbedrede også paclitaxel-akkumulering i Taxus Chinensis-cellekulturer, saponin- og polysaccharid-akkumulering i Panax notoginseng-cellekulturer og eleutheroside-akkumulering i Eleutherococcus sessili et al. et al. 2001; Shohael et al. 2006). Deres resultater indikerede, at virkningerne af kulhydratkoncentration og osmotisk stress var forskellige alt efter plantearter og sekundære metabolitter.
Formålet med denne undersøgelse er fokuseret på de osmotiske virkninger af saccharose, mannitol, PEG og NaCl på cellevækst og PeGs biosyntese iCistanche deserticolacellesuspensionskulturer. PAL-aktivitet i suspensionskulturerne blev undersøgt under forskellige kombinationer af initiale osmotiske midler, og den mulige mekanisme på forbedret PeGs-akkumulering ved at øge osmotisk stress diskuteres.
Materialer og metoder
Plantematerialer og callus-induktion
Frø afCistanche deserticolaYC Ma blev indsamlet fra ørkenområder i Xinjiang-provinsen i Kina og opbevaret i 4C før brug. Botanisk identitet blev bekræftet ved sammenligning med referencestandarder ved Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, PR China. Frø blev overfladesteriliseret ved at dyppe i 70 procent ethanol i 30 s, derefter nedsænket i en 20 procent vandig opløsning af 5,4 procent natriumhypochlorit i vand i 20 minutter, efterfulgt af tre skylninger med sterilt destilleret vand. Calli blev induceret fra overfladesteriliserede frø afCistanche deserticolapå MS (Murashige og Skoog 1962) medium suppleret med 1.0 mg l-1 naphthaleneddikesyre (NAA), 2.0 mg l-1 6-benzyladenin ({{7} }BA), 0,25 mg l-1 2, 4-dichlorphenoxyeddikesyre (2, 4-D), 6 gl-1 agar (PhytoTechnology LaboratoriesTM, produkt-id: A181) og 30 gl-1 saccharose i 60 dage i et vækstskab i mørke ved 25C. Kalluskulturerne induceret fra frøeksplantaterne blev efterfølgende subdyrket til ovennævnte faste medium med et interval på 30 dage (Cheng et al. 2005a).
Etablering og vedligeholdelse af cellesuspensionskulturer
Suspensionscalluskulturerne (3,0 g frisk vægt), som blev filtreret gennem en 1,000 lm mesh-sigte og tilbageholdt på en 200 lm mesh-sigte, blev subkultureret til en 500-ml Erlenmeyer kolbe indeholdende 100 ml af ovennævnte flydende medium på en roterende ryster ved 110 rpm ved 25°C i mørke med et subkulturinterval på 18 dage. Mediets pH blev justeret til 5,8 med 1 M NaOH eller 1 M HCI før autoklavering. Suspensionscalluskulturerne, der var subdyrket efter ti gange, blev anvendt som inokulum til den følgende eksperimentelle kolbekultur. Alle kolbeeksperimenter blev udført i 250 ml Erlenmeyer-kolber indeholdende 50 ml flydende medium med 30 gl-1 saccharose og inokuleret med 1,5 g frisk vægt af 18-daggamle cellesuspensionskulturer. Disse Erlenmeyer-kolber blev inkuberet på en roterende ryster (110 rpm) ved 25°C i mørke.
Eksperiment med osmotisk stress
At undersøge effekten af initial saccharosekoncentration påcellevækst og PeGs akkumulering,Cistanche deserticolasuspensionskulturer blev dyrket i MS-medium med 87,6,175,3 og 262,9 mM saccharose. Til osmotiske stresstilstande,Cistanche deserticolasuspensionskulturer blev inkuberet i MSmedium indeholdende 87,6 mM saccharose kombineret med164,7 mM mannitol. Andre osmotiske midler (PEG 4,000 ogNaCl) blev tilsat svarende til osmolariteten af87,6 mM saccharose. De osmotiske ækvivalentkoncentrationeraf osmotiske midler blev eksperimentelt bestemt som PEG4,000 på henholdsvis 20 mM og NaCl på 50 mM. Der blev anvendt tredobbelte kolber i alle eksperimenter og alle værdiervar middel af tredobbelte kolber ± SD.
Analyse
Cistanche deserticoladyrkede celler under forskellige osmotisk stress blev observeret med Nikon AFX-DX lysmikroskop (Nikon, Japan) under 400· forstørrelser. Osmolariteten af dyrkningsmediet blev målt med et damptrykosmometer (Fiske One-Ten Osmometer, MA, USA). Til bestemmelse af frisk vægt (FW)Cistanche deserticolaceller blev forsigtigt presset på filterpapir for at fjerne overskydende vand og vejet. Efterfølgende blev cellerne tørret i en ovn ved 60°C i 24 timer, og tørvægten (DW) blev registreret. Restsukkerkoncentrationen blev bestemt ved at anvende phenol og koncentreret svovlsyre under anvendelse af glucose som standard (Dubois et al. 1956).
PeG'er blev ekstraheret fra de tørrede celler med methanol i 15 minutter ved 60C i et ultralydsvandbad (KQ2200, Shanghai Cany Precision Instrument Co., Ltd, Kina) med en frekvens på 40 kHz og en effekt på 100 W. Filtratet blev koncentreret og resten opløst i destilleret vand og derefter passeret gennem en makroretikulær harpikssøjle (AB-8, kemisk produkt fra Nankai University, Tianjin, Kina). Methanoleluatet blev opsamlet, og det totale PeGs-indhold blev analyseret ved 333 nm ved at anvende echinacosid som standard (Du og Liu 1993a; Du et al. 1993b).
Cellelevedygtighed blev estimeret ved reduktion af 2,3,5-triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) (Steponkus og Lanphear 1967). Levedygtighedsindekset er defineret som absorbansen målt pr. gram frisk væv. Bestemmelsen af PAL-aktivitet var baseret på metoden ifølge Koukol og Conn (1961). En enhed af PAL-aktiviteten (U) er defineret som mængden af absorbansvariation på 0.01.
Resultater og diskussion
Effekt af initial saccharosekoncentration på cellevækst og PeGs biosyntese i cellesuspensionskulturer afCistanche deserticola.Svaret afCistanche deserticolacellesuspensionskulturer til initial saccharosekoncentration mellem 87,6 og 262,9 mM blev testet. Som vist i fig. 1 voksede cellerne og akkumulerede PeG'er hurtigt ved en lav initial saccharosekoncentration på 87,6 mm, og cellevæksten og PeGs-akkumulering blev tydeligvis undertrykt ved en høj initial saccharosekoncentration på 262,9 mM. Forholdet mellem frisk vægt og tørvægt faldt, når initial saccharosekoncentration steg fra 87,6 fra 262,9 mM (data ikke vist). Den maksimale tørvægt på 15,9 gl-1 og PeGs-indhold på 20,7 mg g-1-DW blev opnået på dag 30 ved en initial saccharosekoncentration på 175,3 mM, hvoraf osmolariteten var omkring 300 mOsm kg-1. Under mikroskopisk observation blev cellevægge adskilt fra deres cytoplasma ved det højeste osmotisk stress på 388 mOsm kg-1, hvor en initial saccharosekoncentration var 262,9 mM (fig. 2), og den højeste osmotisk stress kunne forstyrre metabolismen af celler og resultere i alvorlig vækstundertrykkelse og fald i PeGs biosyntese. Et lignende fænomen blev også observeret i suspensionskulturer af T. Chinensis suspensionscellekulturer, og den optimale saccharosekoncentration til paclitaxelproduktion var 175,3 mM (Kim et al. 2001). Imidlertid var en initial saccharosekoncentration på 204,5 mM gavnlig for væksten af E. sessiliflorus-cellekulturer. En højere saccharosekoncentration på 262,9 mM forbedrede biosyntesen af eleutherosider, phenol og flavonoider i Eleutherococcus-kulturerne (Shohael et al. 2006). Det er klart, at den initiale saccharosekoncentration er vigtig for væksten og sekundære metabolitters akkumulering af plantecellekulturer, og dens virkning er relateret til en specifik cellelinje.
Effekt af forskellige osmotiske midler på cellevækst og PeGs-biosyntese i cellesuspensionskulturer af C. deserticola
For at forstå den osmotiske rolle af metabolisk saccharose og andre ikke-metaboliske kemiske substrater på PeGs biosyntese i cellesuspensionskulturer afCistanche deserticola, blev en række eksperimenter udført under anvendelse af saccharose kombineret med de ikke-metaboliske osmotiske midler (mannitol, PEG og NaCl). I disse eksperimenter blev 164,7 mM mannitol, 20 mM PEG og 50 mM NaCl tilsat til mediet indeholdende 87,6 mM saccharose og gjorde den initiale osmolaritet omkring 300 mOsm kg-1, hvilket var en ækvivalent osmotisk tilstand sammenlignelig med mediet med 175,3 mM saccharose.
Som vist i fig. 3a, b hæmmede tilsætningen af mannitol (ikke-metabolisk sukkerosmotisk middel) og PEG (ikke-permeabelt osmotisk middel) cellevæksthastigheden en smule, men forbedrede signifikant PeGs-biosyntesen iCistanche deserticolacellesuspensionskulturer. Det maksimale PeGs-indhold på henholdsvis 26,9 og 23,8 mg g-1-DW blev opnået på dag 21, hvor cellerne blev dyrket i kombinationerne af 87,6 mM saccharose med enten 164,7 mM mannitol (303 mOsm kg-1) eller 20 mM PEG (299 mOsm kg–1). PeGs-beløbene var højere end forCistanche deserticolacellekulturer dyrket i MS flydende medium med en initial saccharosekoncentration på 175,3 mM på dag 30. Sukker blev indtaget gradvist i løbet afCistanche deserticolacellekultur, og derefter faldt den sukkerinducerede osmotiske stress tilsvarende (fig. 3c, d). Osmotisk stress af det flydende medium med en initial saccharosekoncentration på 175,3 mM faldt fra 280 til 110 mOsm kg-1, da PeG'er i cellekulturerne begyndte at akkumulere på dag 9 og nåede deres maksimum på dag 30 (data ikke vist). Ikke-metaboliske osmotiske midler (mannitol og PEG) blev ikke forbrugt i løbet af cellekulturen, hvilket gør det muligt at opretholde osmotisk stress af flydende medium mellem 200 og 280 mOsm kg-1, et osmotisk tryk gunstigt for PeGs biosyntese. Disse resultater viste, at osmotisk stress i sig selv spillede en vigtig rolle i forbedringen af PeGs biosyntese iCistanche deserticolacellekulturer.
Tilsætning af NaCl blev rapporteret at forbedre henholdsvis indolalkaloider og saponinbiosyntese i cellekulturer af Catharanthus roseus og Panax ginseng (Smith et al. 1987; Wu et al. 2005), men behandlingen af NaCl undertrykte cellevæksten af T. Chinensis mens den ikke viser nogen forskel i palitaxel-biosyntese (Kim et al. 2001). Derfor er en detaljeret undersøgelse nødvendig for hver enkelt sag. Tilsætningen af en osmotisk ækvivalent af 50 mM NaCl undertrykte cellevækst og PeGs-biosyntese. Dette resultat kan skyldes den permeable natur af NaCl, som ikke er gavnlig for cellekulturerne af denne ørkenplanteart, som kan tolerere tørkestress meget godt.
Fig. 3 Effekt af kombinationerne af saccharose og andre ikke-metaboliske osmotiske midler på cellevækst (a), PeGs-akkumulering (b), sukkerforbrug (c) og osmotisk stressændring (d) i løbet af C. deserticola-cellen kultur. Værdier er middelværdier af tredobbelte kolber ± SD
Effekt af forskellige osmotiske midler på cellelevedygtighed og PAL-aktivitet i cellesuspensionskulturer af Cistanche deserticola
I vores tidligere undersøgelser (Cheng et al. 2005b, 2006) stimulerede elicitortilsætning dramatisk PeGs biosyntese iCistanche deserticolacellekulturer, og stimuleringen var korreleret med øget aktivitet af PAL, det første nøgleenzym i PeGs biosyntese (Hahlbrock og Grisebach 1979). Som vist i fig. 4 reducerede tilsætningen af ikke-metabolisk 164,7 mM mannitol eller 20 mM PEG til MS flydende medium indeholdende 87,6 mM saccharose en smule cellelevedygtighed, men øgede signifikant PAL-aktiviteten, som var højere end den, der var induceret af en initial saccharosekoncentration på 175,3 mM. Den forbedrede PeGs-akkumulering iCistanche deserticolacellesuspensionskulturer var relateret til stigningen i PAL-aktivitet stimuleret af osmotisk stress selv. En initial saccharosekoncentration på 175,3 mM i MS flydende medium forårsagede et fald i cellelevedygtighed på 15 dage og hæmmede PAL-aktivitet på 21 dage. Efter en periode med sukkerforbrug af de voksendeCistanche deserticolacellekulturer, steg både cellelevedygtighed og PAL-aktivitet af de dyrkede celler og nåede deres maksimum på henholdsvis dag 24 og dag 30. Forbedret PAL-aktivitet ved osmotisk stress blev også observeret for at forbedre saponinbiosyntesen i P. ginseng-cellekulturer og alkaloidakkumulering i C. roseus-dyrkede celler (Godoy-Hernandez et al. 2000; Wu et al. 2005). Imidlertid reducerede tilsætningen af permeabelt NaCl til MS flydende medium indeholdende 87,6 mM saccharose cellelevedygtighed og inhiberede PAL-aktivitet under hele dyrkningsperioden. Som et resultat blev både cellevækst og PeGs-biosyntese åbenlyst undertrykt.
Fig. 4 Variation af cellelevedygtighed (a) og PAL-aktivitet (b) i C. deserticola-cellekulturer under forskellig osmotisk stress i løbet afCistanche deserticolacellekultur. Værdier er middelværdier af tredobbelte kolber ± SD
Cistanche deserticolaer en ørkenart og undersøgelse af en ørkenart in vitro cellekulturer gav nye udfordringer og muligheder for at forstå plantefysiologi og økologiske tilpasninger. I denne undersøgelse udviklede vi et system med potentiale til at studere en osmotisk stress-medieret signaltransduktionsbiosyntesevej, og systemet gav grundlaget for storskala produktion af PeG'er ved hjælp afCistanche deserticolacellekulturer gennem en ny osmotisk stress-reguleret strategi.
Anerkendelser
Forfatterne anerkender den økonomiske støtte fra det kinesiske videnskabsakademis innovationsforskningsprogram.
Fra: 'Forbedring af phenylethanoid glycosider biosyntese i cellekulturer af Cistanche deserticola ved osmotisk stress' af Chun-Zhao Liu. Xi-Yu Cheng
---Plant Cell Rep (2008) 27:357-362 DOI 10.1007/s00299-007-0443-3
Referencer
Cheng XY, Wei T, Guo B, Ni W, Liu CZ (2005a)Cistanche deserticolacellesuspensionskulturer: Phenylethanoid glycosider biosyntese og antioxidant aktivitet. Process Biochem 40:3119-3124
Cheng XY, Guo B, Zhou HY, Ni W, Liu CZ (2005b) Gentagen fremkaldelse øger akkumulering af phenylethanoidglycosider i cellesuspensionskulturer afCistanche deserticola. Biochem Eng J 24:203-207
Cheng XY, Zhou HY, Cui X, Ni W, Liu CZ (2006) Forbedring af phenylethanoid glycosider biosyntese i Cistanche deserticola cellesuspension kulturer af chitosan elicitor. J Biotech 121:253-260
Du NS, Liu JL (1993a) Bestemmelse af phenylethanoidglykosider iCistanche deserticolaved makroretikulær harpiksspektrofotometri. Nat Prod Res Dev 5:30–33
Du NS, Wang H, Yi YH (1993b) Isolering og identifikation af phenylethanoidglykosider fraCistanche deserticola. Nat Prod Res Dev 5:5–8
Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK (1956) Kolorimetriske metoder til bestemmelse af sukker og beslægtede stoffer. Anal Chem 28:350-357
Godoy-Hernandez GC, Vazquez-Flota FA, Loyola-Vargas VM (2000) Eksponeringen for trans-kanelsyre af osmotisk stressede Catharanthus roseus-celler dyrket i en 14-l bioreaktor øger alkaloidakkumulering. Biotechnol Lett 22:921-925
Hahlbrock K, Grisebach H (1979) Enzymiske kontroller i biosyntesen af ligin og flavonoider. Ann Rev Plant Physiol 30:105-130
Kim SI, Choi HK, Kim JH (2001) Effekt af osmotisk tryk på paclitaxelproduktion i suspensionscellekulturer af Taxus Chinensis. Enzyme Microb Tech 28:202-209
Koukol J, Conn EE (1961) Metabolismen af aromatiske og egenskaber af phenylalanin deaminase af Hordeum vulgare. J Biol Chem. 236:2692-2698
Lu MC (1998) Undersøgelser om den beroligende effekt afCistanche deserticola.J Ethnopharmacol 59:161-165
Lu CT, Mei XG (2003) Forbedring af phenylethanoid glycosider produktion af en svampe-elicitor i cellesuspension kultur afCistanche deserticola. Biotechnol Lett 25:1437-1439
Murashige T, Skoog F (1962) Et revideret medium til hurtig vækst og bioassays med tobaksvævskulturer. Plant Physiol 15:473-497
Ouyang J, Wang XD, Zhao B, Yuan XF, Wang YC (2003) Virkning af sjældne jordarters grundstoffer på væksten afCistanche deserticolaceller og produktionen af phenylethanoid glycosider. J Biotechnol 102:129-134
Shohael AM, Hakrabarty D, Ali MB, Yu KW, Hahn EJ, Lee HL, Paek KY (2006) Forbedring af eleutherosideproduktion i embryogene kulturer af Eleutherococcus sessiliflorus som reaktion på saccharose-induceret osmotisk stress. Process Biochem 41:512-518
Smith JL, Smart NJ, Kurd WGW, Misawa M (1987) Brugen af organiske og uorganiske forbindelser til at øge akkumuleringen af indolalkaloider i Catharanthus roseus (L.) Don-cellesuspensionskulturer. J Exp Bot 38:1507-1511
Steponkus PL, Lanphear FO (1967) Forfining af triphenyltetrazoliumchloridmetoden til bestemmelse af kuldeskade. Plant Physiol 42:1423-1426 Wang HQ, Wu JT, Zhong JJ (1999) Betydelig forbedring af taxanproduktion i suspensionskulturer af Taxus Chinensis ved saccharosefodringsstrategi. Process Biochem 35:479-483
Wang XW, Jiang XY, Wu LY, Wang XF (2001) Scavenging effekt af glykosider afCistanche deserticolaom frie radikaler og dets beskyttelse mod OH-induceret DNA-skade in vitro. Chin Pharm J 36:29-31
Wu JY, Wong K, Ho KP, Zhou LG (2005) Forbedring af saponinproduktion i Panax ginseng cellekultur ved osmotisk stress og næringsstoffodring. Enzyme Microb Technol 36:133-138
Zhang YH, Zhong JJ, Yu JT (1995) Effekt af osmotisk tryk på cellevækst og produktion af ginsengsaponin og polysaccharid i suspensionskulturer af Panax Notoginseng. Biotechnol Lett 17:1347-1350
Zong GZ, He W, Wu GL, Chen LH (1996) Sammenligninger mellemCistanche deserticolaYC Ma og Cistanche tubulosa (Scheak) Udviser nogle farmakologiske aktiviteter. Tradit Chin Med J 21:436–438
