Effekter af flavonoider på huden i henhold til deres strukturelle egenskaber: en gennemgang

Venligst kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mere information

Abstrakt:Baggrund: Under myokardieinfarkt (MI) går milliarder af kardiomyocytter tabt. Den optimale terapi bør effektivt erstatte beskadigede kardiomyocytter, muligvis med stamceller, der er i stand til at indpode og differentiere til voksne funktionelle kardiomyocytter. Som sådan er cardiac atrial appendage stamceller (CASC'er) egnede kandidater. Imidlertid kan tilstedeværelsen af ​​forhøjede niveauer af avancerede glycation slutprodukter (AGE'er) i hjerteregioner, hvor CASC'er transplanteres, påvirke deres regenerative potentiale. I denne undersøgelse undersøger vi, om og hvordan AGEs ændrer CASCs egenskaber in vitro. Metoder og resultater: CASC'er i kultur blev udsat for varierende AGEs koncentrationer (50 ug/mL til 400 ug/mL). CASCs overlevelse, spredning og migrationskapacitet blev signifikant reduceret efter 72 timers eksponering for AGE. Apoptose steg signifikant med stigende AGEs koncentration. De skadelige virkninger af disse AGE'er blev delvist afstumpede ved præ-inkubation med en receptor for AGE'er (RAGE) inhibitor (25μM FPS-ZM1), hvilket indikerer involvering af RAGE i de observerede negative effekter. Konklusion: AGE'er har en tids- og koncentrationsafhængig negativ effekt på CASC's overlevelse, proliferation, migration og apoptose in vitro, delvist medieret gennem RAGE-aktivering. Hvorvidt anti-AGE-terapier er en effektiv behandling i forbindelse med stamcelleterapi efter MI, kræver yderligere undersøgelse.

Nøgleord:stamceller; aldehyddehydrogenase; CASC'er; glycerede proteiner; avancerede glycation slutprodukter; spredning; apoptose; migration; RAGE hæmning

1. Introduktion

Koronar hjertesygdom (CHD) er fortsat den førende årsag til dødelighed og sygelighed på verdensplan, hvor myokardieinfarkt (MI) er den mest almindelige form for CHD [1]. MI skyldes fuldstændig eller delvis okklusion af en kranspulsåre. I det iskæmiske område er ilt og næringsstoffer begrænset, hvilket resulterer i myokardiecelledød. Infarktstørrelsen afhænger af flere faktorer, såsom størrelsen af ​​det iskæmiske område i risikozonen, placeringen og varigheden af ​​koronar okklusion og mængden af ​​resterende kollateral blodgennemstrømning[1,2]. Da voksne kardiomyocytter har minimale regenerative egenskaber, forbliver iboende reparation af det beskadigede væv uhåndgribelig. At finde en terapeutisk tilgang, der effektivt erstatter myokardiear med funktionelt kontraktilt væv, er den eneste mulighed for at genvinde tabt hjertevæv.hvor meget cistanche at tageEn stor forskningsindsats er blevet brugt på at optrevle det terapeutiske potentiale og mekanismerne ved celleterapi med knoglemarvsceller (BMC'er). Knoglemarv indeholder hæmatopoietiske stamceller (HSC'er), endotheliale progenitorceller (EPC'er) og mesenkymale stamceller (MSC'er)[3]. Kliniske forsøg med mononukleære BMC'er og MSC'er leverede ikke signifikante forbedringer i post-MI hjertefunktion. Da mononukleære BMC'er og MSC'er ikke differentierer til kardiomyocytter, kan de observerede begrænsede forbedringer sandsynligvis tilskrives parakrine mekanismer[4,5]. For at forbedre post-MI-hjertefunktionen markant flyttede forskningens fokus mod residente hjertestamceller (CSC'er) såsom c-kit plus , Sca-1 plus , Isl-1 plus -celler og kardiosfærer, som sandsynligvis vil blive forprogrammeret til at blive kardiomyocytter. Alligevel er deres succes med hjerteregenerering ringe [6].

klik venligst her for at vide mere

I de sidste år har vores forskergruppe opdaget en ny type hjertestamceller ved navn 'cardiac atrial stamceller' (CASC'er). I modsætning til andre stamceller viser CASC'er ekstraordinære kardiomyogene differentieringsegenskaber, hvilket gør dem til en lovende kandidat til hjerteregenerering [4]. Isolering af denne stamcellepopulation fra atrielle vedhæng er baseret på høj aldehyddehydrogenase (ALDH) aktivitet. Høj ALDH-aktivitet blev også rapporteret i andre stamcelletyper, såsom MSC'er, HSC'er og neurale og cancerstamceller blandt andre[7-9]. Da ALDH har vist sig at være kardiobeskyttende og fremmer celleoverlevelse under stresstilstande, kan det i denne sammenhæng være gavnligt at bruge en ALDH plus stamcellepopulation under iskæmiske tilstande [4,10]. CASC'er kan udvides op til klinisk relevante tal uden at miste fundamentale egenskaber, såsom ALDH-aktivitet, overfladeantigenprofil og kardiomyogen differentieringskapacitet [11]. Dette givet er afgørende for oversættelsen af ​​denne terapeutiske tilgang til klinikken. Derudover har vi vist, at autolog CASC'er-transplantation resulterer i forbedret venstre ventrikelfunktion, som følge af tilstrækkelig stamcelle-engraftment og yderligere CASC'er-differentiering [4,12].

Hos MI-patienter er niveauer af avancerede glycation-slutprodukter (AGE'er) forhøjede [13]AGE'er er proteiner og/eller lipider, der er irreversibelt beskadiget af glycation, en proces, hvor reducerende sukkerarter reagerer ikke-enzymatisk med aminogrupper i lipider eller proteiner . Udover glycation fører oxidativt stress også til AGE-dannelse gennem oxidation af proteiner og/eller lipider [14]. AGE'er dannes endogent og akkumuleres naturligt i kroppen med ældning eller i patologiske situationer såsom MI, når niveauet af oxidativt stress øges [15-17].hvad er en cistancheDesuden har tidligere forskning vist, at AGE'er påvirker forskellige typer stamceller in vitro [18-20]. Stamcellernes kapacitet til at proliferere reduceres af AGE'er, og den apoptotiske hastighed øges ved AGE's påføring. Disse effekter kan udføres gennem flere mekanismer, herunder aktivering af den apoptotiske vej, RAGE eller overdreven ROS-dannelse [20]. Hvorvidt AGE'er også påvirker CASCs egenskaber er stadig ukendt. Disse resultater rejser spørgsmålet om, hvorvidt AGE'er negativt kan påvirke den terapeutiske effektivitet af CASC'er, som bruges som behandling for MI. Formålet med denne undersøgelse er derfor at undersøge in vitro-effekterne af AGE'er og den potentielle aktivering af dens receptor RAGE på proliferation, overlevelse og migration af CASCS.

2. Materialer og metoder

2.1. Dyreforsøg

Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med EU-direktivet 2010/63/EU for dyreforsøg og godkendt af den lokale etiske komité for dyreforsøg (UHasselt, Belgien, Diepenbeek; ID 201919K). Alle dyr blev holdt i et temperaturkontrolleret miljø (21 grader ,60 procent luftfugtighed) med en 12 timers-12t lys-mørke cyklus. De blev fodret med en standard pelletdiæt med vand tilgængeligt ad libitum. I alt blev 62 Sprague-Dawley hunrotter (Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, Frankrig) brugt.

2.2. Rotte CASC'er Isolering og udvidelse

CASC'er blev høstet fra de højre atrielle vedhæng, som beskrevet før [4] Kort fortalt blev rotter injiceret med heparin (1000 enheder/kg, intraperitonealt (ip) og blev aflivet med en overdosis af natriumpentobarbital (Dolethal, Vetoquinol, Aartselar Belgium, 200 mg/kg, ip). Hjerter blev høstet, perfunderet med en normal Tyrode-opløsning (137mMNaCl, 5,4 mMKCl, 0,5 mMMgClz, 1 mMCaClz, 11,8 mMNa-HEPES, 11,8 mMNa-HEPES, camg0m, taurse, ,pH7,4), og de højre atrielle vedhæng blev opsamlet. Det ekstraherede højre atrielle vedhængsvæv blev hakket i stykker på ~1 mm³, vasket med phosphatbufret saltvand (PBS) og enzymatisk dissocieret i 30 minutter i Hank's Balanced Salt Solution indeholdende 0,6 WU/ml collagenase NB 4 (Serva, Heidelberg, Tyskland) og 20 mM Carly.bioflavonoiderALDHt-celler blev farvet ifølge Aldefluor-kittet (STEMCELL Technologies, Evergem, Belgien). ALDHt-celler blev defineret som CASC'er og blev flowsorteret (BD FACS Aria) i X-VIVO 15-medier (Lonza, Basel, Schweiz) suppleret med 20 procent føtalt kalveserum (FCS) og 2 procent penicillin/streptomycin (P/S) . Isolerede CASC'er blev podet i 6-brøndsplader med en tæthed på 60,000 celler pr. brønd og inkuberet ved 37 grader i en fugtig inkubator med en 5 procent CO2-atmosfære. Mediet blev skiftet hver 2. til 3. dag. Da CASC'er nåede 80 procent sammenløb, blev de høstet ved hjælp af trypsin. Til alle eksperimenter blev passage 1 CASC'er brugt.

Cistanche kan anti-aging

2.3.ALDER Forberedelse

AGE'er blev fremstillet som tidligere beskrevet [21]. Kort fortalt blev bovint serumalbumin (BSA; 7 mg/ml) inkuberet med glycolaldehyd-dimerer (90 mM; Sigma-Aldrich, Diegem, Belgien) i steril PBS (pH 7,4) i 5 dage ved 37 grader. Denne opløsning blev dialyseret mod PBS, to gange i 2 timer og natten over ved 4 grader for at fjerne uomsat glycolaldehyd (3,4 kDa cut-off. AGE'er blev filtreret (0,2 um filter, Sarstedt, Antwerpen, Belgien). BSA inkuberet i PBS (7mg/ml) ) blev brugt som kontrolopløsning.

2.4.Sprednings- og overlevelsesassay

Proliferations- og overlevelsesassays blev udført med et propidiumiodid (PI) assay som beskrevet tidligere af Gervois et al. og Lo Monaco et al.[22,23]. Kort fortalt blev CASC'er podet i en 96-brøndplade i X-VIVO-medium med 10 procent FCS og 2 procent P/S. Til proliferationsassays blev 5000 celler pr. brønd podet. Til overlevelsesassays blev 100 celler pr. brønd podet. Efter 24 timer blev der tilsat fem forskellige betingelser til mediet: 400 ug/ml BSA, 50 ug/ml, 100 ug/ml, 200 ug/ml og 400 ug/mL AGE. For at måle spredning blev BSA eller AGE'er tilsat til X-VIVO medium med 2 procent FCS og 2 procent P/S.køb cistancheFor at måle overlevelse blev BSA eller AGE'er tilføjet til X-VIVO medium med 0 procent FCS og 2 procent P/S. Efter tre forskellige tidspunkter (24, 48 og 72 timer) blev mediet erstattet med lyseringsbuffer A100 (ChemoMetec, Kaiserslautern, Tyskland), efterfulgt af en tilsvarende mængde stabiliseringsbuffer B (ChemoMetec) suppleret med PI (10 ug/ ml, Sigma). Efter en inkubationsperiode på 15 minutter i mørke blev fluorescens målt ved hjælp af Fluostar Optima-pladelæseren (BMG Labtech, Ortenberg, Tyskland) ved en excitation på 540 nm, emissionsbølgelængde på 612 nm og en forstærkning på 2000. Der blev udført eksperimenter. i tre eksemplarer. Data blev normaliseret til data opnået med 400 ug/mL BSA.

2.5. Migrationsanalyse

CASC'er blev podet i en {{0}}brøndplade med en tæthed på 5000 celler pr. brønd i X-VIVO-medium med 10 procent FCS og 2 procent P/S. Fem betingelser blev tilsat til mediet: 400 ug/ml BSA, 50 ug/ml, 100 ug/ml, 200 ug/ml og 400 ug/ml AGE. Efter en inkubationsperiode på 72 timer blev de konditionerede CASC'er høstet under anvendelse af trypsin og brugt til et transwell-migrationsassay. I ThinCerts (Greiner Bio-One, Vilvoorde, Belgien) med en porøs membran på 8 um porestørrelse blev 100.000 celler pr. betingelse podet i X-VIVO medium med 0 procent FCS og 2 procent P/S. ThinCerts blev placeret på 24-brøndsplader indeholdende X-VIVO medium med 2 procent FCS og 2 procent P/S. Efter 24 timers migration blev ThinCerts fikseret med 4 procent paraformaldehyd (PFA) i 15 minutter og inkuberet med 0,1 procent krystalviolet i 30 min. Celler, der ikke migrerede, blev fjernet på toppen af ​​ThinCerts, hvorefter mængden af ​​transmigrerede CASC'er blev kvantificeret med AxioVision 4.6-software (Carl Zeiss, Zaventem, Belgien). Data blev normaliseret til data opnået med 400 ug/mL BSA.

2.6. Apoptoseanalyse

CASC'er blev podet i en 96-brøndplade med en tæthed på 10,00 celler pr. brønd i X-VIVO-medium med 2 procent FCS og 2 procent P/S. For at studere apoptose blev der udført en caspase-analyse under anvendelse af IncuCyte8 Caspase-3/7 Green Apoptosis Assay Reagent (fortyndet 1/100, Sartorius, Schaarbeek, Belgien). Fem betingelser blev tilsat til mediet: 400 ug/mL BSA, 50 ug/ml, 100 ug/ml, 200 ug/mL og 400 ug/mL AGEs.CASCs dyrket i X-VIVO medium uden FCS og 2 procent P/ S blev brugt som en positiv kontrol. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer. Billeder blev taget efter 24, 48 og 72 timers inkubation ved hjælp af IncuCyte@S3Live-Cell Analysis System (Sartorius, Schaarbeek, Belgien). Analyse af området besat af apoptotiske celler blev udført under anvendelse af IncuCyte* SX1 Live-Cell Analysis System (Sartorius, Schaarbeek, Belgien). Data blev normaliseret til den positive kontrol (plus X-VIVO medium uden FCS).

2.7. In vitro RAGE-hæmning

RAGE blev hæmmet for at vurdere bidraget af RAGE-aktivering i proliferation, overlevelse og migration af CASC'er. Kort fortalt blev CASC'er præ-inkuberet ved 37 grader i en 5 procent CO2-inkubator med RAGE-antagonisten FPS-ZM1 (10 og 25 uM, Calbiochem/Merck, Overijse, Belgien). Efter 2 timers præ-inkubation blev 400 ug/ml AGEs tilsat.cistanche AustralienEfter 24 48 og 72 timer blev proliferation og overlevelse evalueret som beskrevet ovenfor. Efter 72 timers inkubation blev prækonditionerede CASC'er høstet og brugt til et transwell migrationsassay som beskrevet ovenfor.

2.8.Statistik

Statistiske analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Prism 9.0.0 software.cistanchDen normale fordeling af data blev vurderet med Shapiro-Wilk-testen. Normalfordelte data blev underkastet en envejs ANOVA-test med gentagne målinger, efterfulgt af Holm-Sidaks Multiple Comparison-test. Når data ikke var normalfordelt, blev den ikke-parametriske Friedman-test brugt efterfulgt af Dunns Multiple Comparison-test. Alle data er udtrykt som middelværdi ± standardfejl af middelværdien (SEM). En værdi på p<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Resultater

3.1. AGEs eksponering påvirker negativt CASCs spredning og overlevelse

Som vist i figur 1 reducerede AGE'er signifikant og gradvist CASC-sproliferation over tid. Den negative indvirkning af AGE'er på CASC's spredning var også koncentrationsafhængig. Efter 72 timer reducerede koncentrationer på 100 ug/mL, 200 ug/mL og 400 ug/mL AGE signifikant CASC-proliferation sammenlignet med BSA (Figur 1C; 80 procent ±7n100ug/ml,74 procent ±3in 200 ug/mL og 65 procent ±4 i 400 ug/mL AGE'er). Anvendelsen af ​​BSA alene påvirkede ikke den proliferative kapacitet af CASC'er (figur Sl i supplerende materialer). Som vist i figur 2 påvirkede stigende koncentrationer af AGE'er negativt CASC's overlevelse i tid. Signifikante virkninger af AGE'er blev observeret efter 48 (Figur 2B) og 72 timer (Figur 2C; 85 procent ±3 i 100 ug/ml, 73 procent ±3 i 200 ug/mL og 64 procent ±4 i 400 ug/mL AGE'er) Anvendelsen af ​​BSA alene påvirkede ikke overlevelseskapaciteten for CASC'er (figur S1).

3.2. Øgede AGEs koncentrationer Øger CASCs Apoptose

For at belyse effekten af ​​forskellige AGEs-koncentrationer (50,100,20 og 400 ug/mL) på CASCs apoptose blev der udført et caspaseassay. Procentdelen af ​​celler, der udtrykker caspase 3/7, blev målt på forskellige tidspunkter: 24 (figur 3A), 48 (figur 3B) og 72 (figur 3C) h. Den apoptotiske hastighed steg gradvist over tid med øgede AGEs-koncentrationer (figur 3C, 72h; 77 procent ±17 i 400 ug/mL AGEs vs. 18 procent ±3 i BSA).

3.3.AGEs eksponering reducerer CASCs migrationskapacitet

CASCs migrationskapacitet blev evalueret med en transwell migration assay efter 72 timers inkubation med forskellige koncentrationer af AGE'er. I figur 4-E er repræsentative eksempler på CASCs-migrering efter inkubation med BSA og forskellige AGE-koncentrationer (50, 100, 200 og 400 ug/ml) vist. Kvantificeringen af ​​migration er vist i figur 4F. Sammenlignet med BSA blev der observeret en signifikant reduktion i migration, når CASC'er blev inkuberet med 400 ug/mL AGE'er (Figur 4E, F; 75 procent ±5 i 400 ug/mL AGE'er).

3.4. Skadelige virkninger af AGE'er i CASC'er medieres af RAGE-aktivering

For at evaluere bidraget af RAGE-aktivering i de observerede skadelige virkninger af AGE'er, blev proliferation, overlevelse og migration af CASC'er vurderet efter inkubationen med RAGE-antagonisten FPS-ZM1. Før eksponering for 400 ug/mL AGE'er blev CASC'er præ-inkuberet i 2 timer med 10 eller 25 µM FPS-ZM1. Anvendelse af FPS-ZMl alene (10 og 25 uM) påvirkede ikke den proliferative kapacitet eller overlevelsen af ​​CASC'er (figur S2). CASCs spredning (figur 5A-C) blev evalueret efter 24(A), 48(B) og 72(C)h. Som vist i figur 1 er den negative indvirkning på CASC'er-proliferation af AGE'er signifikant sløvet efter præ-inkubation med 25 uM FPS-ZM1 (figur 5A-C). Efter 24 og 48 timer var CASCs proliferation signifikant forbedret med 400 ug/mL AGEs eksponering (24 timer, figur 5A; 104 procent 士8 i 25 μM FPS-ZM1 vs. 79 procent ±5 i 400 ug/mL; 48h, figur 5B;95 procent ±5 tommer 25 μM FPS-ZM1 vs. 70 procent ±4 tommer 400 ug/mL AGE). Efter 72 timer blev den samme tendens observeret. Proliferation havde en tendens til at blive bedre, når RAGE blev hæmmet (Figur;80 procent ±8in25μMFPS-ZM1 vs.67 procent ±5in 400 ug/mL AGE'er,p=0.06). Overlevelse (figur 6A-C) blev evalueret efter 24(A), 48(B) og 72(C)t. Den negative indvirkning på CASC'ers overlevelse ved AGE'er (figur 2) er signifikant forbedret efter præ-inkubation med 25 uM FPS-ZM1 (figur 6A-C). ZM1 vs. 91 procent ±4 i 400 ug/mL AGE'er). Denne tendens blev også observeret efter 48 timer (Figur 6B; 91 procent ±5 i 25 μM FPS-ZM1 vs. 81 procent ±5 i 400 ug/ml AGES,p =0.07). Repræsentative eksempler på CASCs migration efter 72 timers inkubation med 400 ug/mL AGEs og FPS-ZMl er vist i figur og kvantificeret i figur. CASCs præ-inkubation med 25 uM FPS-ZMI kunne forhindre den reducerede CASCs migrationskapacitet observeret med AGEs eksponering ( Figur 7B;98 procent ±6 i 25 uM FPS-ZM1 vs. 7 procent ±8 i 400 ug/mL AGE'er, p=0.07）.

4. Diskussion

Vores undersøgelse er den første til at vise, at AGE'er påvirker CASCs egenskaber, nemlig overlevelse, spredning, migration og apoptose in vitro. Vores data viser, at disse virkninger er delvist medieret gennem RAGE-aktivering på en dosisafhængig måde.

4.1. AGE'ers rolle i MI

Cirkulatoriske AGEs niveauer er signifikant forhøjede hos patienter med akut MI [24,25] Hvordan de er involveret i patofysiologien af ​​MI er dog stadig uklart. Reaktive oxygenarter (ROS) er de vigtigste bidragydere involveret i syntesen af ​​AGE'er. Oxidativ stress kan inducere dannelsen af ​​reaktive carbonylforbindelser og glycoxidation af Amadori-produkter i Maillard-reaktionen. Som sådan dannes AGE'er irreversibelt og akkumuleres i hjertet efter MI og menes at potentielt yderligere forværre den ugunstige hjertefænotype [26,27]. Derudover er neutrofiler og aktiverede makrofager, involveret i den inflammatoriske proces i MI, væsentlige bidragydere til AGEs syntese[28,29]. Disse immunceller udskiller AGE'er og er rapporteret som nøgleinducere af AGE'er-dannelse i MI. 4.2. Fysiologisk relevans af AGEs-koncentrationer

I vores undersøgelse testede vi en bred vifte af AGEs-koncentrationer (50 til 400 ug/mL) AGEs-koncentrationen, der blev brugt i andre in vitro-undersøgelser, der undersøger effekten af ​​AGEs på stamceller, varierer fra 15 til 500 ug/mL 【20】. Der er betydelig variation af anvendte koncentrationer, men højere AGE-niveauer afspejler generelt de fysiologiske plasmaniveauer fundet hos patienter, der lider af flere sygdomme. Faktisk har AGEs-albuminkoncentrationen hos diabetespatienter vist sig at variere fra 50 op til 400 ug/mL[30]. AGEs niveauer kan stige til koncentrationer op til 200 ug/ml hos patienter, der lider af hjerte-kar-sygdomme [31,32]. Hos patienter med tidligt stadie af Alzheimers sygdom er lavere AGEs-koncentrationer i nanoskalaområdet også rapporteret [33]. På grund af de forskellige analytiske metoder, der bruges til at måle AGE'er, og heterogeniteten af ​​forskellige typer AGE'er, forbliver estimering af pålidelige AGE'er-koncentrationer in vivo teknisk udfordrende og er sandsynligvis en undervurdering [34].

4.3.AGE'er har en negativ indvirkning på CASC's egenskaber

Selvom CASC-transplantation viser et lovende potentiale for hjerteregenerering efter MI, er cellernes overlevelse og regenerative kapacitet stadig et problem. Iskæmiske områder er kendt for at være et fjendtligt miljø med øgede niveauer af oxidativt stress, inflammation og fibrose kombineret med øgede AGEs-vævsniveauer. Hvorvidt AGE'er ville påvirke den regenerative kapacitet af CASC'er var ukendt, men kunne være vigtig viden i forbindelse med hjerteregenerering og de lovende regenerative kapaciteter af CASC'er[12]. I vores undersøgelse viser vi, at AGE'er hæmmer CASC's overlevelse, proliferation og migration in vitro, på en koncentrations- og tidsafhængig måde. Ydermere fører eksponering for AGEs til en gradvis stigning i CASCs apoptose. Vores data er i overensstemmelse med undersøgelser, der undersøger effekten af ​​AGE'er på flere typer af andre stamceller, hvor den proliferative kapacitet er ændret og apoptose øges [20]. Faktisk påviste Zhu et al. et signifikant fald i EPC-proliferation efter eksponering for forskellige koncentrationer af AGE'er[16]. Den samme effekt blev evalueret af Sun et al. også i EPC'er, hvor en stigning i apoptotisk hastighed blev medieret af p38 MAPK pathway aktivering [35]. NSC'er udsat for AGE'er resulterede i en dosisafhængig reduktion af stamcelleproliferation, medieret via PPARy-vejen [36]. I fedtvævs-afledte stamceller (ADSC'er) fører en stigning i caspase 3-aktivering til en øget apoptotisk hastighed [37]. Yang et al. rapporterede lavere sprednings- og migrationskapaciteter i MSC'er på en AGEs koncentrationsafhængig måde. Denne effekt blev medieret via overdreven ROS-produktion[18]. Hvorvidt de skadelige virkninger på CASC'er, en meget anderledes stamcellepopulation af hjerteoprindelse, også medieres gennem overdreven ROS-produktion, skal stadig afgøres.

Det er blevet vist, at de underliggende mekanismer, hvor AGE'er udfører deres negative virkninger på organfunktionen, er afhængige og/eller uafhængige af RAGE-receptoraktivering [15]. Undersøgelser i mange stamcelletyper viser, at AGE'er medierer deres virkninger hovedsageligt gennem aktivering af RAGE eller andre apoptotiske veje[20]. RAGE-aktivering af AGE'er forårsager aktivering af MAPK, hvilket fører til phosphorylering af JNK og p38] Disse phosphorylerede proteiner øger transkriptionen af ​​forskellige pro-apoptotiske transkriptionsfaktorer i kernen, hvilket fører til en stigning i apoptose. Udover det kan caspase-veje aktiveres, hvilket forårsager AGEs-induceret apoptose[39]. Opfølgningsundersøgelser er stadig nødvendige for at afdække de molekylære mekanismer, hvorved nedstrømseffekterne af AGE'er induceres i CASC'er. Vi har imidlertid vist, at efter RAGE-blokering af FPS-ZM1 blev de observerede virkninger af AGE'er på CASC'er sløvede. Derfor indikerer vores data stærkt, at AGE'er medierer deres virkninger på CASC'er sandsynligvis gennem binding og aktivering af RAGE. Hvorvidt Jak/STAT, PI3K/Akt, MAPK, overdreven ROS-produktion eller andre signalveje er involveret, skal endnu identificeres. Vores data er også i overensstemmelse med arbejdet beskrevet af Zhang et al., hvor FPS-ZMl også vendte de negative virkninger af AGE'er i ADSC'er ved at blokere RAGE, hvilket yderligere bekræfter RAGE-aktiveringens vigtige rolle som mediator af de skadelige virkninger forårsaget af ALDER[40].

4.4. Fremtidsperspektiver for anti-AGEs terapier for hjerte-kar-sygdomme og nuværende begrænsninger

In vivo bekræftelse af brugen af ​​anti-AGEs terapier og deres potentielle merværdi til stamcelletransplantation efter MI skal bekræftes i en dyremodel, før dette kan oversættes til klinikken. Det er blevet vist i flere in vitro undersøgelser, at PPARy-hæmmeren rosiglitazon [41,42], MAPK-hæmmere [18,35,43] eller antioxidanter [4] kan svække de AGEs-medierede virkninger på stamceller. Deres indflydelse in vivo som en terapeutisk intervention i kombination med stamcelletransplantation er dog aldrig blevet behandlet hidtil. Der er flere strategier til at sænke AGEs niveauer i kroppen. Pyridoxamin (PM) er en hæmmer af AGEs-dannelse ved at reducere Amadori-til-AGEs-omdannelsen og fjerne carbonylforbindelser. Effekten såvel som sikkerheden af ​​PM-behandling er blevet påvist i kliniske forsøg med diabetespatienter [45]. Et klinisk forsøg med NephroGenex i 2014, der testede Pyridorin[(dvs. PM) som en antidiabetisk behandling, blev imidlertid stoppet på grund af økonomiske problemer [46]. Ingen andre kliniske forsøg undersøger i øjeblikket PM som terapi. Inhibering af AGEs-dannelse med PM kunne imidlertid være en strategi til at forbedre stamcellepotentialet til hjerteregenerative formål. Derudover kan andre hæmmere af AGEs-dannelse, såsom aminoguanidin, bruges i fremtiden til at sænke AGEs-niveauer efter MI. ACTION II kliniske forsøg viste effektiviteten af ​​aminoguanidin hos diabetespatienter. Mens aminoguanidin ikke signifikant reducerede det primære endepunkt med at fordoble tiden til at nå maksimale serumkreatininniveauer hos disse patienter, blev der vist andre klinisk vigtige virkninger på komplikationerne ved diabetes, såsom reduktion i proteinuri og kredsløbslipidkoncentrationer. Men på grund af reversible bivirkninger såsom induktion af autoantistoffer, influenzalignende symptomer og anæmi, blev dette forsøg afsluttet, og oversættelse til klinikken er fortsat begrænset [47,48]. Derudover kan brug af antioxidanter såsom N-acetyl-L-cystein (NAC) eller glutathion som et supplement til vores kost give nogle gavnlige resultater for stamcelleterapi, da de øger genomisk stabilitet, forbedrer adhæsion og stimulerer stamcelleproliferation [ 49]. Imidlertid adskiller cellespecifikke handlinger sig mellem stamcelletyper, og dosis-respons kliniske forsøg er nødvendige for at evaluere deres terapeutiske effekt, når de anvendes i kombination med stamcelletransplantation. En anden mulighed er at nedbryde AGE'er med ALT-71-terapi. ALT-711 er i stand til at spalte carbon-carbon-bindinger mellem carbonyler og derved bryde tværbindinger i AGEs-molekyler. Adskillige kliniske forsøg kunne dog ikke bekræfte de gavnlige virkninger af ALT-711 observeret i dyreforsøg. Desuden kan inhibitorer af RAGE (som FPS-ZM1) eller inhibitorer af nedstrøms molekyler i RAGE-vejen interferere i AGEs/RAGE-cellesignalaksen og derved blokere AGEs-medierede effekter i stamceller. Effektiviteten af ​​forskellige typer af små molekyler og inhibitorer til at blokere AGE'er i stamceller er blevet påvist i flere in vitro eksperimenter [18,35,44], men er aldrig blevet testet før i dyremodeller. Derfor kan vi kun antage, at disse inhibitorer er effektive til at blokere AGE'er i en in vivo-situation, men der er behov for proof-concept-eksperimenter. Endelig er en anden mulighed for at blokere AGE'er i kombination med stamcelleterapi at genetisk modificere stamceller selv. Overekspression af sRAGE er kendt for at forbedre AGEs-opfangning (og andre RAGE-ligander som amyloid-) for at forbedre effektiviteten af ​​celleterapi. Dette er blevet vist i sRAGE-udskillende MSC'er som en terapi for Alzheimers sygdom[50,51], arthritis [52] og Parkinsons sygdom [53]. sRAGE-udskillende MSC'er overlevede længere, havde øget migrationskapacitet, var bedre beskyttet mod apoptose og havde antiinflammatoriske egenskaber. Også nedreguleringen af ​​RAGE, der derved desensibiliserer stamcellerne for AGE'er, kunne være en mulighed for at forbedre cellernes funktionalitet. Hvorvidt disse strategier også kunne være anvendelige i forbindelse med MI og hjertereparation skal stadig undersøges. For at opsummere sigter alle disse strategier på at tackle AGE'er for at forbedre stamcellefunktionalitet og -retention. Disse terapeutiske muligheder forbliver dog hypotetiske og skal undersøges in vivo i kombination med CASC-terapi, før de kan oversættes til det kliniske miljø. 5. Konklusioner

Vi fandt ud af, at AGE'er havde en tids- og koncentrationsafhængig, gradvis effekt på CASC's egenskaber ved at øge apoptose og ved at reducere overlevelse, spredning og migration in vitro. Arbejdsmekanismerne bag disse effekter skal stadig undersøges yderligere, selvom vi har vist, at RAGE-aktivering er en vigtig bidragyder til disse AGEs-relaterede negative effekter. Hvorvidt målretning af AGE'er in vivo kunne forbedre CASC's terapeutiske kapacitet efter MI, skal stadig undersøges yderligere.

Denne artikel er uddraget af J. Clin. Med. 2021, 10, 2964. https://doi.org/10.3390/jcm10132964 https://www.mdpi.com/journal/jcm