Effekter af kontralateral nefrektomi-timing og iskæmiske tilstande på nyrefibrose efter unilateral nyreiskæmi-reperfusionsskade
Oct 27, 2023
Introduktion
Forekomsten afakut nyreskade(AKI) er steget dramatisk på verdensplan i de seneste år [1]. AKI kan være forårsaget af organtransplantation, postoperativ under perfusion, blødning, dehydrering, shock og sepsis i klinisk praksis [2]. Nylige epidemiologiske og eksperimentelle undersøgelser har vist, at sværhedsgraden, hyppigheden og varigheden af AKI er tæt forbundet med den efterfølgende forekomst afkronisk nyresygdom(CKD). Nyrefibrose efter AKI kan føre til CKD eller enddanyresygdom i slutstadiet(ESKD) [3-5], hvilket antyder, at AKI og CKD er forbundne syndromer [6]. Imidlertid forbliver mekanismerne bag overgangen fra AKI til CKD ukendte på trods af adskillige eksperimentelle og kliniske undersøgelser. Dyremodeller er vigtige værktøjer til at undersøge de mekanismer, hvorved AKI fører til CKD. Nyreiskæmi-reperfusionsskade (IRI) er en af hovedårsagerne til AKI, og der er udviklet adskillige dyremodeller af IRI-induceret AKI [7], herunder den bilaterale IRI (bIRI) model, den unilaterale IRI model med intakt kontralateral nyre , uIRI-modellen med samtidig kontralateral nefrektomi og uIRI-modellen med forsinket kontralateral nefrektomi.
bIRI-modellen er mindre konsistent, fordi når den iskæmiske skade på begge nyrer er for mild, er der ingen signifikante fibrotiske ændringer på lang sigt. Når AKI er for alvorlig, kan mus dø i den akutte skadesfase. Ydermere kan små forskelle i skaden af de to nyrer føre til signifikante forskelle i deres kroniske nyrepatologi efter et par uger [8,9]. UIRI-modellen med samtidig kontralateral nefrotomi ligner bIRI-modellen, da kun den skadede nyre er tilbage på grund af den anden side nefrektomi [10]. I IRI-modellen med en intakt kontralateral nyre er fibrosen i den iskæmiske nyre alvorlig [11,12]. Denne model er meget konsekvent og pålidelig til langsigtet observation af forskere. Men på grund af tilstedeværelsen af en kontralateral ubeskadiget nyre, kan den ikke bruges til evaluering af estimeret glomerulær filtrationshastighed (eGFR), serumkreatinin (SCr) og blodurinstofnitrogen (BUN) [11-14]. Sammenlignet med de to ovennævnte uIRI-modeller overvinder uIRI-modellen med forsinket kontralateral nefrektomi disse problemer og kan bruges til både langtidsobservationer efter AKI og nyrefunktionsmonitorering. Derfor er denne model velegnet til at studere AKI-CKD-overgang [15].
KLIK HER FOR AT FÅ CISTANCHE EKSTRAKT TILAKUT NYRESKADE
Ikke desto mindre kan forskellige iskæmiske tilstande og intervallet mellem kontralateral nefrektomi og uIRI have betydelig indvirkning på progressionen og sværhedsgraden af CKD efter AKI. Tidligere undersøgelser har fokuseret på effekten af den iskæmiske varighed på post-AKI nyrefibrose og har ikke været meget opmærksom på kernelegemetemperaturen under iskæmi. For eksempel har Skrypnyk et al. [12] kontrollerede den iskæmiske temperatur ved 38 C med et vandbadsystem, med en iskæmisk varighed på 30 minutter, og den kontralaterale intakte nyre blev fjernet 8 dage efter uIRI. Resultatet viste, at den iskæmiske nyre havde signifikante fibrotiske ændringer 28 dage efter uIRI. Med samme iskæmiske varighed, Xiao et al. [8] viste, at signifikante fibrotiske ændringer skete 11 dage efter uIRI, når den iskæmiske temperatur blev kontrolleret ved 37 C 38 C og tidsintervallet mellem uIRI og kontralateral nefrektomi var 10 dage. Nogle forskere, såsom Colombaro et al. [14] og Li et al. [16] nævnte ikke den iskæmiske temperatur i deres undersøgelser.
I mellemtiden undersøgte få mennesker effekten af tidsintervallet mellem kontralateral nefrektomi og uIRI i denne model, hvilket resulterede i vidt forskellige resultater blandt forskellige laboratorier, hvilket også dramatisk påvirkede efterfølgende eksperimenter. I denne undersøgelse undersøgte vi virkningerne af de vigtigste faktorer, der påvirker nyrefibrose efter AKI, herunder tidsintervallet mellem kontralateral nefrektomi og uIRI, kernekropstemperaturen under iskæmi og den iskæmiske varighed. Vi havde til formål at give en reference til at lave en passende dyremodel til at studere AKI CKD-overgangen
Materialer og metoder Dyremodeller
C57BL/6J-hanmus (8-10 uger gamle, ca. 22 g vægt; GemPharmatech Co., Ltd., Nanjing, Kina) fik fri adgang til mad og vand i Animal Experiment Center ved Shanxi Medical University. Avlsbetingelserne var som følger: fugtighed 40-70 %, temperatur 23 C, luftrenhedsklasse 7, kontrolleret 12-h lys/mørke cyklus under patogenfrie forhold, foder Co60-bestråling og renset vand. Alle procedurer for denne undersøgelse blev godkendt af den dyreetiske komité på det andet hospital ved Shanxi Medical University (etisk nummer: DW2022028).
Protokoller
I betragtning af at iskæmiske varigheder, kernekropstemperaturer under iskæmi og resektionstidspunkter for den kontralaterale uskadede nyre alle kan have indflydelse på sværhedsgraden af AKI og efterfølgende nyrefibrose, undersøgte vi virkningerne af de ovennævnte tre faktorer individuelt, med de to andre faste. Tre forsøg blev udført som følger.
Protokol 1: For at observere effekten af intervallet mellem kontralateral nefrektomi og uIRI på nyrefunktionen og post-AKI fibrose, blev den iskæmiske tid for venstre nyre fastsat til 24 minutter, og kernelegemetemperaturen blev fastsat til 37 C under nyren. iskæmi i mellemtiden. Den højre nyre-resektion blev udført på henholdsvis dag 7, dag 10 og dag 14 (n ¼ 8 pr. gruppe) efter venstre nyre IRI. Vi bestemte varigheden af iskæmi og nyreresektion baseret på resultaterne af tidligere undersøgelser [8,10,12,15] og vores præ-eksperimentelle resultater. Se figur 1(A–C) for undersøgelsesprotokollen.
Protokol 2: For at observere virkningen af kernekropstemperatur under iskæmi på AKI-CKD-overgangen blev den iskæmiske tid for den venstre nyre fastsat til 24 minutter, og den højre nyre blev fjernet 14 dage efter den venstre nyre IRI. Kernetemperaturen blev kontrolleret til henholdsvis 36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C og 38 C (n ¼ 8 pr. gruppe). Se figur 1(D) for undersøgelsesprotokollen.
Protokol 3: For at observere effekten af nyreiskæmiske varigheder på overgangen fra AKI til CKD blev kernekropstemperaturen fastsat til 37 C under iskæmi, og den højre nyre blev fjernet 14 dage efter den venstre nyre IRI. Vi valgte dette tidspunkt, fordi nyrefibrose, som var den typiske ændring efter AKI til CKD, var meget tydelig ifølge rapporterne [8,10,12,15] og vores præ-eksperimentelle resultater. Den iskæmiske tid for venstre nyre blev kontrolleret til henholdsvis 21 min, 24 min, 27 min og 30 min (n ¼ 8 pr. gruppe). Se figur 1(E) for undersøgelsesprotokollen.
Alle mus blev aflivet 8 uger efter IRI af venstre nyre. En del af det venstre nyrevæv blev opbevaret ved 70 C til den efterfølgende RT-PCR og western blot-analyse, og den anden del blev fikseret i neutralt formalin til histopatologisk analyse. Blodprøver blev opsamlet via sinus retro-orbital til biokemisk testning.
Figur 1. Protokoller over den unilaterale iskæmi-reperfusionsskade (uIRI) med forsinket kontralateral nefrektomi. (A–C): Den venstre nyre blev udsat for IRI på dag 0, og højre nyre-resektion blev udført på forskellige tidspunkter (dag 7, dag 10 og dag 14) med den iskæmiske varighed fikseret til 24 min med kernekropstemperaturen fastsat til 37 C under nyreiskæmi. (D): Den venstre nyre blev udsat for IRI på dag 0, og højre nyre-resektion blev udført under forskellige kropstemperaturer (36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C og 38 C) med den iskæmiske tidspunktet for venstre nyre fastsat til 24 min, og højre nyre blev fjernet 14 dage efter venstre nyre IRI. (E): Den venstre nyre blev udsat for IRI på dag 0, og højre nyresektion blev udført ved forskellige iskæmiske varigheder (21 min, 24 min, 27 min og 30 min) med kernekropstemperaturen fastsat til 37 C under nyren iskæmi, og den højre nyre blev fjernet 14 dage efter den venstre nyre IRI. Nyrevægt, nyrefunktion, nyrehistologisk skade og nyrefibrose blev vurderet indtil dag 56.
Kirurgisk procedure
Før operationen fastede alle mus i 12 timer med fri adgang til vand og blev injiceret med 3 % pentobarbitalnatrium 50 mg/kg intraperitonealt. Under anæstesi blev rektaltemperaturen holdt på henholdsvis 36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C eller 38 C i forskellige forsøgsgrupper. For at opnå dette blev musen placeret med ryggen på en varmepude (CW{{10}}, BARBAROUS Growth, Zhejiang, Kina) i en position med hoved og nakke strakt ud for at sikre, at dens luftveje forblev. uhindret, og øjnene blev dækket med varm saltvandsgaze for at undgå udtørring under proceduren. Efter bedøvelse blev håret på venstre bagside af musen barberet med hårklipperen. Huden i operationsområdet blev derefter tørret af med en 75 % alkoholserviet. Generelt falder musens kropstemperatur efter hårbarbering. Det kirurgiske indgreb blev udført, når kernelegemetemperaturen blev konstant, hvilket kunne tage omkring 15 min. Den venstre nyre kunne ses ved at skære den venstre ryghud 0,5 cm ved siden af midterlinjen og 0,5 cm ved den nederste kant af brystkassen på musen. Derefter klemte vi venstre mave med den ene hånd for at få den venstre nyre ud af kropshulen, løftede nyren med en stump buet pincet (passede på at undgå at beskadige nyren), løsnede nyrepinden og klemte den hurtigt fast og placerede den fastklemte nyre under huden for at holde den varm og fugtet. Succesfuld iskæmi var karakteriseret ved en gradvis farveændring af nyren fra rød til mørk lilla, som varede henholdsvis 21 min, 24 min, 27 min og 30 min i forskellige forsøgsgrupper. Nyrefarven skiftede tilbage til rød inden for 2-5 minutter efter frigørelse af klemmen. Derefter lukkede vi bughulen med lagdelte suturer. Den højre dorsale hud og muskel blev skåret ind på henholdsvis dag 7, dag 10 og dag 14 efter uIRI i forskellige forsøgsgrupper, og højre nyre blev resekeret. Luk derefter såret med standardsuturer. Efter hver operation blev 500 l saltvand injiceret intraperitonealt for at kompensere for væsketabet under operationen. Samtidig blev musen holdt på en varmepude i ca. 2-3 timer, indtil den opnåede fuld bevidsthed, inden den blev overført til buret. Den falske gruppe spændte ikke nyrerne fast, og resten af de kirurgiske operationer var de samme som i uIRI-gruppen. Alle kirurgiske operationer blev udført af den samme person med mere end 2 års erfaring i driften af denne model.
Nyrefunktionsanalyse
SCr-niveauer blev målt ved hjælp af Creatinine Kit (Jaffe Method, 100020170, Biosino Biotechnology and Science). BUN-niveauer blev målt med Urea Kit (Urease-Glutamate Dehydrogenase Method, Biosino Biotechnology and Science).
Nyrevægtanalyse
Efter vandladning blev musenes kropsvægt målt med en elektronisk præcisionsvægt. Friske nyrer blev skyllet tre gange i forkølet saltvand, hvorefter overskydende vand på nyrerne blev fjernet med filterpapir. Nyrekapslerne blev pillet af på isen, og nyrerne blev vejet med det samme. Forholdet mellem nyrevægt og kropsvægt blev beregnet for at evaluere korrigeret nyrevægt i mg/g.
Hæmatoxylin-eosin (HE) farvning og nyreskade score
Neutralt formalinfikseret nyrevæv blev rutinemæssigt dehydreret, indlejret i paraffin, snittet (3 lm) og farvet med HE for at observere skaden af nyrevæv. Ti tilfældigt udvalgte felter af nyrebarken i hver sektion blev fanget med lysmikroskopi ved 400 forstørrelse. To patologer vurderede skaden på glomerulus og nyretubuli hver for sig. Den rørformede skade blev scoret på en skala fra {{20}}-4 ved hjælp af følgende kriterier [17]: 0, ingen skade; 1, der påvirker 1-25% af nyreområdet; 2, der påvirker 26-50% af nyreområdet; 3, der påvirker 51-75% af nyreområdet; og 4, der påvirker 75-100 % af nyreområdet. Graden af tubulær skade blev evalueret semikvantitativt ved at beregne arealet af tubulær nyreskade. Den glomerulære skade blev evalueret og scoret på en skala fra 0-4 i henhold til det procentvise areal af mesangial ekspansion eller sklerose ved hjælp af følgende kriterier [17]: 0, normal glomeruli; 1, 1-25 % af området skadet; 2, 26-50% af området skadet; 3, 51-75 % af området skadet; og 4, 76-100 % af området skadet. Den endelige glomerulære skadescore ¼ 0 (% grad 0 glomeruli) þ 1 (% grad 1 glomeruli) þ 2 (% grad 2 glomeruli) þ 3 (% grad 3 glomeruli) þ 4 (% grad 4 glomeruli). Mere end 50 glomeruli blev scoret pr. mus.
Massons trikromfarvning
Neutralt formalinfikseret nyrevæv blev rutinemæssigt dehydreret, indlejret i paraffin, snittet (3 lm) og farvet med Massons trichrom for at observere nyrefibrose. I Massons trichrom-farvede skiver blev tyve ikke-overlappende felter af nyrebark fanget under 200 forstørrelse. Image-Pro Plus billedanalysesoftware blev brugt til automatisk måling og analyse. Procentdelen af det fibrotiske område blev brugt til at finde ud af niveauet af nyre interstitiel fibrose [8].
RT-PCR
Total mRNA blev ekstraheret fra nyrevævet i hver gruppe af Trizol, og dets koncentration blev målt, derefter blev det omdannet til cDNA (Taka Reverse Transcription Kit). Taqman-fluorescensmetoden (TB Green Premix Ex Taq II Real-time RT-PCR) blev brugt til at kvantificere fibronectin (FN) og kollagen I (COL-I) RNA-ekspressioner i nyrevæv. Specifikke primere blev brugt til FN (fremad: 50 -GGAGTGGCACTGTCAACCTC-30 og omvendt: 50 -ACTGGATGGGGGTGGGAAT-30 ) og COL-I (fremad: 50 -ACATGTTCAGCTTTGTGGACC{ {9}} og omvendt: 50 -TAGGCCATTGTGTATGCAGC-30 ) [18] (leveret af Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, Kina). Amplifikationsbetingelserne er som følger: 95 C i 30 s, 95 C i 5 s, 60 C i 30 s, 40 cyklusser; 95 C i 10 s, 65 C i 5 s og 95 C/5 C. Efter at have analyseret amplifikationskurverne og opløselighedskurverne for produkterne, blev de relative mRNA-niveauer bestemt ved den sammenlignende CT-metode (2-DDCt) med 18SrRNA (frem: 50 - CGGACACGGACAG GATTGACAG-30 og omvendt: 50 -AATCGCTCCACCAACT AAGAACGG-30 ) som intern reference.
Western blot
Radio-immunpræcitations-assay (RIPA) lysisbuffer blev brugt til at lysere nyrevævet, og koncentrationen af protein blev bestemt ved BCA-metoden. Gradientgelelektroforese blev brugt til at adskille proteinerne fra 5 0 lg prøver. Derefter blev proteinerne overført til en nitrocellulosemembran. Efter blokering med 5 % fedtfri mælk i 2 timer blev membranerne blottet natten over ved 4 C med kanin anti-mus monoklonalt antistof mod a-glat muskel actin (a-SMA) (1:1000, nr. 19245, Cell Signaling Technology FN (1:1000, No.ab2413, ABCam) eller COL-I (1:1000, No.72026, Cell Signaling Technology). Den næste dag blev membranerne genopvarmet ved stuetemperatur i 0,5 time. Efter at være blevet vasket med TBST, blev membranerne inkuberet med HRP Conjugated AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG(H þ L)(1:1000, nr. BA1054, BOSTER Biological Technology) i 2 timer. Efter at være blevet vasket med TBST igen, blev de farvet med ultrahøjfølsomt ECL kemiluminescensreagens for at visualisere immunblotterne. b-actin blev målt på den samme membran som den interne reference. Proteinekspressioner blev bestemt ved at kvantificere de relative udtryk for målproteiner versus b-actin.
Data og statistisk analyse
Alle undersøgte data er udtrykt som middel ± standardafvigelse. Sammenligninger mellem de to grupper blev tilgået ved en uafhængig t-test. Sammenligninger mellem flere grupper blev tilgået af envejs ANOVA, når datafordelingen er normal, og variansen er homogen, Welch ANOVA blev brugt til at vurdere statistisk signifikans, når variansen var heterogen, efterfulgt af Tukeys post hoc test for flere sammenligninger. Alle statistiske analyser blev udført af GraphPad Prism 8.0-softwaren. p < 0.05 blev anset for at være statistisk signifikant.
Supportive Service Of Wecistanche - Den største cistanche-eksportør i Kina:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tlf.:+86 15292862950
Shop for flere specifikationer detaljer:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
