Echinacoside modulerer CGAS-STING-vejen for at lindre LPS-induceret inflammatorisk skade i alveolære epitelceller (A549)

 

Forfattere:Jianfeng Luo; Tao Bai
Tilknytning:Afdeling 1, afdeling for infektionssygdomme, Wuhan Jinyintan Hospital, Wuhan 430000, Hubei, Kina

 

Key Takeaways (til naturlige ingrediens- og supplerende R&D-læsere)

LPS-eksponering skadede A549-alveolære epitelceller, reducerer proliferationsmarkører og øger apoptose og inflammatoriske cytokiner.

Echinacoside (ECH) viste dosisafhængig beskyttelse: forbedret cellelevedygtighed/-proliferation og reduceret apoptose og inflammatoriske mediatorer.

Mekanistisk var fordelene forbundet mednedregulering af cGAS–STING–TBK1–IRF3-signalaksenpå både mRNA- og proteinniveauer.

En cGAS-STING pathway aktivator (RocA) svækket/antagoniseret ECH's beskyttende virkninger, der understøtter forløbsinddragelse.

Relevans for botanisk udvikling: Cistanche(肉苁蓉) er bredt anerkendt som en botanisk rig på echinacosid, hvilket gør det til et praktisk opstrømsmateriale at overveje til produkt-F&U - mens man husker, at denne undersøgelse erin vitroog anvender renset ECH.

Tabel 1. Effekter af forskellige koncentrationer af ECH og RocA på A549-celler (OD570_{570}570​, xˉ±s\\bar{x}\\pm sxˉ±s, n=6n=6n=6)

Koncentration (μmol/L)	ECH (OD570_{570}570​)	RocA (OD570_{570}570​)
0	0.45 ± 0.03	0.43 ± 0.04
3	0.42 ± 0.05	0.45 ± 0.06
6	0.43 ± 0.04	0.42 ± 0.05
9	0.46 ± 0.06	0.46 ± 0.07
12	0.44 ± 0.05	0.44 ± 0.05
24	0.47 ± 0.06	0.20 ± 0.03¹

F/P værdi:ECH: 0,857/0,521; RocA: 22.050 /<0.001
Note:Sammenlignet med 0 μmol/L: ¹ P<0.05P<0.05P<0.05.

 

Abstrakt (omskrevet på engelsk, punkt-for-punkt)

Objektiv

For at vurdere omechinacoside (ECH)beskytter humane alveolære epitelceller modlipopolysaccharid (LPS)-induceret inflammatorisk skade, og om denne beskyttelse er knyttet til regulering afcGAS–STINGsignalvej.

Metoder (studiedesign)

Cellemodel:Human alveolær epitelcellelinjeA549.

Cytotoksicitet/levedygtighedsscreening:MTT-assay til at teste ECH og en cGAS-STING pathway-aktivator (RocA) for toksicitet.

Gruppering:

Kontrol (standardkultur)

LPS (30 mg/L)

LPS + ECH lav/medium/høj dosis (9, 12, 24 μmol/L)

LPS + ECH (24 μmol/L) + RocA (12 nmol/L)

Slutpunkter:

Spredning:EdU farvningogPCNA(Western blot)

Apoptose:Flowcytometri (Annexin V-FITC/PI); Bax/Bcl-2(Western blot)

Betændelse:TNF‑ , IL‑6i supernatant (ELISA)

Pathway udlæsninger:cGAS, STING mRNA(qRT-PCR);cGAS, STING, TBK1, IRF3 proteiner(Western blot)

 

Tabel 2. Sammenligning af EdU-positiv rate, PCNA-ekspression, apoptosehastighed, Bax/Bcl-2-ekspression og TNF- /IL-6-niveauer i A549-celler blandt grupper (xˉ±s\\bar{x}\\pm sxˉ±s, n=6n=6n=6

Gruppe	EDU-positiv sats	PCNA/GAPDH	Apoptoserate (%)	Bax/GAPDH	Bcl-2/GAPDH	TNF- (ug/ml)	IL-6 (ng/ml)
Kontrollere	57.38 ± 3.24	1.67 ± 0.15	4.38 ± 1.09	0.37 ± 0.06	1.63 ± 0.12	4.65 ± 1.08	18.47 ± 1.19
LPS	27.51 ± 1.68¹	0.49 ± 0.08¹	36.75 ± 2.31¹	1.59 ± 0.13¹	0.28 ± 0.06¹	30.71 ± 1.68¹	49.23 ± 2.75¹
ECH-L	33.72 ± 1.96²	0.86 ± 0.10²	29.16 ± 2.27²	1.24 ± 0.11²	0.67 ± 0.08²	22.58 ± 1.52²	41.78 ± 2.46²
ECH-M	40.59 ± 2.40²,³	1.27 ± 0.13²,³	21.93 ± 1.64²,³	0.85 ± 0.09²,³	1.08 ± 0.10²,³	15.83 ± 1.16²,³	32.64 ± 2.18²,³
ECH-H	48.21 ± 2.57²,³,⁴	1.58 ± 0.14²,³,⁴	13.86 ± 1.45²,³,⁴	0.49 ± 0.08²,³,⁴	1.35 ± 0.11²,³,⁴	7.91 ± 1.13²,³,⁴	23.59 ± 1.57²,³,⁴
RocA	35.79 ± 2.38⁵	0.92 ± 0.11⁵	25.74 ± 1.69⁵	0.93 ± 0.10⁵	0.74 ± 0.09⁵	19.76 ± 1.20⁵	36.78 ± 2.61⁵

F-værdi: 118.927; 85.600; 245.724; 131.552; 159.598; 321.852; 161.353
P værdi:alle<0.001

Bemærkninger (flere sammenligninger):
Sammenlignet medKontrollere: ¹ P<0.05P<0.05P<0.05
Sammenlignet medLPS: ² P<0.05P<0.05P<0.05
Sammenlignet medECH-L: ³ P<0.05P<0.05P<0.05
Sammenlignet medECH-M: ⁴ P<0.05P<0.05P<0.05
Sammenlignet medECH-H: ⁵ P<0.05P<0.05P<0.05

 

 

Resultater (hovedresultater)

Sammenlignet med kontrol,LPS:

NedsatEDU-positiv sats,PCNA, ogBcl-2

Øgetapoptose rate,TNF‑, IL-6

OpreguleretcGAS og STING på mRNA-niveau

ØgetBax og cGAS-STING pathway proteiner (cGAS, STING, TBK1, IRF3)
(Alle statistisk signifikante, P<0.05P<0.05P<0.05.)

Sammenlignet med LPS alene,ECH (9→12→24 μmol/L)dosisafhængigt:

Gendannet spredning(højere EdU-positiv rate og PCNA)

Reduceret apoptose(lavere apoptoserate, lavere Bax, højere Bcl-2)

Undertrykt betændelse(lavere TNF‑ og IL‑6)

Nedreguleret cGAS–STING-signalering(lavere cGAS/STING mRNA; lavere cGAS, STING, TBK1, IRF3 proteiner)
(Dosisafhængig, s<0.05P<0.05P<0.05.)

RocA modvirkedeECH's beskyttelse under LPS-skadeforhold (s<0.05P<0.05P<0.05), consistent with cGAS–STING pathway involvement.

Konklusion

ECHøget levedygtighed og proliferativ aktivitetaf LPS-udfordrede alveolære epitelceller ogundertrykt apoptose og inflammatoriske reaktioner. Beskyttelsesmekanismen er sandsynligvis relateret tilhæmning/blokade af overaktiveret cGAS-STING-signalering.

 

Baggrund (hvorfor dette betyder noget)

Hos patienter, der er udsat for eller inficeret med LPS (en væsentlig gramnegativ bakteriel komponent),akut lungeskade (ALI)og dens alvorlige formARDSer nøglefaktorer for sygelighed og dødelighed. Karakteristisk patologi involverer diffus skade påalveolært epitelogkapillært endotel, hvilket fører til barrierelækage og lungeødem.

På trods af fremskridt inden for understøttende behandling,effektive målrettede behandlinger forbliver begrænsede, så det er vigtigt at identificere nye lægemiddelkandidater og mål.

Echinacoside (ECH)er et phenylethanoid glycosid med rapporterede aktiviteter, herunder antioxidant, anti-inflammatorisk, cytobeskyttende og anti-apoptotisk virkning.
For udviklere af naturlige produkter:Cistanche (肉苁蓉)er en traditionel botanisk ofte fremhævet for at værerig på echinacoside, hvilket gør det til et praktisk kildemateriale, når man udforsker ECH-orienterede formuleringer - samtidig med at det kræver omhyggelig standardisering og translationsarbejde ud over celleassays.

DecGAS-STING-vejener en cytosolisk DNA-sensing akse, der fremmer type I interferon og inflammatorisk mediatorproduktion. Beviser tyder på detoverdreven aktiveringaf cGAS-STING bidrager til inflammatorisk og autoimmun patologi, og at undertrykkelse af denne overaktivering kan hjælpe med at dæmpe inflammatorisk lungeskade.

 

Materialer og metoder (F&U-venligt resumé)

Cellelinje og kultur

A549-celler blev dyrket iDMEM med lavt glukoseindholdmed10% FBSog1% antibiotika, med medium ændringer hver 2. dag. Forsøg blev udført kl~80-90% sammenløb.

Reagenser (højt niveau)

ECH(leverandøroplysningerne er angivet i det originale papir)

LPS

RocA(brugt her som encGAS-STING pathway aktivator)

Analysesæt: MTT, EdU, apoptosekit (Annexin V-FITC/PI), ELISA-kits til TNF- og IL-6

Molekylær assays: RNA-ekstraktion, revers transkription, qRT-PCR-reagenser; antistoffer til Western blot (PCNA, Bax, Bcl-2, cGAS, STING, TBK1, IRF3, GAPDH)

Dosisvalg (levedygtighedsscreening)

ECH (0-24 μmol/L)visteingen signifikant cytotoksiciteti A549-celler og derfor9/12/24 μmol/Lblev brugt.

RocAvar ikke-giftig indeni0-12 nmol/Lmens højere koncentration reducerede levedygtigheden;12 nmol/Lblev valgt.

LPS skade induktion og gruppering

LPS-skade blev induceret med30 mg/L LPS.

Behandlingsarmene var som beskrevet i abstraktet (Kontrol; LPS; LPS+ECH lav/medium/høj; LPS+ECH høj+RocA).

Resultatmålinger

Spredning:EdU-positive celler ved fluorescensmikroskopi; PCNA ved Western blot.

Apoptose:Flowcytometri (Annexin V-FITC/PI); Bax- og Bcl-2-proteinniveauer.

Inflammatoriske mediatorer:TNF‑ og IL‑6 i kultursupernatant ved ELISA.

Baneudtryk:cGAS og STING mRNA ved qRT-PCR ved hjælp af GAPDH som intern kontrol; proteiner (cGAS, STING, TBK1, IRF3) ved Western blot.

Statistik:ANOVA med SNK-q post-hoc test (GraphPad Prism 9.0), betydning sat til P<0.05P<0.05P<0.05.

 

Resultater (hvad ændrede sig med LPS, ECH og RocA)

1) Cellelevedygtighed/toksicitetsvindue

ECH blev godt tolereret op til det testede område, der blev brugt til mekanistiske undersøgelser.

RocA krævede forsigtig dosering; en ikke-toksisk arbejdskoncentration blev valgt.

Figur 1. A549-celleproliferation i hver gruppe (EDU-farvning, ×200)

 

2) Spredning blev undertrykt af LPS og genoprettet af ECH

LPS reduceretEdU indlemmelseogPCNAekspression, hvilket indikerer nedsat proliferativ aktivitet.

ECH øgede EDU-positive rater og PCNApå en dosisafhængig måde.

Tilføjelse af RocA reducerede disse gevinster, hvilket tyder på, at pathwayen bidrager til ECH's pro-overlevelse/pro-proliferation effekt.

3) Apoptose steg med LPS og blev hæmmet af ECH

LPS øgede apoptoserate, stegBax, og faldtBcl-2.

ECH vendte disse ændringer dosisafhængigt (lavere apoptoserate og Bax, højere Bcl-2).

RocA flyttede fænotypen tilbage mod apoptose, hvilket svækkede ECH-beskyttelse.

Figur 2. Western blot-analyse af PCNA-, Bax- og Bcl-2-ekspression i hver gruppe

 

4) Inflammatoriske cytokiner (TNF‑, IL‑6) blev reduceret af ECH

LPS forhøjet TNF- og IL-6 i supernatanter.

ECH reducerede begge cytokiner dosisafhængigt.

RocA øgede dem i forhold til høje ECH-dosis alene, i overensstemmelse med pathway-reaktivering, der forstærker inflammation.

5) cGAS- og STING-transkription blev induceret af LPS og undertrykt af ECH

LPS stegcGAS og STING mRNA.

ECH sænkede deres udtryk (dosisafhængig).

RocA øgede ekspression sammenlignet med høj ECH-dosis.

Figur 3. Sammenligning af A549-celleapoptose i hver gruppe

 

6) cGAS-STING pathway-proteiner blev nedreguleret af ECH

LPS stegcGAS, STING, TBK1 og IRF3protein ekspression.

ECH reducerede disse proteiner dosisafhængigt.

RocA øgede pathway proteinniveauer versus ECH høj dosis alene.

 

Tabel 3. Sammenligning af cGAS/STING mRNA og cGAS-STING pathway proteinekspression i A549 celler blandt grupper (xˉ±s\\bar{x}\\pm sxˉ±s, n=6n=6n=6)

Gruppe	cGAS mRNA	STING mRNA	cGAS/GAPDH	STING/GAPDH	TBK1/GAPDH	IRF3/GAPDH
Kontrollere	1.00 ± 0.12	1.00 ± 0.11	0.32 ± 0.07	0.36 ± 0.08	0.29 ± 0.05	0.25 ± 0.06
LPS	2.15 ± 0.16¹	2.28 ± 0.17¹	1.68 ± 0.13¹	1.85 ± 0.16¹	1.57 ± 0.13¹	1.62 ± 0.14¹
ECH-L	1.74 ± 0.13²	1.83 ± 0.14²	1.34 ± 0.12²	1.42 ± 0.13²	1.24 ± 0.11²	1.23 ± 0.12²
ECH-M	1.36 ± 0.11²,³	1.31 ± 0.12²,³	0.82 ± 0.09²,³	1.03 ± 0.11²,³	0.86 ± 0.09²,³	0.78 ± 0.09²,³
ECH-H	0.73 ± 0.09²,³,⁴	0.62 ± 0.08²,³,⁴	0.45 ± 0.08²,³,⁴	0.57 ± 0.09²,³,⁴	0.47 ± 0.08²,³,⁴	0.38 ± 0.07²,³,⁴
RocA	1.58 ± 0.12⁵	1.69 ± 0.15⁵	1.17 ± 0.11⁵	1.28 ± 0.14⁵	1.12 ± 0.10⁵	0.97 ± 0.10⁵

F/P værdier:

cGAS mRNA: 103,612/<0.001

STING mRNA: 124,857 /<0.001

cGAS/GAPDH: 160,066 /<0.001

STING/GAPDH: 124.141 /<0.001

TBK1/GAPDH: 150.139 /<0.001

IRF3/GAPDH: 158.576 /<0.001

 

Figur 4. cGAS-STING pathway proteinekspression i celler i hver gruppe

 

Diskussion (fortolkning til produkt- og mekanismelæsere)

LPS bruges almindeligvis til at modellere inflammatorisk lungeskade. Her forringede LPS direkte alveolær epitelcelleproliferativ kapacitet og fremmede apoptose, ledsaget af forhøjede TNF- og IL-6-to cytokiner, der er bredt forbundet med inflammatorisk lungeskade.

ECH fungerede som encytobeskyttende og anti-inflammatorisk middeli denne in vitro indstilling, i overensstemmelse med tidligere rapporter om, at ECH kan afbøde oxidativt stress, inflammation og apoptose i lungeskadesammenhænge.

cGAS-STING-aksen (og nedstrøms TBK1/IRF3) ser ud til at være en mekanistisk knude:ECH-sænkede cGAS-STING-vejmarkører, ogRocA sløvede ECH's fordele, hvilket understøtter hypotesen om, at ECH beskytter celler i det mindste delvist vedblokering af overdreven cGAS-STING-aktivering.

Hvad dette antyder for naturlig botanisk udvikling (Cistanche kontekst)

FordiCistanche (肉苁蓉)er kendt forhøjt echinacoside indhold, er det en logisk botanisk kandidat, når man udforsker ECH-centrerede formuleringer rettet mod inflammatorisk balance og epitelbeskyttelsestemaer.

cellelinjebaseret, brugerLPS skadeogrenset ECH, og fastslår ikke human effekt, oral biotilgængelighed, metabolisme eller klinisk relevant dosering.

Begrænsninger og næste trin (som antydet af forfatterne)

Resultaterne skal valideres iin vivo ALI/ARDS-modellerat bekræfte effektivitet og mekanistisk kobling til cGAS-STING under fysiologiske forhold.

Yderligere arbejde ville være påkrævet for at kortlægge upstream-triggere og bekræfte, om virkningerne er direkte pathway-hæmning versus sekundære til reduceret cellulær stress.

 

Referencer (opbevares komplette, som angivet)

Li N, Liu B, Xiong R, et al. HDAC3-mangel beskytter mod akut lungeskade ved at opretholde epitelbarriereintegritet gennem bevarelse af mitokondriel kvalitetskontrol.Redox Biol, 2023;63(1):102746-61.

Long ME, Mallampalli RK, Horowitz JC. Patogenese af lungebetændelse og akut lungeskade.Clin Sci (Lond), 2022;136(10):747-69.

Mokrý AD. Akut lungeskade - fra patofysiologi til behandling.Physiol Res, 2020;69(Suppl 3):S353-66.

Wang W, Jiang S, Zhao Y, et al. Echinacoside: et lovende aktivt naturprodukt og farmakologiske midler.Pharmacol Res, 2023;197(1):106951-66.

Pan Y, Liu Y. Echinacoside lindrer luftvejsremodellering og inflammation i en ovalbumin-induceret neonatal musemodel af astma ved at modulere SIRT1-NF-KB-vejen.Allergol Immunopathol (Madr), 2023;51(4):71-7.

Cui YH, Li KF, Jin B, et al. Echinacosid hæmmer bleomycin-induceret lungeepitelcelleskade og inflammatorisk respons.Kinesisk tidsskrift for patofysiologi, 2021;37(11):2024-30.

Xie W, Deng L, Lin M, et al. Sirtuin1 medierer de beskyttende virkninger af echinacoside mod sepsis-induceret akut lungeskade via regulering af NOX4-Nrf2-aksen.Antioxidanter (Basel), 2023;12(11):1925-45.

Alonso Paiva IM, Santos AR, Brito CB, et al. cGAS/STING-vejens rolle i kontrollen afBrucella abortinfektion erhvervet gennem luftvejene.Front Immunol, 2023;14:1116811.

Zhao J, Zhen N, Zhou Q, et al. NET fremmer inflammatorisk skade ved at aktivere cGAS-STING-vejen ved akut lungeskade.Int J Mol Sci, 2023;24(6):5125-45.

Wu X, Jiang Y, Li R, et al. Ficolin B udskilt af alveolære makrofag-eksosomer forværrer bleomycin-induceret lungeskade via ferroptose gennem cGAS-STING-signalvejen.Celledød Dis, 2023;14(8):577-92.

Zhang SW, Cheng SL, Xing QF. Pachymsyre lindrer colonepitelcelleskade hos ulcerøs colitis-rotter ved at hæmme cGAS-STING-signalvejen.Journal of Immunology(Kina), 2023;39(8):672-80.

Zhang JJ, Li YY, Qin J. lncRNA LUCAT1 målretter mod miR-203a-3p for at påvirke apoptose og inflammatorisk respons i LPS-inducerede alveolære type II epitelceller.Journal of Immunology(Kina), 2023;39(8):689-95.

Li J, Deng SH, Li J, et al. Obacunon lindrer ferroptose under lipopolysaccharid-induceret akut lungeskade ved at opregulere Nrf2-afhængige antioxidantresponser.Cell Mol Biol Lett, 2022;27(1):29-48.

Hong H, Lou S, Zheng F, et al. Hydnocarpin D dæmper lipopolysaccharid-induceret akut lungeskade via MAPK/NF-KB og Keap1/Nrf2/HO-1 pathway.Fytomedicin, 2022;101(1):154143-50.

Sasaki M, Kishimoto M, Itakura Y, et al. Luft-væske interfase kultur giver SARS-CoV-2 modtagelighed for A549 alveolære epitelceller.Biochem Biophys Res Commun, 2021;577:146-51.

Wang Y, Fan Y, Huang Y, et al. TRIM28 regulerer SARS-CoV-2-celleindgang ved at målrette ACE2.Cellesignal, 2021;85:110064.

Yang X, Ma L. Efterbehandling med propofol hæmmer inflammatorisk respons i LPS-inducerede alveolære type II epitelceller.Exp Ther Med, 2022;23(4):249.

Duan XY, Sun Y, Zhao ZF, et al. Baicalin dæmper LPS-induceret alveolær type II epitelcelle A549-skade ved dæmpning af FSTL1-signalvejen via stigende miR-200b-3p-ekspression.Medfødt immun, 2021;27(4):294-312.

Lei X, Liu X, Yu J, et al. 3-methyladenin afhjælper akut lungeskade ved at hæmme oxidativ skade og apoptose.Heliyon, 2024;10(13):e33996.

Li M, Song J, Tang X, et al. Kritiske roller for PAI-1 i lipopolysaccharid-induceret akut lungeskade.Adv Med Sci, 2024;69(1):90-102.

Jiang T, Yuan D, Wang R, et al. Echinacoside, en lovende sortase A-hæmmer, kombineret med vancomycin mod murine modeller af MRSA-induceret lungebetændelse.Med Microbiol Immunol, 2023;212(6):421-35.

Yang Y, Liu Y, Wang Y, et al. Regulering af SIRT1 og dets roller i inflammation.Front Immunol, 2022;13(1):831168-83.

Jiang Z, Jiang Y, Fan J, et al. Hæmning af cGAS forbedrer akut lungeskade udløst af zinkoxidnanopartikler.Toxicol Lett, 2023;373(1):62-75.

Domizio JD, Gulen MF, Saidoune F, et al. cGAS-STING-vejen driver type I IFN-immunopatologi i COVID-19.Natur, 2022;603(7899):145-51.

Messaoud-nacer Y, Culerier E, Rose S, et al. STING-agonist diABZI inducerer PANoptose og DNA-medieret akut respiratorisk distress-syndrom (ARDS).Celledød Dis, 2022;13(3):269-85.

Wen J, Qin S, Li Y, et al. Flavonoider afledt af lakrids undertrykker LPS-induceret akut lungeskade hos mus ved at hæmme cGAS-STING-signalvejen.Food Chem Toxicol, 2023;175(1):113732.

 

Om Cistanche (肉苁蓉) Extract Manufacturer (til produktudviklere)

For hold, der udforskerCistanche-baseretudvikling af naturlige ingredienser - især standardiserede ekstrakter placeret rundt omkringechinacoside- Oplysninger om producentens baggrund og kapacitet kan findes her:
https://www.xjcistanche.com/about-us