Forskellige antivirale gærsystemer forhindrer dødelig patogenese forårsaget af LA Mycovirus

Nylige undersøgelser viser, at antivirale systemer er bemærkelsesværdigt konserverede fra bakterier til pattedyr, hvilket viser, at enestående indsigt i disse systemer kan opnås ved at studere mikrobielle organismer. I modsætning til bakterier, hvor faginfektion kan være dødelig, kendes der imidlertid ingen cytotoksisk viral konsekvens i den spirende gær Saccharomyces cerevisiae, selvom den er kronisk inficeret med et dobbeltstrenget RNA-mycovirus kaldet LA. Dette er fortsat tilfældet på trods af den tidligere identifikation af konserverede antivirale systemer, der begrænser LA-replikation. Her viser vi, at disse systemer samarbejder for at forhindre udbredt LA-replikation, som forårsager dødelighed i celler dyrket ved høje temperaturer. Ved at udnytte denne opdagelse bruger vi en overekspressionsskærm til at identificere antivirale funktioner for gærhomologerne af polyA-bindende protein (PABPC1) og det La-domæne, der indeholder protein Larp1, som begge er involveret i viral medfødt immunitet hos mennesker. Ved hjælp af en komplementær funktionstabstilgang identificerer vi nye antivirale funktioner for de konserverede RNA-exonukleaser REX2 og MYG1; SAGA og PAF1 kromatin regulatoriske komplekser; og HSF1, master transkriptionelle regulator af det proteostatiske stressrespons. Gennem undersøgelse af disse antivirale systemer viser vi, at LA-patogenese er forbundet med en aktiveret proteostatisk stressrespons og akkumulering af cytotoksiske proteinaggregater. Disse resultater identificerer proteotoksisk stress som en underliggende årsag til LA-patogenese og fremmer yderligere gær som et kraftfuldt modelsystem til opdagelse og karakterisering af konserverede antivirale systemer.

Alle laboratoriestammer og de fleste miljøisolater af den spirende gær S. cerevisiae er inficeret med et dobbeltstrenget RNA (dsRNA) virus kaldet LA (1, 2). LA tilhører den bredt spredte Totiviridae-familie af endogene dsRNA-vira. Som alle vira i denne familie er LA dsRNA-genomet pakket i et virion, der beskytter det mod værtsmedieret fordøjelse. Huller i virion tillader ekstrudering af RNA-transkripter ind i cytosolen, der koder for capsidproteinet, Gag, som omfatter det meste af partiklen. LA-transkriptet koder også for et Gag-pol-fusionsprotein, produceret i meget lavere niveauer end Gag-proteinet, som besidder RNA-afhængig RNA-polymeraseaktivitet. Hver virion indeholder et Gag-pol-protein, som står for LA-replikation og transkription i partiklen. Indkapsling af de virale transkripter i begyndende partikler og syntese af den negative RNA-streng med Gag-pol til dannelse af dsRNA-genomet fuldender LA-replikationscyklussen (2). For at producere disse proteiner anvender LA egenskaber, der er typiske for RNA-vira, der findes hos mennesker, herunder en "cap-snatching"-mekanisme, der forsyner LA-transkripter med en 5'-methylhætte og en ribosomal rammeskiftende mekanisme til at producere Gag- og Gag-pol-fusionsproteiner fra en enkelt afskrift (3, 4).

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Nylige undersøgelser af bakterielle antivirale systemer har vist, at de deler bemærkelsesværdig evolutionær bevaring med mennesker, hvilket afslører mikrobielle organismers potentiale til at give ny indsigt i viral medfødt immunitet (5-11). Faktisk førte tidlige undersøgelser, der involverede LA, til opdagelsen af ​​to antivirale systemer, der efterfølgende har vist sig at bidrage til medfødt immunitet mod forskellige RNA-vira hos pattedyr (12-17). Det første af disse antivirale systemer involverer SKI2-, 3- og 8-generne, som koder for underenheder af et konserveret ribosom-associeret kompleks, der modsætter sig translationen af ​​transkripter, der mangler poly(A)-haler som dem, der kodes af LA (18-23). En separat vej for LA-dæmpning sker gennem Xrn1 (også kendt som SKI1), en 5′-3′ exoribonuklease, der nedbryder uafsluttede mRNA'er (24-26).

Vi har for nylig fundet ud af, at den mitokondrielle DNA/RNA-endonuklease Nuc1 undertrykker akkumuleringen af ​​LA i sporulerende celler, hvilket repræsenterer en ny antiviral gærvej (27). Nuc1 er en homolog af endonuklease G (EndoG) fundet i alle eukaryoter og mange prokaryoter og er mest kendt for sin rolle i at fremme genomfragmentering under pattedyrs programmeret celledød, en fremtrædende sidste udvejsmekanisme for viralt forsvar (28, 29). Spændende nok er programmeret celledød iboende for gærsporulering, og Nuc1 fragmenterer DNA'et fra døende meiotiske produkter under denne proces ud over dets rolle i at svække LA-virusniveauer, der nedarves af de overlevende sporer (27, 30, 31).

På trods af den allestedsnærværende tilstedeværelse af LA i laboratoriestammer, har der ikke været nogen fitness-konsekvens tilskrevet det, og LA betragtes derfor i vid udstrækning som en harmløs commensal. Her viser vi, at LA-infektion faktisk er dødelig for gær, og at den aktivt skal svækkes gennem viral medfødt immunitet for at bevare levedygtigheden. Specifikt i stammer, der mangler parallelt virkende NUC1 og SKI antivirale veje, øges LA kopiantallet massivt, hvilket fører til dødelighed ved høje temperaturer.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Vi begrundede, at yderligere karakterisering af LA og de faktorer, der opretholder replikationen på et lavt niveau, kunne afsløre nye antivirale systemer. Identifikation af tilstande, der fører til LA-patogenese, gjorde det muligt for os at bruge bioinformatiske og fremadrettede genetiske screeningstilgange til at opdage nye antivirale gener. Ved at bruge en screening for overudtrykte gener, der undertrykker nuc1∆ ski3∆ betinget dødelighed, identificerer vi antivirale funktioner for gærhomologerne af poly(A)-bindende protein (PABPC1) og La-domænet indeholdende protein Larp1, som begge er involveret i viral medfødt immunitet hos mennesker (32, 33). Desuden identificerede genetiske undersøgelser med tab af funktion tolv nye antivirale gener. Blandt disse er det meget konserverede SAGA transkriptionelle coactivator kompleks og adskillige RNA exonukleaser, herunder REX2 og MYG1, som begge har distinkte, men dårligt karakteriserede humane og bakterielle homologer (34-37).

Endelig karakteriserer vi LA-patogenese ved hjælp af cellebiologiske metoder og finder ud af, at høj viral belastning forårsager proteostatisk stress. Da høj temperatur er velkendt for at forværre proteostatisk stress, tyder disse observationer på, at katastrofal proteostatisk stress er årsagen til LA-induceret dødelighed. I overensstemmelse med denne hypotese viser vi, at nuc1∆ ski3∆-mutanter udviser LA-afhængig følsomhed over for azetidin-2-carboxylsyre (AZC), en prolinanalog, der er kendt for at forårsage ortostatisk stress (38). Yderligere demonstrerer vi en antiviral funktion for HSF1, en bevaret transkriptionsfaktor, der registrerer og styrer responsen på ortostatisk stress. Interessant nok spiller human Hsf1 også vigtige roller i replikationen og/eller patogeniciteten af ​​forskellige vira, herunder HIV, SARS-Cov-2 og dengue-virus, selvom mekanismerne er uklare (39). Disse resultater giver nye eksempler på medfødt immunbevarelse fra mikrober til mennesker og yderligere højlysgær som et kraftfuldt modelsystem til opdagelsen af ​​nye antivirale systemer.

Resultater

NUC1-, SKI- og XRN1-gær-antivirale systemer samarbejder for at forhindre LA-patogenese.

Vores tidligere undersøgelser af NUC1 var fokuseret på meiotiske celler (27). For at undersøge NUC1 antiviral funktion i vegetativt voksende gær undersøgte vi LA-kopitallet i mitotiske haploide celler i reference BY4742 stamme baggrunden. Vi observerede niveauerne af LA dsRNA ved anvendelse af ethidiumbromid-farvning af elektroforeret RNA og fandt ud af, at en nuc1∆ ski3∆ dobbeltmutant viste en stor stigning i LA dsRNA (fig. 1A). Vi bekræftede disse fund ved hjælp af immunfluorescensmikroskopi med et dsRNA-antistof, der blev brugt til at påvise replikerende RNA-vira (40, 41). Disse billeder viste, at LA dsRNA akkumulerede i foci, der minder om "viral factory" sites for viral replikation observeret i humane celler (Fig. 1B og SI Appendiks, Fig. S1) (42). I overensstemmelse med tidligere fund i andre stammebaggrunde (24, 27, 43), viste western blotting, at Gag-proteinniveauer var forhøjede i nuc1∆- og ski3∆-mutanterne (fig. 1C). Desuden viste vi, at en nuc1∆ ski3∆ dobbeltmutant akkumulerede massivt forhøjede Gag-niveauer (fig. 1C). Disse data viser, at NUC1 og SKI3 deltager i separate antivirale veje, og at tab af begge veje resulterer i en stærkt øget LA-virusbelastning.

For at bestemme, om høj LA-viral belastning påvirker celleegnethed, undersøgte vi gærvækst ved hjælp af plettest-vækstanalyser. Subtile vækstdefekter af nuc1∆ og ski3∆ enkeltmutanter blev observeret ved 37 grader, når celler blev dyrket med glycerol i stedet for glucose som kulstofkilde, en betingelse, hvorunder gær er afhængig af mitokondriel respiration (fig. 1D). Bemærkelsesværdigt, selvom nuc1∆ ski3∆ dobbeltmutanter voksede normalt ved 30 grader, udviste de betinget dødelighed ved 37 grader uanset kulstofkilden (fig. 1D). Som forventet blev levedygtighed ved høj temperatur genoprettet til en nuc1∆ ski3∆ dobbeltmutant af et NUC1--udtrykkende plasmid, som fremkaldte et tilsvarende fald i Gag-niveauer (fig. 1 C og D). For at bekræfte, at vækstdefekten af ​​nuc1∆ ski3∆ dobbeltmutanten var forårsaget af LA, konstruerede vi en isogen stamme helbredt af LA (LA0) og analyserede dens vækst ved høje temperaturer. Vi fandt, at vækstdefekten var fuldstændig lindret, hvilket antydede, at den betingede dødelighed var et resultat af ubegrænset LA-replikation (fig. 1D). For at vurdere virkningerne af et højt LA-kopiantal på celleegnethed under optimale vækstbetingelser målte vi proliferationshastigheder i flydende kultur. Disse undersøgelser afslørede en reduceret væksthastighed i nuc1∆ ski3∆ dobbeltmutanter sammenlignet med vildtypen ved 30 grader, der blev reverseret i L-A0-stammer, hvilket viser, at høj LA-belastning er skadelig for fitness selv i ikke-stressede celler (SI Appendiks, Fig. S2).

cistanche planteforøgende immunsystem

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

For yderligere at karakterisere, hvordan NUC1 interagerer med kendte antivirale veje, testede vi dets forhold til XRN1. Vi fandt ud af, at en nuc1∆ xrn1∆-dobbeltmutant akkumulerede stærkt forhøjede niveauer af Gag sammenlignet med enten enkelt mutant og udviste LA–afhængig betinget dødelighed ved høj temperatur (SI Appendiks, Fig. S3 A ​​og B), hvilket tyder på, at NUC1 og XRN1 virker i parallelle veje til at svække LA. En xrn1∆ ski3∆-dobbeltmutant afspejler deres ikke-redundante nøgleroller i bulk-mRNA-regulering, selv i stammer, der mangler LA (44). For at bestemme, om XRN1 repræsenterer et antiviralt system uafhængigt af både NUC1 og SKI3, brugte vi et højkopiplasmid til at overudtrykke XRN1 i en nuc1∆ ski3∆ dobbeltmutant. Faktisk observerede vi et væsentligt fald i Gag-niveauer og undertrykkelse af nuc1∆ ski3∆ betinget dødelighed ved hjælp af plasmiddrevet XRN1-overekspression (fig. 1 C og D). Vi konkluderer, at Nuc1, Ski3 og Xrn1 konvergent modsætter sig LA-replikation, og at massivt øget LA-virusbelastning i nuc1∆ ski3∆- eller nuc1∆ xrn1∆-mutanter forårsagede dødelig patogenese ved høje temperaturer (fig. 1E).

En bioinformatisk-baseret genetisk skærm identificerer nye antivirale faktorer.

Den LA-afhængige betingede dødelighed af nuc1∆ ski3∆ dobbeltmutanter rejste muligheden for, at andre antivirale faktorer kunne identificeres gennem kombinatoriske mutantundersøgelser. For at identificere nye kandidat-antivirale faktorer søgte vi i en kureret genetisk interaktionsdatabase for gendeletioner, der forårsagede en syntetisk vækstdefekt, når de blev kombineret med nuc1∆ i mindst to high-throughput screeningsundersøgelser (45). Ud over den forventede tilstedeværelse af XRN1 og SKI deletioner i dette datasæt, fandt vi seksten yderligere gener. Vi brugte genetisk krydsning til at lave tredobbelte mutanter, der kombinerede deletioner af hver af disse seksten gener med nuc1∆ ski3∆ og bekræftede seks, der forårsagede alvorlige vækstdefekter (tabel 1). Vi fastslog, at de syntetiske vækstfænotyper forårsaget af hvert af disse gener blev reverseret i LA0-stammer, hvilket tyder på, at de koder for antivirale proteiner (tabel 1). Vi beskriver bekræftelse af flere af disse skærmhits som nye antivirale faktorer nedenfor.

Et gen identificeret i vores screening, REX2, koder for en 3′-5′ RNA-exonuklease, der er konserveret fra bakterier til mennesker (35). Både Rex2 og dets humane homolog REXO2 lokaliseres til mitokondrierne og indeholder et EXOIII-domæne, der i vid udstrækning findes i prokaryote og eukaryote proteiner, herunder det interferon-stimulerede antivirale protein ISG2 0 (36, 37, 46-48). Vi fandt ud af, at en rex2∆ nuc1∆ dobbeltmutant stamme akkumulerede stærkt øgede niveauer af Gag sammenlignet med enten enkelt mutant og udviste LA-afhængige vækstdefekter, herunder dødelighed ved høj temperatur (fig. 2 A og B og SI Appendiks, Fig. S2). En enkelt-mutant rex2∆-stamme udviste en lille stigning i Gag-niveauer, selvom denne effekt var marginal (fig. 2B). For nøje at undersøge konsekvenserne af rex2∆ for LA-kopinummer, kvantificerede vi LA RNA ved hjælp af RT-qPCR. Disse målinger bekræftede, at rex2∆ nuc1∆-stammer akkumulerer stærkt øgede niveauer af LA, selvom de også afslørede, at en enkelt rex2∆-mutant ikke akkumulerede øget LA-RNA (fig. 2C). Disse resultater tyder på, at Rex2's antivirale rolle kun er tydelig i fravær af NUC1-funktion. Bemærkelsesværdigt var nuc1∆ ski3∆ rex2∆ og nuc1∆ xrn1∆ rex2∆ triple mutanter uoverkommelige under alle vækstbetingelser, og disse defekter blev vendt i L-A0-stammer (fig. 2D). Disse fund viser det alvorlige patogene potentiale af LA-mycovirus og identificerer en ny antiviral rolle for en højt konserveret mitokondrielt lokaliseret RNA-exonuklease.

Fig. 1. LA-dæmpning beskytter gær mod dødelig patogenese. (A) En ethidiumbromid-farvet gel af totalt RNA fremstillet ud fra de angivne stammer er vist med 4,6 kb LA dsRNA-båndet angivet med en pil. (B) Immunfluorescens blev brugt til at visualisere LA dsRNA (orange) i celler af de angivne genotyper. Disse stammer blev helbredt for det svagt rigelige L-BC dsRNA-virus for at eliminere baggrundsfarvning (Metodedetaljer). DAPI-farvning af DNA er i blåt. (Skalabjælke, 1 μm.) (C) Western blotting af LA Gag og 3-phosphoglycerat kinase (Pgk1) proteinniveauer i de angivne stammer er vist. Molekylvægtmarkører er angivet til højre. (D) Plettest vækstanalyser af stammerne fra 1C er vist. Stammer blev spottet på -Leu-medier indeholdende enten glucose eller glycerol og dyrket ved de angivne temperaturer. (E) Det mitokondrielle protein Nuc1 samarbejder med de cytosoliske proteiner Xrn1 og SkiC for at regulere LA-proteinniveauet og sikre cellefitness.

Et andet gen identificeret i vores screening var MYG1, gærhomologen af ​​human MelanocYte-proliferation Gen 1, en 3′-5′ RNA-exonuklease, der har homologer i alle taxaer (34). Mutantstammer, der kombinerede myg1∆ og nuc1∆, udviste store stigninger i Gag-protein og LA RNA sammenlignet med de enkelte mutanter og udviste alvorlige LA-afhængige vækstdefekter ved høj temperatur og i flydende kultur (Fig. 2C og SI Appendiks, Fig. S2, S4 A og C). Ligesom med rex2∆ viste en myg1∆ enkelt mutantstamme lille stigning i Gag-niveau og ingen ændring i LA RNA (fig. 2C og SI-tillæg, fig. S4C). Vi var i stand til at genvinde nuc1∆ ski3∆ myg1∆ triple mutanter, selvom de var ekstremt langsomt voksende ved 30 grader og akkumulerede endnu højere niveauer af Gag (SI Appendiks, Fig. S4 A og C). Disse vækstdefekter blev også vendt i L-A0-stammer (SI Appendiks, Fig. S4A). MYG1 repræsenterer således en ny antiviral faktor, der virker parallelt med både NUC1 og SKI-komplekset.

Tabel 1. Identifikation af nye kandidat antivirale faktorer ved brug af en bioinformatisk tilgang

Mutationer, der fører til overekspression af humant MYG1, er forbundet med den autoimmune lidelse vitiligo, hvilket tyder på, at MYG1 kan spille en rolle i menneskelig medfødt immunitet (49, 50). Vi undersøgte denne mulighed ved at bruge et plasmid, der udtrykker human MYG1 under kontrol af en konstitutiv gærpromotor (34) og fandt ud af, at human MYG1 reddede den betingede vækstdefekt af en nuc1∆ myg1∆ mutant (SI Appendiks, Fig. S4D). Disse resultater viser, at den antivirale funktion af gær MYG1 kan opnås af human MYG1, hvilket tyder på en potentiel antiviral funktion for MYG1 hos mennesker.

Fig. 2. Nye antivirale faktorer identificeres ved at udnytte LA-patogenese. (A) Pletanalyse af stammer, der er defekte i NUC1 og REX2 er vist. Stammer blev spottet på SC-medier indeholdende enten glucose eller glycerol og dyrket ved den angivne temperatur. (B) Western blotting af LA Gag- og Pgkl-proteinniveauer af stammer i fig. 2A. Molekylvægtmarkører er angivet til højre. (C) LA RNA blev kvantificeret ved qPCR og normaliseret til endogent ACT1 RNA. Gennemsnitligt RNA-niveau og SD er vist. n=5. *P < {{10}}.05, **P < 0.01, ***P < 0,001 (uparret elevs t-test). (D) Punktanalyse af stammer, der er defekte i tre parallelle antivirale veje, der indeholder et plasmid, der udtrykker NUC1, er vist. Stammer spottes på -URA-medier eller syntetiske komplette (SC)-medier suppleret med 0,1 % 5-fluororotinsyre (5-FOA).

En anden genkategori identificeret ved hjælp af vores bioinformatiske screening var genekspression. CDC73 og SPT3 koder for underenheder af de konserverede kromatin-associerede komplekser henholdsvis PAF1 og SAGA. Både cdc73∆ og spt3∆ forårsagede LA-afhængig dødelighed, når de kombineres med nuc1∆ ski3∆ (tabel 1). Fordi SAGA (SptAda-Gcn5-Acetyltransferase) har vist sig at opregulere antiviral genekspression i kastanjesvampen Cryphonectria parasitica, undersøgte vi dette kompleks yderligere (51). En spt3∆ nuc1∆ dobbelt-mutant stamme akkumulerede øgede niveauer af Gag og udviste LA-afhængig dødelighed ved høje temperaturer (SI Appendiks, Fig. S4 B og C). SAGA er et stort proteinkompleks, og vi bekræftede, at deletioner i flere andre SAGA-underenhedskodende gener havde de samme fænotypiske konsekvenser som spt3∆ (SI-tillæg, tabel S1 og S4C). Sammen med resultaterne fra C. parasitica tyder disse resultater på, at SAGA-komplekset kontrollerer antiviral genekspression i forskellige svampearter.

Screening for høj kopiundertrykkelse identificerer gær-antivirale faktorer, der også er antivirale hos mennesker.

Da XRN1-overekspression undertrykte vækstdefekterne af en nuc1∆ ski3∆-stamme, antog vi, at overekspression af andre antivirale faktorer ville producere en lignende effekt, som kunne bruges som en skærm til at identificere nye antivirale systemer. Vi brugte en højkopi plasmidsuppressionsskærm til at detektere gener, hvis overekspression lindrede den betingede dødelighed af en nuc1Δ ski3Δ-stamme (Metodedetaljer). Ved hjælp af denne skærm identificerede vi SRO9, SLF1 og PAB1 som højkopi-undertrykkere af nuc1∆ ski3∆, som alle koder for ribosom-associerede RNA-bindende proteiner (fig. 3A) (52, 53). Sro9 og Slf1 er paraloge lupus-autoantigen (La) domæneholdige proteiner, der bredt findes i eukaryoter. Navnlig blev deres humane homolog, Larp1, for nylig identificeret i screeninger for proteiner bundet til SARS-Cov-2 plus streng ssRNA eller nukleocapsid (32, 54). Larp1 var et stort fokus i en af ​​disse undersøgelser og viste sig at dæmpe SARS-Cov-2 replikation i humane celler, selvom dens mekanisme ikke er kendt (32). PAB1 koder for det meget konserverede PolyA-bindende protein, som er et fælles mål for viral hæmning hos mennesker gennem forskellige mekanismer (33). Vi fandt, at overekspression af PAB1 eller SRO9 markant reducerede Gag-niveauer i en nuc1∆ ski3∆-mutant, hvilket forklarer deres reddende fænotyper (fig. 3B). Mærkeligt nok, selvom SLF1 overekspression reddede nuc1∆ ski3∆ vækstdefekten lige så godt som SRO9, førte det ikke til nogen reduktion i Gag-niveauer (fig. 3 A og B). Disse resultater tyder på, at PAB1 og SRO9 redder celler ved at undertrykke LA-replikation, og at SLF1 beskytter celler mod de patogene konsekvenser af forhøjet viral replikation.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Et højt LA-kopital fører til cytotoksisk proteostatisk stress.

For at få indsigt i de divergerende mekanismer af Sro9 og Slf1 antivirale aktiviteter overvejede vi, hvad de fysiologiske konsekvenser af LA patogenese kunne være, og hvordan SRO9/SLF1 kunne påvirke dem forskelligt. Vi bemærkede en tidligere undersøgelse, hvor deletioner af NUC1 eller af SKI-komplekse gener førte til svag induktion af et GFP-reportergen kontrolleret af Hsf1 (55), en konserveret transkriptionsfaktor, der registrerer proteostatisk stress og aktiverer genekspressionsresponsen (56-58) ). Ved hjælp af flowcytometri med denne reporter (HSE-GFP) bekræftede vi disse resultater og bestemte, at en nuc1∆ ski3∆ dobbeltmutant forårsagede synergistisk og LA-afhængig aktivering af HSE-GFP (Fig. 3C og SI Appendiks, Fig. S5). Vi antog, at den massive produktion af Gag observeret i nuc1∆ ski3∆ mutanter stod for denne proteostatiske stressrespons. Til støtte for dette blev HSE-GFP-aktivering af en nuc1∆ ski3∆ dobbeltmutant vendt tilbage ved PAB1 eller SRO9 overekspression, hvilket afspejlede disse geners konsekvenser for Gag-akkumulering (fig. 3 B og C). Især forhindrede overekspression af SRO9-paralog SLF1 ikke HSE-GFP-aktivering. Evolutionær divergens af de paralogiske SRO9- og SLF1-gener har således resulteret i forskellige antivirale mekanismer, hvor SRO9 undertrykker viral proteinakkumulering og associeret proteostatisk stress og SLF1 tilsyneladende beskytter cellerne mod de toksiske konsekvenser af viral-induceret proteostatisk stress.

Fig. 3. Overekspression af translationskontrolfaktorer lindrer LA-patogenese. (A) Plettest-vækstanalyser af højkopi-suppressorerne SRO9, SLF1 og PAB1 er vist. Stammer blev spottet på -LEU-medier indeholdende enten glucose eller glycerol og dyrket ved de angivne temperaturer. (B) Western blotting for LA Gag-, Pgk1-, Sro9- og Slf1-proteinniveauer i stammerne fra 3A. Molekylvægtmarkører er angivet til højre. (C) Flowcytometri blev brugt til at måle HSE GFP-ekspression i de angivne stammer (n {{10}}). Den første og tredje kvartil er markeret med de grå felter. Median GFP-intensiteten er markeret med de sorte bjælker indeni. *P < 0.05, **P < 0,01, ***P < 0,001 (ikke-parret elevs t-test). (D) Fluorescensmikroskopi af Hsp104-GFP i angivne stammer. Celler blev farvet med DAPI for at visualisere kerner. (Skalabjælke, 1 μm.) Procentdelen af ​​celler med 3+ GFP-foci er vist til højre. n=3. 75 til 140 celler blev talt for hvert replikat.

Proteostatisk stress er ofte forbundet med akkumulering af cytotoksiske proteinaggregater, der kan visualiseres ved hjælp af GFP fusioneret til proteindisaggregasen Hsp104, et direkte mål for Hsf1-transkriptionel aktivering, som vides at co-lokalisere med proteinaggregater (59, 60). For yderligere at udforske de proteostatiske defekter forbundet med LA-patogenese brugte vi fluorescensmikroskopi til at visualisere Hsp104-GFP-foci i en række forskellige stammer. Som forventet akkumulerede vildtypeceller dyrket ved 30 grader sjældent observerbare Hsp104-GFP-foci. Mens nuc1∆ og ski3∆ enkeltmutanter lignede vildtype, udviste en nuc1∆ ski3∆ dobbeltmutant mere end 25 % af celler med tre eller flere Hsp104-GFP foci (fig. 3D). Som med alle andre fænotyper, vi har observeret for nuc1∆ ski3∆, var akkumuleringen af ​​Hsp104-GFP-foci afhængig af tilstedeværelsen af ​​LA (fig. 3D). Disse resultater viser, at høj viral belastning forårsaget af deletion af NUC1 og SKI3 førte til akkumulering af Hsp104-GFP-foci, der indikerer cytotoksisk proteinaggregering.

Da LA-patogenese var korreleret med proteostatiske defekter, antog vi, at Hsf1 ville fungere som en antiviral faktor. Sletning af HSF1 er dødelig, så vi brugte den temperaturfølsomme allel hsf1-848 fra en tidligere offentliggjort samling af stammer (61). hsf1-848-allelen udviste fravær af vækst ved 39 grader, en mellemvækstfænotype ved 37 grader og ingen tilsyneladende vækstdefekt ved 35 grader (fig. 4A). Plettestassays viste, at hsf1-848-vækstfænotyperne ved 35 grader og 37 grader blev stærkt forbedret, når de blev kombineret med enten nuc1∆ eller ski3∆, og at disse vækstdefekter blev vendt i stammer, der manglede LA-virus (fig. 4A) . Som forventet fortsatte uoverkommeligheden af ​​alle hsf1-848 mutantstammer i celler dyrket ved 39 grader uanset tilstedeværelsen af ​​LA. Desuden viste vi ved hjælp af tetrad-dissektioner, at hsf1-848 nuc1∆ ski3∆ triple mutanter var uoverkommelige ved den tilladelige temperatur, hvis de var inficeret med LA, men sunde, hvis de var afledt af en LA0-stamme (SI) Tillæg, Fig. S6). Ved hjælp af western blotting fandt vi ud af, at hsf1-848 nuc1∆ og hsf1-848 ski3∆ akkumulerede øgede mængder af LA Gag sammenlignet med de enkelte mutanter (fig. 4B). Sammen med vores cellebiologiske undersøgelser tyder disse resultater på, at den Hsf1-regulerede proteostatiske stressrespons fungerer som et antiviralt system i gær, der modsætter sig de patogene konsekvenser af udbredt LA-replikation.

Da proteostatiske defekter vides at blive forværret og føre til cytotoksicitet ved høje temperaturer (59), tilskriver en simpel model de dødelige konsekvenser af LA-patogenese ved høje temperaturer til katastrofalt proteostatisk stress. For yderligere at teste denne model behandlede vi stammer med azetidin-2-carboxylsyre (AZC), en prolinanalog, der er inkorporeret i proteiner, der fører til ortostatisk stress (38). Disse eksperimenter viste, at nuc1∆ ski3∆ udviste stærk følsomhed over for AZC på en måde, der var afhængig af LA-viruset (fig. 4C og SI-tillæg, fig. S6). Yderligere fandt vi, at nuc1∆ ski3∆ udviste følsomhed over for 5 % ethanol, en tilstand, der også forårsager proteostatiske defekter, men ikke til 0.5 M NaCl, som forårsager osmotisk stress (SI Appendiks, Fig. S6). Disse resultater tyder på, at de dødelige konsekvenser af LA-patogenese specifikt skyldes overvældende proteostatisk stress.

Fig. 4. Varmechok-reaktionen undertrykker LA-patogenesen. (A) Pletanalyse af stammer, der er defekte i HSF1, NUC1 og SKI3 med eller uden LA er vist. Stammer blev spottet på SC-medier indeholdende glucose og dyrket ved den angivne temperatur. (B) Western blotting for LA Gag- og Pgk1-proteinniveauer af angivne stammer. Molekylvægtmarkører er angivet til højre. (C) Pletanalyse af stammer behandlet med den proteotoksiske prolinanalog, azetidin-2-carboxylsyre (AZC), er vist. Stammer blev spottet på SC-medier indeholdende glucose suppleret med eller uden 0,1 mg/ml AZC og dyrket ved 30 grader.

Diskussion

På trods af dets allestedsnærværende tilstedeværelse i laboratoriestammer, har undersøgelser af LA dsRNA-virus været begrænset på grund af dets tilsyneladende godartede natur. Her viser vi, at LA har dybtgående konsekvenser for gær, når dets replikation er ukontrolleret, og at forskellige medfødte immunsystemer opretholder LA-replikation på et acceptabelt niveau. Specifikt viser vi, at i stammer, der mangler de parallelt virkende NUC1- og SKI3-antivirale gener, er LA-replikation massivt opreguleret, hvilket fører til ortostatisk stress og betinget dødelighed ved høje temperaturer. Ved at udnytte denne nye opdagelse brugte vi bioinformatiske og fremadgående genetiske screeninger til at identificere nye gærgener, der fungerer til at begrænse LA-replikation eller beskytte celler mod de patogene konsekvenser af uhæmmet LA-replikation. Da disse screeninger ikke var mættende, koder gærgenomet sandsynligvis for adskillige andre antivirale faktorer. Mange indsigtsfulde undersøgelser er blevet udført i gær, der studerer replikationen af ​​eksogent introducerede virale RNA'er fra andre organismer, og det vil være interessant at afgøre, om de LA antivirale faktorer virker på samme måde på disse virale RNA'er (62, 63).

I betragtning af den klare risiko for LA-infektion, er det gådefuldt, hvordan det ikke desto mindre fortsætter i lyset af den altid tilstedeværende antiviral aktivitet. En forklaring på dette paradoks kan være, at LA giver en modvægt. En mulig fordel ved LA er, at det gør det muligt for nogle stammer at opretholde satellitvira, der koder for udskilte toksiner, der dræber tilstødende uinficerede celler. Imidlertid er LA til stede i mange stammer, der mangler "Killer"-satellitter, så denne forklaring er utilstrækkelig til at forklare persistensen af ​​LA-infektion. Vi spekulerer således i, at LA kan have nogle kryptiske fordele, der modvirker dets skadelige potentiale.

Vores opdagelse af Rex2 som en viral svækkelsesfaktor udvider arsenalet af kendte mitokondrielle antivirale faktorer ud over Nuc1 og antyder, at mitokondrier er et vigtigt antiviralt knudepunkt i gær. Faktisk tjener mitokondrier centrale roller i viralt forsvar som en programmeret celledødsregulator og som en platform for antiviral signalering hos mennesker. Hvordan dæmper mitokondrielle nukleaser en virus, der findes i cytosolen i gær? En mulighed er, at disse enzymer, selvom de er målrettet mod mitokondrier, ikke desto mindre kan akkumulere til lave, men tilstrækkelige niveauer i cytosolen til at opnå LA-dæmpning direkte. I overensstemmelse med denne hypotese viste vi tidligere, at Nuc1 akkumuleres i cytosolen af ​​meiotiske celler, selvom vores metoder ikke kunne påvise det i mitotiske cellers cytosol (27). En anden hypotese er, at nogle aspekter af LA-replikationscyklussen forekommer i intim forbindelse med mitokondrier. For eksempel kan LA-transkripter associere med og muligvis krydse mitokondrierne og udsætte dem for Nuc1 og/eller Rex2. Vores resultater fremhæver den potentielle generelle betydning af mitokondrier for viral medfødt immunitet i eukaryoter og placerer gær-LA-systemet som en kraftfuld model for yderligere undersøgelser af dette emne.

Det antivirale SKI-kompleks, der er forbundet med oversættelse af ribosomer, og vores identifikation af Pab1, Sro9 og Slf1 som højkopi-undertrykkere af LA-patogenese afslører yderligere det oversættende ribosom som et centralt knudepunkt for gær-antiviral aktivitet. Opdagelsen af, at PAB1 (polyA-bindende protein) undertrykker LA, er overraskende i betragtning af fraværet af polyA-haler i LA-transkripter, hvilket tyder på, at Pab1 ikke virker direkte på LA. Tidligere fund viste, at LA-transkripter konkurrerer med polyA+-gær-mRNA'er om indfangning af 60S ribosomale underenheder for at danne translaterende 80S-komplekser (64). En model, der forklarer vores resultater, er, at Pab1 forbedrer translationen af ​​polyA-haleholdige mRNA'er, som derefter udtømmer tilgængeligheden af ​​60S-underenheder til LA-transkripter til translation. Rollerne for Sro9 og Slf1 i oversættelsen er mindre velforståede, men deres funktioner kan på samme måde relatere til konkurrencen mellem LA-transskriptioner om 60S-underenheder. Det er vigtigt, at homologerne af Pab1 og Sro9/Slf1 er involveret i humant viralt forsvar, og yderligere undersøgelser af disse gener i gær vil kaste lys over antivirale mekanismer konserveret fra gær til mennesker.

cistanche planteforøgende immunsystem

Vi identificerede en antiviral rolle for den konserverede transkriptionsfaktor HSF1 sammen med en LA-induceret proteostatisk stressrespons, der involverer akkumulering af Hsp104-GFP foci, en HSF1-aktiveret markør for cytotoksiske proteinaggregater. Disse resultater understøtter modellen, hvor LA-patogenese er forårsaget af proteotoksisk stress. Vi opdagede også antiviral funktion for SAGA-komplekset, som har vist sig at fungere som en coactivator af Hsf1-målgeninduktion efter varmechok (65, 66). Disse observationer tyder på, at høje niveauer af LA fører til den SAGA-afhængige aktivering af Hsf1-målgener, som derefter udfører den antivirale funktion, hvilket belyser et potentielt antiviralt genekspressionsprogram i spirende gær. Denne model giver mange testbare forudsigelser, der kan være relevante for viral patogenese i andre organismer. Faktisk kontrollerer human HSF1 også ekspressionen af ​​proteolytiske regulatoriske faktorer. Mens antivirale funktioner af human HSF1 er blevet beskrevet, er det uklart, hvilken rolle den ortostatiske stressreaktion spiller i dette (39). Vores resultater belyser et kraftfuldt system til at skelne Hsf1's antivirale funktion med hensyn til dens rolle i aktiveringen af ​​det proteostatiske stressrespons.

referencer

1. T. Nakayashiki, CP Kurtzman, HK Edskes, RB Wickner, gær prioner [URE3] og [PSI+] er sygdomme. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 10575-10580 (2005).

2. RB Wickner, T. Fujimura, R. Esteban, Viruss and prions of Saccharomyces cerevisiae. Adv. Virus Res. 86, 1-36 (2013).

3. T. Fujimura, R. Esteban, Cap-snatching-mekanisme i gær LA dobbeltstrenget RNA-virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108, 17667-17671 (2011).

4. JD Dinman, T. Icho, RB Wickner, Et -1 ribosomalt rammeskift i et dobbeltstrenget RNA-virus af gær danner et gag-pol-fusionsprotein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 174-178 (1991).

5. A. Bernheim et al., Prokaryote viperiner producerer forskellige antivirale molekyler. Nature 589, 120-124 (2021).

6. A. Bernheim, R. Sorek, Det pan-immune system af bakterier: Antiviralt forsvar som en samfundsressource. Nat. Rev. Microbiol. 18, 113-119 (2020).

7. AG Johnson et al., Bakterielle masterminds afslører en gammel mekanisme for celledød. Science 375, 221-225 (2022).

8. BR Morehouse et al., STING cyklisk dinukleotid-sensing stammer fra bakterier. Nature 586, 429-433 (2020).

9. G. Ofir et al., Antiviral aktivitet af bakterielle TIR-domæner via immunsignalmolekyler. Nature 600, 116-120 (2021).

10. KM Slavik et al., cGAS-lignende receptorer registrerer RNA og kontrollerer 3'2'-cGAMP-signalering i Drosophila. Nature 597, 109-113 (2021).

11. AT Whiteley et al. syntetiserer bakterielle cGAS-lignende enzymer forskellige nukleotidsignaler. Nature 567, 194-199 (2019).

12. HM Burgess, I. Mohr, Cellular 5'-3' mRNA exonuclease Xrn1 kontrollerer dobbeltstrenget RNA-akkumulering og anti-virale responser. Celleværtsmikrobe. 17, 332-344 (2015).

13. SC Eckard et al., SKIV2L RNA-eksosomet begrænser aktiveringen af ​​de RIG-I-lignende receptorer. Nat. Immunol. 15, 839-845 (2014).

14. M. Miyashita, H. Oshiumi, M. Matsumoto, T. Seya, DDX60, en DEXD/H box helicase, er en ny antiviral faktor, der fremmer RIG-I-lignende receptor-medieret signalering. Mol. Cell Biol. 31, 3802-3819 (2011).

15. CS Ng, DM Kasumba, T. Fujita, H. Luo, Spatio-temporal karakterisering af den antivirale aktivitet af XRN1-DCP1/2-aggregationen mod cytoplasmatiske RNA-vira for at forhindre celledød. Celledød Differ 27, 2363-2382 (2020).

16. RE Rigby, J. Rehwinkel, RNA-nedbrydning i antiviral immunitet og autoimmunitet. Trends Immunol. 36, 179-188 (2015).

17. F. Shiromoto et al., IL-1beta/ATF3-medieret induktion af Ski2-ekspression øger hepatitis B-virus x mRNA-nedbrydning. Biochem. Biofys. Res. Commun. 503, 1854-1860 (2018).

18. JT Brown, X. Bai, AW Johnson, Gærens antivirale proteiner Ski2p, Ski3p og Ski8p eksisterer som et kompleks in vivo. RNA 6, 449-457 (2000).

19. DC Masison et al., Decoying af cap-mRNA-nedbrydningssystemet ved hjælp af et dobbeltstrenget RNA-virus og poly(A)-mRNA-overvågning af et gær-antiviralt system. Mol. Cell Biol. 15, 2763-2771 (1995).

20. C. Schmidt et al., Kryo-EM-strukturen af ​​et ribosom-Ski2-Ski3-Ski8-helicasekompleks. Science 354, 1431-1433 (2016).

21. AM Searfoss, RB Wickner, 3' poly(A) er unødvendig til oversættelse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 9133-9137 (2000).

22. EA Toh, P. Guerry, RB Wickner, Kromosomale superkiller-mutanter af Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 136, 1002-1007 (1978).

23. A. Zinoviev, RK Ayupov, IS Abaeva, CUT Hellen, TV Pestova, Ekstraktion af mRNA fra Stalled Ribosomes af Ski Complex. Mol. Celle 77, 1340-1349 e1346 (2020).

24. SG Ball, C. Tirtiaux, RB Wickner, Genetisk kontrol af La og L-(Bc) Dsrna kopinummer i dræbersystemer af SACCHAROMYCES CEREVISIAE. Genetics 107, 199-217 (1984).

25. R. Esteban, L. Vega, T. Fujimura, 20S RNA-narnavirus trodser den antivirale aktivitet af SKI1/XRN1 i Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 283, 25812-25820 (2008).

26. PA Rowley, B. Ho, S. Bushong, A. Johnson, SL Sawyer, XRN1 er en artsspecifik virusrestriktionsfaktor i gær. PLoS Pathog. 12, e1005890 (2016).

27. J. Gao et al., Meiotisk viral svækkelse gennem en forfædres apoptotisk vej. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 116, 16454-16462 (2019).

28. LY Li, X. Luo, X. Wang, Endonuklease G er en apoptotisk DNase, når den frigives fra mitokondrier. Nature 412, 95-99 (2001).

29. BJ Thomson, Viruss and apoptosis. Int. J. Exp. Pathol. 82, 65-76 (2001).

30. MD Eastwood, SW Cheung, KY Lee, J. Moffat, MD Meneghini, Udviklingsprogrammeret nuklear ødelæggelse under gærgametogenese. Dev. Celle 23, 35-44 (2012).

31. MD Eastwood, MD Meneghini, Udviklingskoordinering af gametedifferentiering med programmeret celledød i sporulerende gær. Eukaryot Cell 14, 858–867 (2015).

32. N. Schmidt et al., SARS-CoV-2 RNA-protein-interaktomet i inficerede humane celler. Nat. Microbiol. 6, 339-353 (2021).

33. RW Smith, NK Grey, Poly(A)-bindende protein (PABP): Et almindeligt viralt mål. Biochem. J. 426, 1-12 (2010).

34. R. Grover et al., Myg1 exonuklease kobler de nukleare og mitokondrielle translationelle programmer gennem RNA-behandling. Nucleic Acids Res. 47, 5852-5866 (2019).

35. EV Koonin, Et bevaret gammelt domæne slutter sig til den voksende superfamilie af 3'-5' exonukleaser. Curr. Biol. 7, R604-606 (1997).

36. M. Szewczyk et al., Human REXO2 kontrollerer korte mitokondrielle RNA'er genereret af mtRNA-behandling og henfaldsmaskineri for at forhindre akkumulering af dobbeltstrenget RNA. Nucleic Acids Res. 48, 5572-5590 (2020).

37. Y. Zuo, MP Deutscher, Exoribonuclease superfamilier: Strukturel analyse og fylogenetisk fordeling. Nucleic Acids Res. 29, 1017-1026 (2001).

38. EW Trotter, L. Berenfeld, SA Krause, GA Petsko, JV Grey, Proteinfejlfoldning og temperaturstigning forårsager G1-stop via en fælles mekanisme afhængig af varmechokfaktor i Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 7313-7318 (2001).

39. A. Reyes, AJ Navarro, B. Diethelm-Varela, AM Kalergis, PA Gonzalez, Er der en rolle for HSF1 i virale infektioner? FEBS Open Bio 12, 1112-1124 (2022).

40. F. Weber, V. Wagner, SB Rasmussen, R. Hartmann, SR Paludan, Dobbeltstrenget RNA produceres af positivstrengede RNA-vira og DNA-vira, men ikke i detekterbare mængder af negativstrengede RNA-vira. J. Virol. 80, 5059-5064 (2006).

41. S. Welsch et al., Sammensætning og tredimensionel arkitektur af dengue-virusreplikations- og samlingssteder. Celleværtsmikrobe. 5, 365-375 (2009).

42. I. Fernandez de Castro, R. Tenorio, C. Risco, Virussamlingsfabrikker i en lipidverden. Curr. Opin. Virol. 18, 20-26 (2016).

43. YX Liu, CL Dieckmann, Overproduktion af gærviruslignende partikler af stammer, der mangler en mitokondriel nuklease. Mol. Cell Biol. 9, 3323-3331 (1989).

44. AW Johnson, RD Kolodner, Syntetisk dødelighed af sep1 (xrn1) ski2 og sep1 (xrn1) ski3 mutanter af Saccharomyces cerevisiae er uafhængig af dræbervirus og foreslår en generel rolle for disse gener i translationskontrol. Mol. Cell Biol. 15, 2719-2727 (1995).

45. C. Stark et al., BioGRID: Et generelt lager for interaktionsdatasæt. Nucleic Acids Res. 34, D535-539 (2006).

46. ​​L. Espert et al., ISG20, en ny interferon-induceret RNase specifik for enkeltstrenget RNA, definerer en alternativ antiviral vej mod genomiske RNA-vira. J. Biol. Chem. 278, 16151-16158 (2003).

47. T. Hanekamp, ​​PE Thorsness, YNT20, en bypass suppressor af yme1 yme2, koder for en formodet 3'-5' exonuklease lokaliseret i mitokondrier af Saccharomyces cerevisiae. Curr. Genet 34, 438-448 (1999).

48. A. van Hoof, P. Lennertz, R. Parker, Tre konserverede medlemmer af RNase D-familien har unikke og overlappende funktioner i behandlingen af ​​5S, 5.8S, U4, U5, RNase MRP og RNase P RNA'er i gær . EMBO J. 19, 1357-1365 (2000).

49. M. Dwivedi, NC Laddha, R. Begum, Korrelation af øget MYG1-ekspression og dets promotorpolymorfi med sygdomsprogression og højere modtagelighed hos vitiligopatienter. J. Dermatol. Sci. 71, 195-202 (2013).

50. K. Kingo et al., MYG1, et nyt melanocytrelateret gen, har forhøjet ekspression i vitiligo. J. Dermatol. Sci. 44, 119-122 (2006).

51. IB Andika, A. Jamal, H. Kondo, N. Suzuki, SAGA-kompleks medierer den transkriptionelle opregulering af antiviral RNA-dæmpning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 114, E3499–E3506 (2017).

52. SG Sobel, SL Wolin, To gær La-motiv-holdige proteiner er RNA-bindende proteiner, der associeres med polyribosomer. Mol. Biol. Cell 10, 3849-3862 (1999).

53. A. Proweller, JS Butler, Ribosomal association af poly(A)-bindende protein i poly(A)-deficient Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 271, 10859-10865 (1996).

54. DE Gordon et al., Et SARS-CoV-2-proteininteraktionskort afslører mål for genbrug af lægemidler. Nature 583, 459-468 (2020).

55. O. Brandman et al., Et ribosombundet kvalitetskontrolkompleks udløser nedbrydning af begyndende peptider og signalerer translationsstress. Celle 151, 1042-1054 (2012).

56. J. Anckar, L. Sistonen, Regulering af HSF1-funktion i varmestressresponsen: Implikationer i aldring og sygdom. Annu. Rev. Biochem. 80, 1089-1115 (2011).

57. J. Li, J. Labbadia, RI Morimoto, Rethinking HSF1 in stress, development and organismal health. Trends Cell Biol. 27, 895-905 (2017).

58. PK Sorger, HR Pelham, Oprensning og karakterisering af et varmechokelementbindende protein fra gær. EMBO J. 6, 3035-3041 (1987).

59. EJ Solis et al., Definition af gær Hsf1's væsentlige funktion afslører et kompakt transkriptionelt program til opretholdelse af eukaryotisk proteostase. Mol. Celle 63, 60-71 (2016).

60. JR Glover, S. Lindquist, Hsp104, Hsp70 og Hsp40: Et nyt chaperonsystem, der redder tidligere aggregerede proteiner. Cell 94, 73-82 (1998).

61. Z. Li et al., Systematisk udforskning af essentiel gærgenfunktion med temperaturfølsomme mutanter. Nat. Biotechnol. 29, 361-367 (2011).

62. RY Zhao, Gær til virusforskning. Microb. Celle 4, 311-330 (2017).

63. T. Panavas, E. Serviene, J. Brasher, PD Nagy, Gær-genom-wide screening afslører forskellige sæt værtsgener, der påvirker replikation af RNA-vira. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 7326-7331 (2005).

64. Y. Ohtake, RB Wickner, Gærvirusudbredelse afhænger kritisk af fri 60S ribosomale underenhedskoncentration. Mol. Cell Biol. 15, 2772-2781 (1995).

65. SB Kremer, DS Gross, SAGA og Rpd3 kromatinmodifikationskomplekser regulerer dynamisk varmechok-genstruktur og -ekspression. J. Biol. Chem. 284, 32914-32931 (2009).

66. MD Leach et al., Hsf1 og Hsp90 orkestrerer temperaturafhængig global transkriptionel ombygning og kromatinarkitektur i Candida albicans. Nat. Commun. 7, 11704 (2016).

67. CS Sitron, JH Park, JM Giafaglione, O. Brandman, Aggregation af CAT-haler blokerer deres nedbrydning og forårsager proteotoksicitet i S. cerevisiae. PLoS One 15, e0227841 (2020).

68. L. Magtanong et al., Genetiske interaktionsnetværk for dosisundertrykkelse forbedrer cellens funktionelle ledningsdiagrammer. Nat. Biotechnol. 29, 505-511 (2011).

69. V. Bilanchone et al., Ty3 retrotransposon kaprer parrende gær-RNA-bearbejdningslegemer for at inficere nye genomer. PLoS Genet. 11, e1005528 (2015).

70. L. Ruan et al., Cytosolic proteostase gennem import af fejlfoldede proteiner til mitokondrier. Nature 543, 443-446 (2017).