Kombineret pangenomics og transcriptomics afslører kerne og redundante virulensprocesser i et hastigt udviklende svampeplantepatogen
Dec 05, 2023
Abstrakt
Baggrund
At studere genomisk variation i hurtigt udviklende patogener muliggør potentielt identifikation af gener, der understøtter deres "kernebiologi", er til stede, funktionelle og udtrykt af alle stammer eller "fleksibel biologi", varierende mellem stammer. Gener, der understøtter fleksibel biologi, kan anses for at være "tilbehør", mens "kerne"-gensættet sandsynligvis vil være vigtigt for fælles træk ved en patogenartsbiologi, herunder virulens på alle værtsgenotyper. Den hvedepatogene svamp Zymoseptoria tritici repræsenterer en af de hurtigst udviklende trusler mod global fødevaresikkerhed og var fokus for denne undersøgelse.
cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet
Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity
【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Resultater
Vi konstruerede et pangenom af 18 europæiske feltisolater, hvor 12 også blev udsat for RNAseq-transskriptionsprofilering under infektion. Ved at kombinere disse data forudsagde vi et "kerne"-gensæt omfattende 9807 sekvenser, som var (1) til stede i alle isolater, (2) mangler inaktiverende polymorfier og (3) udtrykt af alle isolater. Et stort accessorisk genom, bestående af 45% af de samlede gener, blev også defineret. Vi klassificerede genetisk og genomisk polymorfi på både kromosomale og individuelle genskalaer. Proteiner, der kræves til essentielle funktioner, herunder virulens, havde lavere end gennemsnittet sekvensvariabilitet blandt kernegener. Både kerne- og accessoriske genomer kodede for mange små, udskilte kandidat-effektorproteiner, der sandsynligvis interagerer med planteimmunitet. Viral vektor-medieret transient i planta-overekspression af 88 kandidater kunne ikke identificere nogen, som inducerede bladnekrose karakteristisk for sygdommen. Funktionel komplementering af en ikke-patogen deletionsmutant, der mangler fem kernegener, viste imidlertid, at fuld virulens blev genoprettet ved genindførelse af det enkelte gen, der udviste den mindste sekvenspolymorfi og højeste ekspression.
Konklusioner
Disse data understøtter den kombinerede brug af pangenomics og transcriptomics til at definere gener, der repræsenterer kernen og potentielt udnyttelige svagheder i hurtigt udviklende patogener.
Nøgleord
Rævehale mosaikvirus, Septoria tritici, Necrotrophic effektor, Essentielle gener, Accessoriske kromosomer, Dothideomycetes,Kromosom-ustabilitet, Mycosphaerella spp
Baggrund
Den bæredygtige kontrol af infektionssygdomme, der påvirker dyr og planter, er udfordret af udviklingen af de kausale mikroorganismer [1, 2]. De sygdomme, der er sværest at kontrollere, er dem, der er forårsaget af de hurtigst udviklende arter, som hurtigt kan reagere på selektive belastninger, herunder naturlig værtsimmunitet, ugunstige miljøforhold og/eller anti-infektionsmedicin [1, 3]. Potentialet for, at mikrobielle patogener hurtigt udvikler sig, bestemmes af flere egenskaber, herunder blandt andre; (1) hurtig livscyklus og (2) mekanismer, der fremmer seksuel reproduktion [4]. Sidstnævnte kan føre til store niveauer af stående genetisk variation, der eksisterer inden for patogenpopulationer, som kan opretholdes og forstærkes i lyset af eksterne selektive pres. Mens bestemte gener sandsynligvis vil udvise naturlig genetisk sekvensvariation, der driver deres udvikling, kan andre ikke gå tabt (eller inaktiveres ved mutation) uden at påvirke en patogens kondition. For eukaryote og prokaryote plantepatogener har denne forskel i niveauer af polymorfismer mellem gener ført til realiseringen af "to-hastigheds genomer" [5], som omfatter nogle komponenter, der hurtigt udvikler sig og menes at reagere på eksterne drivere (værtsområde og immunitet osv.), mens det langsommere udviklende sæt indeholder gener med kernehusholdning og andre væsentlige funktioner. De accessoriske og kernedele af patogengenomer kan samles til et "pangenom", som bør repræsentere tæt på det komplette sæt af gener, der er til stede i en art [6]. Størrelsen af kerne- og accessoriske dele af pangenomer varierer inden for arter af bakterier, svampe og oomyceter [7-13] og kan give en indikation af potentialet for mikrobielle populationer til at udvikle sig hurtigt til selektive tryk. Det er tænkeligt, at jo større det accessoriske pangenom er i forhold til kernen, jo bedre er disse populationer i stand til at udvikle sig hurtigt. Hvedes ascomycetsvampepatogen, Zymoseptoria tritici, er årsagsagenset til Septoria tritici plet (STB), en globalt vigtig sygdom, der truer fødevaresikkerheden [14]. Patogenet har også længe været betragtet som et modelsystem for undersøgelser af populationsbiologi og evolution [15-18]. Dette skyldes, at Z. tritici har en høj grad af seksuel rekombination, som opretholder store mængder af stående genetisk diversitet i dens populationer og tillader hurtig tilpasning på både global og lokal skala [17, 19-24]. Som en konsekvens heraf overvindes store hvedegener, der giver resistens over for Z. tritici, hurtigt [25]. Derudover mister de fleste af de meget anvendte kommercielle fungicider deres effektivitet over tid [3]. Kombinationen af disse to faktorer udgør en trussel mod den globale hvedeproduktion, som skal løses hurtigst muligt. Z. tritici er også for nylig dukket op som en ny model for patogengenomik med mange genomreferencer af høj kvalitet nu tilgængelige [26] ud over pangenomer konstrueret ud fra et stort antal individuelle isolat genomer [27, 28]. Et af de mest interessante træk ved Z. tritici-genomet er måske tilstedeværelsen af 13 kernekromosomer (1-13) fundet i alle isolater, men derefter op til yderligere 8 mindre accessoriske kromosomer (14-21), som viser tilstedeværelsen/fraværet og strukturel polymorfi mellem isolater [26, 29]. Heldigvis bærer et af samfundsreferenceisolaterne, og det første, der er fuldstændig sekventeret, det hollandske feltisolat IPO323 indsamlet i 1980'erne, 21 kromosomer, det største antal observeret til dato. Derfor fungerer IPO323 som et glimrende benchmark til at studere variation i andre isolater og som et stillads til opbygning af pangenomer.
cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet
Den aseksuelle infektionscyklus af Z. tritici er typisk for mange beslægtede plantepatogener, der påvirker mange fødevareafgrøder [30]. Disse svampe, der tilhører Mycosphaerellaceae-familien af ordenen Dothideomycetes, invaderer typisk plantevæv gennem stomata [30, 31]. Derefter følger en periode med lang asymptomatisk vækst mellem planteceller, der varer mindst 8 dage, som ender brat med dannelsen af nekrotiske bladlæsioner, en situation som for Z. tritici ser ud til at opstå som et resultat af "hyperaktivering" af planten immunitet [32-34]. Plantecelledøden er efterfølgende forbundet med dannelsen af nye sporulationsstrukturer, pyknidier, i sub-stomatale hulrum og den efterfølgende ekstrudering og spredning af nydannede pycnidiosporer i perioder med sprøjtende nedbør. Andre Dothideomycetes-svampe har vist sig at fremkalde en hyperaktivering af planteimmunitet gennem sekretion af protein-"effektorer", som genkendes i følsomme planter, hvilket resulterer i celle- og vævsdød (nekrose eller programmeret celledød). Disse nekrotrofiske svampe drager fordel af dette respons, og de involverede effektorproteiner omtales nu som nekrotrofiske effektorer [35, 36]. Selvom der er nogle foreløbige beviser for, at Z. tritici også kan anvende nekrotrofiske effektorer ved overgangen til symptomatisk vækst [37], der påberåber sig bladlæsioner, er denne hypotese ikke blevet robust testet til dato. De to gensidigt ikke-eksklusive veje til at beskytte fremtidig hvedeproduktion mod virkningen af STB er at (1) øge naturlig plantesygdomsresistens og (2) identificere nye molekylære mål, der kan udnyttes til sygdomsbekæmpelse. Ideelt set ville disse muliggøre selektiv kontrol af patogenet, mens andre miljømæssige og økologiske påvirkninger begrænses til et minimum. Patogengenomik og især pangenomics tilbyder potentialet til at forstærke begge strategier. Mens proteiner kodet af tilbehøret, hurtigt udviklende del af pangenomet kan indeholde mange gener, der interagerer med planteimmunitet (f.eks. effektorer), kan kernegenomet præsentere mål, der muterer mindre let på grund af at give negative fitness (og virulens) straffe. Af denne grund er landbrugsfungicider normalt målrettet mod kerneprocesser, som formodentlig anses for at være mindre foranderlige. Men som tidligere nævnt kan selv disse mål udvikle sig til en vis grad for at undgå kemisk hæmning, som beskrevet for mange nuværende fungicide målproteiner [3, 14]. De fleste fungicider, der er brugt til dato, har rettet sig mod et ganske snævert sæt molekylære processer (f.eks. sterolbiosyntese, respiration osv.) [3]. Der er potentielt mange andre mål, der kunne bruges til selektivt at kontrollere svampepatogener, som skulle opstå ved at kombinere og analysere flere omics-datasæt. Det høje potentiale for opdagelse understreges af det faktum, at typisk op til 40 % af alle gener identificeret i genomsekvenserne af patogene svampe (og svampe generelt) stadig er af ukendt funktion. De, der er til stede og måske konserveret i kernegenomet af patogene svampe, kan være af særlig relevans.
Pangenomics of rapidly evolving pathogens could be used to identify core, potentially specific gene sets, which could be exploited in future disease control [11]. The premise is that genes which are not evolving, in an otherwise rapidly evolving species, are most likely to be essential for either life or important for key virulence processes of the pathogen. Pangenomes themselves have, to date, largely been defined by sequencing genomic DNA from multiple members of a species. Whilst this is a critical and indispensable step in ascertaining the full potential of a species' genomics, gene expression support is perhaps overlooked for refinement of core and accessory gene calls, particularly in relation to biological processes such as pathogenicity/virulence. For example, if a core gene, predicted through genomic DNA sequence analysis, is not expressed by a successful pathogenic strain/ isolate during infection, it might be more appropriately considered accessory. Pangenome analyses on fungi and yeasts have recently emerged and have highlighted some major differences in the size of core and accessory gene components. For example, one recent study which analyzed the animal pathogenic yeasts, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, the free-living yeast, Saccharomyces cerevisiae, and the animal filamentous fungal pathogen Aspergillus fumigatus, predicted each to have >80 % gener annoteret som kerne [10]. Imidlertid har andre analyser på plante-associerede flamentøse svampe forudsagt større accessoriske genkomponenter, herunder ~38% for patogenerne Claviceps purpurea [38] og ~44% i Pyrenophora tritici-repentis [39]. Tidligere omfattende pan-genomiske undersøgelser af Z. tritici har brugt globale og historiske populationer, der involverer store isolatantal, som er blevet sekventeret på både fragmenterede og komplette genomskalaer [27, 28]. Disse undersøgelser identificerede et stort accessorisk gensæt (~40% af alle gener) for denne art. Derudover var dette korreleret med omfattende tilstedeværelse/fravær og kromosomale strukturelle polymorfier, hvilket også implicerede dynamiske gentagne elementer (herunder transponerbare elementer). Yderligere analyse antydede også, at mange accessoriske gener også er lavere udtrykt (i gennemsnit) end kernegener. Disse undersøgelser repræsenterer "guldstandarden" for strukturen af Z. tritici arten pangenom og den mest omfattende til dato for enhver filamentøs svamp. Spørgsmålet er dog stadig for denne og andre arter, i hvilket omfang pangenomics kan bruges til at identificere kernevirulensgener og -processer. Og inden for kernegensættene, om niveauer af populationsdækkende polymorfismer, der påvirker aminosyreændringer, såvel som genekspressionsniveauer, forråder identiteten af nøglepatogenvirulensgener?
I denne undersøgelse har vi kombineret genomsekventering og RNAseq-baserede transkriptomiske tilgange for at producere et pangenom fra en nylig europæisk samling af Z. tritici-isolater. Vores hovedformål var at teste, om gener, der er til stede i kernegenomet, der koder for proteiner med lav frekvens af aminosyrepolymorfi (dvs. i kodende sekvenser) mellem isolater, har vigtige funktioner, herunder vigtige roller i kerneinfektionsprocesser på hvede. I overensstemmelse med de tidligere undersøgelser [27, 28] viser vi, at Z. tritici har et ekstremt stort accessorisk genom (~45% af alle gener), der understøtter dets hurtigt udviklende status. Desuden leverer vi biologiske data, der klart understøtter nytten af den kombinerede brug af begge omics-metoder til at identificere nye kernevirulensgener. Omvendt mislykkedes high-throughput viral-medierede funktionelle protein-overekspressionsscreeninger med at identificere nogen kandidat nekrotrofiske efektorer, der var ansvarlige for at fremkalde sygdomslæsioner i hvedeblade, fra enten kerne- eller accessorisk pangenom.
cistanche planteforøgende immunsystem
Resultater
Virulensskærme på en europæisk Z. tritici-samling identificerer lignende aggressive stammer fra geografisk uforbundne steder
Vi testede 43 Z. tritici-isolater for virulens på 21 bredt modtagelige europæiske brødhvedesorter for at give i alt 2709 datapunkter (inklusive tre replikationer). Isolationsoplysninger (kode og oprindelsesland) er præsenteret i Yderligere fil 1: Tabel S1. Hver interaktion blev vurderet kvantitativt for følgende parametre: (1) længden af inkubationsperioden, (2) den tid, det tog at nå fuldstændig nekrose (når den forekom) og (3) niveauer af aseksuel sporulering (fig. 1A). Baseret på både beregningsmæssig og visuel sygdomsscoring (se Metoder og yderligere fil 2: Fig. S1), blev alle isolater derefter grupperet baseret på deres virulensprofiler på det testede kultivarpanel (Fig. 1B). Det positive kontrol-isolat IPO323, der tjener som en global reference [26] med fuldt sekventeret genom, var mindre aggressivt end størstedelen af testede isolater mod næsten alle kultivarer. Dette isolat blev indsamlet i ~1984 og har været opbevaret siden, med lejlighedsvis genpassage gennem hvedeblade; derfor er det i øjeblikket uklart, om denne observation (i det mindste delvist) kunne være opstået fra prøveopbevaring over tid. Vi identificerede syv isolater, der ikke var i stand til at producere sygdomssymptomer på nogen af hvedesorterne (fig. 1B). Da disse isolater alle stammer fra enten Spanien eller Italien, hvor tetraploid (durum/pasta) hvede (Triticum durum L.) dyrkes hyppigere, er det sandsynligt, at disse isolater var hård hvede-specifikke [40, 41]. Det er væsentligt, at isolater med lignende virulensprofiler ikke klyngede sig på deres indsamlingssted, med isolater, der stammede fra så langt øst som Slovakiet til så langt vest som Irland, alle grupperede sig (fig. 1B). Denne observation stemmer godt overens med høje niveauer af genetisk variation mellem isolater og tidligere undersøgelser, som har vist, at dette er lige så højt på skalaen af en enkelt hvedebladlæsion som på tværs af kontinenter [42]. Mange af de mere aggressive isolater med distinkte virulensprofiler blev efterfølgende udvalgt til genomisk sekventering (fremhævet med "#" i fig. 1B) og RNAseq-analyse (fremhævet med "+" i fig. 1B).
Fig. 1 Virulensvurderinger af den europæiske isolatsamling mod en række hexaploide (brød)hvedesorter. Et typisk tidsforløb for sygdomsprogression, der illustrerer parametrene vurderet på skærmen, inklusive den tid, det tager, før de første synlige symptomer opstår, og til fuld bladnekrose vises i det podede område. Figuren viser infektionen af hvedesorten Riband med Z. tritici isolat IPO323. B Virulensprofil for isolaterne vs. sortspanelet baseret på niveauer af bladnekrose og chlorose. Målinger blev foretaget ved både visuelle vurderinger og ved at bruge LemnaTec og LemnaGrid billedanalysesoftware med sammenlignelige endelige resultater. Isolater blev rangeret og grupperet baseret på virulensdata. Z. tritici-isolater fremhævet med # blev genomsekventeret for at konstruere et pangenom. Isolater fremhævet med + blev også analyseret ved RNAseq transcriptomics. Hvedesort Panorama (fremhævet med X) blev bestemt til at være lige og fuldt modtagelig for de fleste isolater og blev valgt som værtsgenotype for bladinfektionen RNAseq. Bemærk, at de lave virulensdata for udgruppen af syv isolater mod alle kultivarer sandsynligvis skyldes, at disse isolater er tilpasset til at forårsage sygdom på tetraploid hvede (Durum eller Pasta). Alle data er repræsentative for tre inficerede blade analyseret/interageret med fra to biologiske gentagelsesforsøg (6 blade i alt). C SplitsTree-analyse af den molekylære fylogeni af isolater udvalgt til genomisk sekventering. Oprindelseslandet for isolater er vist i forkortelsen (Pl=Polen; GB=Storbritannien; Be=Belgien; Cz=Tjekkiet; Ge {{8 }} Tyskland; SV=Sverige; Fr=Frankrig; Sl=Slovakiet; Ir=Irland). Referenceisolatet, IPO323 indsamlet ~1984 fra Holland (Ne) er også repræsenteret
Genomsekvens og fylogenetisk analyse på sytten europæiske isolater afslører høje niveauer af genetisk diversitet
We used Illumina HiSeq 250 bp paired-end read technology to assemble the gene space of seventeen new isolates (indicated by # in Fig. 1B). BUSCO analysis (core dataset Pezizomycotina) was then performed to assess the completeness of each genome assembly (Table 1). Scores >97% i alle tilfælde indikerede god samling af genrummet (kodende regioner) for alle isolater. Nogle få udvalgte BUSCO-gener manglede fra alle samlinger, hvilket tyder på, at Z. tritici muligvis ikke har ortologer af disse gener. For at bestemme mængden af genetisk variation, der påvirker forudsagte kodende regioner, kørte vi derefter en SNPEf-analyse for hver stamme mod et pangenom bygget på det komplette genom af referenceisolatet IPO323 (tabel 2). Denne analyse viste, at hver ny stamme havde mere end 160,000 SNP'er mod det afledte pangenom. Blandt disse var mere end 65,000, som enten forårsagede et potentielt tab af proteinfunktion (høj effekt, rammeskift, mistet start, for tidlige stopkodoner) eller fremkaldte en aminosyreændring i forudsagte proteiner (moderat). Disse data demonstrerede den genetiske diversitet, der eksisterer mellem Z. tritici-isolaterne.
En splits tree-analyse blev udført på de 17 nyligt sekventerede stammer og IPO323 for at bestemme, om isolater med lignende kultivarinfektionsmønstre havde nogen fylogenetisk sammenhæng, og om dette var forbundet med oprindelseslandet. Fylogeni blev bestemt ved hjælp af en sammenkædning af seks kodende og ikke-kodende sekvenser (se Metoder og yderligere fil 3: Data S1). Træet (fig. 1C) illustrerer endnu en gang, at der ikke var nogen klar sammenhæng mellem virulensprofiler og prøveudtagningssted for de sekventerede isolater, med tæt beslægtede virulensprofiler (sammenlignet med fig. 1B) set for isolater indsamlet fra forskellige europæiske lande, som ikke desto mindre var fylogenetisk nært beslægtet.
Pangenom konstruktion og analyse forudsiger 9807 "kerne" og 8083 "accessoriske" gener
Ud over genomsekvenserne udvalgte vi 12 isolater til RNAseq-baseret transkriptionsprofilering (angivet med + i fig. 1B). Hvert isolat blev profileret i tre eksemplarer under axenisk vækst i YPD-bouillon og også ved to uafhængige stadier af bladinfektion; 6 dage efter inokulering (dpi), der repræsenterer den midterste symptomfri fase og 9 dpi, i overgangsfasen af tidlig symptomudvikling. Den universelt modtagelige hvedesort Panorama blev brugt til infektionsassays, som alle isolater var i stand til fuldt ud at inficere med uskydelig kinetik. Ved at bruge disse transkriptomdata kombineret med de nye genomsamlinger og den oprindelige referencesekvens for IPO323 som stilladset, bestemte vi et pangenom for de europæiske isolater, der også inkorporerede sekvenser til stede i andre isolater, som ikke blev påvist i IPO323. Trinene i pangenomkonstruktionen og vores kriterier for at kategorisere generne som "kerne" eller "tilbehør" er vist i fig. 2. Vigtigt, inaktiverende (høj effekt, tab af funktion-LoF) sekvenspolymorfi og tilstedeværelse og fravær, overvejelser blev også understøttet af beviser for genekspression. Derved bør et gen være til stede i en funktionel form og udtrykt af alle isolater, for at blive tildelt kategorien "kerne". Vores overordnede tilgang (fig. 2) definerede et samlet pangenom på 17.890 gener inklusive 2017, som ikke var til stede i IPO323. De efterfølgende filtreringstrin kategoriserede 9807 til at ligge i kernegenomet, med kun et lidt mindre antal, 8083, i tilbehørssættet. Sidstnævnte repræsenterer ~45% af det samlede pangenom, en lille stigning i forhold til det tidligere beskrevne [28]. Selvom disse tal generelt stemmer godt overens, er estimater af accessoriske gener mere subjektive over for bias på grund af de anvendte metoder (Panseq osv.), og vi kan ikke antage, at yderligere fremtidig analyse muligvis ikke reducerer det accessoriske gennummer ved brug af for eksempel ortologi-baseret tilgange. Alle pangener blev analyseret for flere funktioner (forudsigelser af sekretion, membranassociation, lokalisering og cysteinindhold) og forudsagte funktioner (BLAST-, GO- og Interpro-annoteringer). En tabel, der giver alle tilgængelige oplysninger om alle gener, er tilvejebragt (Yderligere fil 4: Tabel S2). Tabellen viser også de relative gennemsnitlige RNAseq-afledte genekspressionsniveauer bestemt for alle gener for alle 12 isolater under de tre testede betingelser. Samlet set, når det også sammenlignes med de tidligere pan-genomiske undersøgelser af denne organisme [27, 28], er det klart, at Z. tritici har en af de største antal accessoriske genetiske komponenter af svampe, der er undersøgt til dato, hvilket sandsynligvis afspejler dens hurtige udvikling natur.
Tabel 1 BUSCO-analyse af nye genomer
Tabel 2 Oversigt over SNP-effektpåvirkninger for hvert nyt genom versus IPO323-referencegenmodellerne
Fig. 2 Sammenfatning af de trin, der blev brugt til at generere "kerne" og "accessoriske" genkald og numre for det nykonstruerede europæiske Z. tritici pangenom. Tallene repræsenterer antallet af gener identificeret på hvert trin i pipelinen
Strukturelle træk ved variation i det europæiske Z. tritici pangenom
Målet med denne undersøgelse var at teste hypotesen om, at pangenomics kunne udnyttes til at identificere vigtige nye gener, enten essentielle for liv eller for virulens i patogene organismer. Vi antog, at disse gener ville være til stede og funktionelle i og udtrykt af enhver stamme af patogenet. Vi spekulerede yderligere i, at disse gener ville have lavere niveauer af SNP-mutationer med høj og moderat effekt, der påvirker kodende sekvenser (mindre polymorfe), og at de kan klynge sig i områder på bestemte kromosomer.
Vi brugte SNP-variationsdata (høj, moderat og modifikator - se yderligere fil 4: Tabel S2) såvel som gennemsnitlige ekspressionsdata for alle gener til at undersøge gennemsnitlige niveauer af kodende polymorfi og ekspression på kromosombasis ved hjælp af de 21 kromosomer af IPO323 som stillads. Modifikator-SNP'er repræsenterer nukleotidændringer, der ikke fremkalder en aminosyreændring. Figur 3A viser, at der ikke eksisterede nogen særlig skævhed for mutationsfrekvens, når kumulative høje, moderate og modificerende SNP'er blev udtrykt som et træk ved den gennemsnitlige proteinlængde pr. hele kromosom. Men når modificerende mutationer, dvs. dem, der ikke forårsager en aminosyreændring, blev udeladt, var det klart, at de mindste 8 kromosomer besad gener med højere antal høje og moderate SNP-mutationer (fig. 3B). Denne effekt blev yderligere understreget, når kun høj-effekt SNP'er blev analyseret (fig. 3C). I modsætning til niveauerne på kernekromosomerne 1-13 (~20%), var op til 90% af generne på de otte mindste kromosomer 14-21 udsat for høj effekt, sandsynligt tab af funktionsmutationer i mindst én isolat (fig. 3C). De kumulative transkriptionsdata fra alle 12 nye isolater viste også relativt lav gennemsnitlig ekspression af gener til stede på kromosomerne 14-21 (fig. 3D), som tidligere var blevet observeret for IPO323 [32, 43, 44]. Tilsammen indikerer disse data en klar genomisk kompartmentalisering, hvor de mindste otte accessoriske kromosomer huser sekvenser, der er meget polymorfe, accessoriske og generelt dårligt udtrykt.
Sammenligning af alle gener i enten kerne- eller accessorisk genom afslørede, at ~60 % af alle gener i sidstnævnte blev fundet i mindst én stamme med en høj effekt (tab af funktion (LoF)) mutation, og at 47 % også var fraværende fra kl. mindst én stamme (Yderligere fil 4: Tabel S2). I lighed med analysen på de accessoriske kromosomer var individuelle accessoriske gener også meget dårligt udtrykt generelt på tværs af de testede isolater (Yderligere fil 4: Tabel S2) og havde et langt højere antal sekvenser med ukendte funktioner (ca. 80%). Disse observationer sammenligner godt med tidligere pan genomiske undersøgelser udført på globale samlinger af Z. tritici indsamlet med årtier fra hinanden [27, 28].
Vi udførte også en gen-for-gen tilstedeværelse og fravær variation (PAV) analyse for alle gener forudsagt i reference isolatet IPO323, for de andre 17 sekventerede isolater. Disse tilstedeværelse/fravær data blev plottet positionelt for hvert gen på tværs af hvert af de 21 kromosomer, der er til stede i IPO323. Figur 3E og F viser data fra repræsentative kernekromosomer (1 og 7), mens figur 3G og H viser data for repræsentative accessoriske kromosomer (13 og 14). Data for de resterende kromosomer er vist i yderligere fil 2: Fig. S2. Denne analyse identificerede mange gener til stede i IPO323, som mangler i en række af de re-sekventerede isolater og viser tydeligt forskellen i generel gentilstedeværelse/fravær mellem "kerne"-kromosomerne i IPO323 (som findes i hver Z. tritici-stamme) sammenlignet med de 8 mindste "accessoriske" kromosomer. Dataene fremhæver også en region på især kromosom 7, mellem 1,7 Mb og 2,5 Mb, som viser en høj frekvens af genfravær i de nye isolater (fig. 3F). Interessant nok matcher denne region nøjagtigt en genomplacering, der tidligere er set at have minimal eller ingen genekspression i IPO323 enten under vækst i kultur eller under enhver fase af planteinfektion [32, 43]. Denne region matcher også en kromosomal deletion, som blev observeret i et yemenitisk isolat i en tidligere pangenomundersøgelse [28]. Tilsammen forstærker disse data forestillingen om, at Z. tritici repræsenterer en organisme i hurtig udvikling med høje niveauer og forskellige typer af genetisk og genomisk mangfoldighed inden for dens befolkning.
Proteinlokaliseringsforudsigelser afslører gener i det accessoriske pangenom, der kan fungere i tilpasning til skiftende miljøer
WolfPsort-proteinlokaliseringsforudsigelser blev kørt på alle proteinerne kodet af pangenomet. Vi beregnede derefter den relative procentdel af proteiner, der forventes at lokalisere sig til hver subcellulær region som et træk ved det samlede antal proteiner for kerne- eller accessorisk pangenom (fig. 4). Adskillige lokaliseringskategorier blev beriget i kernegenomet, herunder "cytoplasma", "ekstracellulær" og "plasmamembran", hvoraf sidstnævnte indeholder mange nøgletransportfunktioner (fig. 4). Tværtimod var lokationerne "kerne" og "mitokondrier" forbundet med en højere procentdel af gener i det accessoriske genom (fig. 4). Det accessoriske genom blev beriget for særlige zinkbindende domæner, som kan give transkriptionsfleksibilitet. Berigelsen af denne kategori blev også rapporteret i et tidligere pangenomstudie, der fremhævede, at vores samlede pipeline genererede sammenlignelige resultater [27, 28]. Den "mitokondrielle" berigelse er interessant, da der findes pseudogener og paraloger af bonafide mitokondrielle proteiner, som er målrettet af antifungale kemier. Et tydeligt eksempel i det accessoriske pangenom er en paralog af en succinatdehydrogenaseunderenhed C (SDHC3), som har vist sig at mediere stående resistens mod en underklasse af SDHI (succinatdehydrogenasehæmmer) fungicider i Z. tritici [45]. Vi identificerede komplette sekvenser af dette gen i kun tre af de sytten sekventerede isolater, og vi påviste et højt niveau af genekspression i kun én af de 12 efterfølgende undersøgt af RNAseq (fig. 5B). Ikke desto mindre understreger den tidligere undersøgelse og vores nuværende analyse, at der faktisk er vigtige funktioner i det accessoriske genom, men at disse sandsynligvis er vigtigere for tilpasning til skiftende miljøer end for kernelivsstilen.
Fig. 3 Pangenom strukturelle træk og tilstedeværelse/fravær polymorfismer på tværs af de 21 kromosomer af referenceisolat IPO323. Et samlet antal kumulative SNP-mutationer, der giver modificerende, moderate (M) og høje (H-tab af funktion-LoF) påvirkningsændringer udtrykt som et træk ved den gennemsnitlige proteinlængde (aa) pr. kromosom. B Samlet antal kumulative SNP-mutationer, der giver moderate og høje virkningsændringer udtrykt som et træk ved den gennemsnitlige proteinlængde pr. kromosom. C Samlet antal kumulative SNP-mutationer, der giver ændringer med høj effekt udtrykt som et træk ved den gennemsnitlige proteinlængde pr. kromosom. D Gennemsnitlig ekspression af alle gener til stede på hver af de 21 kromosomer på tværs af alle isolater. E Tilstedeværelse og fravær (PaV) polymorfi af generne forudsagt på kernekromosom 1 af isolat IPO323 i de 17 nyligt sekventerede isolater. F PaV for gener på kernekromosom 7. G PaV for gener på accessorisk kromosom 15. G–F PaV for gener på accessorisk kromosom 15. Dataene fremhæver omfattende regional variation og markerer en klar skelnen mellem niveauerne af overordnede sekvenspolymorfismer og tilstedeværelse/ fravær tydeligt på kerne- og accessoriske kromosomer
Fig. 4 Forudsagt lokalisering af proteiner kodet af kerne- og accessoriske gener. Sammenfatning af procentvise forudsagte proteinlokaliseringer bestemt af WolfPsort for kategorier angivet i forhold til det samlede antal proteiner til stede i kerne- og accessorisk pangenom
Effektorproteiner i det accessoriske genom viser mere inter-stamme variabilitet i ekspression end dem i kernen
Over otte procent af generne i kernegenomet kodede formodede udskilte proteiner, et tal højere end for det accessoriske genom (~5%). Imidlertid var gener i det accessoriske genom, der koder for secerneret protein, hyppigere af ukendt funktion og manglede genkendelige domæner eller katalytiske regioner. Disse proteiner med ukendt funktion udgjorde ~75% af det totale accessoriske sekretom i forhold til 42% for kernesekretomet. Mange af kandidat- (og i nogle tilfælde validerede) efektorer til stede i kernegenomet blev udtrykt i lignende mønstre og til sammenlignelige niveauer i alle tolv isolater analyseret af RNASeq. For eksempel blev de tre LysM (Lysin) domæne-holdige efektorer, 3LysM, 1LysM og xLysM, udtrykt til meget lignende niveauer og i identiske mønstre af hver stamme (fig. 5C-E). Te 3LysM effektor forbliver den eneste større udskilte virulensdeterminant af Z. tritici, hvor dette protein tjener til at undertrykke kitin-udløst planteimmunitet under tidlig infektion [46, 47]. Imidlertid er alle tre LysM-effekter kendt for at arbejde sammen til dette formål [48]. Det er derfor bemærkelsesværdigt, at der var meget lidt ekspressionsvariation for disse gener mellem isolater, hvilket forstærker forslag om, at denne forsvarsundertrykkelse er en kernekomponent i infektion. I modsætning hertil viste kandidateffektorer fundet i det accessoriske genom både tilstedeværelse og fravær variation og meget variabel ekspression mellem isolater (fig. 5F-H). For eksempel viser AvrStb6, den første avirulenseffektor identificeret i Z. tritici, [49, 50] betydelig ekspressionsvariation (fig. 5F), på trods af at den er til stede i alle isolater. Denne sekvensvariabel, et lille, udskilt protein, genkendes af hvedesorter, der indeholder funktionelle alleler af den receptorlignende kinase Stb6 [25, 51]. Denne anerkendelse giver sygdomsresistens mod alle isolater, der rummer en bestemt allel af denne effekt. Der var en signifikant ekspressionsvariation af AvrStb6 mellem isolater, og vi identificerede et isolat (Zt118), hvor vi slet ikke kunne påvise nogen ekspression under nogen af de tre testede betingelser. Af denne grund blev AvrStb6 i vores forudsigelsespipeline klassificeret i det accessoriske genom. Mange andre kandidateffektorer med aktuelt ukendte funktioner viste signifikant tilstedeværelse/fravær og/eller ekspressionsvariation i det accessoriske genom (fig. 5G og H).
Fig. 5 Ekspressionsvariation af gener i kerne- og accessorisk pangenom og etablering af et forbigående viralt overekspressionssystem indsat til nekrotrofiske effektorscreeninger. En nøgle til fortolkning af data er vist i figurerne. B Tilstedeværelse/fravær og genekspressionsvariation for succinatdehydrogenase-underenhed C-paralogen til stede i det accessoriske genom. C-E-ekspressionsprofiler for ZtLysM-effekterne, 3LysM, 1LysM og xLysM, alle til stede i kernepangenomet. F Udtryksprofil af avirulenseffekten AvrStb6. Manglen på ethvert udtryk i isolat 118 klassificerer efektoren i det accessoriske pangenom. G og H repræsenterer eksempler på yderligere kandidateffekter i det accessoriske pangenom.
Funktionelle screeninger giver ingen beviser for nekrotrofisk effektoraktivitet i hverken kerne- eller accessorisk pangenom
Vi har vedtaget et nyligt udviklet viralt vektor-medieret protein-transient ekspressionssystem for hvede (og andre korn- og ikke-kornafgrøder), der anvender Foxtail Mosaic-virus (FoMV), til at udføre en middel til høj gennemløbsscreening af kandidat Z. tritici-effekter fra pangenomet. Vi havde specifikt til formål at teste, om nogen havde evnen til at inducere nekrose på et lille panel af hvedesorter, hvilket kunne antyde deres funktion ved overgangen til sygdomssymptomer som "nekrotrofiske effektorer" [36, 52]. Til denne undersøgelse lavede vi nogle ændringer til det tidligere publicerede system [53]. For at drive ekstracellulær proteinsekretion i hvede brugte vi den hvedepatogenese-relaterede protein 1 (TaPR1) signalpeptidsekvens, codon-optimeret til Arabidopsis thaliana, som derefter blev fusioneret i rammen med hver kandidat svampeeffektorsekvens ved gensyntese (fig. 5I). Effektiviteten af TaPR1-signalpeptidet til at udskille funktionelle Z. tritici ekstracellulære proteiner blev fastslået ved dets evne til at inducere bladnekrose i tobak, når det placeres foran Z. tritici-nekrose og ethylen-inducerende-lignende protein (ZtNLP), som kun er funktionelt når målrettet for ekstracellulær sekretion (fig. 5 Jl) [54]. Vi bekræftede derefter, at vektoren kunne overudtrykke proteiner lige så godt på tværs af en række hvedesorter ved at visualisere lokal og systemisk ekspression af det grønne fluorescerende protein (GFP) gennem bladene af forskellige hvedesorter (Yderligere fil 2: Fig. S3). Til sidst testede vi derefter evnen af den velkarakteriserede nekrotrofiske effektor SnToxA, fra det beslægtede hvedepatogen Parastagonospora nodorum, til at inducere nekrose i hvedeblade af genotyper, der besidder Tsn1-følsomhedsgenet [55]. Som forventet inducerede FoMV-medieret overekspression af SnToxA, med TaPR1-signalpeptidet, kun nekrose på hvedesorten, der besad Tsn1 (cv Halberd i fig. 5K) uden symptomer observeret på kultivarer, der mangler dette modtagelighedsgen (cv 5K Riband i fig. ). Disse data bekræftede, at det virale vektormedierede overekspressionssystem var egnet til en større screening af kandidat Z. tritici-effektorer for at identificere enhver med nekrotrofisk effektoraktivitet. I alt 88 kandidater blev udvalgt og screenet mod fem hvedekultivarer (Yderligere fil 5: Tabel S3). Disse omfattede 66 proteiner bosat i kernepangenomet og 22 fra tilbehøret. De udvalgte gener (Yderligere fil 5: Tabel S3) spændte fra kernegener uden stammespecifikke polymorfismer (monomorfe) og høje i planta-ekspression til dem i det accessoriske genom, der udviser tilstedeværelse/fravær og/eller væsentlig ekspressionspolymorfi. I alle eksperimenter blev der kørt parallelle ToxA vs cv Halberd og cv Riband tekniske kontroller, og disse gav altid de forventede resultater. I modsætning hertil inducerede ingen af de 88 testede Z. tritici-overudtrykte proteiner nogen bladnekrose på nogen hvedekultivar. Sammenfattende gav disse resultater ikke noget bevis for nekrotrofiske virkninger og derfor ingen støtte for nogen af de testede kandidater til at inducere skiftet til nekrotrofisk vækst under infektion.
cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet
Kernegener, der koder for proteiner med påviste eller forudsagte, livsnødvendige eller vigtige virulensfunktioner har lavere overordnede niveauer af aminosyrepolymorfi
Vi udførte en litteratursøgning for at identificere alle Z. tritici-gener, der havde været genstand for funktionel karakterisering, enten i virulens eller som essentielle gener, der dateres op til 2018. Dette genererede en liste med 28 proteinsekvenser (Yderligere fil 6: Tabel S4). Tilsvarende identificerede vi en liste over 26 proteiner, der også var blevet funktionelt karakteriseret, men som havde vist sig ikke at spille en stor rolle i virulens eller være essentielle (Yderligere fil 6: Tabel S4). Vi undersøgte derefter niveauerne af kumulative overflødige høje og moderate mutationer i disse gener og udtrykte deres værdier som et træk ved hver proteinlængde og bestemte derefter gennemsnitsværdierne for sættet. Figur 6 fremhæver, at de publicerede gener, der påvirker virulens, havde en statistisk signifikant lavere frekvens (p=0.007) af mutationer (polymorfi) end dem, der har vist sig at være funktionelt overflødige.
Der er få undersøgelser, der sigter mod at definere essentielle-for-livet (essentielle) gener i trådsvampe (undtagen gær), og til dato findes der kun én repræsentant i databasen over essentielle gener (DEG), nemlig fra det opportunistiske menneskelige patogen Aspergillus fumigatus [56-58]. Vi identificerede Z. tritici-ortologen af alle 28 gener, der eksperimentelt viste sig at være essentielle for livet i A. fumigatus og beregnede igen de relative mutationshastigheder for hver i forhold til sekvenslængder (Yderligere fil 7 Tabel S5). Endnu en gang fandt vi en klar statistisk signifikant reduktion (p=0.0148) i frekvensen af høje og moderate SNP-mutationer i disse essentielle kandidatgener, dernæst observeret for gener, der viste sig ikke at være essentielle for hverken virulens eller liv ( Fig. 6). I modsætning hertil var der ingen signifikant forskel (p=0.2128) mellem mutationshastigheder for eksperimentelt validerede virulensgener og de forudsagte essentielle gener (fig. 6). Disse data understøtter tilsammen konceptet om, at niveauer af aminosyrepolymorfismer i populationer kan bruges til at forudsige genernes relative betydning for organismens kernelivsstil.
Fig. 6 Analyse af kernegensæt af eksperimentelt valideret patogenicitet og/eller forudsagte essentielle-for-livet-gener afslører lavere mutationsrater end set i ikke-essentielle gener. De gennemsnitlige høje og moderate (H/M) mutationshastigheder udtrykt som et træk ved proteinlængder (aa) for genlister, der koder for proteiner, som har været; 1- eksperimentelt bestemt til at spille ingen (eller meget mindre) roller i svampevirulens; 2-eksperimentelt bestemt til at spille en vigtig rolle i virulens og; 3-forudsagt at kode for formodede essentielle-for-livet-gener gennem ortologi til proteiner eksperimentelt karakteriseret i Aspergillus fumigatus. Stjerne (*)-symbolet angiver en statistisk signifikant forskel mellem mutationshastigheder mellem de angivne gensæt. Genlister og tilhørende polymorfidata er vist i yderligere fil 6: Tabel S4
Nytten af den kombinerede forudsigende tilgang til at afsløre patogensvaghed understøttes gennem genetiske komplementeringsundersøgelser på en fem "kerne" gendeletionsmutant
Z. tritici er egnet til at videresende genetiske screeninger baseret på tilfældig integration af T-DNA via Agrobacterium-medieret svampetransformation (AMT). Vores tidligere arbejde havde genereret en Z. tritici T-DNA-mutant i særdeleshed, som ikke var i stand til at forårsage fuld sygdom på inficerede hvedeblade (fig. 7A). Denne mutant, kaldet 23-21 (23. transformationsrunde og den 21. koloni plukket), kunne vokse normalt som vildtype på næringsrigt agarmedium (YPD), men kunne ikke udvide sammenlignelige niveauer af svampehyfer, når de blev dyrket på en næringsstofberøvet medium, herunder vandagar (fig. 7A). Vi brugte helgenom Illumina-baseret re-sekventering af 23-21 til at afsløre positionen af den potentielt forårsagende T-DNA-insertion. Denne analyse afslørede en enkelt T-DNA-integration mellem position 899878 og 912699 på kromosom 8, hvilket forårsagede en deletion/afbrydelse af fem forudsagte kodende sekvenser (fig. 7B). SNP- og indel-analyse afslørede ingen yderligere umærkede mutationer i 23-21-stammen i forhold til vildtypegenomsekvensen af IPO323. 23-21 T-DNA-deletionen fjernede effektivt fem gener, som alle findes i kernegenomet, og med følgende funktionelle (Interpro) forudsigelser; gen 1=Cytokrom P450; gen 2=S-adenosylmethioninmethyltransferase; gen 3=Zink (2) C6 type DNA bindende protein; gen 4=Nukleosid-diphosphatkinase (NDK) og gen 5=Glycosylhydrolase 31 (fig. 7B). Vi undersøgte det relative antal af høje og moderate mutationer i hvert protein som et træk ved proteinlængde, hvilket afslørede, at protein 4 (NDK) havde langt færre mutationer, der påvirkede aminosyresekvensændringer end de andre fire analyserede sekvenser på tværs af det isolerede sæt (fig. 7C og yderligere fil 2: Fig. S4). Vi undersøgte derefter den gennemsnitlige relative ekspression af alle fem gener på tværs af alle de testede isolater. Det afslørede også, at gen 4 (der koder for NDK) var signifikant højere udtrykt end alle de andre kandidater (fig. 7D og yderligere fil 2: fig. S5). Vi antog således, at tabet af det mindst polymorfe og højest udtrykte gen, gen 4, NDK, var ansvarlig for tabet af virulens og associeret defekt i forlængelse af hyfeflamenter. For at teste dette transformerede vi hvert af de fem kandidatgener tilbage individuelt til 23-21 Z. tritici mutantstammen, hver drevet af sin egen endogene promotor. Multiple transformanter blev opnået fra hver og gentestet for virulens på hvedeblade og evnen til at forlænge filamentøse hyfer på vandagar. Dette viste, at genindførelse af NDK-genet alene (gen 4) fuldt ud genoprettede både virulens og hyphal vækst til vildtype-niveauer (fig. 7E og yderligere fil 2: fig. S6). Genindførelse af hver af de andre fire kandidater forårsagede ikke nogen ændring i fænotype fra den oprindelige mutantstamme 23-21 (fig. 7E). For at sikre, at alle genindførte gener blev udtrykt i deres respektive komplementerede stamme, blev RT-PCR udført på hver af transformanterne og den oprindelige 23-21-mutant. Dette bekræftede den forventede mangel på hvert transkript i 23-21-mutanten og demonstrerede korrekt ekspression af hvert målgen i de komplementerede isolater (fig. 7F). Tus, genindførelse af det enkelte gen med de mindste populationsniveau polymorfismer af de fem kandidater, og højeste relative ekspression, genoprettede de defekte fænotyper i dette hvedepatogen. Denne eksperimentelle observation understøtter nytten af at kombinere pangenomics og transcriptomics til at forudsige gener, der er potentielt vigtige for vigtige funktionelle livstræk.
Fig. 7 Funktionelle komplementeringsassays på en ikke-patogen Z. tritici-mutant med fem geners deletion understøtter den kombinerede brug af pangenom-afledt mutationshastigheds- og ekspressionsniveauanalyse som prædiktorer for vigtige kernelivsstilsgener. A Vækst- og infektionskarakteristika for en Z. tritici tilfældig T-DNA-insertionsmutant "23-21". Stammen vokser normalt på rig næringsagar, men er defekt i filamentøs vækst på dårlig næringsagar og alvorligt kompromitteret i hvedeblads sygdomsfremkaldende aktivitet. Skala barer repræsenterer 1 cm. B Helgenom-resekventering af stamme 23-21 afslører en T-DNA-medieret deletion af en 13 kb genomisk region, der forstyrrer eller sletter fem forudsagte gener fra kernepangenomet. C Viser de gennemsnitlige høje og moderate mutationshændelser for hvert gen (mærket 1-5) fra pangenomet i forhold til kodet proteinlængde (aa)
Diskussion
Kombineret pangenomics og transcriptomics kan bruges som våben mod hurtigt udviklende patogener
Pangenomics analyses have been performed on other fungi and yeasts including Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans var. grubii, and Aspergillus fumigatus [10]. All four species are model organisms in eukaryotic genomics and the latter three can also cause human diseases. Recent pangenome analyses on each of these species revealed that > 80% of all genes detected were core and thus found in every strain [10]. Our current study, and those previously [27, 28], clearly highlight that Z. tritici has a larger (>40% af de samlede gener) accessorisk genom end disse arter. Hvorfor og hvordan Z. tritici og potentielt andre plantepatogene svampe opretholder en så stor accessorisk komponent er uklart. For eksempel har de mindste otte kromosomer identificeret i IPO323 ikke nogen klar større indvirkning på virulens eller andre processer, med kun én undersøgelse, der i øjeblikket tyder på, at kromosomerne 14, 16, 18, 19 og 21 spiller en subtil rolle i virulens på udvalgte hvedesorter [59]. Ikke desto mindre opretholdes kombinationer af disse små kromosomer i populationer. Det er blevet foreslået, at de sørger for rekombinationshændelser, som kan ligge til grund for svampens evne til at udvikle sig hurtigt for at tilpasse sig miljøbelastninger, potentielt kombineret med høje aktivitetshastigheder af transponerbare elementer [60-62]. Et lignende tilfælde kan argumenteres for det store accessoriske genom. Støtte til dette ydes af den funktionelle betydning af to accessoriske genomkomponenter, der henvises til i denne undersøgelse, SDH-underenheden C-paralog og AvrStb6, som begge har nøgleroller i interaktion med variable elementer i det ydre miljø (fungicidpåføring og sorter med matchende henholdsvis sygdomsresistensgener) [25, 45]. Andre biologiske processer er blevet beskrevet, som også kan gå tabt i individuelle Z. tritici-isolater uden klare konditionsfejl, herunder kontrol af melanisering (pigmentering) [63]. Vores undersøgelse har fremhævet, at Z. triticis hjælpegenom, der hurtigt udvikler sig, potentielt kan bruges mod det, når fokus i stedet er placeret på det, der ikke kan gå tabt eller har begrænset polymorfi. Denne undersøgelse har søgt at gøre dette ved at betragte kernegener som ikke kun til stede og funktionelle i alle isolater, men også udtrykt af alle isolater. Vi tog også tilgangen til at forsøge at rangere gensæt i kernegenomet baseret på niveauer af aminosyresekvensvariabilitet. Der er selvfølgelig nogle forbehold med de metoder, vi har brugt, især ved at redundante (identisk type og position) mutationer ikke let kan adskilles fra et tilsvarende antal mutationer, som kan forekomme på unikke positioner i hvert isolat (ikke-redundante mutationer). Vores metode er således ikke egnet til at rangere hurtigt udviklende gener. Ikke desto mindre muliggør metoden, at gener uden og lav variabilitet let kan identificeres baseret på lave mængder af polymorfismer, der påvirker aminosyreændringer. Fremgangsmåden viste, at eksperimentelt verificerede og forudsagte essentielle-for-livet-gener eller virulensgener rummede signifikant mindre polymorfi af denne type mellem isolater end dem, hvis funktioner er nødvendige for disse processer. Endelig udvidede vi denne tilgang til at identificere en ny virulensfunktion af en nukleosid-diphosphatkinase (NDK), som udviste den mindste variation af alle gener i en 5--gen T-DNA-deletion. Baseret på disse resultater foreslår vi, at niveauer af polymorfi i kernegener identificeret i pangenomics kan bruges til at udlede vigtige funktioner for de kodede proteiner og derved prioritere gener til funktionel analyse for at identificere nye mål for afgrødebeskyttelse og potentielt dyresundhed.
En ny svaghed i infektionsbiologien hos Z. tritici og relaterede patogener?
Denne undersøgelse gav også yderligere specifik indsigt i infektionsbiologien af dette vigtige hvedepatogen. For det første blev der ikke opnået beviser, der understøtter tilstedeværelsen af større nekrotrofiske effektoraktiviteter for 88 udskilte proteiner udvalgt fra både kerne- og accessoriske genomer. Vi kan ikke forkaste muligheden for, at vi ikke valgte de korrekte proteiner, eller at flere effektorer kunne arbejde sammen for at påkalde plantecelledød (også foreslået af lignende ekspressionsprofiler). Hvis sidstnævnte er tilfældet, vil dette adskille sig fra den klare betydning af enkelte nekrotrofiske effektorer i beslægtede hvede-inficerende svampe, især Parastagonospora nodorum og Pyrenophora-arter [35]. Det er også muligt, at de ekspressionsniveauer, vi udleder fra det transiente FoMV-system, er lavere end dem, der kræves for effektorer, hvis genkendelse er mindre udtalt end for SnToxA. Ikke desto mindre giver de heri præsenterede data ingen støtte for ideen om, at overgangen til symptomatisk vækst og plantecelledød fremkaldes af genkendelsen af større (enkelte) nekrotrofe Z. tritici-effekter. Det er derfor muligt, at masseproduktionen af disse proteiner ved symptomernes begyndelse i stedet kan tjene til at beskytte svampehyfer mod den tilsyneladende hyperaktivering af celledød og planterespons. I overensstemmelse hermed har udskilte effektorer fra denne og andre svampe vist sig at have evnen til at hæmme plante-afledte proteaser, kitinaser og andre cellevægsangribende enzymer, som i sig selv induceres af planter under forsvarsreaktioner [46, 48, 64, 65 ]. For nylig har svampeeffektorer også vist sig at manipulere og ombygge mikro- og mikrobiomer [66, 67].
cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet
Identifikationen af en nøglerolle i virulens for NDK er dog væsentlig. Disse proteiner er blevet tilskrevet flere funktioner fra forskellige prokaryote og eukaryote organismer. I svampe er der en rapport, der tilskriver en rolle til modulering af planteimmunitet [68], mens der i en anden art (A. fumigatus) er påvist en livsnødvendig funktion [69]. Imidlertid er den primære og konserverede funktion af disse proteiner at fosforylere nukleosid-diphosphater, sædvanligvis ved hjælp af ATP som substrat, for at generere andre nukleosid-trifosfater (NTP'er), der er nødvendige for at hjælpe med at brænde forskellige cellulære processer [70, 71]. Dette er især vigtigt, når begrænsede ressourcer gør det vanskeligere at skabe visse NTP'er på andre måder. Tus, NDK'er præsenterer en vigtig redningsvejaktivitet for regenerering af NTP'er, der sandsynligvis er vigtig, når ekstracellulære ressourcer er begrænsede. Vigtige roller for adskillige andre redningsveje, og især biosyntetiske veje, er for nylig dukket op fra andre genfunktionsundersøgelser på Z. tritici. For eksempel er lysinbiosyntese afgørende for infektion og hyphal vækst på dårlige næringsstoffer [72], ligesom purinbiosyntese [73]. Disse funktioner er overflødige for vækst på komplette medier. Tidligere transkriptomdata om det meget tidlige stadie af bladoverfladekolonisering har indikeret, at svampen er i et næringsfattigt miljø og er afhængig af at udnytte intracellulære lagre [33]. Sammenholdt med de tidligere funktionelle undersøgelser, og den nøglerolle, der er vist for NDK, er det klart, at Z. tritici er ekstremt sårbar over for inhibering af vigtige biosyntese- og redningsveje, når de er på bladoverfladen under tidlig kolonisering og potentielt frem til induktion af plantecelledød omkring 7-10 dage senere. Nye plantebeskyttelsesmidler eller strategier kunne således rettes mod hæmning af disse processer, hvilket kan repræsentere en svaghed hos Z. tritici og potentielt for en lang række andre relaterede svampe med lignende infektionsmåder.
Konklusioner
Denne undersøgelse giver indledende støtte til den kombinerede brug af pangenomics og transcriptomics til at definere gener, der repræsenterer kernen, og potentielt udnyttelige, svagheder i hurtigt udviklende patogener. Men i princippet kunne tilgangene bruges til genprioritering i ethvert biologisk system, hvor flere genomer og transkriptomer er tilgængelige. Vi forventer, at disse tilgange kan fremme opdagelsesrørledninger af biologiske kerneprocesser i mange forskellige biologiske systemer.
Referencer
1. Fisher MC, Hawkins NJ, Sanglard D, Gurr SJ. Den verdensomspændende fremkomst af resistens over for svampedræbende lægemidler udfordrer menneskers sundhed og fødevaresikkerhed. Videnskab. 2018;360. https://doi.org/10.1126/science.aap7999.
2. Fisher MC, Henk DA, Briggs CJ, Brownstein JS, Madoff LC, McCraw SL, et al. Nye svampetrusler mod dyre-, plante- og økosystemers sundhed. Natur. 2012;484. https://doi.org/10.1038/nature10947.
3. Lucas JA, Hawkins NJ, Fraaije BA. Udviklingen af fungicideristens. Adv Appl Microbiol. 2015;90. https://doi.org/10.1016/bs.aambs.2014.09.001.
4. Heitman J. Seksuel reproduktion og udviklingen af mikrobielle patogener. Curr Biol. 2006;16. https://doi.org/10.1016/j.cub.2006.07.064.
5. Dong S, Raffaele S, Kamoun S. De to-hastigheds genomer af filamentøse patogener: vals med planter. Curr Opin Genet Dev. 2015;35:57–65. https://doi.org/10.1016/J.GDE.2015.09.001.
6. Tettelin H, Masignani V, Cieslewicz MJ, Donati C, Medini D, Ward NL, et al. Genomanalyse af flere patogene isolater af Streptococcus agalactiae: implikationer for det mikrobielle "pan-genom". Proc Natl Acad Sci US A. 2005;102. https://doi.org/10.1073/pnas.0506758102.
7. Lefébure T, Stanhope MJ. Udvikling af kernen og pan-genomet af strep-til coccus: positiv selektion, rekombination og genomsammensætning. Genom Biol. 2007;8. https://doi.org/10.1186/gb-2007-8-5-r71.
8. Tian CF, Zhou YJ, Zhang YM, Li QQ, Zhang YZ, Li DF, et al. Sammenlignende genomik af rhizobia-nodulerende sojabønner tyder på omfattende rekruttering af afstamningsspecifikke gener i tilpasninger. Proc Natl Acad Sci US A. 2012;109. https://doi.org/10.1073/pnas.1120436109.
9. Syme RA, Tan KC, Rybak K, Friesen TL, McDonald BA, Oliver RP, et al. Panparastagonospora komparativ genomanalyse-effektor forudsigelse og genomevolution. Genom Biol Evol. 2018;10. https://doi.org/10.1093/gbe/evy192.
10. McCarthy CGP, Fitzpatrick DA. Pan-genomanalyser af modelsvampearter. Microb. Genomik. 2019;5. https://doi.org/10.1099/mgen.0.000243.
11. Yang X, Li Y, Zang J, Li Y, Bie P, Lu Y, et al. Analyse af pan-genom for at identificere kernegener og essentielle gener fra Brucella spp. Mol Gen Genomics. 2016;291. https://doi.org/10.1007/s00438-015-1154-z.
12. Barber AE, Sae-Ong T, Kang K, Seelbinder B, Li J, Walther G, et al. Aspergillus-lus fumigatus pan-genomanalyse identificerer genetiske varianter forbundet med human infektion. Nat Microbiol. 2021;6. https://doi.org/10.1038/ s41564-021-00993-x.
13. Zhang X, Liu B, Zou F, Shen D, Yin Z, Wang R, et al. Resekventering af hele genomet afslører naturlig variation og adaptiv udvikling af Phytophthora sojae. Front Microbiol. 2019;10. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019. 02792.
14. Torriani SFF, Melichar JPE, Mills C, Pain N, Sierotzki H, Courbot M. Zymoseptoria tritici: en stor trussel mod hvedeproduktion, integrerede tilgange til kontrol. Svampegenet Biol. 2015;79. https://doi.org/10. 1016/j.fgb.2015.04.010.
15. Zhan J, Mundt CC, McDonald BA. Måling af immigration og seksuel reproduktion i feltpopulationer af Mycosphaerella graminicola. Fyto-patologi. 1998;88. https://doi.org/10.1094/PHYTO.1998.88.12.1330.
16. Zhan J, Kema GHJ, Waalwijk C, McDonald BA. Fordeling af alleler af parringstype i hvedepatogenet Mycosphaerella graminicola over rumlige skalaer fra læsioner til kontinenter. Svampegenet Biol. 2002;36. https://doi. org/10.1016/S1087-1845(02)00013-0.
17. Stukenbrock EH, Banke S, Javan-Nikkhah M, McDonald BA. Oprindelse og domesticering af svampehvedepatogenet Mycosphaerella gramini-cola via sympatrisk artsdannelse. Mol Biol Evol. 2007;24. https://doi.org/10. 1016/S1087-1845(02)00013-0.
18. Linde CC, Zhan J, McDonald BA. Befolkningsstruktur af Mycosphaere-lla graminicola: fra læsioner til kontinenter. Fytopatologi. 2002;92. https://doi.org/10.1094/PHYTO.2002.92.9.946.
19. Croll D, McDonald BA. Det genetiske grundlag for lokal tilpasning til patogene svampe i landbrugets økosystemer. Mol Ecol. 2017;26. https://doi.org/ 10.1111/mec.13870.
20. Croll D, Lendenmann MH, Stewart E, McDonald BA. Virkningen af rekombinationshotspots på genomudviklingen af et svampeplantepatogen. Genetik. 2015;201. https://doi.org/10.1534/genetics.115.180968.
21. Dutta A, Croll D, McDonald BA, Barrett LG. Opretholdelse af variation i virulens og reproduktion i populationer af et landbrugsplantepatogen. Evol Appl. 2021;14. https://doi.org/10.1111/eva.13117.
22. Feurtey A, Stevens DM, Stephan W, Stukenbrock EH, Stajich J. Interspecifik genudveksling introducerer høj genetisk variabilitet i afgrødepatogen. Genom Biol Evol. 2019;11. https://doi.org/10.1093/gbe/evz224.
23. Hartmann FE, Sánchez-Vallet A, McDonald BA, Croll D. Et svampehvedepatogen udviklede værtsspecialisering ved omfattende kromosomale omlejringer. ISME J. 2017;11. https://doi.org/10.1038/ismej.2016.196.
24. Fouché S, Plissonneau C, McDonald BA, Croll D. Meiosis fører til udbredt kopitalvariation og forvrænget nedarvning af accessorisk kromo-nogle af hvedepatogenet Zymoseptoria tritici. Genom Biol Evol. 2018;10. https://doi.org/10.1093/gbe/evy100.
25. Stephens C, Ölmez F, Blyth H, McDonald M, Bansal A, Burcu Turgay E, et al. Bemærkelsesværdige nylige ændringer i genetisk diversitet af avirulensgenet AvrStb6 i globale populationer af hvedepatogenet Zymoseptoria tritici. Mol Plant Pathol. 2021. https://doi.org/10.1111/mpp.13101.
26. Goodwin SB, M'Barek S, Dhillon B, Wittenberg AHJ, Crane CF, Hane JK, et al. Det færdige genom af svampehvedepatogenet Mycosphaerella graminicola afslører dispenseringsstruktur, kromosomplasticitet og stealth-patogenese. PLoS Genet. 2011;7. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002070.
27. Badet T, Oggenfuss U, Abraham L, McDonald BA, Croll D. Et 19-isolat referencekvalitet globalt pangenom for svampehvedepatogenet Zymoseptoria tritici. BMC Biol. 2020;18. https://doi.org/10.1186/ s12915-020-0744-3.
28. Plissonneau C, Hartmann FE, Croll D. Pangenome-analyser af hvedepatogenet Zymoseptoria tritici afslører det strukturelle grundlag for et meget plastisk eukaryotisk genom. BMC Biol. 2018;16. https://doi.org/10.1186/ s12915-017-0457-4.
29. Wittenberg AHJ, van der Lee TAJ, M'Barek SB, Ware SB, Goodwin SB, Kilian A, et al. Meiose driver ekstraordinær genom-plasticitet i det haploide svampeplantepatogen Mycosphaerella graminicola. PLoS One. 2009;4. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005863.
30. Steinberg G. Cellebiologi af Zymoseptoria tritici: patogencelleorganisation og hvedeinfektion. Svampegenet Biol. 2015;79. https://doi.org/10. 1016/j.fgb.2015.04.002.
31. Kema GHJ, Yu DZ, Rijkenberg FHJ, Shaw MW, Baayen RP. Histologi af patogenesen af Mycosphaerella graminicola i hvede. Fytopatologi. 1996;86. https://doi.org/10.1094/Phyto-86-777.
32. Rudd JJ, Kanyuka K, Hassani-Pak K, Derbyshire M, Andongabo A, Devon-Shire J, et al. Transkriptom- og metabolitprofilering af infektionscyklussen af Zymoseptoria tritici på hvede afslører en bifasisk interaktion med planteimmunitet, der involverer differentielle patogen kromosomale bidrag og en variation af den hemibiotrofiske livsstilsdefinition. Plante Fysiol. 2015;167. https://doi.org/10.1104/pp.114.255927.
33. Keon J, Antoniw J, Carzaniga R, Deller S, Ward JL, Baker JM, et al. Transkriptionel tilpasning af Mycosphaerella graminicola til programmeret celledød (PCD) af dens modtagelige hvedevært. Mol Plant-Microbe Interact. 2007;20. https://doi.org/10.1094/MPMI-20-2-0178.
34. Rudd JJ, Keon J, Hammond-Kosack KE. De hvedemitogenaktiverede proteinkinaser TaMPK3 og TaMPK6 reguleres differentielt på flere niveauer under kompatible sygdomsinteraktioner med Mycosphaerella graminicola. Plante Fysiol. 2008;147. https://doi.org/10.1104/pp.108. 119511.
35. Friesen TL, Faris JD. Karakterisering af effektor-mål-interaktioner i nekrotrofiske patosystemer afslører tendenser og variationer i værtsmanipulation. Annu Rev Phytopathol. 2021;59. https://doi.org/10.1146/annur ev-phyto-120320-012807.
36. Friesen TL, Faris JD, Solomon PS, Oliver RP. Værtsspecifikke toksiner: effektorer af nekrotrofisk patogenicitet. Cellemikrobiol. 2008;10. https://doi.org/10. 1111/j.1462-5822.2008.01153.x.
37. Ben M'Barek S, Cordewener JHG, Tabib Ghafary SM, van der Lee TAJ, Liu Z, Mirzadi Gohari A, et al. FPLC og væskekromatografi massespektrometri identificerer kandidat-nekrose-inducerende proteiner fra kulturfiltrater af svampehvedepatogenet Zymoseptoria tritici. Svampegenet Biol. 2015;79. https://doi.org/10.1016/j.fgb.2015.03.015.
38. Wyka S, Mondo S, Liu M, Nalam V, Broders K. Et stort accessorisk genom og høje rekombinationshastigheder kan påvirke den globale distribution og brede værtsområde af svampeplantepatogenet Claviceps purpurea. PLoS One. 2022;17. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263496.
39. Moolhuijzen PM, Se PT, Shi G, Powell HR, Cockram J, Jørgensen LN, et al. Et globalt pangenom for hvedesvampepatogenet Pyrenophora triticirepentis og forudsigelse af strukturel homologi af efectorprotein. Microb. Genomik. 2022;8. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263496.
40. Kema GHJ, Sayoud R, Annone JG, Van Silfhout CH. Genetisk variation for virulens og resistens i hvede-Mycosphaerella graminicola-stisystemet II. Analyse af interaktioner mellem patogenisolater og værtskultivarer. Fytopatologi. 1996;86. https://doi.org/10.1094/Phyto-86-213.
41. Kema GHJ, Annone JG, Sayoud R, Van Silfhout CH, Van Ginkel M, De Bree J. Genetisk variation for virulens og resistens i hvede Mycosphaerella graminicola-patosystemet I. interaktioner mellem patogenisolater og værtskultivarer. Fytopatologi. 1996;86. https://doi.org/ 10.1094/Phyto-86-200.
42. Zhan J, Pettway RE, McDonald BA. Den globale genetiske struktur af hvedepatogenet Mycosphaerella graminicola er karakteriseret ved høj nuklear diversitet, lav mitokondriel diversitet, regelmæssig rekombination og genflow. Svampegenet Biol. 2003;38. https://doi.org/10.1016/S1087- 1845(02)00538-8.
43. Palma-Guerrero J, Torriani SFF, Zala M, Carter D, Courbot M, Rudd JJ, et al. Sammenlignende transkriptomiske analyser af Zymoseptoria tritici-stammer viser komplekse livsstilsovergange og intraspecifik variabilitet i transkriptionsprofiler. Mol. Plante Pathol. 2016;17. https://doi.org/10.1111/mpp.12333.
44. Kellner R, Bhattacharyya A, Poppe S, Hsu TY, Brem RB, Stukenbrock EH. Ekspressionsprofilering af hvedepatogenet Zymoseptoria tritici afslører genomiske mønstre for transkription og værtsspecifikke reguleringsprogrammer. Genom Biol Evol. 2014;6. https://doi.org/10.1093/gbe/evu101.
45. Steinhauer D, Salat M, Frey R, Mosbach A, Luksch T, Balmer D, et al. En uundværlig paralog af succinatdehydrogenase-underenhed C medierer stående modstand mod en underklasse af SDHI-fungicider i Zymosep-toria tritici. PLoS Pathog. 2019;15. https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 1007780.
46. Marshall R, Kombrink A, Motteram J, Loza-Reyes E, Lucas J, Hammond Kosack KE, et al. Analyse af to planta-udtrykte LysM efector homologer fra svampen Mycosphaerella graminicola afslører nye funktionelle egenskaber og varierende bidrag til virulens i hvede. Plante Fysiol. 2011;156. https://doi.org/10.1104/pp.111.176347.
47. Lee WS, Rudd JJ, Hammond-Kosack KE, Kanyuka K. Mycosphaerella graminicola liste efektor-medieret stealth patogenese undergraver genkendelse gennem både cerk1 og cebip homologer i hvede. Mol Plant-Microbe Interact. 2014;27. https://doi.org/10.1104/pp.111.176347.
48. Tian H, MacKenzie CI, Rodriguez-Moreno L, van den Berg GCM, Chen H, Rudd JJ, et al. Tre LysM-effekter af Zymoseptoria tritici afvæbner kollektivt kitin-udløst planteimmunitet. Mol Plant Pathol. 2021;22. https:// doi.org/10.1104/pp.111.176347.
49. Zhong Z, Marcel TC, Hartmann FE, Ma X, Plissonneau C, Zala M, et al. Et lille udskilt protein i Zymoseptoria tritici er ansvarlig for avirulens på hvedesorter, der bærer Stb6-resistensgenet. Ny Phytol. 2017;214. https://doi.org/10.1111/nph.14434.
50. Kema GHJ, Mirzadi Gohari A, Aouini L, Gibriel HAY, Ware SB, Van Den Bosch F, et al. Stress og seksuel reproduktion påvirker dynamikken i varmepatogeneffektoren AvrStb6 og strobilurinresistens. Nat Genet. 2018;50. https://doi.org/10.1111/nph.14434.
51. Saintenac C, Lee WS, Cambon F, Rudd JJ, King RC, Marande W, et al. Hvede receptor-kinase-lignende protein Stb6 kontrollerer gen-for-gen-resistens over for svampepatogen Zymoseptoria tritici. Nat Genet. 2018;50. https://doi.org/ 10.1038/s41588-018-0051-x.
52. Tan KC, Oliver RP, Solomon PS, Mofat CS. Proteinholdige nekrotrofiske virkninger i svampevirulens. Function Plant Biol. 2010;37. https://doi.org/10. 1071/FP10067.
53. Bouton C, King RC, Chen H, Azhakanandam K, Bieri S, Hammond-Kosack KE, et al. Rævehale mosaikvirus: en viral vektor til proteinekspression i korn. Plante Fysiol. 2018;177. https://doi.org/10.1104/pp.17.01679.
54. Motteram J, Küfner I, Deller S, Brunner F, Hammond-Kosack KE, Nürn-berger T, et al. Molekylær karakterisering og funktionel analyse af MgNLP, det eneste NPP1-domæneholdige protein, fra svampehvedebladpatogenet mycosphaerella graminicola. Mol Plant-Microbe Interact. 2009;22. https://doi.org/10.1094/MPMI-22-7-0790.
55. Faris JD, Zhang Z, Lu H, Lu S, Reddy L, Cloutier S, et al. Et unikt hvedesygdomsresistens-lignende gen styrer effektor-udløst modtagelighed for nekrotrofiske patogener. Proc Natl Acad Sci US A. 2010;107. https://doi. org/10.1094/MPMI-22-7-0790.
56. Lu Y, Deng J, Rhodes JC, Lu H, Lu LJ. Forudsigelse af essentielle gener til at identificere potentielle lægemiddelmål i Aspergillus fumigatus. Comput Biol Chem. 2014;50. https://doi.org/10.1016/j.compbiolchem.2014.01.011.
57. Osmani AH, Oakley BR, Osmani SA. Identifikation og analyse af essentielle Aspergillus nidulans gener ved hjælp af heterokaryon redningsteknikken. Nat Protoc. 2006;1. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.406.
58. Hu W, Sillaots S, Lemieux S, Davison J, Kaufman S, Breton A, et al. Essentiel genidentifikation og lægemiddelmålprioritering i Aspergillus fumigatus. PLoS Pathog. 2007;3. https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 0030024.
59. Habig M, Quade J, Stukenbrock EH. Den fremadrettede genetiktilgang afslører den værtsgenotypeafhængige betydning af accessoriske kromosomer i svampehvedepatogenet Zymoseptoria tritici. MBio. 2017;8. https://doi. org/10.1128/mBio.01919-17.
60. Fouché S, Badet T, Oggenfuss U, Plissonneau C, Francisco CS, Croll D. Stress-drevet transposable element de-repression dynamik og virulens evolution i et svampepatogen. Mol Biol Evol. 2020;37. https://doi. org/10.1093/molbev/msz216.
61. Möller M, Habig M, Freitag M, Stukenbrock EH. Ekstraordinær genom-ustabilitet og udbredte kromosom-omlejringer under vegetativ vækst. Genetik. 2018;210. https://doi.org/10.1534/genetics.118.301050.
62. Bertazzoni S, Williams AH, Jones DA, Syme RA, Tan KC, Hane JK. Tilbehør gør outfittet: tilbehørskromosomer og andre uundværlige DNA-områder i plantepatogene svampe. Mol Plant-Microbe Interact. 2018;31. https://doi.org/10.1094/mpmi-06-17-0135-f.
63. Krishnan P, Meile L, Plissonneau C, Ma X, Hartmann FE, Croll D, et al. Transponerbare elementindsættelser former genregulering og melaninproduktion i et svampepatogen af hvede. BMC Biol. 2018;16. https://doi. org/10.1094/mpmi-06-17-0135-f.
64. Sánchez-Vallet A, Tian H, Rodriguez-Moreno L, Valkenburg DJ, Saleem Batcha R, Wawra S, et al. En udskilt LysM-effekt beskytter svampehyfer gennem chitinafhængig homodimerpolymerisation. PLoS Pathog. 2020;16. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008652.
65. Breen S, Williams SJ, Winterberg B, Kobe B, Solomon PS. Hvede PR-1-proteiner er målrettet af nekrotrofiske patogeneffektorproteiner. Plant J. 2016;88. https://doi.org/10.1111/tpj.13228.
66. Snelders NC, Petti GC, van den Berg GCM, Seidl MF, Thomma BPHJ. Et ældgammelt antimikrobielt protein co-opteret af et svampeplantepatogen til planta mycobiom manipulation. Proc Natl Acad Sci US A. 2021;118. https://doi.org/10.1073/pnas.2110968118.
67. Snelders NC, Rovenich H, Petti GC, Rocafort M, van den Berg GCM, Vorholt JA, et al. Mikrobiommanipulation af et jordbåren svampeplantepatogen ved hjælp af effektorproteiner. Nat Planter. 2020. https://doi.org/10. 1038/s41477-020-00799-5.
68. Rocha RO, Wilson RA. Magnaporthe oryzae nukleosid-diphosphatkinase er påkrævet til metabolisk homeostase og redox-medieret værts medfødt immunitetsundertrykkelse. Mol Microbiol. 2020;114. https://doi.org/ 10.1111/mmi.14580