Sygdomsmodellering med nyreorganoider Ⅱ

4. Strategier til at forbedre nyreorganoide platforme

Nuværende nyreorganoider udvisernyre-relevante strukturermen ligner ikkefunktionelle voksne nyrer. Således er protokollerne beskrevet i pkt2.2 give anledning til nyreorganoider, der mangler et in vivo-lignende biofysisk miljø, herunder væskegennemstrømning gennem vævene. Nylige undersøgelser har forbedret organoid lighed med voksne nyrer ved at bruge teknikker som transplantation og kombination af forskellige organoidtyper for at opnå højere ordens nyrestrukturer. Disse teknikker kan kombineres med bioingeniørmæssige tilgange til at udforske og forbedre organoidmodning. Nedenfor vil vi fremhæve disse strategier og diskutere nye overvejelser for at skabe næste generationnyrernes organoide systemer. 

KLIK HER FOR AT FÅ CISTANCHE TIL CKD-BEHANDLING

4.1. Introduktion af gradienter

Vi ved, at under normal embryogenese sender mesonephros, metanephros og UB signaler til hinanden for at mønstre den udviklende nyre [6]. Derudover er biokemiske gradienter etableret i det tidlige embryo afgørende for at styre korrekt nyremønster og udvikling [47]. Et væsentligt problem i vores nuværende udviklingsprotokoller for nyreorganoider er deres isolering fra andre kropslige væv under udvikling og dermed mangel på biokemiske gradienter etableret via interaktioner med andre samudviklende vævssystemer i et embryo. Derfor er det umagen værd at inkludere disse interaktioner i organoid udvikling. Taguchi og Nishinakamura (2017) og Tsujimoto et al. (2020) har overvejet nogle af disse interaktioner for at lette organoidmodning [17,24]. I deres strategier brugte de først PIM- og AIM-specifikke faktorer til at udvikle uafhængige organoider, og transplanterede derefter co-dyrkede MM- og UB-organoider i mus [17,24]. Nyreorganoider udviklet på denne måde udviste strukturer af højere orden, men kunne ikke rekapitulere omfattende in vivo-lignende UB-forgrening. Mens disse undersøgelser understreger vigtigheden af ​​samdyrkning af nabovæv, kræver de forbedring af organoidet via etablerede gradienter inkluderet fra begyndelsen af ​​organoidudvikling.

Da det er næsten umuligt at inkludere hvert væv fra det udviklende embryo og optimere dets betingelser, foreslår vi en simulering af et miljø, hvor cellerne oplever virkningerne af nabovæv. Dette kan opnås ved at konstruere en biokemisk gradient til at dyrke celler, hvor gradienten kan efterligne tilstedeværelsen af ​​nabovæv. Gradienten kan derefter dirigere både AIM- og PIM-linjer inden for den samme suspension af celler og dermed inducere UB- og MM-dannelse samtidigt. For eksempel kunne vi etablere en GDNF-gradient og fremme UB-forgrening inden for MM for at inducere dannelsen af ​​det indviklede opsamlingskanalsystem i den voksne nyre.

Selvom disse gradientbaserede tilgange ikke er blevet undersøgt for at etablere nyreorganoider, er de blevet brugt til at forbedre modningen af ​​andre organoider. For eksempel har Ben-Reuven og Reiner et al. (2020) indlejrede morfogenfrigivende perler i en hydrogel for at hjælpe med at mønstre den anterior-posteriore akse af hjerneorganoider [48]. I en anden undersøgelse har Kamperman et al. (2019) etablerede cellesubstrat med biotinylerede morphogener [49]. Udover disse statiske tilgange har forskere også udviklet mikrofluidiske chips med kollegadrevet morfogentilsætning. For eksempel beskriver Cui et al. (2020) brugte et kammer med kemotaksikamre til morfogenfordeling og kamre, hvori stamceller kan dyrkes i hydrogeler [50]. Således kan forskere anvende lignende systemer til at programmere nyreorganoid udvikling ved hjælp af specifikke faktorer, der er rumligt kontrolleret for at mediere deres virkninger. Dette ville etablere en gradient og efterligne de naturligt forekommende morfogenfordelinger, der er relevante for embryonal nyreudvikling. For eksempel kan perler med faktorer, der er specifikke for AIM- og PIM-differentiering, podes på modsatte sider af en hydrogel for at efterligne naturlige AIM-PIM-gradienter. Alternativt, for at kontrollere hiPSC-differentiering, kan celler eller organoider podes i mikrofluidiske enheder, således at celler/organoider af forskellige afstamninger er på modsatte sider (se figur 5A). HiPSC'er indlejret i hydrogeler kan dyrkes mellem disse to strukturer, som kan tjene som kilder til morfogene faktorer. Denne tilgang kan bruges til at efterligne interaktioner mellem mesonephros og metanephros, som de nuværende nyreorganoide protokoller mangler i deres opsætning (se figur 5A). Derfor bør fremtidigt arbejde sigte mod at efterligne biokemiske signaler fra flere vævstyper, der er relevante for nyreudvikling, herunder dem mellem UB og MM, såvel som mellem den udviklende nyre og vaskulatur. Det relaterede systemdesign kan undersøge mulighederne for at etablere gradienter for at efterligne disse interaktioner.

4.2. Perfusion af organoider med mikrofluidika

Væskeflow er afgørende fornyrefysiologida det initierer en kaskade af intracellulære hændelser som reaktion på mekanosensing og letter transport på tværs af væv [51]. Derfor, hvis vi ønsker at generere funktionelle nyreorganoider og opretholde dem i længere perioder, skal vi integrere stabile og perfusable vaskulære netværk i vores organoide modelsystemer. Væskeflow er blevet introduceret til nyreorganoider på to hovedmåder, mikrofluidik og transplantation. Homan et al. (2019) inkluderede biofysiske signaler i en 3D bioprintet chip, hvor organoider blev dyrket i et kammer med dynamisk væskestrøm [52]. Denne opsætning simulerede mikrofluidisk kollega og fremmede vaskulær netværksdannelse, men den rekapitulerede ikke perfusion gennem vaskulære og tubulære strukturer for at replikere nyrefysiologien. Ikke desto mindre fremhævede denne undersøgelse vigtigheden af ​​det biofysiske miljø i organoid modning.

Figur 5. Foreslåede forbedringer af nyreorganoide platforme. (A) Tilgange til at generere gradienter, hvori hiPSC'er kan dyrkes til at udvikle sig til nyreorganoider. Fra venstre mod højre: iPSC-klynge i hydrogel flankeret af morfogenemitterende perler, hiPSC-klynge i hydrogel flankeret af morfogenemitterende organoider, multi-kammer chipsystem med hiPSC-klynge dyrket i en hydrogel og bilateralt udsat for morphogener af NP- og UB-afstamning indeholdt i en væske. (B) Foreslået chipsystem til dyrkning af en nyreorganoid ved siden af ​​en forgrenet endotelkanal, med opfølgning i en hydrogel (f.eks. kollagenmatrix). (C) Foreslåede stilladsopstillinger, hvori nyreorganoider kan dyrkes og efterfølgende transplanteres. Fra venstre mod højre: porøst stillads med forgrenede endotelkanaler (røde), frøede nyreorganoider og frøede morfogenperler (røde og blå kugler); porøst stillads med NP-organoider, der omgiver UB-organoider

Vi mener, at man kan udvikle organoider i en kanaliseret mikrofluidisk organ-på-chip platform til at modellere den menneskelige nyre, som det er blevet udført i andre sfæroidale systemer. For eksempel, i modsætning til Homan et al. (2019), der placerede en organoid i et fluid-kammeratkammer, Nashimoto et al. (2017) dyrkede humane lungefibroblastsfæroider i en ekstracellulær matrix (ECM) mellem to endotelkanaler [52,53]. Kanalerne gav anledning til et perfusibelt vaskulært netværk dannet via angiogenese. Ved at bruge en noget lignende tilgang til Nashimoto et al. (2017), foreslår vi at placere en hiPSC-klynge ved siden af ​​et perfuserbart endotelkar, der kan indbygges i en chip, som vist i figur 5B [53]. Med den efterfølgende tilføjelse af spirende nyre-organoid-specifikke signaler kan den vaskulære kanal dirigeres til at forgrene og invadere organoiden, når den begynder at differentiere. Denne konfiguration ville replikere de tidlige stadier af nyreudvikling [54]. Med vedvarende perfusion af de nødvendige morfogenetiske signaler til nyreudvikling bør nyreorganoider være i stand til bedre at replikere faktiske menneskelige nyredannelsesprocesser. Det er også vigtigt, at systemparametre, såsom flydende medspænding, ECM-sammensætning og -konfiguration, og organoidstadiet overvejes omhyggeligt og optimeres. Da Schumacher et al. (2021) har vist, at hypoxi fører til øget angiogenese i nyreorganoider, et sådant ex vivo-system kan dyrkes i nærvær af nedsat ilt for mere effektivt at inducere vaskularisering [55]. I sidste ende bør disse strategier lette organoid modning, rekapitulere vaskulær og tubulær perfusion og udføre fysiologiske funktioner, som de forekommer in vivo.

4.3. Fremme organoid modning via transplantation

Undersøgelser har vist, at transplantation af nyreorganoider ind i en vært, såsom en mus, et hønseæg eller en rotte, kan give en levedygtig vej til vaskularisering [16,33,56]. Imidlertid udviser transplanterede organoider begrænset succes som funktionelle strukturer. En stor hindring i denne strategi er at rekapitulere den omfattende UB-forgrening inden for MM af transplanterede organoider. Derudover mangler nefronsegmenter i organoider korrekt orientering mod en opsamlingskanal. Disse egenskaber er afgørende for, at de transplanterede organoider kan udføre en voksen menneskelig nyres funktion. Desuden integrerer organoider efter transplantation med værten, hvilket gør det vanskeligt at skelne mellem organoid- og værtsvævsgrænserne, og dermed begrænser den organoidspecifikke analyse.

Vævsingeniørstrategier giver en bred vifte af værktøjer tilforbedre nyreorganoidudviklingi forhold til modning og funktionel integration. Typisk anvender vævstekniske tilgange stilladser (f.eks. silkefibroin-stilladser) i forskellige konfigurationer, såsom film, måtter, hydrogeler og svampe, for at understøtte arrangementet af celler og for at rekapitulere de forskellige biofysiske tegn på de ønskede problemer. For eksempel i en undersøgelse, Gupta et al. (2019) brugte porøse silkestilladser til at dyrke organoider, efterfulgt af transplantation [31]. I denne tilgang tilvejebragte stilladsets biomateriale og konfiguration en ramme til at understøtte organoidudvikling og bibringe stabilitet ved transplantation. Imidlertid manglede dette system funktionelle signaler til at understøtte organoid modning, såsom fælles udvikling af vaskulatur med fyren i nærheden af ​​andre udviklende strukturer.

Fremtidige undersøgelser kan udvikle lignende strategier og inkludere funktionelle signaler til at understøtte organoid modning. For eksempel, som skitseret i figur 5C, kan et porøst stillads konfigureres med perfuserbare kanaler og fyldt med morfogene faktorer for at udvikle et relevant organoid udviklingssystem via transplantation. Forudsåning med endotelceller kan understøtte rettet karudvikling, hvorimod den åbne porøse struktur kan podes med hiPSC'er og programmeres via morfogenetiske faktorer til organoid udvikling. Alternativt kan den ekstracellulære matrix (ECM) udskilt fra nyrevæv i sig selv tjene som et stilladsmateriale til vævskonstruktion af en nyreorganoid. For eksempel er decellulariserede nyrer blevet brugt til at understøtte organoidens modning. Disse matricer kunne bruges til at dyrke og transplantere organoider eller til at udlede vævstekniske stilladser fra disse biomaterialer.

Desuden giver stilladser en uudnyttet mulighed for at indlejre flere organoide slægter sammen i udvalgte positioner. Eksempelvis Taguchi og Nishinakamura (2017) og Tsujimoto et al. (2020) transplanterede både UB- og NP-organoider, hvilket gjorde det muligt for dem at vaskularisere [17,24]; dog manglede de et ekstracellulært stillads til at orientere deres multi-lineage organoider. Ved at bruge stilladser kunne vi efterligne nefrongenerering omkring en enkelt samlestruktur ved at orientere UB-organoider i midten og bunden af ​​et stillads. Samtidig kan vi så NP-organoider langs ydersiden (se figur 5C). Lignende vævstekniske tilgange kan udvikles for at fremme organoidmodning. Ikke desto mindre, når man designer en vævsteknik-baseret tilgang til transplantation af organoiderne, bør parametre såsom biomaterialers konfiguration og kompatibilitet alle vælges omhyggeligt i henhold til nyrernes behov

5. Konklusioner

Udviklingen afnyre organoider et stort gennembrud in vitromodellering af nyresygdomme. Nyreorganoidergive mulighed for den individualiserede undersøgelse afgenetiske nyresygdommeog lægemiddelscreening i en menneske-afledt platform. Mens de har et enormt løfte, er nyreorganoider umodne og isolerede i deres nuværende form. For virkelig at modelleremenneskelig nyreog relaterede sygdomme, er vi nødt til at modne dem ved at rekapitulere udviklende nyreinteraktioner. Især er vi nødt til at fremme interaktionerne mellem UB og MM in vitro og introducere menneskeafledt vaskulatur til nyreorganoider. Vi skal også overveje gradientbaserede morfogentilgange til parallel in vivo human embryonal udvikling. Nyreorganoider rummer et stort potentiale for genetiske undersøgelser af voksne ogfosterets nyresygdomog lægemiddelscreening. Deres avancement kan føre til udvikling af livreddendenyre sygdombehandlinger på en måde, der er hurtigere og mere præcis end nogensinde før.

Referencer

1. Bannier-Hélaouët, M.; Post, Y.; Korving, J.; Trani Bustos, M.; Gehart, H.; Begthel, H.; Bar-Efraim, YE; van der Vaart, J.; Kalmann, R.; Imhoff, SM; et al. Udforskning af den menneskelige tårekirtel ved hjælp af organoider og enkeltcellesekvensering.Celle stamcelle2021, 28, 1221–1232.e7. [CrossRef] [PubMed]

2. Lee, J.; Rabbani, CC; Gao, H.; Steinhart, MR; Woodruff, BM; Pflflum, ZE; Kim, A.; Heller, S.; Liu, Y.; Shipchandler, TZ; et al. Hårbærende menneskelig hud er udelukkende genereret fra pluripotente stamceller.Natur2020, 582, 399–404. [CrossRef] [PubMed]

3. Takahashi, K.; Yamanaka, S. Induktion af pluripotente stamceller fra museembryonale og voksne fibroblastkulturer ved definerede faktorer.Celle2006, 126, 663–676. [CrossRef] [PubMed] 

4. Globale fakta: Om nyresygdom. Tilgængelig online:https://www.kidney.org/kidneydisease/global-facts-about-kidney disease#:~{}:text=10%25%20of%20the%20population%20worldwide,have%20access%20to%20affordable %20behandling(tilgået den 6. juli 2022).

5. Rehman, S.; Ahmed, D.Embryologi, nyre, blære og urinleder; StatPearls: Treasure Island, FL, USA, 2022.

6. Reidy, KJ; Rosenblum, ND Celle- og molekylærbiologi af nyreudvikling.Semin. Nephrol.2009, 29, 321–337. [CrossRef] [PubMed] 

7. Ryan, D.; Sutherland, M.; Flores, TJ; Kent, AL; Dahlstrom, J.; Puelles, V.; Bertram, J.; McMahon, AP; Lille, MH; Moore, L.; et al. Udvikling af den menneskelige føtale nyre fra midten til sen drægtighed hos mandlige og kvindelige spædbørn.eBioMedicin2017, 27, 275–283. [CrossRef] 

8. Al-Awqati, Q.; Oliver, JA Stamceller i nyren.Nyre Int.2002, 61, 387–395. [CrossRef] 

9. Tran, F.; Klein, C.; Arlt, A.; Imm, S.; Knappe, E.; Simmons, A.; Rosenstiel, P.; Seibler, P. Stamceller og organoid teknologi i præcisionsmedicin ved inflammation: Er vi der endnu?Foran. Immunol.2020, 11, 573562. [CrossRef]

10. Drost, J.; Clevers, H. Translationelle anvendelser af voksne stamcelle-afledte organoider.Udvikling2017, 144, 968–975. [CrossRef] 

11. Hishikawa, K.; Takase, O.; Yoshikawa, M.; Tsujimura, T.; Nangaku, M.; Takato, T. Voksne stamlignende celler i nyren.World J. Stamceller2015, 7, 490–494. [CrossRef]