Differentiel kontrol af humane treg- og effektor-T-celler i tumorimmunitet ved hjælp af Fc-konstrueret anti-CTLA-4 antistof

Anti-CTLA-4 mAb er effektivt til at forbedre tumorimmunitet hos mennesker. CTLA-4 udtrykkes af konventionelle T-celler ved aktivering og af naturligt forekommende FOXP3 plus CD4 plus Treg-celler konstitutivt, hvilket rejser et spørgsmål om, hvordan anti-CTLA-4 mAb differentielt kan kontrollere disse funktionelt modsatte T-cellepopulationer i tumor immunitet. Her viser vi, at FOXP3 høj potent undertrykkende effektor Treg-celler var rigelige i melanomvæv, der udtrykte CTLA -4 på højere niveauer end tumorinfiltrerende CD8 plus T-celler. Efter in vitro tumor-antigen-stimulering af mononukleære celler fra perifert blod fra raske individer eller melanompatienter, Fc-region-modificeret anti-CTLA-4 mAb med høj antistofafhængig cellemedieret cytotoksicitet (ADCC) og cellulær fagocytose (ADCP) ) aktivitet udtømte selektivt CTLA-4 plus FOXP3 plus Treg-celler og udvidede følgelig tumorantigenspecifikke CD8 plus T-celler.

Det er vigtigt, at udvidelsen kun skete, når antigenstimulering blev forsinket flere dage fra antistofbehandlingen for at skåne CTLA-4 plus aktiveret effektor CD8 plus T-celler fra mAb-medieret drab. Tilsvarende forlængede høj-ADCC/ADCP anti-CTLA-4 mAb-behandling med forsinket tumor-antigen-vaccination i tumorbærende mus deres overlevelse signifikant og markant forhøjet cytokinproduktion af tumorinfiltrerende CD8 plus T-celler, mens antistofbehandling samtidig med vaccination ikke. Anti-CTLA4 mAb modificeret til at udvise en mindre eller ingen Fc-bindingsaktivitet viste ikke en sådan timingafhængig in vitro og in vivo immunforstærkning. Således kan høj ADCC anti-CTLA-4 mAb selektivt udtømme effektor-Treg-celler og fremkalde tumorimmunitet afhængigt af CTLA-4 – hvilket udtrykker status for effektor CD8 plus T-celler. Disse resultater er medvirkende til at designe cancerimmunterapi med mAbs rettet mod de molekyler, der almindeligvis udtrykkes af FOXP3 plus Treg-celler og tumorreaktive effektor-T-celler.

Regulatoriske T-celler|CTLA-4|FOXP3|kræft immunterapi|antistofafhængig cellemedieret cytotoksicitet.

Naturligt forekommende CD25 plus CD4 plus Treg-celler, som udtrykker transkriptionsfaktoren FOXP3, spiller uundværlige roller i opretholdelsen af ​​immunologisk selvtolerance og homeostase (1). Imidlertid hindrer de også effektive immunresponser mod tumorceller, der stammer fra sig selv, som illustreret af resultaterne af, at musetumorer kan udryddes blot ved udtømning af Treg-celler (2-5).

Hos mennesker er der akkumulerende evidens for rigelig infiltration af Treg-celler i forskellige tumorvæv (6-8), og en signifikant sammenhæng mellem Treg-infiltration og dårlig prognose i forskellige typer kræftformer (9). Kontrol af Treg-celler i tumorvæv vil derfor sandsynligvis være en lovende måde at fremkalde effektiv tumorimmunitet hos cancerpatienter.

For anti-tumor fandt vi ud af, at Cistanche deserticola har en åbenlys anti-tumor effekt i rotteforskning. 3 Polysaccharidkomponenterne i Cistanche deserticola kan forbedre kroppens immunfunktion, fremme aktiveringen af ​​hvide blodlegemer, forbedre kroppens immunstatus og kan også virke direkte på tumorceller. Hæmmer spredning, metastasering og invasion af tumorceller. Hæmmer også angiogenese. Tumorvækst og metastaser har brug for støtte til vækst af nye blodkar, og polysaccharidkomponenterne i Cistanche kan hæmme angiogenese og derved reducere tumorvækst og metastase.

Klik her for at købe cistanche

Humane FOXP3-udtrykkende CD4 plus T-celler er heterogene i funktion, herunder Treg-celler og ikke-undertrykkende konventionelle T-celler. De kan fraktioneres i tre subpopulationer ved deres forskellige ekspressionsniveauer af FOXP3 og CD45RA (10) (fig. 1A): (i) CD45RA plus FOXP3lo naive/hvilende Treg-celler [fraktion (Fr). I];(ii) CD45RA− FOXP3hi effektor Treg (Treg) celler (Fr. II), som er terminalt differentierede og stærkt undertrykkende; og (iii) CD45RA− FOXP3lo ikke-Treg-celler (Fr. III), som mangler suppressiv aktivitet og er i stand til at udskille proinflammatoriske cytokiner. Ved antigen stimulering blev Fr. Jeg naive Treg-celler differentierer til Fr. II Treg-celler, som i høj grad udtrykker CTLA-4 (10).

Fig. 1. Præferentiel CTLA-4-ekspression af FOXP3hi Treg-celler i melanomvæv. (A og B) Repræsentative plots af CD4 plus T-cellefarvning (A) og frekvenser af hver fraktion (B). PBMC'er fra raske donorer (HD, n=5) og PBMC'er og TIL'er fra melanompatienter (henholdsvis n=11 og 14) blev udsat for direkte farvning for CD4, CD45RA og FOXP3. (C og D) Repræsentative plots af CCR7 og CD45RA ekspression af CD8 plus T-celler (C) og resumé af hver CD8 plus T-celle undergruppe (D). (E) CTLA-4-udtrykker klynger (stiplet linje) i PBMC'er og TIL'er fra melanompatienter ved CyTOF-analyse. viSNE-plot af CD4 plus og CD8 plus T-celler med varmekort for angivne markørekspressionsniveauer er vist (n=2). (F) Kun overflade eller overflade- og intracellulær farvning af CTLA-4 i HD PBMC. (G) Overflade-CTLA-4-ekspressioner af hver cellulær fraktion fra TIL'er og PBMC'er fra melanompatienter. Betyder ± SEM. *P Mindre end eller lig med {{20}}.05, **P Mindre end eller lig med 0.01, ***P Mindre end eller lig med 0,001 og ****P Mindre end eller lig med 0,0001 ved envejs ANOVA med post hoc Tukey's HSD-test.

Selvom de fleste celler i Fr. III er ikke-Treg-celler og differentierer ikke til Fr. II eTreg-celler, en cirkulerende undergruppe af T-follikulære regulatoriske celler, som er CXCR5 plus CD45RA−, er inkluderet i Fr. III (11), hvilket indikerer heterogenitet af Fr. III befolkning. I modsætning hertil, med tilstedeværelsen af ​​disse tre FOXP3 plus-populationer i blodet, viser størstedelen af ​​tumorer dominerende infiltration af Treg-celler, som ser ud til at undertrykke effektive antitumor-immunresponser hos cancerpatienter (12). Disse resultater tyder på, at udtømning/reduktion af Treg-celler i tumorer og regionale lymfeknuder er medvirkende til at fremkalde og forstærke antitumor-immunresponser, som for nylig demonstreret med nogle monoklonale antistoffer (mAbs), der er specifikke for de molekyler, der specifikt udtrykkes af Treg-celler (13).

CTLA-4 udtrykkes af konventionelle T-celler ved aktivering og af FOXP3 plus CD25 plus CD4 plus Treg-celler konstitutivt. Det spiller en nøglerolle i Treg-medieret undertrykkelse, i det mindste delvist, via styring af CD80/CD86-ekspression af antigen-præsenterende celler (APC'er) (14-16). Anti-humant CTLA-4 mAb, som er klinisk effektivt til behandling af melanom (17, 18), blev oprindeligt anset for at blokere CTLA-4-medieret negativt signal ind i aktiverede effektor-T-celler og opretholde deres aktiverede tilstand i angriber tumorceller. Nylige prækliniske undersøgelser har dog vist, at anti-CTLA-4 mAb kan udtømme FOXP3 plus Treg-celler, især i tumorvæv, og derved øge tumorimmuniteten (19-21). Hos mennesker er det imidlertid kontroversielt, om CTLA-4 mAb påvirker antallet eller funktionen af ​​Treg-celler eller effektor-T-celler eller begge dele, for at øge antitumorimmunresponser i kliniske sammenhænge.

I denne undersøgelse har vi undersøgt in vivo og in vitro, hos mennesker og mus, virkningerne af Fc-konstruerede anti-CTLA-4 mAbs på FOXP3 plus Treg-celler og selv-/tumorantigen-specifikke CD8 plus T-celler. Vi viser, at celledepleterende anti-CTLA-4 mAb med høj antistofafhængig cellemedieret cytotoksicitet (ADCC) aktivitet kan fremkalde antitumorimmunresponser afhængigt af niveauerne og kinetikken af ​​CTLA-4 ekspression af to populationer. Resultaterne kan udvides til celledepleterende mAb'er rettet mod andre celleoverflademolekyler, som både Treg- og effektor T-celler (Teff)-celler almindeligvis udtrykker på forskellige niveauer og med forskellig kinetik.

Betydning

Anti-CTLA-4 mAb kan øge tumorimmunitet på trods af CTLA-4-ekspression ved funktionelt modsatrettede T-cellepopulationer: aktiverede effektor T (Teff)-celler og FOXP3 plus CD4 plus Treg-celler. Her viser vi, at anti-CTLA-4 mAb konstrueret til at være cytotoksisk udtømte Treg-celler effektivt in vitro hos mennesker og in vivo hos mus. Det udvidede antigenspecifikke CD8 plus Teff-celler, når tumorantigenstimulering blev forsinket flere dage for at beskytte dem mod at blive dræbt af mAb. Anti-CTLA-4 mAb modificeret til at udvise en mindre eller ingen celledepleterende aktivitet viste ikke sådanne effekter. Denne strategi med differentiel kontrol af Treg- og Teff-celler ved hjælp af cytotoksisk anti-CTLA-4-mAb for at fremkalde effektiv tumorimmunitet vil hjælpe med at designe cancerimmunterapi rettet mod andre molekyler, der almindeligvis udtrykkes af Treg- og Teff-celler.

Forfatterbidrag: DH, A. Tanaka, HN og SS designet forskning; DH, A. Tanaka, TK, A. Tanemura, DS, JBW, ELL, KWWT, DA og IK udførte forskning; A. Tanemura bidrog med nye reagenser/analytiske værktøjer; DH, A. Tanaka, TK, DS, DA, EWN, IK, HN og SS analyserede data; og DH, A. Tanaka og SS skrev papiret.

Anmeldere: MA, Tokyo Medical and Dental University; og SAQ, University College London.

Erklæring om interessekonflikt: HN modtog et forskningslegat fra Bristol Myers Squibb. SS modtog en forskningsbevilling fra Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. TK er ansat af Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., som leverede nogle af de antistoffer, der blev brugt i denne undersøgelse.

Udgivet under PNAS-licensen.

1 Nuværende adresse: Institut for Immunologi, Graduate School of Medicine, Nagoya University, 466-8550 Nagoya, Japan.

2 Nuværende adresse: Department of Immunology, Moffitt Cancer Center, Tampa, FL 33612.

3 Nuværende adresse: Afdelingen for Cancer Immunology, Exploratory Oncology Research & Clinical Trial Center, National Cancer Center, 277-8577 Kashiwa, Japan.

4 Hvem korrespondancen skal rettes til. E-mail: shimon@ifrec.osaka-u.ac.jp.

Udgivet online den 26. december 2018.

Resultater

Akkumulering af CTLA-4–Udtrykkende, terminalt differentierede FOXP3hi Treg-celler i melanomvæv.

Vi vurderede først hyppigheden af ​​forskellige T-cellesubpopulationer blandt tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL'er) hos melanompatienter. CD45RA− FOXP3hi eTreg-celler (Fr. II) var overvejende (~10- gange) øget i forholdet mellem CD4 plus TIL'er sammenlignet med CD4 plus T-celler fra perifert blod hos raske donorer eller melanompatienter (fig. 1 A og B) ). Frekvensen af ​​CD45RA− FOXP3lo Fr. III ikke-Treg-celler steg også lidt (-to gange) blandt CD4 plus TIL'er. I modsætning hertil blev CD45RA plus FOXP3lo naive Treg-celler (Fr. I) signifikant reduceret i TIL'er til en fjerdedel i gennemsnit af den tilsvarende fraktion i perifere blodmononukleære celler (PBMC'er).

Blandt FOXP3− konventionelle CD4 plus T-celler i TILs, CD45RA− FOXP3− effektor/hukommelse CD4 plus T-celler, som kunne dissekeres yderligere i CD25 plus (Fr. IV) og CD25− (Fr. V) populationerne (10) , en smule (∼1.3-fold) steg, mens CD45RA plus FOXP3− naive CD4 plus T-celler (Fr. VI) reducerede signifikant til en tiendedel af dem i PBMC'er. I CD8 plus T-cellefraktionen af ​​TIL'er, sammenlignet med PBMC'er hos patienterne eller raske donorer, var der en signifikant stigning (~1.6-fold) af CD45RA-CCR7-effektorhukommelse T (TEM)-celler, med et signifikant fald i CD45RA plus CCR7 plus naive og CD45RA plus CCR7− terminalt differentieret effektorhukommelse (TEMRA) celler til henholdsvis en halv og en femtedel af cellerne i PBMCs, og ingen signifikant ændring i CD45RA−CCR7 plus central hukommelse T (TCM) celler (fig. 1 C og D). Det blev også bemærket hos melanompatienter, at naive CD8 plus T-celler i PBMC'er markant (∼14-fold) faldt sammenlignet med raske donorer.

Vi vurderede derefter, hvilken T-cellepopulation der udtrykte CTLA -4 i TIL'er eller PBMC'er af melanompatienter ved cytometri ved time-of-flight (CyTOF) massespektrometricytometer (Fig. 1E og SI Appendiks, Fig. S1A). CD4 plus CD45RA− Foxp3hi klyngen af ​​celler, der repræsenterer Fr. II eTreg-celler, der overvejende udtrykte CTLA4 i PBMC og TIL, mens CD8 plus T-celler næsten ikke udtrykte CTLA-4 i hverken PBMC eller TIL'er. Hos mus blev den dominerende CTLA4-ekspression af FOXP3 plus Treg-celler på lignende måde observeret i milten og CMS5a-tumorvævet (SI Appendiks, Fig. S1B). CTLA4 udtrykt af human Fr. II Treg-celler var for det meste i det intracellulære rum, og celleoverflade-CTLA-4 var begrænset (fig. 1F). Ikke desto mindre er der i TIL'er, Treg-celler og i mindre grad Fr. III ikke-Treg-celler, blev fundet at udtrykke overflade-CTLA -4 ved signifikant høje niveauer (fig. 1G og SI-tillæg, fig. S2). TIL CD8 plus TCM- og TEM-celler udtrykte også et højere niveau af overflade-CTLA -4 sammenlignet med nogen af ​​de cirkulerende T-cellefraktioner, selvom Treg-celler viste meget højere ekspression hos melanompatienter (fig. 1G og SI-tillæg, fig. S2).

Tilsammen er kardinaltræk ved humant melanomvæv en markant stigning og reduktion af henholdsvis Treg-celler og naive Treg-celler og en markant stigning af effektor/hukommelse CD8 plus T-celler med en reduktion af naive CD8 plus T-celler. Disse Treg-celler og CD8 plus T-celler i TIL'er udtrykker CTLA-4 på celleoverfladen med højere ekspression af førstnævnte end sidstnævnte. I modsætning til TIL eTreg-celler er cirkulerende eTreg-celler hos melanompatienter signifikant lavere i niveauet af overflade-CTLA4-ekspression, hvilket tyder på, at de kan være mindre påvirket af anti-CTLA-4 mAb-behandling.

Reduktion af både Treg-celler og antigen-specifikke CD8 plus T-celler ved in vitro-behandling med celledepleterende anti-CTLA-4 mAb og samtidig antigenstimulering.

For at afgøre, om anti-CTLA-4 mAb's antitumoreffekter ville afhænge af dets evne til at udtømme Treg-celler ved ADCC, modificerede vi Fc-delen af ​​anti-CTLA-4 IgG1 mAb (klon MDX{{3 }}, ipilimumab), som havde en moderat ADCC-aktivitet, for at ændre dets affinitet for Fc RIIIa (CD16a), en aktiverende Fc R udtrykt af NK-celler, monocytter/makrofager og andre celler (22) (fig. 2A). Et anti-CTLA-4 mAb således genereret med en høj ADCC-aktivitet, som vi kaldte asymmetrisk reengineering-teknologi-Fc-domæne (ART-Fc), havde forskellig aminosyresubstitution på hver tung kæde (23); det vil sige L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A substitutioner i en tung-kæde Fc-region og D270E/K326D/A330M/K334E substitutioner i den anden. Det rekonstruerede mAb viste en 1,000- gange højere bindingsaffinitet for human Fc RIIIa end umodificeret mAb uden at øge affiniteten for inhiberende Fc RIIb. Vi genererede også en anti-CTLA-4 mAb, der næppe binder til Fc Rs, som vi kaldte silent-Fc anti-CTLA-4, ved aminosyresubstitutioner; det vil sige L235R, G236R og S239K ind i Fc-regionen af ​​begge tunge kæder. Sammenlignet med umodificeret eller tavs-Fc anti-CTLA-4 mAb, viste ART-Fc meget højere in vitro cytotoksicitet over for CTLA-4 – der udtrykker kinesisk hamster ovarieceller (CHO) i nærværelse af PBMC'er fra raske donorer med øget cytotoksicitet ved længere inkubation (fig. 2B). På samme måde dræbte ART-Fc anti-CTLA-4 mAb effektivt frisklavet Fr. II Treg-celler og i mindre grad Fr. III ikke-Treg eller Fr. Jeg naive Treg-celler, mens IgG1 (ipilimumab) eller silent-Fc mAb næppe udviste dræbende aktivitet (fig. 2C).

Dernæst vurderede vi virkningerne af disse Fc-konstruerede mAbs på in vitro antigen-specifik ekspansion af CD8 plus T-celler ved at stimulere PBMC'er fra HLA-A*0201-udtrykkende sunde donorer eller melanompatienter i 9 dage med forskellige peptider, for eksempel: afledt af Melan-A/MART-1, et selv-/tumorantigen udtrykt af normale melanocytter og nogle melanomceller (24); og NY-ESO-1, cancer/testis-antigen udtrykt af forskellige typer cancerceller og humane kimcelleceller (25), cytomegalovirus (CMV) eller influenzavirus (influenza). Denne in vitro peptidstimulering, for eksempel af Melan-A-peptid, opretholdt den høje ekspression af CTLA4 af Treg-celler (fig. 2D og SI-tillæg, fig. S3). Peptidstimuleringen alene udvidede også peptidspecifikke tetramer (Tet) plus CD8 plus T-celler, som udtrykte højere niveauer af CTLA-4, især på celleoverfladen, sammenlignet med Tet-celler (fig. 2 E, F, og jeg). Når ART-Fc anti-CTLA-4 mAb var til stede fra begyndelsen af ​​peptidstimuleringen af ​​PBMC'er fra raske donorer eller melanompatienter, var forholdet mellem CTLA-4-udtrykkende Treg-celler blandt CD4 plus T-celler signifikant reduceret på en dosisafhængig måde, mens silent-Fc mAb ikke viste denne effekt (fig. 2 D og G og SI-tillæg, fig. S4 og S5).

Treg-cellereduktionen ledsagede imidlertid ikke ekspansionen af ​​antigenspecifikke CD8 plus T-celler; snarere forårsagede behandlingen en dybtgående reduktion af forholdet mellem Tet plus CD8 plus T-celler blandt CD8 plus T-celler (fig. 2H). I disse in vitro-stimuleringer udviste umodificeret IgG1 eller silent-Fc anti-CTLA-4 mAb ikke signifikant eTreg-depletering (fig. 2I). Graden af ​​eTreg-cellereduktion af disse mAbs var faktisk korreleret med reduktionen af ​​antigen-specifikke CD8 plus T-celler, uanset det stimulerende antigen, for eksempel Melan-A eller CMV-peptid (fig. 2I).

Mens Treg-celler således konstitutivt udtrykker CTLA-4, især intracellulær CTLA-4, udvider antigenstimulering CD8 plus T-celler, der udtrykker høje niveauer af CTLA-4, især på celleoverfladen. ART-Fc anti-CTLA-4 mAb med høj ADCC-aktivitet er derfor i stand til at udtømme ikke kun CTLA-4 plus Treg-celler, men også antigenaktiverede CTLA-4 plus CD8 plus T-celler . Denne effektor CD8 plus T-celle udtømning kan opveje en immunforstærkende effekt af eTreg celle udtømning i immunresponser in vitro.

Fig. 2. Samtidig in vitro peptidstimulering med ART-Fc anti-CTLA-4 mAb begrænser antigenspecifikke CD8 plus T-celleresponser. (A) Sammenfatning af aminosyresubstitutioner lavet til Fc-delen af ​​anti-humant CTLA-4 IgG1 mAb (klon MDX-010, ipilimumab) for at generere ART-Fc eller silent-Fc mAb'er og deres affiniteter til inhiberende Fc RIIb eller aktiverende Fc RIIIa. Silent-Fc mAb-affinitet var under detektionsgrænsen for BIACORE-assayet. (B) ADCC-aktivitet af forskellige anti-CTLA4 mAbs mod humane CTLA-4-udtrykkende CHO-celler. Anti-CTLA-4 mAbs (ART, ADCC-forstærket anti-CTLA-4 ART-Fc; IgG1, konventionel umodificeret anti-CTLA-4 IgG1; Silent, Fc-region-inaktiveret anti- CTLA-4 silent-Fc) blev inkuberet med CHO-celler og HD PBMC'er (n=3) ved et E/T-forhold på 50:1. Betyder ± SEM. Stjerner indikerer signifikante forskelle mellem hvert antistof og silent-Fc ved respektive koncentrationer for {{30}}h (sort) eller 24-h (rød) kulturer. (C) ADCC-aktivitet til hver cellulær fraktion af CD4 plus og CD8 plus T-celler fra PBMC'er med ART-Fc, IgG1 eller silent-Fc anti-CTLA-4 mAbs (n=4 eller 5). Frekvenser af døde celler blandt CTV præmærkede celler efter {{40}}h kulturen er angivet. (D) CTLA-4 udtryk af Fr. II Treg-celler efter 9 dages Melan-A-peptidstimulering og 1 ug/mL ART-Fc, silent-Fc eller IgG1 anti-CTLA-4 mAb-behandling til hele PBMC'er (n {{50 }}). (E og F) Overflade-CTLA-4-ekspressioner af Tet plus og Tet−CD8 plus T-celler efter indikerede peptidstimuleringer. Repræsentative histogrammer (E) og oversigt over gennemsnitlig fluorescensintensitet (MFI) (F) (Melan-A, n=9; CMV, n=9; Flu, n=3; ESO{{ 57}}, n=4). (G og H) Repræsentative plots og frekvenser af Fr. II eTreg-celler (G) og antigen-specifikke CD8 plus T-celler (H) fra HD'er (n=6) eller melanompatienter (n=5) efter kulturen med indiceret peptid og 1 ug/mL ART -Fc anti–CTLA-4 mAb som i D. (I) Kvantificering af frekvensen af ​​Treg-celler (Øvre) og Tet plus CD8 plus T-celler (nedre) efter 9 dages Melan-A- eller CMV-antigenstimulering til HD PBMC'er med indikerede anti-CTLA-4 mAbs i G og H. Middel ± SEM. Den viste signifikans mellem de to grupper blev beregnet ved hjælp af parret t-test, envejs ANOVA eller tovejs ANOVA med post hoc Tukey's HSD test. *P Mindre end eller lig med 0,05, **P Mindre end eller lig med 0,01, ***P Mindre end eller lig med 0,001, og ****P Mindre end eller lig med 0,0001.

Robust udvidelse af antigenspecifikke CD8 plus T-celler ved eTreg-celleudtømning før antigenstimulering.

. Vi forsøgte derefter at udtømme CTLA-4 plus Treg-celler før antigenstimulering for at skåne antigenaktiveret CTLA-4-udtrykkende CD8 plus T-celler fra at dræbe med anti-CTLA-4 mAbs. Vi dyrkede hele PBMC'er fra raske donorer eller melanompatienter i nærværelse af ART-Fc anti-CTLA-4 mAb i 5 dage uden antigenstimulering, fjernede mAb'en, stimulerede derefter cellerne med forskellige peptider i 8 dage og analyserede dem for forholdet mellem Treg-celler og Tet plus CD8 plus T-celler blandt henholdsvis CD4 plus T-celler eller CD8 plus T-celler (fig. 3A). Forholdet mellem FOXP3hi Treg-celler blev signifikant reduceret inden for 5 dage af ART-Fc-forbehandlingen (fig. 3A og SI-tillæg, fig. S6) og holdt på et lavt niveau under efterfølgende peptidstimulering (fig. 3B), hvilket indikerer, at Treg celler var ikke fuldt ud restitueret under antigen-stimuleringsperioden. Denne ART-Fc-forbehandling kombineret med antigenstimulering inducerede robust ekspansion af Melan-A-specifikke CD8 plus T-celler fra raske donor-PBMC'er og NY-ESO-1-specifikke CD8 plus T-celler fra PBMC'er fra patienter, hvis melanomvæv udtrykte NY-ESO-1 (fig. 3C). CMV-specifikke CD8 plus T-celler var ikke meget påvirket af ART-Fc-medieret Treg-depletering. I modsætning til ART-Fc ændrede silent-Fc anti-CTLA-4 mAb ikke frekvensen af ​​Treg-celler og kunne ikke udvide Tet plus CD8 plus T-celler uanset antigenart (fig. 3D).

En af de forskellige undertrykkelsesmekanismer, der anvendes af Treg-celler, er CTLA-4-afhængig nedregulering af CD80- og CD86-ekspression af dendritiske celler (DC'er) (14, 15). For at undersøge mulige bidrag fra denne mekanisme til udvidelsen af ​​selv-/tumorantigen-specifikke CD8 plus T-celler efter in vitro ART-Fc anti-CTLA-4 mAb-behandling, vurderede vi CD80 og CD86 ekspression ved hjælp af DC'er, som var fænotypisk defineret som Lin-1- CD11c plus HLA-DR plus, i raske donor-PBMC'er. Både CD80- og CD86-udtryk viste tydelig opregulering i den ART-Fc-forbehandlede gruppe i modsætning til uændret CD80/CD86-udtryk i et umodificeret IgG1--forbehandlet, silent-Fc -forbehandlet eller ubehandlet gruppe (fig. 3E). Derudover havde graden af ​​FcR-bindingsaffiniteter af mAb'er en god korrelation med deres Treg-udtømningsaktivitet og også med Tet plus CD8 plus T-celle-inducerende aktivitet (fig. 3F). Fordi blot blokering af CTLA-4 af silent-Fc ikke opregulerede CD80/86, indikerede resultaterne, at Treg-depletering af ART-Fc aktiverede DC'er, selvom der er en mulighed for, at ART-Fc selv kan bidrager desuden til aktiveringen af ​​DC'er via højaffinitetsbinding til deres aktiverende Fc-receptorer.

Tilsammen indikerer disse resultater, at Treg-depletering af ART-Fc anti-CTLA-4 mAb flere dage før antigeneksponering kan spare drabet på CTLA-4 plus antigenaktiverede CD8 plus T-celler af antistoffet, udvide dem, i det mindste delvist, ved at forbedre CD80/CD86-udtrykket af APC'er.

Fig. 3. Forudtømning af Treg-celler ved hjælp af ART-Fc anti-CTLA-4 mAb forstærker selv-/tumorantigenspecifikke CD8 plus T-celleresponser. (A–D) Antigenspecifikke CD8 plus T-celler blev induceret fra hele PBMC'er af HD'er (n=7) eller patienter (n=5) ​​efter 5 dages forbehandling med ART-Fc anti-CTLA{ {11}} mAb. (A) Skema for eksperimentet og repræsentativ FOXP3- og CD45RA-farvning af CD4 plus T-celler på dag -5 og dag 0 af eksperimentet. Sammendrag af Fr. II eTreg-frekvenser på dag 0 (nederst). (B og C) Repræsentativ FOXP3-farvning af CD4 plus T-celler (B) og antigenspecifikke CD8 plus T-celler (C) med eller uden ART-Fc-forbehandling for hvert peptid efter kulturen. Sammenfatning af Treg- og antigen-specifikke CD8 plus T-cellefrekvenser efter kulturen (nederst). (D) Sammendrag af Fr. II eTreg og Tet plus CD8 plus T-cellefrekvenser med silent-Fc anti-CTLA-4 mAb-forbehandling i stedet for ART-Fc som i A–C. (E) Ekspressionsniveauer af CD80 og CD86 af Lin-1-CD11c plus HLA-DR plus DC'er efter 5 dages Melan-A-stimulering med forbehandling af indikeret anti-CTLA -4 mAbs (n=6). Tal på histogrammer viser MFI. (F) Sammenfatning af Treg og Tet plus CD8 plus T-cellefrekvenser efter forbehandling med indikerede anti-CTLA-4 mAbs efterfulgt af Melan-A26-35-stimulering som i A-C. Betyder ± SEM. Den viste signifikans mellem de to grupper blev beregnet ved hjælp af parret t-test. *P Mindre end eller lig med 0,05.

CTLA-4–medieret treg-depletion før tumorantigenvaccination forbedrer antitumorresponser hos mus.

For at validere in vitro-fundene i mus med humane PBMC'er og anti-humane CTLA-4 mAbs genererede vi mAbs med høj eller lav ADCC og antistofafhængig cellulær fagocytose (ADCP) aktivitet fra anti-muse CTLA{{4 }} mAb (klon UC10) af IgG2a-isotype (kaldet mIgG2a i det følgende) ved aminosyresubstitution i Fc-domænet (fig. 4A). Mutationen S239D i begge tunge kæder hævede affiniteten for muse-Fc RIV ~syvfold (mFa55 mIgG2a-variant), mens L235R-, G236R- og S239K-mutationer i begge tunge kæder gjorde dem ikke-bindende til muse-Fc Rs (mFa31 mIg-variant); førstnævnte blev kaldt mus ADCC/ADCP–enhanced-Fc (forbedret), sidstnævnte mus silent-Fc (mSilent) mAb. For at sammenligne antitumoraktivitet af disse Fc-modificerede anti-muse-CTLA-4 mAbs i kombination med tumorantigenvaccination, inokulerede vi subkutant i BALB/c mus CMS5a fibrosarcoma-celler, der udtrykker humant NY-ESO-1-antigen, og på dag 9, da tumoren blev etableret, behandlede musene med 100 ug af hvert mAb og vaccinerede med NY-ESO-1-peptid på samme dag (dag 9; vi kalder herefter protokollen "samtidig behandling") eller 3 dage senere (dag 12; herefter "Ab-forbehandling") (fig. 4B). Ab-forbehandling med mEnhanced mAb var mere effektiv end samtidig behandling eller forbehandling med enten mIgG2a eller mSilent mAb til retardering af tumorvækst; virkningerne af de to sidstnævnte mAb'er på tumorvækst var lave og ikke signifikant forskellige mellem Ab-forbehandling og samtidig behandling (fig. 4C). Overlevelsen var signifikant bedre hos mus, der var forbehandlet med mEnhanced mAb, og også i mus med samtidig behandling eller forbehandling med mIgG2a, selvom begge måder af mIgG2a-behandling ikke kunne inducere tumorregression i de fleste af musene (fig. 4 C og D).

Fig. 4. Forbehandling med ADCC/ADCP-forstærket anti-CTLA-4 mAb inducerer stærke antitumoreffekter i mus. (A) Sammenfatning af aminosyresubstitutioner foretaget til Fc-delen af ​​anti-muse CTLA-4 IgG2a mAb (klon UC10; mIgG2a) for at generere ADCC/ADCP-forstærket anti-muse-CTLA{{ 10}} (forbedret) eller silent-Fc anti-mus-CTLA-4 (mSilent) mAbs og deres affiniteter til mus Fc RIV vises. mSilent mAb-affinitet var under detektionsgrænsen for BIACORE-analysen. (B–D) Forsøgsskema (B). Mus blev udfordret med 2 × 106 CMS5a fibrosarkom, der udtrykker human NY-ESO-1 på dag {{40}} og efterladt ubehandlet eller behandlet med mEnhanced, mIgG2a eller silent anti-mus-CTLA-4 mAb på dag 9. Vaccination af NY-ESO-181-88 peptider blandet med CFA blev udført på samme dag (dag 9, samtidig behandling) eller 3 dage senere (dag 12, Ab forbehandling). Tumorvækst for hver mus med en fed linje, der angiver gennemsnittet af hver behandlingsgruppe (C) (n=8-13 pr. gruppe). Sammenfatning af gennemsnitlig tumorvækst for hver behandlingsgruppe (D, venstre). Stjerner angiver P-værdier mellem den mEnhanced mAb-forbehandlingsgruppe ved to-vejs ANOVA med Tukeys multiple sammenligningstest. Sammenfatning af overlevelsesraten (D, højre) for hver behandlingsgruppe. P-værdier mellem overlevelsen af ​​hver gruppe og overlevelsen af ​​vaccine-alene kontrol blev beregnet ved log-rang test. Dødsbegivenhed svarer til tumorlængde over Større end eller lig med 200 mm eller musens død. *P Mindre end eller lig med 0,05, **P Mindre end eller lig med 0,01, ***P Mindre end eller lig med 0,001, og ****P Mindre end eller lig med 0,0001.

Den forbedrede mAb-forbehandling resulterede også i en signifikant stigning i antallet af tumorinfiltrerende CD8 plus T-celler og CD8/Treg-forholdet i TIL'er, omend procentdelen af ​​FOXP3 plus-celler blandt CD4 plus T-celler steg lidt (fig. 5 A– C). Mens hyppigheden af ​​NY-ESO-1 peptidspecifikke CD8 plus TIL'er desuden ikke var statistisk forskellig blandt musene behandlet med hvert mAb eller mellem forbehandling og samtidig behandling, var de antigenspecifikke CD8 plus TIL'er fra forstærket mAb forbehandlet mus, sammenlignet med andre grupper, viste signifikant mere aktiv IL-2- og IFN-produktion ved in vitro-restimulering med NY-ESO-1-peptid (fig. 5 D og E). Desuden steg effektorhukommelses-CD8 plus T-celler defineret som CD44highCD62Llow-populationen signifikant blandt NY-ESO-1-specifikke CD8 plus TIL'er i forbehandlede mAb-mus (fig. 5 F og G).

Tilsammen var mEnhanced mAb-forbehandling mest effektiv til at fremkalde tumorimmunitet, efterfulgt af forbehandling med mIgG2a, som havde en vis ADCC-aktivitet, mens mSilent mAb var meget mindre effektiv. Resultaterne indikerer, at forbehandling af tumorbærende mus med ADCC/ADCP-forstærket anti-CTLA-4 mAb efterfulgt af tumorantigenvaccination effektivt kan fremkalde antitumorimmunresponser in vivo.

Diskussion

De vigtigste resultater i denne rapport er: (i) terminalt differentierede, stærkt undertrykkende eTreg-celler er rigelige i tumorvæv og udtrykker overflade-CTLA-4 i højere niveauer end tumorinfiltrerende CD8 plus T-celler; (ii) anti-CTLA-4 mAb med høj ADCC-aktivitet er i stand til at udtømme/reducere CTLA-4høje eTreg-celler og CTLA-4 plus effektor CD8 plus T-celler; og (iii) celledepleterende anti-CTLA-4 mAb kan fremkalde og forbedre effektiv tumorimmunitet, når antistofbehandlingsregimet er udtænkt til ikke at påvirke CTLA-4 plus effektor CD8 plus T-celler, f.eks. ændring af tidspunktet for udtømning af Treg-celler og vaccination mod cancerantigen.

ADCC-aktiviteten af ​​anti-CTLA-4 mAb er en nøgledeterminant for effektiviteten af ​​eTreg-reduktion og den resulterende udvidelse af tumorreaktive CD8 plus T-celler. Til støtte for ideen viste vi, at anti-CTLA-4 mAb (ART-Fc) med en øget ADCC-aktivitet (og/eller ADCP-aktivitet i mus) var i stand til at forstærke antitumorimmunresponser in vitro hos mennesker og in vivo i mus ved at udtømme CTLA-4-udtrykkende Treg-celler. Anti-CTLA4 mAbs (silent-Fc) modificeret til at udvise meget mindre eller ingen ADCC-aktivitet viste ikke sådan antitumoraktivitet, selvom de havde samme specificitet for en epitop af CTLA-4-molekylet. Det er fortsat uklart hos mennesker, om antitumoreffekten af ​​ipilimumab med IgG1 Fc-del tilskrives blokaden af ​​CTLA4-molekylet eller udtømning af CTLA-4-udtrykkende celler af ADCC. Det blev vist i mus, at en forbedring af antitumorimmunitet med et anti-CTLA-4 mAb krævede udtømning af tumorinfiltrerende Treg-celler af Fc R-medieret ADCC (19-21, 26, 27). Tilsvarende blev antistoffer mod GITR-, OX40- og CD25-molekyler, hvor tumorinfiltrerende Treg-celler udtrykker de højeste mængder, vist at være afhængige af ADCC-medieret udtømning af Treg-celler ved tumorafstødning (19, 26, 28). Det blev også rapporteret, at behandling med ipilimumab hos melanompatienter signifikant reducerede FOXP3 plus Treg-celler i tumorvævet, især hos klinisk respondere (29).

Derudover har en nylig rapport vist, at blandt melanompatienter med høj tumormutationsbyrde viste dem, der genetisk havde en højaffinitetsvariant af Fc RIIIa med forstærket ADCC (V158-variant, i modsætning til F158-lavaffinitetsvarianten) sig signifikant bedre klinisk respons på ipilimumab-behandling og bedre samlet overlevelse (27). Dette fund understøtter forestillingen om, at anti-CTLA-4 mAb med bedre Treg-depletion-aktivitet kan være mere effektiv end ipilimumab i cancerimmunterapi. Det er således sandsynligt, at ART-Fc anti-CTLA4 mAb, som har en høj affinitet for V158-varianten (KD=3,7 × 10-10 M, sammenlignet med 3,1 × 10-6 M for ipilimumab eller IgG1) , kan have bedre klinisk effekt i cancerimmunterapi via udtømmende Treg-celler. Tilsammen indikerer disse fund hos mennesker og mus, at høj-ADCC/ADCP anti-CTLA-4 mAb kan være effektiv til at fremkalde og forbedre tumorimmunitet via udtømmende Treg-celler.

Fig. 5. Ag-specifikke CD8 plus T-celleresponser induceret i tumorbærende mus ved forbehandling med ADCC/ADCP-forstærket anti-CTLA-4 mAb. (A-G) TIL'er fra Fig. 4 blev analyseret 19 d efter tumorimplantation (n=4-6 pr. gruppe). Antallet af infiltrerede T-celler pr. gram tumor (A). CD8/Treg-celleforhold (B). Hyppighed af Foxp3 plus Treg-celler blandt CD4 plus T-celler (C). Repræsentative plots af IL-2 plus IFN- plus CD8 plus T-celler (D). Cytokinproduktion blev målt ved at restimulere TIL'er med ESO-181-88 peptider in vitro i 5 timer. Sammenfatning af Tet plus CD8 plus T-celler i tumoren og IL{{20}} plus IFN- plus CD8 plus T-celler i D efter restimuleringen (E). Repræsentative plots (F) og oversigt (G) af CD44- og CD62L-ekspressioner med NY-ESO-1-Tet plus CD8 plus T-celler i tumoren i hver behandlingsgruppe. Data blev opnået fra tre uafhængige eksperimenter. P-værdier mellem naive eller EM CD8 plus T-celleundersæt af hver tilstand. Betyder ± SEM. *P Mindre end eller lig med 0.05, † P Mindre end eller lig med 0.05, **P Mindre end eller lig med 0,01, ††P Mindre end eller lig med 0,01 og ***P Mindre end eller lig med 0,001 ved to-vejs ANOVA med Tukeys multiple sammenligningstest.

Materialer og metoder

Donorprøver.

Perifere blodprøver blev opnået fra raske individer eller patienter med stadium III til IV melanom. PBMC'er blev isoleret ved densitetsgradient med Ficoll-Paque (GE Healthcare). TIL'er blev opnået fra resekeret melanomvæv. Tumoren blev hakket, og enkeltcellesuspensioner genereret efter blid MACS-dissociation (Miltenyi) blev fremstillet ved at filtrere gennem en 40-μm cellesi. Alle donorer gav skriftligt informeret samtykke før prøvetagning i henhold til Helsinki-erklæringen. Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board ved Osaka University.

CyTOF-analyse.

TIL'er og splenocytter fra tumorbærende mus blev beriget for CD3 plus-celler og farvet med 198-cisplatin til forskelsbehandling af døde celler og et panel af antistoffer, herunder følgende metalkonjugerede antistoffer: 172Yb-CD4 (RM4-5 ), 168Er-CD8 (53-6.7), 164Dy-CTLA-4 (UC-10), 158GdFOXP3 (FJK-16s). For humane PBMC'er og TIL'er blev cellesuspensioner stregkodet af anti-CD45-antistoffer med forskellige metalkonjugater, som beskrevet tidligere (35), før farvning med 198-cisplatin til diskrimination af døde celler og derefter antistoffarvning med følgende panel. Metalkonjugerede antistoffer blev opnået fra Fluidigm eller Maxpar Antibody Labeling kit (Fluidigm) blev brugt i henhold til producentens instruktioner til at konjugere oprensede antistoffer: 89Y-CD45 (klon: HI30; Fluidigm), 115In-CD45 (HI30; Biolegend), 175Yb- CD45 (HI30; Biolegend) antistoffer blev brugt til stregkodning af forskellige prøver; CLA-FITC (HECA-452; BD), CCR8-PE (L263G8; Biolegend), CXCR5-Biotin (RF8B2; BD), eVolve 605 (114 Cd)-CD8a (RPA) -T8; eBioscience), 139La-CD123 (6H6; Biolegend), 141Pr-CCR6 (11A9; Fluidigm), 142Nd-CD14 (M5E2; Biolegend), 144Nd-FITC (CLA) (FIT22; Fluidigm-), 44Nd-CD14 ; Fluidigm), 148Sm-CD20 (2H7; Biolegend), 149Sm-CCR4 (205410; Fluidigm), 150Nd-SAV (CXCR5) (1D4-C5; Fluidigm), 151Eu-ICOS (C398.) , 152Sm-CD69 (FN50; Biolegend), 153Eu-CD45RA (HI100; Fluidigm), 154Sm-CD3 (UCHT1; Fluidigm), 155Gd-CD197 (CCR7) (150503; R&D Systems), anti) (PECCRd-) PE001; Fluidigm), 158Gd-CD27 (L128; Fluidigm), 159TbCD19 (HIB19; Biolegend), 160Gd-CD39 (A1; Fluidigm), 163Dy-CXCR3 (G025H7; Fluidigm), 260Gd-CD39 (A1; Fluidigm), 163Dy-CXCR3 (G025H7; Fluidigm). CD45RO (UCHL1; Fluidigm), 166Er-CD279 (PD-1) (EH12.2H7; Biolegend), 167Er-PDL1 (29E.2A3; Biolegend), 169Tm-CD25 (IL-2R) ( 2A3; Fluidigm), 171Yb-CD11c (3.9; Biolegend), 172YbCD38 (HIT2; Fluidigm), 173Yb-TIGIT (MBSA43; eBioscience), 174Yb-HLA-DR (L243; Fluidigm), 176Yb-CD127 (IL-7R) (A019D5; Fluidigm), 209Bi-CD11b (ICRF44; Fluidigm), 146Nd-Helios (22F6; Biolegend), 161Dy–CTLA{14D3} ({188}; Fluidigm), 162Dy-FOXP3 (236A/E7; eBioscience) og 168Er-Ki-67 (Ki-67; Fluidigm).

Menneske- og museceller blev fikseret med eBioscience Foxp3/transkriptionsfaktor-farvningsbuffere (ThermoFisher) før intracellulær farvning. Farvede celler blev derefter resuspenderet i 2 procent PFA med 191/193-iridium DNA intercalator (Fluidigm) natten over og derefter vasket og resuspenderet i Maxpar vand (Fluidigm) og EQ fire-element perler (Fluidigm) umiddelbart før analysen med Helios CyTOF system (Fluidigme). Normaliserede data blev analyseret med Cytobank Premium.

Stimulering af antigenspecifikke CD8 plus T-celler.

Hele PBMC'er fra raske individer og melanompatienter blev stimuleret med 10 μM korte peptider, der er specifikke for HLA-A*0201 (Operon Biotechnology) i 8-9 dage: Melan-A26-35 (EAAGIGILTV), CMV495-503 (NLVPMVATV), Flu58 –66 (GILGFVFTL), eller NY-ESO1157–165 (SLLMWITQC) (12, 22). For at bestemme effekten af ​​anti-CTLA-4 mAb med forskellige ADCC blev en af ​​følgende mAb'er tilsat til kulturen ved 1 ug/mL (medmindre andet er angivet) samme dag eller 5 dage før antigenstimulering: ADCC -forstærket anti-human-CTLA-4 IgG1 (MDX-010-ART-Fc), konventionel umodificeret anti-CTLA-4 IgG1 (MDX-010-IgG1) eller silent-Fc anti-CTLA-4 IgG1-antistoffer (MDX-010-silent-Fc): Alle mAbs blev venligst leveret af Chugai Pharmaceutical. Halvdelen af ​​mediet blev erstattet med frisk medium indeholdende 10 U/mL IL-2 og 40 ng/mL IL-7 hver 3. dag.

Lactatdehydrogenase-frigivelsesassay med human CTLA-4-udtrykker CHO-celler.

Et lactatdehydrogenase (LDH)-frigivelsesassay blev udført for at bestemme ADCC-aktiviteten i PBMC'er. CHO DG44-hCTLA4-cellerne (fra Chugai Pharmaceutical) blev podet på 96-brønd rundbundede plader (1 × 104 celler pr. brønd) og inkuberet med forskellige koncentrationer af mAbs i 15 min. PBMC'er opnået fra raske donorer blev derefter tilsat til kulturen i et effektor-til-mål-forhold (E∕T) på 50:1. Celler blev inkuberet ved 37 grader, 5 procent CO2 i 6 eller 24 timer, 100 μL af supernatanten fra hver brønd blev opsamlet, og absorbans på 492 nm og 630 nm blev målt ved hjælp af Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (BioTek Instruments). LDH-frigivelse blev anset for at være maksimal efter inkubation af cellerne i 1 procent Nonidet P-40-opløsning. Cytotoksiciteten (procent) blev bestemt ud fra formlen; (AC)∕(BC) × 100, hvor A, B og C repræsenterer henholdsvis LDH-frigivelsen af ​​hvert eksperiment, maksimal LDH-frigivelse og baggrunds-LDH-frigivelse. Alle eksperimenter blev udført i to eksemplarer.

ADCC-assay med frisk isoleret human PBMC.

PBMC'er fra raske donorer blev FACS-sorteret for hver fraktion af T- og Treg-celler blev præmærket med CellTrace Violet (CTV; ThermoFisher) og dyrket med ikke-T-celler som effektorceller i et mål-til-effektor-forhold på 1:50. Derefter blev 1 ug/mL indiceret anti-CTLA-4 mAb tilsat til 10 procent humant AB-serum indeholdende RPMI1640-medium med 5 IE/mL IL-2. Efter 24-h dyrkning ved 37 grader blev hyppigheden af ​​døde celler, angivet ved LIVE/DEAD fikserbar farvning (ThermoFisher), blandt CTV plus-celler vurderet af FACS.

Murine tumoreksperimenter.

Seks til 7- uger gamle BALB/c-mus blev købt fra CLEA Japan og holdt under specifikke patogenfrie forhold. Mus blev subkutant udfordret med 2 × 106 CMS5a-NY-ESO-1. Ni dage efter tumorimplantationen modtog mus 100 ug anti-muse-CTLA4 mAb (UC-10 klon; mIgG2a, mEnhanced eller mSilent, fra Chugai Pharmaceutical) intravenøst. mEnhanced variant (mFa55 mIgG2a-variant) blev genereret af S239D-mutation i CH2-domænet og viser forbedret bindingsaffinitet til muse Fc RIV med ca. syv gange sammenlignet med vildtype-mIgG2a. Mus blev behandlet med vaccination af 100 ug ESO-181-88 peptider (Operon Biotechnology) blandet med 200 μL CFA/PBS (1:1 forhold) enten på samme dag (dag 9, samtidig behandling) eller 3 d senere (dag 12, Ab forbehandling) subkutant. Tumorstørrelsen blev målt hver 3-4 dag. Eksperimenter blev godkendt af Institutional Review Board og udført i overensstemmelse med Osaka Universitys regler.

Flowcytometri.

Som beskrevet tidligere (12, 23) blev in vitro-genererede antigen-specifikke CD8 plus T-celler farvet med PE-mærket Melan-A, CMV eller Flu tetramer (TC Matrix) eller PE-mærket NY-ESO-1 tetramer (MBL) i 10 minutter ved 37 grader og derefter farvet med forskellige overflade-mAbs. Til farvning af overflade-CTLA-4 i denne undersøgelse blev et biotinyleret-anti-humant CD152-antistof (klon BNI3; BD Biosciences) brugt ved 4 grader i 15 minutter med andre antistoffer mod overflademolekyler. Efter vask tilsatte vi APC-streptavidin (Biolegend) også ved 4 grader i 15 minutter for at undgå farvning af CTLA-4-molekyler eksternt til overfladen efter forlænget farvningstilstand ved 37 grader. Disse farvningsprocedurer blev udført før fiksering og permeabilisering, som beskrevet i vores tidligere undersøgelse (24).

Intracellulær farvning af FOXP3 blev udført ved hjælp af FOXP3 Transcription Factor Staining Buffer-sættet (eBioscience). Følgende antistoffer med indikerede fluorescerende mærker blev brugt til farvning af humane celler: PerCP/Cy5.5-CCR7 (150503; BD Biosciences), FITC-CD45RA (HI100; BD Biosciences), biotin-CTLA-4 (BNI3 ; BD Biosciences), APC-Streptavidin (BioLegend), V500-CD8 (RPA-T8; BD Biosciences), BrilliantViolet711-CD3 (OKT3; Biolegned), AlexaFluor700-CD4 (RPA -T4; eBioscience), FITC-Lineage-blanding (BD Biosciences), PerCP/Cy5.5-CD11c (3.9; BioLegend), APC-HLA-DR (LN3; eBioscience), PE-CD86 (IT2.2; eBioscience), AlexaFluor700-CD80 (L307.4; BD Biosciences), PE-FOXP3 (236A/E7; eBioscience) og fixerbart levedygtighedsfarvestof eFluor780 (eBioscience). Følgende antistoffer blev brugt til at farve museceller: V500-CD8 (53-6.7; BD Biosciences), PE-Cy7-CD3e (145-2C11; eBioscience), eFluor 450-CD4 (RM4-5; eBioscience), APC-CD25 (PC61.5; eBioscience), PE-FOXP3 (FJK-16s; eBioscience), FITC–IFN- (XMG1. 2; BD Biosciences), AlexaFluor647-IL-2 (JES6-5H4; eBiosciences) og fixerbart levedygtighedsfarvestof eFluor780 (eBioscience). Antigenspecifikke TIL CD8 plus T-celler fra mus blev farvet med PE-mærkede, H-2Dd-begrænsede ESO-181-88 tetramerer (TC Matrix), som beskrevet ovenfor. For at måle cytokinproduktion fra CD8 plus T-celler blev muse TIL'er restimuleret i 5 timer ved 37 grader i nærværelse af 10 μM af de samme ESO-181-88 peptider, der blev brugt til en vaccination med GolgiPlug (BD Bioscience). Fiksering og permeabilisering blev udført med Cytofix/Cytoperm buffersættet (BD Bioscience). Celler blev erhvervet med LSR Fortessa (BD Bioscience) og analyseret ved hjælp af FlowJo v9.9.5-software.

Statistisk analyse

To-halet parret t-test blev brugt til at evaluere signifikansen mellem de to grupper. En- eller tovejs ANOVA med post hoc Tukeys ærlige signifikante forskel (HSD) test blev brugt til at sammenligne flere grupper. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af Prism v6-software (GraphPad). P-værdier < 0.05 blev betragtet som signifikante.

ANKENDELSER.

Vi takker medlemmer af Department of Dermatology, Graduate School of Medicine, Osaka University for indsamlingen af ​​patientprøver; og K. Teshima, T. Shimizu og N. Mizoguchi for teknisk assistance. Konstruerede anti-humane og muse-CTLA-4-antistoffer blev genereret og leveret af Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. Denne undersøgelse blev støttet af Grant-in-Aid for Specially Promoted Research 16H06295 (til SS), Grants-in-Aid for videnskabelig forskning (A) 26253030 (til SS) og (B) 26290054 (til HN), Grantin-Aid for udfordrende Exploratory Research 26670581 (til HN), og Grant-inAid for Young Scientists (B) 26860315 og 27K ( A. Tanaka) fra ministeriet for undervisning, kultur, sport, videnskab og teknologi i Japan; og Core Research for Evolutional Science and Technology fra Japan Science and Technology Agency (SS). Denne undersøgelse blev delvist udført som et forskningsprogram under projektet for udvikling af innovativ forskning om kræftterapi (P-DIRECT), og praktisk forskning for innovativ kræftkontrol og projekt for kræftforskning og terapeutisk evolution (P-CREATE) af Japan Agenturet for Medicinsk Forskning og Udvikling.

1. Sakaguchi S (2004) Naturligt opståede CD4 plus regulatoriske T-celler til immunologisk selvtolerance og negativ kontrol af immunresponser. Annu Rev Immunol 22:531-562.

2. Zou W (2006) Regulatoriske T-celler, tumorimmunitet og immunterapi. Nat Rev Immunol 6:295-307.

3. Tanaka A, Sakaguchi S (2017) Regulatoriske T-celler i cancerimmunterapi. Cell Res 27: 109-118.

4. Quezada SA, Peggs KS, Curran MA, Allison JP (2006) CTLA4-blokade og GM-CSF-kombinationsimmunterapi ændrer intratumorbalancen af ​​effektor- og regulatoriske T-celler. J Clin Invest 116:1935–1945.

5. Shimizu J, Yamazaki S, Sakaguchi S (1999) Induktion af tumorimmunitet ved at fjerne CD25 plus CD4 plus T-celler: Et fælles grundlag mellem tumorimmunitet og autoimmunitet. J Immunol 163:5211-5218.

6. Wolf AM, et al. (2003) Forøgelse af regulatoriske T-celler i det perifere blod hos cancerpatienter. Clin Cancer Res 9:606-612.

7. Curiel TJ, et al. (2004) Specifik rekruttering af regulatoriske T-celler i ovariekarcinom fremmer immunprivilegier og forudsiger reduceret overlevelse. Nat Med 10:942-949.

8. Petersen RP, et al. (2006) Tumorinfiltrerende Foxp3 plus regulatoriske T-celler er forbundet med recidiv hos patienter med patologisk stadium I NSCLC. Cancer 107:2866-2872.

9. Shang B, Liu Y, Jiang SJ, Liu Y (2015) Prognostisk værdi af tumorinfiltrerende FoxP3 plus regulatoriske T-celler i cancer: En systematisk gennemgang og meta-analyse. Sci Rep 5:15179.

10. Miyara M, et al. (2009) Funktionel afgrænsning og differentieringsdynamik af humane CD4 plus T-celler, der udtrykker FoxP3-transkriptionsfaktoren. Immunity 30:899-911.

11. Wing JB, et al. (2017) En særskilt underpopulation af CD25-T-follikulære regulatoriske celler lokaliseres i germinalcentrene. Proc Natl Acad Sci USA 114:E6400–E6409.

12. Saito T, et al. (2016) To FOXP3(plus)CD4(plus)-T-celle-subpopulationer kontrollerer tydeligt prognosen for kolorektale cancere. Nat Med 22:679-684.

13. Sugiyama D, et al. (2013) Anti-CCR4 mAb udtømmer selektivt effektor-type FoxP3 plus CD4 plus regulatoriske T-celler, hvilket fremkalder antitumorimmunresponser hos mennesker. Proc Natl Acad Sci USA 110:17945–17950.

14. Shevach EM (2009) Mekanismer for foxp3 plus T regulatorisk cellemedieret undertrykkelse. Immunity 30:636-645.

15. Wing K, et al. (2008) CTLA-4 kontrol over Foxp3 plus regulatorisk T-cellefunktion. Science 322:271-275.

16. Qureshi OS, et al. (2011) Trans-endocytose af CD80 og CD86: Et molekylært grundlag for den celleekstrinsiske funktion af CTLA-4. Science 332:600-603.

17. Hodi FS, et al. (2010) Forbedret overlevelse med ipilimumab hos patienter med metastatisk melanom. N Engl J Med 363:711-723.

18. Robert C, et al. (2011) Ipilimumab plus dacarbazin til tidligere ubehandlet metastatisk melanom. N Engl J Med 364:2517-2526.

19. Bulliard Y, et al. (2013) Aktiverende Fc-receptorer bidrager til antitumoraktiviteterne af immunregulatoriske receptor-målrettede antistoffer. J Exp Med 210:1685-1693.

20. Simpson TR, et al. (2013) Fc-afhængig udtømning af tumorinfiltrerende regulatoriske T-celler meddefinerer effektiviteten af ​​anti-CTLA-4-terapi mod melanom. J Exp Med 210:1695–1710.

21. Selby MJ, et al. (2013) Anti-CTLA-4-antistoffer af IgG2a-isotype øger antitumoraktivitet gennem reduktion af intratumorale regulatoriske T-celler. Cancer Immunol Res 1: 32-42.

22. Nimmerjahn F, Ravetch JV (2008) Fcgamma-receptorer som regulatorer af immunresponser. Nat Rev Immunol 8:34-47.

23. Mimoto F, et al. (2013) Ny asymmetrisk konstrueret antistof Fc-variant med overlegen FcR-bindingsaffinitet og specificitet sammenlignet med fucosyleret Fc-variant. MAbs 5:229-236.

24. Maeda Y, et al. (2014) Påvisning af selvreaktive CD8 plus T-celler med en anergisk fænotype hos raske individer. Science 346:1536-1540.

25. Gnjatic S, et al. (2006) NY-ESO-1: Gennemgang af et immunogent tumorantigen. Adv Cancer Res 95:1–30.

26. Arce Vargas F, et al.; Melanom TRACERx konsortium; Renalt TRACERx-konsortium; Lung TRACERx Consortium (2017) Fc-optimeret anti-CD25 udtømmer tumorinfiltrerende regulatoriske T-celler og synergerer med PD-1 blokade for at udrydde etablerede tumorer. Immunity 46:577-586.

27. Arce Vargas F, et al.; TRACERx melanom; TRACERx Renal; TRACERx Lung consortia (2018) Fc-effektorfunktion bidrager til aktiviteten af ​​humane anti-CTLA-4-antistoffer. Cancer Cell 33:649–663.e4.

28. Bulliard Y, et al. (2014) OX40-engagement udtømmer intratumorale Tregs via aktiverende Fc R'er, hvilket fører til antitumoreffektivitet. Immunol Cell Biol 92:475-480.

29. Romano E, et al. (2015) Ipilimumab-afhængig cellemedieret cytotoksicitet af regulatoriske T-celler ex vivo af ikke-klassiske monocytter hos melanompatienter. Proc Natl Acad Sci USA 112:6140–6145.

30. Walker LSK, Sansom DM (2011) CTLA4's nye rolle som en celleekstrinsisk regulator af T-celleresponser. Nat Rev Immunol 11:852-863.

31. Linsley PS, et al. (1996) Intracellulær trafficking af CTLA-4 og fokal lokalisering mod websteder med TCR-engagement. Immunitet 4:535-543.

32. Egen JG, Allison JP (2002) Cytotoksisk T-lymfocytantigen-4 akkumulering i den immunologiske synapse reguleres af TCR-signalstyrke. Immunitet 16:23-35.

33. Ko K, et al. (2005) Behandling af fremskredne tumorer med agonistisk anti-GITR mAb og dets virkninger på tumorinfiltrerende Foxp3 plus CD25 plus CD4 plus regulatoriske T-celler. J Exp Med 202: 885-891.

34. Prieto PA, et al. (2012) CTLA-4 blokade med ipilimumab: Langtidsopfølgning af 177 patienter med metastatisk melanom. Clin Cancer Res 18:2039–2047.

35. Mei HE, Leipold MD, Schulz AR, Chester C, Maecker HT (2015) Stregkodning af levende humane perifere blodmononukleære celler til multiplekset massecytometri. J Immunol 194:2022-2031.

Danbee Haa,b, Atsushi Tanakaa, Tatsuya Kibayashia,c, Atsushi Tanemurad, Daisuke Sugiyamaa,1, James Badger Winga, Ee Lyn Lima, Karen Wei Weng Tenge, Dennis Adeegbea,2, Evan W. Newelle, Ichiro Katayamaad N,ikawaaoy N,ika 1,3, og Shimon Sakaguchia,b,4.

en eksperimentel immunologi, Immunology Frontier Research Center, Osaka University, 565-0871 Osaka, Japan; b Laboratory of Experimental Immunology, Department of Regeneration Science and Engineering, Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University, 606-8507 Kyoto, Japan; c Research Division, Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., 247-8530 Kanagawa, Japan; d Department of Dermatology, Graduate School of Medicine, Osaka University, 565-0871 Osaka, Japan; og e Agency for Science, Technology, and Research, Singapore Immunology Network, 138632 Singapore.

Bidraget af Shimon Sakaguchi, 23. november 2018 (sendt til gennemgang 19. juli 2018; anmeldt af Miyuki Azuma og Sergio A. Quezada).

For more information:1950477648nn@gmail.com