Eksponering for dieseludstødning ændrer udtryk for netværk impliceret i neurodegeneration i zebrafiskhjerner, del 3

Resultaterne af proteomics sammenligning afslørede opregulering (overrepræsentation) af ACTG2 (actin, gamma 2), CAT (catalase), GSR (glutathion-disulfidereduktase), GST (glutathion S-transferase), HMOX1 (hæm oxygenase 1) og PRDX1 (peroxiredoxin) 1), såvel som nedreguleringen af ​​ubiquitin-konjugatingenzyme ubcM2, RAP1A (RAP1A, medlem af RAsoncogene-familien), UBE2E3 (ubiquitin-konjugatingenzym E2 E3) og ACTA1 (actin, alfa 1).

Proteomics er en storstilet videnskabelig teknologi, der studerer typer, strukturer, mængder og funktioner af proteiner i organismer. I de senere år har flere og flere undersøgelser vist, at proteomics er tæt forbundet med hukommelsen.

Forskere har opdaget, at proteiner i hjernen kan påvirke signalering mellem neuroner og derved påvirke kognitive aktiviteter såsom indlæring og hukommelse. For eksempel syntetiseres de fleste proteinmolekyler, der kræves til hukommelseskodning og lagringsprocesser ved synapser. Disse proteinmolekyler er ikke kun direkte involveret i ledning og transduktion af nervesignaler, men kan også påvirke de synaptiske forbindelser og deres stabilitet mellem neuroner og derved påvirke genereringen og konsolideringen af ​​hukommelsen.

Forskning har også fundet ud af, at visse proteiner spiller en afgørende rolle i hukommelsesprocessen. For eksempel regulerer CaMKII-proteinkinase i neuroner styrken og stabiliteten af ​​synaptiske forbindelser og spiller en vigtig rolle i indlæring og hukommelse. Et andet vigtigt protein er BDNF, som kan fremme væksten af ​​neuroner, synaptisk styrkelse og neuronal overlevelse og derved forbedre konsolideringen og vedligeholdelsen af ​​hukommelsen.

Derudover har nogle undersøgelser fundet, at fysisk sundhed og kost også har betydelige effekter på proteomics og hukommelse. Tilstrækkelig søvn, passende motion og en fedtfattig kost med højt proteinindhold kan fremme proteinsyntese og reparation, hvilket er gavnligt for at forbedre hukommelsen og kognitive evner.

Sammenfattende er proteomik og hukommelse tæt forbundet. Forskere, der studerer biovidenskab, opdager i stigende grad, hvordan man kan modulere proteomet for at forbedre hukommelsen og forebygge behandlinger af kognitive lidelser såsom Alzheimers sygdom. Derfor bør vi være opmærksomme på resultaterne af videnskabelig forskning og opretholde gode spise-, leve- og motionsvaner for at opretholde en sund, stærk hjerne og have en bedre hukommelse. Det kan ses, at vi skal forbedre hukommelsen, og Cistanche deserticola kan forbedre hukommelsen markant, fordi Cistanche deserticola også kan regulere balancen af ​​neurotransmittere, såsom at øge niveauet af acetylcholin og vækstfaktorer. Disse stoffer er meget vigtige for hukommelse og indlæring. Derudover kan Cistanche deserticola også forbedre blodgennemstrømningen og fremme ilttilførsel, hvilket kan sikre, at hjernen får tilstrækkelige næringsstoffer og energi, og derved forbedre hjernens vitalitet og udholdenhed.

Klik på kender 10 måder at forbedre hukommelsen

Blandt dem kan nedreguleringen af ​​ubcM2, en inhibitor af Nrf2, føre til den højere aktivitet af denne vej. Da forskellige komponenter i cytoskelettet (ACTG2 og ACTA1) opfører sig forskelligt, og i betragtning af manglen på signifikant differentiel ekspression i Nrf2 eller Keep1, kan det konkluderes, at eksponeringen for DEP kan inducere omlejringen af ​​cytoskelettet (til fordel for Nrf2-translokation til kernen) og aktivering af Nrf2-vej indirekte via oxidative stressstimuli (fig. 4).

Disse resultater er godt understøttet af vores transkriptomiske analyse, som viser opreguleringen af ​​PRDX, GSR og GST (nedstrøms gener). Imidlertid detaljerede transkriptomanalysen yderligere, at c-Fos og FRA1 (to hæmmere af nuklear Nrf2) er signifikant nedregulerede og derfor tillader højere Nrf2-aktivitet under DEPe-behandlingen.

Fagosom modning

Fagosommodning letter handelen med internaliserede partikler mod en række tiltagende forsurede, membranbundne subcellulære strukturer, hvilket resulterer i partikelnedbrydning. Efter forsegling eller udskæring fra overflademembranen fusionerede fagosomer med tidlige endosomer, sene endosomer og lysosomer ledsaget af betydelige forsurende ændringer i dets sammensætning, hvilket omdanner det til et oxidativt og nedbrydende miljø.

Fagosombevægelsen sker baseret på cytoskeletproteinbinding (mikrotubuli), hvilket fører til fusion af endosomer og lysosomer sekventielt på en dynamisk måde (Gotthardt et al. 2002). Under modningen driver GTPase Rab5 fusionen af ​​tidlige endosomer via interaktion med flere molekyler. herunder det tidlige endosomantigen 1 (EEA1), VPSS34-komplekset og SNAREproteiner.

Desuden sker forsuring samtidigt via vATPase (en vakuolær protonpumpe), der translokerer H+ over membranen og forsurer lumen yderligere (Desjardins et al. 1994).

Selvom der ikke blev fundet nogen signifikant involvering af denne vej på det transkriptomiske niveau, viser vores proteomiske analyse nedregulering af ATP6V1A (ATPase H+transporterende V1 underenhed A), ATP6V1E1, ATP1B2B, ATP1B3A, ATP6V1F, DYNLRB1 (dynein let kæde vejblok-type 1), TUBA1C(tubulin alpha 1c), TUBB2A, TUBB4A og VAMP2(vesikel-associeret membranprotein 2), hvilket tyder på, at behandlingen med DEPe kan føre til lavere fagosommodningsaktivitet eller ændret lysosomal pH (fig. 4). Dette er i overensstemmelse med vores seneste rapport om, at DEPe-eksponering resulterer i lavere neuronalautophagisk fux og antyder en mekanisme, der ligger til grund for neuronal toksicitet af luftforurening (Barnhill et al.2020).

Amyloidbehandling

Amyloide plaques er kendetegn ved neuropatologiske hjernelæsioner i AD og PD med demens. Disse strukturer er sammensat af A-beta-peptid, som er centralt for patofysiologien af ​​AD (SadighEteghad et al. 2015).

Amyloid beta behandles af gamma-sekretasekompleks (Presenilin1/2) og beta-sekretase (BACE1) fra Type 1 transmembranprotein-Amyloidprotein (APP). Det er kendt, at unormal Ca2+infux fører til den afvigende aktivering af Calpain, som spiller en rolle i phosphoryleringen af ​​det mikrotubuli-associerede protein Tauvia CDK5-vejen.

Ydermere bidrager oxidativ stress forbundet med akkumulering af A-beta til aktiveringen af ​​adskillige kinaser, herunder MAP-kinaser, hvilket resulterer i phosphorylering af tau. Den patologiske hyperphosphorylering af tau har en væsentlig rolle i destabiliseringen af ​​mikrotubuli (Sadigh-Eteghad et al. 2015) ). Disse ændringer er særligt relevante for patogenesen af ​​AD og PD og kan være en medvirkende faktor til, hvordan luftforurening øger risikoen.

Vores ekspressionsanalyser tyder på en destabiliserende indvirkning af DEPe på regulatorerne af amyloidbehandling, da tre regulatorer, herunder CAPNS1 (calpain lille underenhed 1), MARK1 (mikrotubuli affinitetsregulerende kinase 1) og PRKAR1B (protein kinasecAMP-afhængig type I regulatorisk underenhed beta) blev nedreguleret på proteinniveau (fig. 4).

Mitokondriel dysfunktion

Som de vigtigste forbrugere af ilt i en celle indeholder mitokondrier et væld af redoxbærere til at overføre elektroner til oxygen, hvilket resulterer i dannelsen af ​​reaktive oxygenarter (ROS).

Disse organeller indeholder et antioxidantforsvarssystem til at afgifte ROS og undgå oxidativ skade på andre cellulære komponenter. DEPe-eksponering førte til ændringer i udtrykket af nøgleproteiner, der sandsynligvis resulterede i mitokondriel dysfunktion. Som vist i fig. 4 er der et betydeligt fald i proteinniveauet af ATP-syntase (ATP5F1D, ATP5mea), Cytochrom c-oxidase (COX7A2), NADH-dehydrogenase (NDUFA10, NDUFS8), 2-oxoglutarat-dehydrogenase (OGDH), og Cytochrom b-c1 kompleks underenhed 2 (UQCRC2), der spiller afgørende roller i elektrontransport.

Dette kunne ændre ATP-produktion og også direkte resultere i forhøjet ROS-produktion og toksicitet. Mitokondriel dysfunktion er blevet foreslået at bidrage til patogenesen af ​​AD og PD, og ​​som med nogle af de førnævnte veje, kan luftforurening ændre risikoen ved at forstyrre funktionen af ​​denne kritiske organel.

Aksonal vejledningssignalering

Dannelsen af ​​neuronale forbindelser kræver forlængelse af axoner, der migrerer mod deres synaptiske mål. Ved axonens forkant indeholder axonalgrowth-keglen receptorer med evnen til at fornemme attraktive og frastødende vejledningssignaler, der er nødvendige for navigationen af ​​aksonet.

Ud over BMP, Shh og Wnt (der for nylig er blevet impliceret i aksonal vejledning) er der mindst fire hovedgrupper af vejledningssignaler: (i) Netriner og DCC/UNC-5-receptorer; (ii) Plexin, semaphoriner og neuropilinreceptorer; (iii) spalter og Robo-receptorer; og (iv) ephriner og Eph-receptorer. Disse proteiner kan enten udskilles og associeres med den ekstracellulære matrix (Slits, Netrins og nogle Semaphorins) eller være forankret til celleoverfladen (Ephrins and someother Semaphorins) (Stoeckli 2018). Behandling med DEPe påvirker flere aspekter af aksonal vejledning.

På proteinniveau blev adskillige vigtige faktorer og regulatorer ændret ved behandlingen. Overrepræsentationen af ​​PLXNB2 (plexin B2) og underrepræsentationen af ​​adskillige proteiner, herunder ARHGEF11 (Rho guanin nucleotideexchange factor 11), CHMP1A (ladet multivesikulært kropsprotein 1A), COPS5 (COP9 signalosomunderenhed 5), GNAT1 (G trans GNAT underenhed 1 alfa), (G protein underenhed alfa transducin 2), GNB5 (G protein underenhed beta 5), ​​MYL1 (myosin let kæde 1), MYL2 (myosin let kæde2), NCK1 (adaptor protein 1), PLXNA1 (plexin A1), PRKAR1B (protein kinase cAMP-afhængig type I regulatorisk underenhed beta), RAC3 (Rac familie smallGTPase 3), RAP1A (et medlem af RAS onkogenfamilien), SHANK2 (SH3 og multiple ankyrin gentagelsesdomæner 2), TUBA1C (tubulin alfa 1c), TUBB2A (tubulin beta 2A klasse II ), og TUBB4A (tubulinbeta 4A klasse Iva) tyder på en signifikant svækkelse af axonstyringen i det udviklende embryo (Supplerende tabel 5).

Interessant nok blev den aksonale vejledningsvej ikke væsentligt påvirket på det transkriptomiske niveau, hvilket tyder på, at involveringen af ​​denne vej kan være et nedstrøms resultat, hvorigennem nogle af effektor/regulatorproteinerne er blevet nedbrudt.

Ændringer i aksonale vejledningsveje beskrevet her kan afspejle neurotoksiske veje, der er relevante for AD og PD eller blot afspejle interferens af neural udvikling i udvikling af embryoner. Analyse af udtryksprofiler hos DEPe-eksponerede voksne ville hjælpe med at løse dette spørgsmål.

Andre veje

Vores proteomiske og transkriptomiske analyser viste også involvering af adskillige veje og metaboliske ruter, herunder melatonin-nedbrydning, døgnrytme, Sertoli-celle-Sertoli-celleforbindelsessignalering, signalering af epiteladherens-forbindelse, thyreoideahormonmetabolisme II (via konjugation og/eller nedbrydning, i RhoosineA), -5′-phosphatbiosyntese II, GP6-signalvej, RhoGDI-signalering, ekstrinsisk protrombinaktiveringsvej og koagulationssystemet. Mange af disse ændringer kan afspejle ændringer som følge af afbrydelse af udviklingen.

For eksempel afslørede både proteomiske og transkriptomiske analyser, at fototransduktionsvejen har de største ændringer i udtryk ved DEPe-behandling. Som vist i supplerende tabel 5 har flere gener, herunder Opsin, GRK, S-arrestin, Transducin-, Transducin-, PDC og GUCA et svækket niveau af transkription på grund af eksponeringen for DEPe. På grund af manglen på bevis for induktion af ethvert element i denne vej, ser DEPe-behandling ud til at skade udviklingen af ​​det visuelle system. Dette er i overensstemmelse med vores observation, at øjnene aldrig udviklede sig fuldt ud og er små efter behandlingen.

Funktionsvurdering

I denne rapport var den signifikante opregulering af cytochrom P450 (Cyp1A) den mest fremtrædende effekt af DEPe-eksponering. Cyp1A metaboliserer mange endogene og eksogene forbindelser, og øget ekspression i hjernen kan være beskyttende mod eller bidrage til toksicitet. For bedre at forstå Cyp1A's rolle i DEPe-toksicitet brugte vi CRISPR/Cas9 til at generere en Cyp1A knockdown-model. Da genredigeringsproceduren i zebrafisk sandsynligvis er en delvis proces, der resulterer i mosaik-embryoner, bruger vi udtrykket "knockdown" (KD) i stedet for "knockout". Ved hjælp af et sekvensspecifikt guide-RNA konverterede vi det første CCA PAM-sted til et TGA (stop) codonin det første exon af Cyp1A. Et ikke-mål-guide-RNA blev alternativt brugt som scramble-kontrol (SC).

Total RNA blev derefter isoleret fra hovederne på op til 20 KD og SC embryoner (5 pdf), og knockdown-effektiviteten blev valideret ved qPCR-analyse. I lighed med det, der blev observeret i RNA-Seq-undersøgelsen med høj kapacitet, viste dette eksperiment en skarp induktion (30.59- gange fra basislinjen) af Cyp1A ved DEPetreatment i SC-embryonerne, mens KD-embryonerne manglede en sådan stigning i ekspression ( Fig. 5a).

Overlevelsen af ​​seks grupper af embryoner under et 7-dagkursus (n større end eller lig med 40) er vist i fig. 5b. Kort fortalt, på 7pdf, var den gennemsnitlige overlevelse 89,1 %, 74,4 %, 79,4 %, 68,5 %, 48,8 % og 7,6 % for WT/DMSO, WT/DEPe, SC/DMSO, SC/DEPe, KD/DMSO og henholdsvis KD/DEPe. KD af Cyp1A resulterede således i reduceret overlevelse, men blev dramatisk reduceret i de DEPe-behandlede fisk sammenlignet med kontroller.

Desuden resulterede KD også i en signifikant højere frekvens af morfologiske misdannelser (fig. 5c). Således ser induktionen af ​​Cyp1A-ekspression af DEPe ud til at være en beskyttende kompensatorisk mekanisme. En væsentlig begrænsning af vores resultater er, at vi målte Cyp1A-induktion af ekspression i zebrafiskhjernerne, men KDexperiments reducerede ekspression i hele embryoet.

Betydning og implikationer for neurodegenerative sygdomme

Luftforurening er kendt for at påvirke livskvaliteten negativt og spille en vigtig rolle i udviklingen af ​​sygdomme hos mennesker og dyr. Ved hjælp af ekspressionsanalyser med høj kapacitet viste vi, at DEPe-behandling ændrede adskillige biologiske processer og signalveje i hovedet på zebrafiskembryoner. Ændringer i fagosomdannelse, amyloidbehandling og mitokondriel funktion er særligt relevante for neurodegeneration.

Overraskende nok indikerede vores resultater ikke nogen tydelig involvering af inflammation, som er blevet antaget at spille en vigtig rolle i luftforureningstoksicitet. Dette skyldes sandsynligvis, at vi kun målte udtryk i hovedet på 5-daggamle zebrafisk og ikke hele kroppen. Disse undersøgelser havde til formål at bestemme, hvordan hjernen påvirkes af eksponering for DEPe.

Hjernen indeholder mikroglia, som sandsynligvis aktiveres af DEPe, men de udgør en så lille del af cellerne i hjernen, at eventuelle ændringer kan være uopdagelige. Derudover er mikroglia ikke til stede og fungerer i hjernen hos udviklende larver før 3-5 pdf. På grund af dette er tidlig eksponering muligvis ikke den mest relevante til at studere inflammatoriske reaktioner. Fremkaldelsen af ​​xenobiotisk metabolisme er sandsynligvis også relevant som en kompenserende eller beskyttende reaktion på luftforurening.

Vores Cyp1AKD-model validerede denne vejs beskyttende rolle og repræsenterer et glimrende eksempel på, hvordan ekspressionsundersøgelser kan give vigtige spor til at bestemme mekanismer af giftige stoffer såsom luftforurening. Det vides ikke, om polymorfismer i Cyp1A-genet ændrer risikoen for AD eller PD hos mennesker udsat for luftforurening, men disse resultater tyder på en potentiel gen-miljøinteraktion og fortjener yderligere undersøgelse.

Et vigtigt spørgsmål at tage fat på er relevansen af ​​DEPe-eksponeringer for luftforurening. DEPe er den mest almindelige blanding, der bruges i luftforureningsforskning til cellekultur og andre modeller, der ikke er modtagelige for inhalationskamre. Dichlormethanekstrakterne af DEP indeholder hydrofobe dele såsom PAH'er, der med størst sandsynlighed kommer ind i blodbanen og bioakkumulerer i hjernen. En nylig undersøgelse bestemte koncentrationen af ​​adskillige PAH'er i menneskelige obduktionshjerner og fandt, at de indeholdt koncentrationer af PAH'er meget lig dem, der blev brugt i undersøgelserne præsenteret her (Pastor-Belda et al. 2019). Eksponeringerne for zebrafiskhjerner er således meget relevante, da de indeholder PAH'er og andre dele, der er observeret at bioakkumulere i menneskehjernen.

Tak Vi takker følgende agenturer for at finansiere dette arbejde: Levine Foundation (JMB), tilskud fra National Institute of Environmental Health Sciences, NIEHST32ES015457 (LMB, SK) og The Parkinson's Alliance (JMB).

Forfatterbidrag Udformning og design af undersøgelsen (MSJ, LMB, JMB); Indsamling af data (MSJ, HM, LMB, SL): Analyse og fortolkning af data (MSJ, LMB, JMB); Udarbejdelse af artiklen eller kritisk revision af den for vigtigt intellektuelt indhold (MSJ, HM, LMB, JMB).

Finansiering Disse undersøgelser blev støttet af The Levine Foundation (JMB), tilskud fra National Institute of Environmental Health Sciences, NIEHS T32ES015457 (LMB, SK) og The Parkinson's Alliance (JMB).

Datatilgængelighed Alle data er tilgængelige i vores supplerende filer.

Erklæringer

Etisk godkendelse Alle dyreforsøg blev godkendt af UCLA Animal Research Committee.

Samtykke til offentliggørelse Alle forfattere godkender denne indsendelse til offentliggørelse.

Konkurrerende interesser Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Open Access Denne artikel er licenseret under en Creative Commons Attribution 4.0 International License, som tillader brug, deling, tilpasning, distribution og reproduktion i ethvert medie eller format, så længe du krediterer den eller de originale forfattere. og kilden, angiv et link til Creative Commons-licensen og angiv, om der er foretaget ændringer.

Billederne eller andet tredjepartsmateriale i denne artikel er inkluderet i artiklens Creative Commons-licens, medmindre andet er angivet i en kreditgrænse til materialet. Hvis materiale ikke er inkluderet i artiklens Creative Commons-licenshaver, og din tilsigtede brug ikke er tilladt i henhold til lovbestemmelser eller overstiger den tilladte brug, skal du indhente tilladelse direkte fra indehaveren af ​​ophavsretten. For at se en kopi af denne licens.

Referencer

1. Ahmadinejad F, Møller, SG Hashemzadeh-Chaleshtori M, BidkhoriG, Jami MS. Molekylære mekanismer bag frie radikaler fungerer mod oxidativt stress Antioxidanter 2017;6https://doi.org/10.3390/antiox6030051

2. Barnhill LM, Khuansuwan S, Juarez D, Murata H, Araujo JA, Bronstein JM. 2020. Eksponering af dieseludstødningsekstrakt inducerer neuronal toksicitet ved at forstyrre autofagi. Toxicol Sci; https://doi.org/10.1093/toxsci/kfaa055. Tilgængelig: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32298450 [Få adgang til 1. maj 2020].

3. Bostancıklıoğlu M. En opdatering om interaktionerne mellem Alzheimers sygdom, autofagi og inflammation. Gene.2019;705:157-66. https://doi.org/10.1016/j.gene.2019.04.040.

4. Calderón-Garcidueñas L, Maronpot RR, Torres-Jardon R, Henriquez-Roldán C, Schoonhoven R, Acuña-Ayala H, et al. DNA-skader i næse- og hjernevæv hos hunde, der er udsat for luftforurenende stoffer, er forbundet med tegn på kronisk hjernebetændelse og neurodegeneration. Toxicol Pathol. 2003;31:524-38. https://doi.org/10.1080/01926230390226645.

5. Calderón-Garcidueñas L, Mora-Tiscareño A, Ontiveros E, Gómez-Garza G, Barragán-Mejía G, Broadway J, et al. Luftforurening, kognitive underskud og hjerneabnormiteter: en pilotundersøgelse med børn og hunde. Brain Cogn.2008a;68:117–27. https://doi.org/10.1016/j.bandc.2008.04.008.

6. Calderón-Garcidueñas L, Reed W, Maronpot RR, Henríquez Roldán C, Delgado-Chavez R, Calderón-Garcidueñas A, et al. Hjernebetændelse og Alzheimers-lignende patologi hos personer udsat for alvorlig luftforurening. Toxicol Pathol. 2004;32:650-8. https://doi.org/10.1080/01926230490520232.

7. Calderón-Garcidueñas L, Solt AC, Henríquez-Roldán C, TorresJardón R, Nuse B, Herritt L, et al. Langtidseksponering for luftforurening er forbundet med neuroinflammation, en ændret medfødt immunreaktion, forstyrrelse af blod-hjerne-barrieren, ultrafin partikelaflejring og akkumulering af amyloid -42 og -synuclein hos børn og unge voksne. Toxicol Pathol. 2008b;36:289-310. https://doi.org/10.1177/0192623307313011.

8. Calderón-Garcidueñas L, Villarreal-Calderon R, ValenciaSalazar G, Henríquez-Roldán C, Gutiérrez-Castrellón P, Coria-Jiménez R, et al. Systemisk inflammation, endoteldysfunktion og aktivering hos klinisk raske børn udsat for luftforurenende stoffer. Inhaler Toxicol. 2008c;20:499-506. https://doi.org/10.1080/08958370701864797.

   ---

   For more information:1950477648nn@gmail.com