Cytokinabsorption under human nyreperfusion reducerer forsinket graftfunktion-associeret inflammatorisk gensignatur

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

John R. Ferdinand1,2|Sarah A. Hosgood2,3|Tom Moore2,3|Ashley Ferro1|Christopher J. Ward1|Tomas Castro-Dopico1|Michael L. Nicholson2,3|Menna R. Clatworthy1,2

1 Molecular Immunity Unit, University of Cambridge Department of Medicine, Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK

2 National Institute of Health Research Blod- og transplantationsforskningsenhed i organdonation, Cambridge, Storbritannien

3 University of Cambridge Department of Surgery, Cambridge, Storbritannien

Transplantation er den optimale behandling for de fleste patienter med slutstadietnyresygdommen organmangel er en stor udfordring. Normotermic machine perfusion (NMP) er blevet brugt til at rekonditionere marginale organer; mekanismer, hvorved NMP kan gavne organer, er imidlertid ikke godt forstået. Ved at bruge par menneskelige nyrer opnået fra den samme donor sammenlignede vi effekten af ​​NMP med virkningen af ​​køleopbevaring på den globalenyretranskriptom. Vi fandt ud af, at køleopbevaring førte til en global reduktion i genekspression, herunder inflammatoriske pathway-gener og dem, der kræves til energigenereringsprocesser, såsom oxidativ phosphorylering (OXPHOS). I modsætning hertil var der under NMP markant opregulering af OXPHOS-gener, men også af en række immun- og inflammatoriske pathway-gener. Ved at bruge biopsier fra nyrer, der gennemgår NMP, som efterfølgende blev transplanteret, fandt vi, at højere inflammatorisk genekspression forekom i organer med forlænget forsinket graftfunktion (DGF). Derfor brugte vi en hem-adsorber (HA) til at fjerne pro-inflammatoriske cytokiner. Denne svækkede inflammatoriske genekspression øgede OXPHOS pathway-gener og havde potentielt klinisk vigtige virkninger til at reducere ekspressionen af ​​en DGF-associeret gensignatur. Sammen tyder vores data på, at adsorption af pro-inflammatoriske mediatorer fra perfusatet repræsenterer en potentiel intervention, der kan forbedre organets levedygtighed.

SØGEORD:klinisk forskning/praksis, forsinket graftfunktion (DGF), donorer og donation: afdøde,nyre(allograft) funktion/dysfunktion,nyresygdom: immun / inflammatorisk, nyre

Cistanche urt, der forbedrer nyrefunktionen

1. INTRODUKTION

Nyretransplantation repræsenterer den optimale behandling for de fleste patienter medslutstadietnyresygdom, med fordele for både livskvalitet og kvantitet.1 Organmangel er en stor udfordring, og adskillige strategier er blevet brugt til at øge antallet af tilgængelige nyrer, herunder brugen af ​​døde kredsløbsdødsdonorer (DCD) og donorer med udvidede kriterier (ECD). ), som begge er forbundet med højere rater af forsinket graftfunktion (DGF) sammenlignet med afdøde hjernestammedødsdonorer (DBD).2,3 I DCD-nyrer yder eksponering for varm iskæmi under processen med kredsløbsophør et væsentligt bidrag til DGF . DGF opstår på grund af iskæmisk tubulær celleskade eller død, som kan stimulere medfødt immunaktivering via NLRP3-inflammasomsamling, hvilket fører til dannelsen af ​​interleukin (IL)1 og IL18.4-6 Faktisk er tilstedeværelsen af ​​inflammatoriske cytokiner i urinen blevet bruges som biomarkør forspidsnyreskadeog DGF.7-9

Normotermic machine perfusion (NMP) gør det muligt for transplanterede organer at blive perfunderet med varme, iltede røde blodlegemer i fravær af cirkulerende immunkomponenter, herunder komplement og neutrofiler.10-14 Denne proces er blevet brugt til at vurdere marginale organer15 og til at " genoprette" organer for at lette transplantation af nyrer, der oprindeligt blev afvist efter et tilbud via en national organallokeringstjeneste.16 Vores tidligere erfaring med at bruge NMP gav begrundelsen for et randomiseret kontrolleret forsøg for at vurdere dets effektivitet til at forebygge DGF i DCD-nyrer,17 men de mekanismer, hvorved NMP kan gavne transplanterede nyrer, er ikke fuldt ud forstået. Endvidere spørgsmålet om, hvorvidt yderligere manipulation afnyreunder NMP, for eksempel ved fjernelse af pro-inflammatoriske cytokiner og kemokiner fra perfusatet, kan tilbyde yderligere fordele ved at optimere organet før transplantation er ikke blevet behandlet i humane nyrer, men vores undersøgelse af svine NMP viste lovende resultater.18

Her tog vi en objektiv tilgang til at løse disse to spørgsmål ved hjælp af transkriptomisk analyse af menneskernyrebiopsier taget ved starten og slutningen af ​​NMP for at vurdere globale ændringer i genekspression. Vi brugte par af menneskelige nyrer fra en enkelt donor, hvilket muliggjorde en sammenligning af effekten af ​​forskellige indgreb i organer med en identisk genetisk baggrund og var i stand til at vurdere virkningen af ​​disse ændringer på en forudsigelse af transplantatresultatet.

Cistanche ekstrakt fordel: forebyggelse af akutnyreskade

2. RESULTATER

2.1. Parrede nyrer er genetisk ens og en nyttig model til at vurdere interventioner

Vi undersøgte de transkriptionelle ændringer forbundet med organkonservering og NMP i to uafhængige undersøgelser, hver med fem par nyrer, hvilket giver i alt 10 par/20 humane nyrer. Af disse var to fra DBD og otte fra DCD-donorer (tabel S1, S2 og figur S1). I disse undersøgelser tog vi kortikale biopsier før og efter intervention (køling eller NMP) og undersøgte det transkriptionelle landskab ved hjælp af RNA-sekventering (RNA-Seq). Brugen af ​​parrede nyrer og parrede biopsier fra sammenyregjorde det muligt for os at kontrollere for biologisk variation og at regressere denne konfounder ud af analysen (figur S2A). Det bekræftede vinyrepar starter med et fælles transkriptionelt landskab (fig. S2B) og ved at anvende forskellige indgreb på hvernyrei et par er vi i stand til at studere effekten af ​​en intervention uafhængig af biologisk variation.

FIGUR 1 Nyrer udsat for kold opbevaring viser begrænsede ændringer i genekspression sammenlignet med dem, der gennemgår NMP. Der blev opnået et par nyrer, som var blevet afvist til brug ved transplantation. Ennyreblev opretholdt i statisk kold opbevaring, og den anden gennemgik normotermisk maskinperfusion (NMP). Biopsier blev taget fra den ydre cortex ved starten og efter 2 timer. B, Vulkanplot, der indikerer en ændring i genekspression efter 2 timer for den angivne gruppe sammenlignet med starten. Røde prikker indikerer differentielt udtrykte gener med en justeret P-værdi<0.05 and="" the="" experimental="" group="" is="" indicated="" above="" the="" plot.="" c,="" gene="" set="" enrichment="" analyses="" of="" the="" differential="" expressions="" from="" b="" against="" the="" hallmarks="" pathways.="" only="" significant="" pathways="" (fdr="" q="" value=""><0.05) are="" plotted.="" red="" dots="" indicate="" positive="" enrichment="" and="" blue="" negative,="" the="" size="" of="" the="" dot="" is="" inversely="" correlated="" with="" the="" fdr="" q="" value="" and="" the="" position="" indicates="" the="" normalized="" enrichment="" score="" (nes).="" d,="" heatmap="" of="" the="" top="" 20="" significantly="" upregulated="" genes="" during="" nmp,="" genes="" are="" ranked="" by="" log2="" fold="" change.="" e,="" string="" analysis="" of="" the="" top="" 50="" genes="" upregulated="" during="" nmp.="" the="" color="" of="" each="" node="" indicates="" membership="" of="" each="">

FIGUR 2 Korrelation af transkriptom efter NMP med længden af ​​forsinket graftfunktion. En genekspression var korreleret med længden af ​​DGF i biopsier taget efter NMP som en del af et randomiseret klinisk forsøg. Ekspressionsniveauerne for de 1000 gener med den største korrelation med resultatet er blevet plottet. B, GSEA blev udført for korrelationen fra A mod kendetegnsdatasættet. Kun signifikante veje (FDR q-værdi<0.05) are="" plotted.="" red="" dots="" indicate="" positive="" enrichment="" and="" blue="" negative,="" the="" size="" of="" the="" dot="" is="" inversely="" correlated="" with="" the="" fdr="" q="" value="" and="" the="" position="" indicates="" the="" normalized="" enrichment="" score="">

2.2. NMP resulterer i en stigning i OXPHOS- og inflammatoriske pathway-gener sammenlignet med køleopbevaring

For at undersøge de potentielle mekanismer, hvorved NMP kan påvirke nyrerne, tog vi oprindeligt femnyrepar (n {{0}} DCD-donorer og n=1 afdøde hjernestammedødsdonor [DBD]-donor, figur S1, tabel S1) og udførte en tids 0 (0 timer) kortikal biopsi . På dette tidspunkt blev nyrerne randomiseret til statisk køleopbevaring eller NMP, som beskrevet tidligere 10 (figur 1A). Efter 2 timer blev en anden biopsi taget fra begge nyrer, og RNA-Seq blev udført. Ved sammenligning af genekspression mellem tids-0-- og 2-timebiopsier fandt vi, at nyrer placeret i statisk kølerum ikke havde nogen statistisk signifikant ændring i ekspressionen af ​​noget individuelt gen, når de blev korrigeret for flere tests (Figur 1B , venstre panel). I modsætning hertil blev 956 gener opreguleret i løbet af 2 timers NMP, og 353 gener blev nedreguleret (figur 1B, højre panel). Vi vurderede derefter ændringer i ekspressionen af ​​grupper af gener inden for en fælles vej, og sammenlignede tiere eller hundreder af gener i stedet for ethvert individuelt gen, hvilket yderligere reducerede effekten af ​​biologisk interindividuel variation på analysen. Dette afslørede ændringer i funktionelt vigtige veje, hvor ekspressionen af ​​hvert enkelt gen inden for denne vej ikke blev ændret med tilstrækkelig størrelse til at nå statistisk signifikans. Denne gensætberigelsesanalyse (GSEA) viste, at kold opbevaring havde en væsentlig indvirkning på en række metaboliske veje (figur 1C, venstre panel). Der var især en markant reduktion i gener involveret i oxidativ phosphorylering (OXPHOS), en nøglevej, der kræves for at generere ATP.19 I modsætning hertil var OXPHOS blandt de veje, der var signifikant opreguleret under NMP (Figur 1C, højre panel), med potentielle fordele for cellelevedygtighed og genoprettelse af cellulær homeostase. Derudover blev en række veje involveret i immun- eller inflammatoriske processer induceret under NMP, hvor "TNF-signalering via NFkB" viste den største stigning. I overensstemmelse med dette var TNF, såvel som IL1B og de neutrofilrekrutterende kemokiner CXCL8 (IL8) og CXCL2, blandt de mest opregulerede gener i 2-time NMP-biopsier (figur 1D). Strengeanalyse af de 50 bedste opregulerede gener afslørede opregulering af biokemisk beslægtede gener, som var grupperet i fire hovedknuder; IL8 og neutrofil-rekrutterende kemokiner, Inflammasom-associerede gener, NFkB-signalering og transkriptionel regulering (figur 1E). Det skal bemærkes, at DBD- og DCD-nyrer var transkriptionelt ens ved baseline (Figur S2C), og genvejene, der ændrede sig under NMP, var ens i DBD- og DCD-nyrer (Figur S2D). Tilsammen viser vores analyse, at der under NMP er en øget ekspression af gener, der fremmer genereringen af ​​energi, med potentielt gavnlige effekter for organet, men en samtidig induktion af pro-inflammatoriske gener, som kan være skadelige.

Cistanche tubulosa ekstrakt: forbedre nyrefunktionen

2.3. Inflammatoriske pathway-gener i NMP-nyrer forbundet med langvarig forsinket graftfunktion

For at koble de transkriptionelle ændringer, der opstår under køleopbevaring og NMP til kliniske resultater, udførte vi RNA-Seq på biopsier taget fra 33 DCD-nyrer, der havde gennemgået NMP som en del af et randomiseret klinisk forsøg, der i øjeblikket vurderer dets effektivitet.17 prøver var tilgængelige på en undergruppe af nyrer randomiseret til NMP-armen af ​​undersøgelsen, der efterfølgende blev transplanteret (tabel S3, figur S1). DGF er mere almindelig i DCD-nyrer og er klassisk defineret som et krav til dialyse i den første uge efter transplantationen. Men i den umiddelbare post-transplantationsperiode får nogle patienter en enkelt episode af dialyse for hyperkaliæmi, hvilket ikke nødvendigvis afspejler tilstedeværelsen af ​​signifikant akut tubulær nekrose. Vi brugte derfor en model, der korrelerede genekspression med tiden mellem transplantationskirurgi og den sidste dialysesession (dvs. varigheden af ​​DGF). Dette viste mere markante transkriptionelle ændringer i transplantationer, der kræver dialyse ud over de første 24 timer efter transplantation (figur 2A), såvel som en signifikant positiv sammenhæng mellem ekspressionen af ​​inflammatoriske pathway-gener inklusive "TNFA-signalering via NFkB" og "inflammatorisk respons"-veje og længden af ​​DGF, med en større berigelse af disse veje i nyrer, der oplevede mere forlænget DGF efter transplantation (figur 2B). Omvendt korrelerede længden af ​​DGF negativt med størrelsen af ​​ekspressionen af ​​"OXPHOS" pathway-gener (figur 2B). Tilsammen indikerer disse data, at efter NMP er nyrer, der har lavere ekspression af gener for inflammatorisk vej og højere ekspression af "OXPHOS"-vejgener, mindre modtagelige for forlænget DGF posttransplantation. Dette ville understøtte konklusionen om, at de molekylære ændringer, der forekommer under NMP, kan have både gavnlige (induktion af OXPHOS-pathway-gener) og skadelige (induktion af inflammatoriske pathway-gener) virkninger.

2.4. Urinproduktion og renal blodgennemstrømning under NMP viser forskellige associationer til OXPHOS- og inflammatoriske pathway-gener

Mængden af ​​urin produceret under NMP er en af ​​en række parametre, der indgår i kirurgiske kvalitetsvurderinger, der bruges til at vejlede beslutninger om organudnyttelse,15 men hvorvidt høj urinproduktion under NMP virkelig giver en god prognose for nyrerne og de underliggende molekylære veje aktiveret i nyrer med høj urinproduktion er uklar. I i alt 10 nyrer, der gennemgår NMP (NMP kun nyrer, tabel S1 og S2, figur S1), observerede vi en række urinoutput fra 0 til 340 ml i løbet af 2-timers perfusionsperiode (Figur 3A venstre panel). Det skal bemærkes, at da vi sammenlignede de veje, der ændrede sig under NMP i fem nyrer i to uafhængige eksperimenter, fandt vi, at lignende veje blev induceret (Figur S3A), hvilket bekræfter reproducerbarheden af ​​vores eksperimentelle design og nytten af ​​at sammenligne veje snarere end individuelle gener. I 2-timens postperfusionsbiopsier korrelerede ekspressionen af ​​11 gener signifikant med urinvolumenet produceret i denne periode. Disse inkluderede varmechokproteiner (HSP'er), HSPA1A, HSPA1B og HSPH1, som positivt korrelerede med øget urinproduktion (figur 3A højre panel). Gensætberigelsesanalyse viste, at urinoutput også var positivt korreleret med "TNF-signalering via NFkB"-vejgenerne og negativt korreleret med OXPHOS-gener i postperfusionsbiopsier (figur 3B, S3C). Tilsvarende korrelerede OXPHOS i præperfusionsbiopsier negativt med urinproduktion i disse nyrer, mens veje forbundet med immunaktivering, herunder "TNF-signalering via NFkB" og "allotransplantatafstødning" positivt korreleret med urinproduktion, hvilket tyder på, at NMP havde ringe effekt på disse processer. eller på andre analyserede veje i nyrer med høj urinproduktion (figur 3B, S3C-D). Da induktionen af ​​inflammatoriske pathway-gener blev observeret i vores kliniske prøver med forlænget DGF (figur 2B), udfordrer disse data dogmet om, at høj urinproduktion forekommer i mere levedygtige, "sunde" nyrer og antyder, at disse nyrer faktisk kan have mere inflammatorisk potentiale, er mindre i stand til at generere energi, og at dette ikke ændres væsentligt under NMP.

Renal blodgennemstrømning under perfusion er også blevet vurderet som en parameter, der kan afspejle efterfølgende transplantationsfunktion.15 I de 10 undersøgte nyrer varierede renal blodgennemstrømning ved 2 timers perfusion fra 14,1 til 168,8 ml/minut (Figur 3C venstre panel). I 2-timens postperfusionsbiopsier korrelerede otte gener signifikant positivt med stigende nyreblodgennemstrømning (Figur 3C højre panel), inklusive HSPA1L, men der var ingen direkte overlap mellem denne genliste og dem, der korrelerede med urinproduktion (Figur 3A) ). Gensætberigelsesanalyse viste, at høj nyreblodstrøm korrelerede positivt med OXPHOS-gener i 0-timebiopsier, men i modsætning til dem med den højeste urinproduktion, havde perfusion en signifikant indvirkning, hvilket resulterede i en negativ korrelation med "OXPHOS" pathway-gener med 2 timer (figur 3D, figur S4A-B). Renale blodstrømme er negativt korreleret med en række immun- og inflammatoriske genveje i både 0- og 2-timebiopsier (figur 3D, figur S4B), i modsætning til urinproduktion (figur 3B, figur S3C). Sammen tyder disse data på, at nyrernes blodgennemstrømning og urinproduktion muligvis ikke er ækvivalente indikatorer for en mere levedygtig nyre, men at førstnævnte mere trofast kan identificere ennyremindre tilbøjelige til at have forlænget DGF.

fordele og bivirkninger af cistanche: anti-inflammatorisk

2.5. Tilføjelse af en hem-adsorber til perfusionskredsløbet har ingen effekt på perfusionsparametre, men reducerer signifikant inflammatorisk genekspression, herunder NLRP3 og IL1B

Analyser afnyreperfusat har vist en væsentlig stigning i koncentrationen af ​​pro-inflammatoriske cytokiner og kemokiner i løbet af hypotermisk og NMP.20,21 Disse bioaktive molekyler recirkulerer ind i nyren med potentiale til at inducere yderligere inflammation. I betragtning af, at vores analyse af transplanteretnyreprøver indikerede, at induktionen af ​​TNF-afhængige gener i NMP-nyrer var forbundet med DGF (figur 2B), antog vi, at fjernelse af cytokiner og kemokiner fra perfusionskredsløbet kan svække inflammatorisk geninduktion med potentielle gavnlige virkninger for nyren. En sådan tilgang har vist en vis effektivitet hos patienter med systemisk inflammatorisk respons-syndrom,22,23, og var forbundet med øget renal blodgennemstrømning i svinenyrer, der gennemgår NMP.18 For at teste dette i menneskelige nyrer tog vi yderligere fem nyrepar og udførte NMP i 4 timer med biopsier taget ved 0, 2 og 4 timer (figur S1). I hvert tilfælde blev en cytosol hæm-adsorber (HA), der fjerner molekyler med en molekylvægt på 10-50 kDa, tilføjet til perfusionskredsløbet af en nyre inden for hvert par (NMP plus HA) (figur 4A). Som forventet resulterede tilsætningen af ​​HA i lavere koncentrationer af en række cytokiner i perfusatet (figur 4B), men havde ingen effekt på renal blodgennemstrømning, urinproduktion eller sammensætning, oxygenforbrug og syre-base homeostase (figur 4C, Tabel S4, S5). Over 4 timers NMP havde HA således ingen indflydelse på de perfusionsparametre, der i øjeblikket anvendes klinisk til at generere kvalitetsvurderingsscore, men havde en væsentlig effekt på genekspression; Efter NMP blev 1794 og 4026 gener opreguleret efter henholdsvis 2 og 4 timer, inklusive TNF og IL6 (figur 4D, E). men kun halvdelen af ​​dette tal (n=898 og n=2606) blev øget, når HA var til stede (figur 4D, figur S5A og B). Antallet af nedregulerede gener blev også reduceret ved tilsætning af HA (figur 4D). Efter 4 timers NMP blev 46 gener signifikant opreguleret og 181 nedreguleret med tilsætning af HA (figur 4F). Dette svækkede transkriptionelle respons inkluderede NLRP3-inflammasomaktiveringsassocierede gener, såsom IL1B, NLRP3 og CASP1 (figur 4G, figur S4B) og nogle neutrofilrekrutterende kemokiner (figur S5C), tidligere forbundet med nyreskade i dyremodeller.24,25 Dette viser, at opløselige mediatorer frigivet franyrerecirkulere og drive de novo ekspression af inflammatoriske gener i organet, men at dette kan afhjælpes ved at fjerne dem fra perfusionskredsløbet.

FIGUR 4 Tilføjelse af en hem-adsorber til det normotermiske maskinperfusionskredsløb har væsentlige virkninger på cytokinniveauet i perfusatet og transkriptomet, men ikke på fysiske parametre registreret på riggen. Et par humane nyrer blev taget fra den samme donor, den ene af parret gennemgik standard normotermisk maskinperfusion (NMP) protokol i 4 timer og den andennyreundergik NMP med tilføjelse af en hem-adsorber til kredsløbet. Prøver blev taget for RNA-Seq før perfusion (0 timer), efter 2 timer og ved slutningen (4 timer). B, Koncentration af nøglecytokiner i perfusatet efter 4 timers NMP. Linjen angiver nyrepar. Cytokinmålinger blev normaliseret til totalt indhold af perfusatprotein. Den angivne P-værdi er fra en parret t-test-test for reduktion af cytokiner med tilsætning af HA. C, Urinproduktion og renal blodgennemstrømning (RBF) på tværs af perfusionens tidsforløb. Greenline angiver NMP alene og orange med tilføjelse af hem-adsorber. D, Venn-diagram, der viser antallet af gener, der udtrykkes signifikant differentielt, når man sammenligner 2-hr eller 4-hr prøverne med præ(0-hr) prøverne. Røde diagrammer er opregulerede gener og blå nedregulerede. Skæringspunktet er de gener, der udtrykkes respektielt på begge tidspunkter i samme retning. E, log2 normaliserede ekspressionsværdier for de angivne gener på tværs af perfusion fra vævstranskriptomet, standardfejlsøjler er angivet. F, vulkanplot til parvis sammenligning af NMP alene med NMP plus HA efter 4 timer. Rød indikerer differentielt udtrykte gener med en justeret P-værdi<0.05. g,="" as="" for="">

behandle nyresygdomme cistanche ekstrakt

2.6. HA forbundet med en reduktion i en forsinket graftfunktion-associeret gensignatur

Gensætberigelsesanalyse viste et signifikant fald i "TNF-signalering via NFkB"-vejen i NMP plus HA-nyrer sammenlignet med NMP alene (figur 5A-B). Navnlig reducerede tilstedeværelsen af ​​HA ikke kun inflammatorisk genekspression inyremen også øgede OXPHOS- og fedtsyremetabolismeveje, som begge bidrager til energigenerering (figur 5A-B). Derfor vil ændringerne i genekspressionsveje, der forekommer med HA'en, understøtte konklusionen om, at dets virkninger er klinisk gavnlige, da det reducerede "TNFA-signalering via NFkB"-pathway-gener og øgede "OXPHOS"-pathway-gener, som begge var forbundet med en kortere varighed af DGF (figur 2B).

For yderligere at udforske forholdet mellem transkriptionelle ændringer i NMP og kliniske resultater, søgte vi at kurere en gensignatur, der er til stede i nyrer med DGF. Vi identificerede top 100 positivt (OP) og negativt (NED) regulerede gener (rangeret efter log-fold ændring), som korrelerede med længden af ​​DGF i de 33 kliniske forsøgsprøver (Figur 5C, Data S1). Vi fandt en signifikant berigelse af gensignaturen forbundet med øget længde af DGF i prøver med højere urinproduktion (figur 5D), hvilket tyder på, at høj urinproduktion under NMP identificerer nyrer med risiko for mere langvarig DGF. Der var ingen statistisk signifikant korrelation mellem DGF-signaturen og generne forbundet med højere renal blodgennemstrømning (figur 5E). Vi vurderede derefter, om og hvordan tilføjelsen af ​​HA til NMP-kredsløbet påvirkede ekspressionen af ​​DGF "UP" og "DOWN" gensignaturer. Bemærkelsesværdigt viste dette, at ekspressionen af ​​gensignaturen forbundet med øget længde af DGF blev signifikant reduceret ved tilsætning af HA, og signaturen forbundet med reduceret længde af DGF blev signifikant forøget ved tilføjelse af HA (figur 5F).

Samlet set tyder de transkriptionelle ændringer, vi har identificeret, på, at NMP har potentielle fordele i forhold til køleopbevaring med hensyn til dets virkninger på energigenerering i nyrerne. Men under perfusion frigives nogle bioaktive molekyler fra nyren til perfusionskredsløbet, hvilket genererer en amplifikationsløkke, der driver inflammation, når de kommer ind i nyren igen. Fjernelse af disse molekyler afbryder denne sløjfe og kan være nyttig til at reducere inflammation og øge energigenerering, hvilket yderligere forbedrer de gavnlige virkninger af NMP og reducerer modtageligheden for DGF (figur 6).

FIGUR 5 Tilsætning af skinkeadsorberen reducerer en DGF-associeret gensignatur. En GSEA-analyse af virkningen af ​​tilsætningen af ​​HA til transkriptomet efter 4 timers NMP mod kendetegnsvejen for genesæt. Kun væsentlige veje er plottet. Røde prikker indikerer positiv berigelse og blå negativ, størrelsen af ​​prikken er omvendt korreleret med FDR q-værdien og positionen angiver den normaliserede berigelsesscore (NES). B, berigelsesplot fra GSEA for nøgleveje fra Hallmark-databasen til sammenligningen fra A. Linjen angiver den løbende berigelsesscore, og violinplottet angiver fordelingen af ​​generne fra genesettet gennem den rangerede genliste, der anvendes i hver analyse. C, Heatmap over de fire største positive (UP) og negative (DOWN) korrelation med længden af ​​DGF og brugt som en del af genekspressionssignaturen for DGF. Fuld DGF-signatur givet i supplerende data. DF, DGF-associeret gensignatur blev brugt med GSEA til at undersøge ekspressionen af ​​signaturen i korrelationen af ​​2-hr urinoutput med 2-hr transkriptom (D), korrelation af 2-hr RBF med 2-hr transkriptom (E) og virkningen af ​​tilsætning af HA på transkriptomet efter 4 timer (F). Grunde som for A

FIGUR 6 Grafisk oversigt. A, Under køleopbevaring er der en global reduktion i transkription. Under NMP opreguleres ekspressionen af ​​gener i en række veje, herunder oxidativ phosphorylering (OXPHOS) og inflammatoriske pathway-gener såsom TNF, IL8 og NFkB. B venstre panel, Under NMP frigives inflammatoriske mediatorer (gule cirkler) franyrei perfusionsopløsningen. De recirkulerer og stimulerer pro-inflammatorisk gentranskription i nyrerne og er forbundet med en reduktion af generne til produktion af energiveje, hvilket reducerer ATP. Højre panel, Tilstedeværelsen af ​​hem-adsorberen (HA) bryder denne inflammatoriske amplifikationsløkke

Cistanche urt, der forbedrer nyrefunktionen

3. DISKUSSION

Vores data viser, at kold opbevaring er effektiv til at begrænse væsentlige ændringer i genekspression. Dette er i overensstemmelse med gnavermodeller, hvor nyrer opbevaret i op til 18 timer på køl viste ringe ændring i ekspressionen af ​​pro-inflammatoriske cytokiner, herunder IL1 , TNF og IL6.26 Vores brug af upartisk, global transkriptionel profilering i stedet for målingen af ​​et lille antal kandidatgener gjorde det muligt for os at analysere ekspressionen af ​​grupper af gener fundet inden for specifikke veje. Dette afslørede en signifikant reduktion i ekspressionen af ​​OXPHOS og glycolyse pathway gener i koldt opbevarede nyrer, hvilket potentielt reducerede disse nyres kapacitet til at generere ATP, i overensstemmelse med en tidligere undersøgelse, der viste reduceret ATP i koldt opbevarede humane nyrer.27 Et antal af pro-inflammatoriske veje blev også nedreguleret under køleopbevaring, inklusive TNF-aktivering via NFkB og reaktive oxygenarter, hvilket kan være potentielt gavnligt. Det kan dog være, at kold opbevaring blot sætter et midlertidigt greb om disse veje, og at der efter reperfusion i recipienten vil forekomme lignende ændringer i inflammatorisk genekspression, som observeret i NMP.

NMP havde den modsatte effekt af køleopbevaring på OXPHOS- og glykolyse-pathway-gener, hvilket øgede deres ekspression med potentialet til at øge den cellulære kapacitet til at generere ATP og genoprette homeostase. Det er værd at bemærke, at hypoterm iltet perfusion af menneskelige nyrer også har vist sig at øge ATP-niveauer sammenlignet med køleopbevaring 27, derfor kan genoprettelse af iltning være den vigtigste stimulus for disse processer snarere end normothermi. Ikke desto mindre vil disse ændringer sandsynligvis være gavnlige for organet givet vores observation af en negativ korrelation mellem øget ekspression af OXPHOS pathway-gener og forlænget DGF.

Et nyligt papir af Hameed et al28 udførte også en transkriptomisk analyse af NMP i tre nyrer, der gennemgår NMP. Desværre har forfatterne ikke gjort deres data offentligt tilgængelige, og en dybdegående sammenligning med vores datasæt er derfor ikke mulig. Imidlertid indikerede deres manuskript induktion af immunrespons-relaterede gener under NMP, herunder IL1B, CXCL2 og TNF, hvilket er i overensstemmelse med vores resultater.

I vores analyse af nyrer, der gennemgår NMP i forbindelse med et klinisk forsøg, korrelerede vi genekspressionssignaturer med en længde af DGF snarere end DGF-incidens (defineret som et behov for dialyse inden for den første uge efter transplantation). Navnlig var nyrer med en varighed af DGF på 1 dag eller mindre meget transkriptionelt lig dem uden DGF, hvilket sandsynligvis afspejlede dialysebehov på grund af perioperativt associeret hyperkaliæmi snarere end bona fide DGF. Vi fandt, at en længere DGF var forbundet med højere ekspression af TNFA-signalering via NFkB pathway-gener og lavere ekspression af gener forbundet med OXPHOS. Disse data tyder på, at nyrer med øget OXPHOS og nedsat immunsignalering kan præsentere et bedre potentiale som donorers nyrer, men denne konklusion kræver validering i et større prospektivt studie.

Vi vurderede også de molekylære processer, der korrelerer med urinproduktion og nyreblod under NMP. Disse parametre er tidligere blevet brugt sammen med en række andre målinger til at generere en kvalitetsvurderingsscore af perfunderede nyrer. Høje værdier af urinproduktion og renal blodgennemstrømning er blevet anset for at afspejle et mere levedygtigt transplantat.15 Vores data afslører, at veje, der korrelerer med høj urinproduktion og høj renal blodgennemstrømning, er forskellige, og faktisk viser disse parametre polære modsatte associationer med inflammatoriske veje . Høj urinproduktion var forbundet med højere ekspression af gener i immunsystemet, mens høj renal blodgennemstrømning var negativt korreleret med disse veje. Vi fandt også, at DGF-gensignaturen, vi genererede, blev beriget i nyrer med en høj urinproduktion under NMP, hvilket tyder på, at denne parameter kan identificere nyrer med risiko for en længere DGF, i modsætning til det nuværende dogme. En potentiel forklaring er, at en meget høj urinproduktion afspejler nyrer med mere tubulær skade, som mangler evnen til at koncentrere urinen. Der kan således være en "Goldilocks-effekt" med hensyn til urinproduktion, hvor nyrer med lav/lidt urinproduktion er dem med væsentlige abnormiteter i dannelsen af ​​filtrat, og dem med en meget høj urinproduktion har betydelige tubulære skader, der udelukker urinkoncentration. Denne hypotese skulle testes i et større antal nyrer, der efterfølgende blev transplanteret.

I løbet af 4 timers NMP var der en induktion af inflammatoriske gener i nyren. Det er dog værd at bemærke, at den nuværende kliniske praksis kun involverer 1 times NMP, og denne effekt er muligvis ikke tydelig over en kortere perfusionstid. Imidlertid kan længere perfusion have fordele med hensyn til genoprettelse af iltning og energigenerering, og i vores eksperiment kunne de negative virkninger af immungeninduktion væsentligt negeres ved introduktionen af ​​en cytosol HA til perfusionskredsløbet. Disse data indikerer, at inflammatoriske mediatorer genereret af nyren under forløbet af NMP kommer ind i perfusionskredsløbet og er i stand til at forværre steril inflammation, og at deres fjernelse forbedrer induktionen af ​​inflammationsvejsgener observeret under NMP. Det er vigtigt, at vi viste, at tilføjelsen af ​​HA påvirker ekspressionen af ​​gener, der er forbundet med dårligere resultater klinisk. Vores DGF-gensignatur blev afledt af prøver, der gennemgår NMP som en del af et klinisk forsøg, der vurderer dets effektivitet, hvilket giver os mulighed for robust at forbinde de ændringer, vi observerede i vores parrede nyreundersøgelser, med kliniske endepunkter i nyrer, der gennemgår transplantationer. Det vil dog være nødvendigt at anvende det i forbindelse med et klinisk forsøg for endeligt at bevise nytten af ​​dets anvendelse på nyrer før transplantation. HA er uspecifik og kan fjerne molekyler, der er nyttige, ud over dem, der er skadelige for organet. Vi fandt ud af, at nettoeffekten af ​​HA på nyretranskriptomet virkede gavnlig, men det kan være, at en forfining til specifikt at fjerne dokumenterede, skadelige mediatorer kan være endnu mere effektiv.

De nyrepar, vi brugte, var fra samme individ og var derfor genetisk identiske og havde oplevet et lignende miljø gennem donorens liv. Vi bekræftede, at deres tid 0 transkriptom var ekstremt ens (figur S2 A, B). Imidlertid prøver disse biopsier en lille del af nyren, og nyrepar kan være asymmetrisk påvirket af patologi, for eksempel cyster eller småkarsygdomme. En yderligere advarsel er, at alle nyrer, der blev brugt i de her præsenterede interventionsforsøg, blev afvist til transplantation, og nogle repræsenterer transplanterede organer i den nedre ende af kvalitetsspektret. Ikke desto mindre observerede vi meget reproducerbare resultater, når vi sammenlignede genveje i grupper på fem nyrer. Vi var også i stand til at påvise, at nyrer fra DCD og DBD havde en lignende respons på perfusion. Ved at kombinere dette med vores kuraterede post-NMP DGF-signatur var vi i stand til at forudsige potentielle kliniske fordele. Denne eksperimentelle tilgang kunne bruges som et præklinisk værktøj til at screene fremtidige interventioner for potentiel terapeutisk effekt for at muliggøre rationel udvælgelse af kandidatinterventioner til kliniske forsøg.

Sammenfattende giver vores undersøgelse den første globale transkriptionelle profil af menneskelige nyrer, der gennemgår NMP, og løser de forskellige molekylære veje, der aktiveres i NMP sammenlignet med køleopbevaring, og viser, at de skadelige virkninger af bioaktive molekyler produceret eller frigivet fra nyren under NMP kan vendes ved tilføjelse af en HA. Desuden reducerede denne intervention ekspressionen af ​​gener forbundet med forlænget DGF, hvilket gav et stærkt mekanistisk rationale for at anvende en sådan intervention til et fremtidigt klinisk forsøg. Vores data har også implikationer for perfusionsstrategier ud over nyrerne, herunder ved lever- og lungetransplantation, hvilket tyder på, at fjernelse af bioaktive molekyler fra perfusater bør undersøges i disse sammenhænge, ​​hvor NMP i stigende grad anvendes. Endelig fremhæver vores undersøgelse nytten af ​​global transkriptionel profilering i parnyrertil vurdering af nye indgreb på perfunderede organer; transkriptionelle ændringer går forud for ændringer i proteinoverflod (traditionelt brugt som biomarkører fornyreskade) og titusindvis af gentranskriptioner kan let måles. Således har RNA-måling potentialet til at give en tidlig, følsom udlæsning af cellulære funktion af menneskelige organer hentet til transplantation, som kan anvendes til fremtidige undersøgelser.

ANKENDELSER

Forfatterne takker alle organdonorer og deres familier. Clatworthy Lab er taknemmelig for de kernefaciliteter, som MRC Laboratory of Molecular Biology tilbyder. Dette arbejde blev udført ved hjælp af ressourcer leveret af Cambridge Service for Data-Driven Discovery (CSD3) drevet af University of Cambridge Research Computing Service, leveret af Dell EMC og Intel ved hjælp af Tier-2-finansiering fra Engineering and Physical Sciences Research Council (kapitaltilskud EP/P020259/1) og DiRAC-finansiering fra Science and Technology Facilities Council (www. Dirac. ac. UK).

AFSLØRING

Forfatterne har ingen interessekonflikt at afsløre som beskrevet af American Journal of Transplantation.

FORFATTERS BIDRAG

JRF, SH, MLN og MRC designede undersøgelsen og fortolkede dataene. JRF, SH, TM, CJW, AF og TCD udførte eksperimenterne. JRF, SH og MRC skabte figurer og tabeller. MRC skrev hovedmanuskriptet. JRF og SH skabte metoderne og figurlegenderne, JRF, SH og MLN redigerede manuskriptet.

Cistanche fordel: forbedre nyrefunktionen

Referencer:
1. Methven S, Steenkamp R, Fraser S. UK Renal Registry 19th Annual Report: Chapter 5 Survival and Causes of Death in UK Adult Patients on Renal Replacement Therapy in 2015: National and Centre-specific Analyses. Nephron. 2017;137(1):117-150.
2. Summers DM, Johnson RJ, Allen J, et al. Analyse af faktorer, der påvirker resultatet efter transplantation af nyrer doneret efter hjertedød i Storbritannien: en kohorteundersøgelse. Lancet. 2010;376(9749):1303-1311.
3. Summers DM, Johnson RJ, Hudson A, Collett D, Watson CJ, Bradley JA. Effekt af donoralder og køleopbevaringstid på resultatet hos modtagere af nyrer doneret efter kredsløbsdød i Storbritannien: en kohorteundersøgelse. Lancet. 2013;381(9868):727-734.
4. Friedewald JJ, Rabb H. Inflammatoriske celler ved iskæmisk akut nyresvigt.NyreInt. 2004;66(2):486-491.
5. Kono H, Rock KL. Hvordan døende celler advarer immunsystemet mod fare. Nat Rev Immunol. 2008;8(4):279-289.
6. Berry M, Clatworthy MR. Immunterapi til akuttenyreskade. Immunterapi. 2012;4(3):1–12.
7. Parikh CR, Coca SG, Thiessen-Philbrook H, et al. Postoperative biomarkører forudsiger akutnyreskade og dårlige resultater efter hjertekirurgi hos voksne. J Am Soc Nephrol. 2011;22(9):1748-1757.
8. Hall IE, Yarlagadda SG, Coca SG, et al. IL-18 og urin-NGAL forudsiger dialyse og gendannelse af transplantat efternyretransplantation. J Am Soc Nephrol. 2010;21(1):189-197.
9. Malyszko J, Lukaszyk E, Glowinska I, Durlik M. Biomarkører for forsinket graft fungerer som en form for akutnyreskade inyretransplantation. Sci Rep. 2015;5:11684.
10. Hosgood SA, Nicholson ML. Først nyretransplantation hos mennesker efter ex vivo normoterm perfusion. Transplantation. 2011;92(7):735-738.
11. Yong C, Hosgood SA, Nicholson ML. Ex-vivo normoterm perfusion ved nyretransplantation: fortid, nutid og fremtid. Curr Opin Organtransplantation. 2016;21(3):301-307.
12. Fisher A, Andreasson A, Chrysos A, et al. En observationsundersøgelse af Donor Ex Vivo Lung Perfusion i UK lungetransplantation: DEVELOP-UK. Health Technol Assess. 2016;20(85):1–276.
13. Slama A, Schillab L, Barta M, et al. Standard donorlungeindsamling med normotermisk ex vivo lungeperfusion: Et prospektivt randomiseret klinisk forsøg. J Hjerte Lungetransplantation. 2017;36(7):744–753.
14. Nasralla D, Coussios CC, Mergental H, et al. Et randomiseret forsøg med normotermisk konservering ved levertransplantation. Natur. 2018;557(7703):50–56.
15. Barlow AD, Hamed MO, Mallon DH, et al. Brug af Ex Vivo Normotermisk Perfusion til kvalitetsvurdering af kasserede humane donorpancreaser. Am J Transplantation. 2015;15(9):2475-2482.

16. Hosgood SA, Saeb-Party K, Hamed MO, Nicholson ML. Vellykket transplantation af menneskelige nyrer, der anses for utransplanterede, men genoplivet af Ex Vivo Normotermic Machine Perfusion. Am J Transplantation. 2016;16(11):3282-3285.
17. Hosgood SA, Saeb-Party K, Wilson C, Callaghan C, Collett D, Nicholson ML. Protokol for et randomiseret kontrolleret, åbent forsøg med ex vivo normoterm perfusion versus statisk køleopbevaring i donation efter nyretransplantation med kredsløbsdød. BMJ åben. 2017;7(1):e012237.
18. Hosgood SA, Moore T, Kleverlaan T, Adams T, Nicholson ML. Hæmoadsorption reducerer det inflammatoriske respons og forbedrer blodgennemstrømningen under ex vivo renal perfusion i en eksperimentel model. J Transl Med. 2017;15(1):216.
19. Krebs HA. Historien om tricarboxylsyrecyklussen. Perspect Biol Med. 1970;14(1):154-170.
20. Hoogland ER, de Vries EE, Christiaans MH, Winkens B, Snoeijs MG, van Heurn LW. Værdien af ​​maskinperfusionsbiomarkørkoncentration i DCDnyretransplantationer. Transplantation. 2013;95(4):603-610.
21. van Balkom BWM, Gremmels H, Ooms LSS, et al. Proteiner i konserveringsvæske som prædiktorer for forsinket graftfunktion i nyrer fra donorer efter kredsløbsdød. Clin J Am Soc Nephrol. 2017;12(5):817–824.
22. Kogelmann K, Jurczak D, Scheller M, Druner M. Hæmoadsorption af CytoSorb hos septiske patienter: en case-serie. Crit Care. 2017;21(1):74.
23. David S, Thamm K, Schmidt BMW, Falk CS, Kielstein JT. Effekt af ekstrakorporal cytokinfjernelse på vaskulær barrierefunktion hos en patient med septisk shock. J Intensiv pleje. 2017;5:12.
24. Li L, Huang L, Vergis AL, et al. IL-17 produceret af neutrofiler regulerer IFN-gamma-medieret neutrofil migration i musnyreiskæmi-reperfusionsskade. J Clin Invest. 2010;120(1):331–342.
25. Hayama T, Matsuyama M, Funao K, et al. Gavnlig effekt af neutrofil elastasehæmmer på nyrevarm iskæmi-reperfusionsskade hos rotter. Transplantation Proc. 2006;38(7):2201-2202.
26. Saat TC, Susa D, Roest HP, et al. En sammenligning af inflammatoriske, cytobeskyttende og skadesgenekspressionsprofiler i nyrer fra hjernedød og hjertedødsdonorer. Transplantation. 2014;98(1):15–21.
27. Ravaioli M, Baldassare M, Vasari F, et al. Strategier til at genoprette niveauet af adenosintriphosphat (ATP) efter mere end 20 timers kold iskæmi i menneskelig marginalNyrePodninger. Ann Transplant. 2018;23:34–44.
28. Hameed AM, Lu DB, Patrick E, et al. Kort Normotermic Machine Perfusion forynger kasserede menneskelige nyrer. Transplantation direkte. 2019;5(11):e502.