Koordinere regulering af systemisk og nyretryptofanmetabolisme af lægemiddeltransportører OAT1 og OAT3

Jeffry C. Granados¹, Anne Richelle², Jahir M. Gutierrez¹, Patrick Zhang³, Xinlian Zhang⁴, Vibha Bhatnagar⁵, Nathan E. Lewis^1,2,6, og Sanjay K. Nigam^2,7,*

^{Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com}

cistanche oplevelse

Hvordan organer registrerer cirkulerende metabolitter er et nøglespørgsmål. Her viser vi, at de multispecifikke organiske aniontransportører af lægemidler, OAT1 (SLC22A6 eller NKT) og OAT3 (SLC22A8), spiller en rolle i organsansen. Metabolomiske analyser af serum fra Oat1 og Oat3 knockout mus afslørede ændringer i tryptophanderivater involveret i metabolisme og signalering. Flere af disse metabolitter stammer fra tarmmikrobiomet og er impliceret som uremiske toksiner ikronisknyresygdom. Direkte interaktion med transportørerne blev understøttet med cellebaserede transportassays. For at vurdere virkningen af ​​tabet af OAT1- eller OAT3-funktion på nyren, et organ, hvor disse optagelsestransportører er højt udtrykt, blev knockout-transkriptomiske data kortlagt på en "metabolisk opgave"-baseret beregningsmodel, der evaluerer over 150 cellulære funktioner. På trods af ændringerne af tryptophan-metabolitter i begge knockouts, var der kun i Oat1-knockouten, der øgede flere tryptofan-relaterede cellulære funktioner. Frataget evnen til at tage kynurenin, kynurenat, anthranilat og N-for-mylanthranilat gennem OAT1 reagerer nyren således ved at aktivere sine egne tryptofan-relaterede biosynteseveje. Resultaterne understøtter Remote Sensing and Signaling Theory, som beskriver, hvordan "lægemiddel"-transportører hjælper med at optimere niveauer af metabolitter og signalmolekyler ved at lette organ krydstale. Da OAT1 og OAT3 hæmmes af mange lægemidler, antyder dataene potentialet for lægemiddel-metabolit-interaktioner. Faktisk behandling af mennesker med probenecid, en OAT-hæmmer, der bruges til at behandle gigt, forhøjede cirkulerende tryptophanmetabolitter. I betragtning af, at regulerende myndigheder har anbefalet, at lægemidler testes for OAT1- og OAT3-binding eller transport, følger det, at disse metabolitter kan bruges som endogene biomarkører til at bestemme, om lægemiddelkandidater interagerer med OAT1 og/eller OAT3.

De organiske aniontransportører OAT1 (SLC22A6, oprindeligt NKT (1)) og OAT3 (SLC22A8, oprindeligt ROCT (2)) findes i den proksimale tubuli afnyreog choroid plexus i hjernen og kontrollerer den fysiologiske fordeling og eliminering af talrige lægemidler og miljøgifte såvel som endogene metabolitter såsom -ketoglutarat, prostaglandiner og urat (3, 4). Derudover hjælper OAT'er med at regulere niveauer af indtaget naturlige produkter og tarmmikrobiom-afledte forbindelser (f.eks. epicatechin, 3-indoxylsulfat, p-cresolsulfat) (5, 6).

OAT1 og OAT3, medlemmer af SLC22-familien, er blandt de bedst kendte multispecifikke lægemiddeltransportører. Denne gruppe af lægemiddeltransportører inkluderer andre medlemmer af SLC (solute carrier) og ABC (ATP-binding cassette) superfamilierne (7, 8). Der er omfattende litteratur om de farmaceutiske og toksikologiske roller af disse transportører, men de endogene funktioner af disse evolutionært konserverede proteiner, såvel som det regulatoriske netværk, hvori de deltager, er kun begyndt at blive karakteriseret (9). Disse multispecifikke transportører påvirker mange aspekter af fysiologi og patofysiologi, sandsynligvis ved at fungere i kombination med mono- eller oligospecifikke transportere. Tre velkarakteriserede patofysiologiske eksempler er rollerne af OAT1, OAT3, URAT1 og ABCG2 i gigt (10), rollen af ​​OAT1 og OAT3 i akkumulering af uremiske toksiner forbundet med kroniskenyresygdom (CKD) (11, 12) og SLC22-familien i akutte tilfældenyreskade (13).

På grund af det store udvalg af små organiske anionforbindelser, der transporteres af OAT1 og OAT3, kan en bred vifte af xenobiotika og endogene molekyler tænkes konkurrere om adgang til og renal clearance af disse OAT-transportører (14, 15). Dette har vigtige implikationer, fordi mange af metabolitterne, inklusive dem, der stammer fra tarmmikrobiomet og transporteres af OAT1 og OAT3, regulerer endogen fysiologi og er blevet forbundet med udviklingen af ​​kliniske lidelser, såsom CKD, metabolisk syndrom og diabetes (14, 16, 17). For eksempel er mængden af ​​CMPF (3-carboxy-4-methyl-5-propyl-2- furanpropansyre), et substrat for OAT3, i kredsløbet blevet relateret til diabetes. CMPF er en furanfedtsyremetabolit, der findes i fiskeolier, vegetabilske olier, smør og andre fødevarer og forstyrrer bugspytkirtlens cellefunktion, hvilket fører til glucoseintolerance (18, 19). De potentielle konsekvenser af konkurrence på transportørniveau mellem et lægemiddel og den transporterede endogene metabolit omfatter (a) ændrede intracellulære koncentrationer af metabolitter, fordi et transporteret lægemiddel blokerer metabolitindtrængen i cellen; (b) ændrede serumkoncentrationer af lægemidlet, metabolitten eller begge dele, hvilket fører til øgede halveringstider og/eller metabolitniveauer; og (c) ændret systemisk metabolisme som følge af distale kaskadevirkninger på flere metaboliske veje, der afhænger af OAT1 eller OAT3 eller begge dele.

Vi anvendte en systembiologisk tilgang, der brugte metabolomics og transkriptomiske data fra Oat1 og Oat3knockout (KO) mus til at analysere de vigtigste metaboliske funktioner, der er påvirket af OAT1 og OAT3. Serummetabolomiske data fra Oat1- og Oat3 KO-musene repræsenterede den indvirkning, som disse transportører har på endogen systemisk metabolisme. Vi brugte de transkriptomiske data franyre, som er ekspressionsstedet for de kodende transportergener, for at evaluere aktiviteten af ​​hundredvis af metaboliske funktioner ved hjælp af metabolisk opgaveanalyse. Derved var vi i stand til at supplere en forståelse af ekstracellulære metabolitændringer på grund af tabet af OAT1- eller OAT3-transportøren med en analyse af påvirkede intracellulære metaboliske veje.

Sammen giver multiomics-tilgangen og systembiologianalysen, der bruges her, et portræt af de lokale og systemiske metaboliske og signalveje moduleret separat og i fællesskab af OAT1 og OAT3. Vi viser, at OAT1 ikke kun regulerer tryptofanmetabolismen systemisk, men også spiller en nøglerolle i tryptofanmetabolismevejene inde i vævet, hvor det findes. Vores resultater indikerer således, at undersøgelser af nye lægemiddelenheder ikke kun bør overveje lægemiddel-metabolit-interaktion (DMI)-effekter i serum, men også evaluere potentielle skift i cellulær metabolisme på grund af tab af metabolittilstrømning gennem konkurrence på transportørens niveau. Til støtte for den menneskelige relevans af vores arbejde viser vi, at mange af de ændringer i serumniveauer af tryptophan-metabolitter, der ses hos knockout-musene, også observeres hos mennesker efter administration af probenecid, et lægemiddel til behandling af gigt, som hæmmer OAT1 og OAT3.

\

cistanche mandlige fordele

Resultater

Sammenfatning af den overordnede tilgang

SLC22-genfamilien (OAT'er, OCT'er, OCTN'er) koder for transportører, der deltager i optagelsen af ​​mange unikke forbindelser på tværs af flere væv, selvom meget af forskningen har fokuseret på en håndfuld medlemmer (SLC22A1, SLC22A2, SLC22A6, SLC22A8), der håndterer mange almindelige stoffer (20, 21). Disse gener er dog meget konserverede med ortologer i flue, orm, fisk og søpindsvin (22); dette indebærer, at de har vigtige fysiologiske roller ud over at håndtere lægemidler. For at bestemme de endogene roller af OAT1 og OAT3 i at kontrollere metabolisme på vævsniveau og organismeniveau uafhængigt af deres velkendte roller som lægemiddel- og toksintransportører, analyserede vi vævsspecifikke transkriptomiske data og serummetabolomiske data (fig. 1). Vi sammenlignede data fra mus med genetisk mangel på enten Oat1 eller Oat3 og deres vildtypekontroller. Disse datasæt er tidligere blevet undersøgt ud fra et kemoinformatisk perspektiv (23) og for at give et bredt overblik over berørte veje (24), men her lægger vi vægt på deres specifikke rolle i dispositionen af ​​tryptofanmetabolitter. Fordi disse to transportere findes inyre, analyserede vinyretranskriptomiske data ved hjælp af Metabolic Task Analysis, en systembiologisk metode, der grupperer gener i henhold til deres koordinerede roller i biosyntesen af ​​et begrænset sæt nøglemetabolitmellemprodukter fra forskellige metabolitinputs (se afsnittet Metoder for flere detaljer). Vi støttede disse undersøgelser inden for vitro-transportassays; vi understøtter også den kliniske relevans af vores resultater med humane metabolomiske data.

Kendte karakteristika for Oat1 KO og Oat3 KO mus Næsten alle karakteristika for mus, der mangler Oat1 eller Oat3, ligner dem for vildtype mus (25-27) (tabel 1). Knockout-musene er levedygtige med en overlevelse, der kan sammenlignes med den for vildtype-mus. Desuden viser de ingen tilsyneladende udviklings- eller vækstabnormiteter, og histologisk og fysiologisk undersøgelse af disse forskellige knockouts (i alderen ~2-8 måneder) afslørede små eller ingen forskelle fra vildtype, bortset fra Oat3 KO-musene med et lidt lavere blodtryk ( 28). En tendens mod hepatisk lipidaflejring i Oat1 KO er også blevet bemærket, men kun for meget gamle mus (29).

Disse transportør-knockout-mus er også blevet karakteriseret ud fra et farmakologisk og toksikologisk synspunkt (tabel 2). OAT1 og OAT3 spiller vigtige roller i håndteringen af ​​forskellige lægemidler og toksiner, både miljømæssigt og endogent produceret (30-38). Begge knockout-mus har ændret respons på loop- og thiaziddiuretika på grund af disse lægemidlers manglende evne til at få adgang til nefronens lumen - en proces afhængig af OAT1-- eller OAT3--medieret optagelse i den proksimale tubulicelle . Oat1 KO-dyr er beskyttet mod kviksølv-induceret nefrotoksicitet på grund af mangel pånyreoptagelse af kviksølvkonjugater. Begge mus akkumulerede uremiske toksiner i serumet og udviste nedsat sekretion af urinsyre. Ex vivo analyse af væv fra enten Oat1 KO eller Oat3 KO mus viser reduceret optagelse af flere antivirale midler.

Vi har rapporteret, at havre1-mangelfulde dyr kan have reduceret ekspression af OAT3 (39). En række undersøgelser har dog vist, at den funktionelle påvirkning af dette i bedste fald er beskeden i basaltilstanden. For eksempel Oat1 knockoutnyrerhar markant reduceret PAH-transport, men intet tilsyneladende tab af transport af OAT3-substratet, østronsulfat (26). Kemoinformatisk analyse har identificeret sæt af molekylære egenskaber, der adskiller metabolitter ændret i Oat1 sammenlignet med de Oat3-mangelfulde mus (23). Desuden embryonalenyreorgankulturer fra begge linjer af mus transporterede forskellige sæt af antivirale midler (36-38). Der er også forskelle i de typer af uremiske toksiner, der findes i Oat1 versus Oat3 KO (34).

Tryptophan metabolisme ændres systemisk i Oat1 og Oat3 KO mus

Publicerede metabolomiske analyser af Oat1 KO og Oat3 KO mus antyder fysiologisk vigtige ændringer i håndteringen af ​​endogene metabolitter og tarmmikrobiomer, herunder nogle uremiske toksiner (34, 35). Her analyserede vi 731 metabolitter af kendt identitet i serumet indsamlet fra kontrol- og Oat1 KO-mus. Ligeledes blev 611 metabolitter af kendt identitet påvist i serum fra kontrol- og Oat3 KO-mus.

For Oat1 KO-mus fandt vi, at 63 metabolitter i Amino Acid Superpathway (Supplerende Tabel S1) var signifikant forøget (p Mindre end eller lig med 0.05, 54 metabolitter, heriblandt 12 metabolitter havde foldændringer højere end 3) eller tendens til signifikant øget (0.05 Mindre end eller lig med p Mindre end eller lig med 0,10, ni metabolitter), hvilket tyder på, at de enten er OAT1-substrater, eller at deres serumkoncentrationer afhænger af på OAT1. For Oat3 KO-mus fandt vi, at ti metabolitter i Amino Acid Superpathway var signifikant øget, mens 11 havde en tendens til signifikant øget (Supplerende Tabel S2). Som et supplement til p-værdierne beregnede vi også Cohens d, som viste store effektstørrelser (fra 1,76 til 4,17) for tryptofanmetabolitter. I overensstemmelse med andre farmakologiske og fysiologiske data opnået fra OAT1- og OAT3-knockout-musene eller deres væv, der indikerer vigtige funktionelle forskelle (23, 36, 38), sammenligning af ændringer i serummetabolitter på Amino Acid Superpath-måden mellem Oat1 KO (63 metabolitter) og Oat3 KO (21 metabolitter) mus afslørede kun ti overlappende metabolitter i disse undergrupper (Supplerende tabel S3).

Hver metabolit blev klassificeret ved hjælp af Metabolons software i en af ​​otte superpathways (aminosyre, kulhydrat, cofaktorer og vitaminer, energi, lipid, nukleotid, peptid, xenobiotika) og en af ​​90 underveje. Af de 17 metabolitter, der signifikant akkumulerede i serumet fra både Oat1 KO og Oat3 KO dyrene, tilhørte fire Tryptophan Metabolism Subpathway, hvilket indikerer, at disse to transportører har en vigtig fælles rolle i reguleringen af ​​systemisk tryptophan metabolisme (fig. 2). . Uafhængigt af hinanden var tryptofanmetabolisme blandt de mest berigede sub-veje for begge knockout-modeller (fig. 3). Seksten Figur 3. Tryptofan-metabolisme er en af ​​de mest ændrede veje i begge knockout-mus. Et vulkanplot for Oat1 KO (n=5) ​​viser tryptofanmetabolitterne mod alle andre målte metabolitter. B, tryptofanmetabolisme er den næstmest berigede vej for signifikant forhøjede metabolitter. C, vulkanplot for Oat3 KO (n=3), der viser tryptofanmetabolitterne mod alle andre målte metabolitter. D, tryptofan metabolisme er den mest berigede vej for signifikant forhøjede metabolitter baseret på metabolon subpathway analyse. Rolle af OAT1 og OAT3 i tryptofan metabolisme 4 J. Biol. Chem. (2021) 296 100575tryptophanmetabolitter blev målt i serum fra begge mus, og 12 blev signifikant ændret i mindst én gruppe. Oat1 KO-musene havde 11 forhøjede metabolitter, inklusive en (N-formylant-hranilat), som ikke blev målt i serumet af Oat3 KO (tabel 3). Analyse af Oat3 KO afslørede, at seks af de 16 metabolitter var signifikant eller tendens til signifikant ændret. Nogle af disse metabolitter, inklusive dem, der stammer fra bakterier i tarmmikrofloraen, er kendt for at have distale virkninger på flere andre organer. For eksempel er 3-indoxylsulfat forbundet med progressionen afnyresygdom og uremisk syndrom (12, 40). Dataene indikerer, at OAT1 og OAT3 arbejder sammen om at regulere systemisk tryptofanmetabolisme, og alligevel har de også specifikke funktioner inden for tryptophanmetabolisme ved at håndtere forskellige sæt af metabolitter, der påvirker forskellige biokemiske reaktioner.

Evaluering af lægemiddel-metabolit-interaktioner hos mennesker, der involverer et OAT-hæmmende lægemiddel og tryptofan-metabolitter

Probenecid, et lægemiddel, der bruges til at behandle gigt, blev givet til mennesker for at bestemme den kortsigtede virkning af et højaffinitets OAT-bindende lægemiddel på niveauerne af cirkulerende metabolitter. Probenecid har tre veletablerede mål: SLC22A12 (URAT1, Rst), OAT1 og OAT3, som alle er nært beslægtede gener i den organiske aniontransportørgruppe i SLC22-familien af ​​opløste stoffer. URAT1 er en urinsyretransportør placeret på den apikale membran (den side, der vender mod urinen) af den proksimale tubuli, så OAT1 og OAT3, som er multispecifikke og udtrykt på den blodvendte side af den proksimale tubuli, forventes at udøve en mere dybtgående effekt på serummetabolomet. Sammenligninger af metaboliske målinger på blodet før og 5 timer efter dosering viser store ændringer i Tryptophan Metabolism Subpathway (tabel 4). På grund af forskellige platforme var der 22 metabolitter i denne undervej, hvoraf 16 var signifikant ændret. Fjorten metabolitter blev målt på tværs af alle tre platforme og afslørede adskillige fællestræk mellem knockout-musene og probenecid-behandlede mennesker (fig. 4). For eksempel blev stigninger i 3-indoxylsulfat, kynurenin, N-acetylkynurenin og indollactat observeret i både knockout-musegrupper og mennesker. Der var dog mere overlap mellem Oat1 KO-musen og mennesker behandlet med probenecid. Alle otte metabolitter, der var signifikant forhøjet i Oat1 KO, var også signifikant forhøjet hos lægemiddelbehandlede mennesker. Kun serotonin, som var forhøjet i Oat3 KO-musen, blev ikke ændret hos mennesker.

Mus behandlet med et OAT-hæmmende lægemiddel viser ændringer i tryptofanmetabolismen

Som en mellemting mellem vores knockout-musemodeller og mennesker behandlede vi vildtypemus med probenecid, et veletableret OAT-hæmmende lægemiddel. Denne lægemiddelbehandling førte til en forhøjelse af seks tryptofanmetabolitter, herunder kynurenin, kynurenat og indolelactat (fig. 5). Disse metabolitter blev forhøjet i et eller begge knockout-eksperimenter og de probenecid-behandlede mennesker.

Således understøtter de overordnede resultater i probenecid-behandlede mennesker og mus, såvel som knockout-musene, rollen som OAT1 og OAT3 i reguleringen af ​​cirkulerende niveauer af tryptophan-metabolitter.

Tryptophan-metabolitter interagerer med human OAT1 og OAT3 in vitro transportassays For at bekræfte vores resultater udførte vi in ​​vitro transportassays ved hjælp af celler, der overudtrykker human OAT1 og OAT3. Mange af metabolitterne i denne undervej er blevet testet mod disse transportører (tabel 3), men andre metabolitter forbliver uudforskede. Transportassays for indoleddikesyre (ILA) viste, at ILA interagerer med OAT1 og OAT3 (henholdsvis IC50=229.1 ± 74.56 μM, 74.49 ± 23.29 μM) (fig. 6). Desuden interagerede serotonin, som var unikt forhøjet i Oat3 KO, kun med OAT3 in vitro (IC50=288.2 ± 167.0 μM) (data ikke vist). IC50-værdierne blev derefter integreret med kendte Km-værdier for at beregne inhiberende konstanter. Den inhiberende konstant (Ki) for ILA med OAT1 var 119,3 μM.

Knockout-nyremetabolomisk opgaveanalyse indikerer en central rolle for OAT1 i proksimal tubuli-sensing af tryptofan-metabolitter

Vi brugte microarray-data franyreraf Oat1 KO, Oat3 KO og deres vildtypekontroller for at identificere, hvordan transportørændringerne påvirkernyremetaboliske funktioner. Til dette formål brugte vi en systembiologimetode (metabolisk opgaveanalyse (41) fra CellFie-værktøjet), der forudsiger, hvordan ændringer i genekspression påvirker en foruddefineret liste med 175 metaboliske opgaver (Supplerende Tabel S4), der dækker de generelle metaboliske systemer i en celle (energi, nukleotid, kulhydrater, aminosyre, lipid, vitamin og co-faktor og glycan metabolisme). Som beskrevet i Metoder tager beregningen af ​​en "metabolisk opgavescore" transkriptomiske data og tilskriver en genaktivitetsscore for hvert gen. En genom-skala model af metabolisme bruges til at udarbejde en liste over reaktioner, der kræves for at udføre hver af de 175 metaboliske opgaver. Transkriptomisk analyse kan således bruges direkte til kvantitativt at sammenligne den relative aktivitet af hver metabolisk funktion under de forskellige betingelser (f.eks. vildtype versus Oat1 KO, vildtype versus Oat3 KO).

Vi fandt ud af, at tryptofan-relaterede metaboliske opgaver var almindelige blandt dem med en stor forskel mellem Oat KO og vildtype mus. Hvad der dog var uventet var, atnyretryptofan-relaterede metaboliske opgaver var afhængige af OAT1, men ikke OAT3. I Oat1 KO-musene havde syntesen af ​​kynurenin, kynurenat, anthranilat og N-for-mylanthranilat fra tryptofan øget metaboliske opgavescore, mens hver af disse opgaver havde en nedsat metabolisk opgavescore i Oat3 KO. Dette er i overensstemmelse med serummetabolomiske analyser, som viser signifikante stigninger i niveauerne af kynurenin, kynurenat, anthranilat og N-for-mylanthranilat i Oat1 KO.

Diskussion

OAT1 og OAT3 er anerkendt for deres rolle i elimineringen af ​​hundredvis af lægemidler (42). Imidlertid har in vivo og in vitro undersøgelser af OAT1 og OAT3 vist, at disse proteiner er involveret i transporten af ​​adskillige endogene og tarmmikrobeafledte metabolitter, uremiske toksiner, signalmolekyler, indtaget næringsstoffer, industrielle toksiner og naturlige produkter (9, 24, 26, 34, 35, 43). Dette ser også ud til at være tilfældet for andre multispecifikke lægemiddeltransportører, hvilket tyder på, at deres bidrag til endogen metabolisme er stærkt undervurderet (44).

Disse multispecifikke lægemiddeltransportører er højt udtrykt i næsten alle væv og spiller en særlig kritisk rolle i figur 4. Tryptophan-metabolitter var forhøjet i havre-knockout-mus og probenecid-behandlede mennesker. Et Venn-diagram over signifikant ændrede tryptofan-metabolitter i knockout-mus og mennesker behandlet med probenecid. Af de 14 metabolitter, der er fælles for alle tre platforme, var 12 signifikant forhøjet i mindst et af eksperimenterne. Fire metabolitter var signifikant forhøjet i hvert forsøg. B, kemiske strukturer af metabolitter forhøjet i hvert eksperiment: 3-indoxylsulfat, indolelactat, kynurenin og N-acetylkynurenin. C, boxplots for hver metabolit i de probenecid-behandlede mennesker (n=20), Oat1 KO-mus (n=5) og Oat3 KO-mus (n=3). Linjer i boxplot angiver medianen. Rolle af OAT1 og OAT3 i tryptofan metabolisme. Biol. Chem. (2021) 296 100575 7epitel- og endotelbarrierer mellem blod og andre kropsvæsker/-rum (f.eks. blod-hjerne-barriere, blod-nethinde-barriere, blod-CSF-barriere, næse-hjerne-barriere, blod-urin-barriere). Som regulatorer af systemisk metabolisme, såvel som lokal metabolisme i deres ekspressionsvæv, kan den type undersøgelser og analyser, vi har beskrevet her, hvis de udføres for alle "lægemiddel"-transportører, radikalt ændre vores fysiologiske syn på disse evolutionært konserverede proteiner.

Den kliniske farmaceutiske betydning af disse transportører er enorm, og tilsynsmyndigheder har anbefalet screening af nye lægemiddelenheder mod mindst syv multispecifikke lægemiddeltransportører (OAT1, OAT3, OATP1B1, OATP1B3, OCT2, P-GP, BCRP) for at begrænse muligheden for lægemiddel- lægemiddelinteraktioner (DDI) - tilfælde, hvor to eller flere lægemidler konkurrerer om adgang til den samme transportør. Transporter-medierede DDI'er kan ændre koncentrationen af ​​lægemidlerne i blodet, hvilket potentielt kan føre til uønskede kliniske virkninger (45). I betragtning af antallet af substrater for OAT1 og OAT3, kan et lignende fænomen forekomme mellem lægemidler og metabolitter i cirkulation. Disse DMI'er har også potentiale til at påvirke vævsfunktion, da metabolitter og signalmolekyler muligvis ikke kan trænge ind i cellen og udøve deres virkning på normal cellulær fysiologi. Nærværende undersøgelse understøtter denne mulighed.

I vores metabolomiske analyser af serum fra Oat1 og Oat3 knockout mus var der markante ændringer i tryptophan-relaterede metabolitter. Stigningen i systemiske niveauer af metabolitter på grund af fraværet af disse transportører i blodets grænseflade mednyre, hævede muligheden for nedsat intracellulær koncentration inyreproksimale tubuliceller. Hvordan kan disse celler reagere? Vi brugte transkriptomik-baseret metabolisk opgaveanalyse til at løse dette spørgsmål. Vi identificerede flere lokale (nyre) tryptofan-relaterede metaboliske opgaver påvirket af fraværet af transportører. Disse ændringer i metaboliske opgavescorer er forårsaget af kompenserende stigninger i ekspressionen af ​​de metaboliske opgaveassocierede gener i forbindelse med OAT1-mangel. Mens mange metaboliske veje blev undersøgt af både metabolomics og transkriptomics-baseret metabolisk opgaveanalyse, gav brugen af ​​begge tilgange os unik indsigt i, hvordan visse lægemiddeltransportører deltager i kommunikationen mellem vævet og det ekstracellulære miljø. Hvor tryptophanmetabolitter blev reguleret af begge transportører på systemisk niveau, var tryptofan-relaterede metaboliske opgaver i nyrerne primært afhængige af OAT1.

Resultaterne indikerer, at den proksimale tubuli afnyre, hvor OAT'er findes, er ikke blot en kanal til renal eliminering af tryptophanmetabolitter; det registrerer tryptofanmetabolitter og reagerer på ændringer i deres intracellulære overflod. Samlet understøttede dataene synspunktet om, at OAT1 ikke kun spiller en nøglerolle i at fjerne tryptofan-relaterede metabolitter fra kredsløbet ved at fremme deres optagelse afnyremen også at denne transportør regulerer intracellulær metabolisme, især tryptofan metabolisme.

Dette understøtter det synspunkt, at OAT1-medieret transport af kynurenin, kynurenat, anthranilat og N-for-mylanthranilat er vigtig fornyrefunktion (fig. 8). Disse fire metabolitter tilhører kynurenin-undervejen for tryptophan-nedbrydning, og bortset fra kynurenat, er de involveret i produktionen af ​​cellulær energi gennem syntesen af ​​NAD plus (46). Det er således muligt, at manglen på OAT1 fører til nedsat cellulært stofskifte, som i det mindste delvist kan genvindes gennem produktionen af ​​disse metabolitter.

Næsten alt indtaget tryptofan metaboliseres i tre hovedsubpathways: kynurenin, serotonin og indol (47, 48). Ud over sin rolle i at producere NAD plus producerer kynurenin-subpathwayen metabolitter, der har en række funktioner i både sunde og syge tilstande (46, 49). Serotoninvejen producerer neurotransmitteren, serotonin, som spiller en rolle i adskillige fysiologiske processer, især som regulator af CNS-funktionen (50). Indol-undervejen, som medieres af tarmmikrobiomet, producerer signalmolekyler, der deltager i værts-mikrobiel kommunikation (51). Systemisk modulerer OAT1 og OAT3 biotilgængeligheden af ​​tryptophan-metabolitter fra hver af de tre underveje, selvom de fleste af metabolitterne kommer fra kynurenin- og indol-undervejene.

I betragtning af de utallige signalroller, de forhøjede metabolitter har, er der potentiale for, at OAT1 og OAT3 kan påvirke mange aspekter af fysiologien. For eksempel aktiverer kynurenat GPR35, et lægemiddelmål, og en GPCR involveret i inflammatoriske reaktioner og hjerte-kar-sygdomme (52). Mange af de væsentligt ændrede tryptophanmetabolitter er også etablerede eller formodede ligander af arylcarbonhydridreceptoren (AhR) (tabel 3), en transkriptionel regulator udtrykt i næsten alle væv, der reagerer på xenobiotika (53).

De metabolomiske undersøgelser af de to knockout-mus viste, at en central endogen funktion af OAT1 og OAT3 er at regulere systemiske niveauer af tryptofan-metabolitter. Et lægemiddel rettet mod OAT1 og OAT3 ville således forventes at have en lignende indvirkning på metabolomet. Som forudsagt blev translationspotentialet for vores knockout-mus som modeller af DMI'er stærkt understøttet af resultaterne fra mennesker behandlet med probenecid, et OAT-hæmmende lægemiddel, der bruges over hele verden til at behandle gigt. Flere af tryptofanmetabolitterne var forhøjet i både serum fra mennesker og knockout-mus.

Der er således potentiale for, at de forbindelser, der er forhøjet i undersøgelser af mennesker og gnavere, kan bruges som biomarkører for nye lægemiddelenheder, der kan hæmme OAT1 og OAT3. Mens knockout-musemodellerne (som har normal forventet levetid) og de probenecid-behandlede mennesker var raske, er nogle af de forhøjede metabolitter kendte uremiske toksiner, der øges i serum hos mennesker, der lider af kronisk nyresvigt og er forbundet med negative resultater (54) 55). Overlapningen af ​​metabolitter involveret i aspekter af CKD og vores undersøgelser antydede, at OAT'erne kan spille en nøglerolle i manifestationer af CKD eller dets progression, selvom det også er muligt, at metabolitkoncentrationer kan øges på grund af tab af sekretion som følge af væv skade (56, 57). CKD kan også føre til multiorgansvigt, delvist på grund af ophobning af uremiske toksiner, og dette kan delvist skyldes optagelse i andet væv via SLC og ABC lægemiddeltransportere (12, 58).

Tryptofanmetabolismevejen kræver en koordineret funktion af flere organer. Tryptofan absorberes af tarmen, modificeres af leveren eller andre organer, og metabolitterne transporteres i sidste ende afnyre, til dels gennem funktionen af ​​OAT1 og OAT3. Konventionelt betragtes dette blot som en elimineringsvej. Vores resultater, som indikerer, at celler afnyrereagere på fraværet af disse metabolitter og signalmolekyler ved at geare op til at producere dem, tyder på noget andet. Selvom deres specifikke rolle inyreproksimale tubuli er dårligt defineret, er det klart, at mange af de producerede mellemprodukter er neurotransmittere og har en vigtig rolle i CNS-funktionen (46, 49, 59, 60). Ud over interorgankommunikation afspejler tryptofanmetabolisme også interorganismel kommunikation mellem værten og tarmmikrobiomet. Serum fra bakteriefri mus har faktisk reducerede niveauer af 3-indoxylsulfat, indolpropionat og serotonin (61). Ydermere har tidligere undersøgelser vist, at inden for renale OAT1-positive celler fungerer 3-indoxylsulfat i cellesignalering ved at aktivere AhR og regulere deres egen sekretion gennem OAT1 (62). Vores resultater af, at tarm-afledte metabolitter blev øget i serum fra både Oat1 KO og Oat3 KO mus - sammen med vores demonstration af, at nogle er ligander in vitro, giver yderligere støtte til vigtigheden af ​​disse transportører i reguleringen af ​​kommunikationen mellem værten og kommensal organismer. Samlet set stemmer vores resultater overens med Remote Sensing and Signaling Theory, som foreslår, at lægemiddeltransportører og lægemiddelmetaboliserende enzymer deltager i interorgan- og interorganismel kommunikation gennem transport og modifikation af små molekyler for at opretholde homeostase (63, 64). Det er således afgørende at forstå spektret af endogene fysiologiske funktioner af lægemiddeltransportører systemisk og lokalt.

Med forbedrede metabolomiske data identificerede vi metabolitter påvirket af fraværet af OAT1 og OAT3 i gnavermodeller og metabolitter påvirket af hæmningen af ​​OAT1 og OAT3 hos mennesker behandlet med OAT-hæmmende lægemidler. Vores gruppe har tidligere brugt metaboliske rekonstruktionsnetværk til at forudsige metabolisk funktion og rapporteret om flere fælles og unikke veje reguleret af OAT1 og OAT3 (43, 65). Imidlertid var disse undersøgelser begrænset af tidlige versioner af rekonstruktionsværktøjer og meget få metabolomiske data. Ved hjælp af en anden tilgang lagde Metabolic Task Analysis en meget større vægt på OAT1's rolle i intracellulær tryptofanmetabolisme afnyre. Vores tilgang kan anvendes til at undersøge de endogene funktioner af andre SLC- og ABC-familiemedlemmer og opbygge separate, men overlappende netværk for alle disse lægemiddeltransportører, som findes ikke kun i mus, men også i fuld og orme (20, 66). Sådanne repræsentationer vil også lette forståelsen af ​​det fulde omfang af DMI'er for lægemidler, der interagerer med OAT1, OAT3 eller begge, hvilket sandsynligvis går ud over simpel konkurrence på transportørniveau.

Eksperimentelle procedurer

Dyr

Alle forsøgsprotokoller, der involverer brug af dyr, blev godkendt af UCSD Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Alle dyr blev håndteret i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer for brug af levende dyr til forskning. Voksne WT-, Oat1 KO- og Oat3 KO-hanner blev anbragt separat under en 12-h lys-mørke-cyklus og fik ad libitum adgang til mad og vand. Disse dyr er blevet beskrevet i tidligere publikationer (26, 27). Probenecid-behandlede mus fik administreret en daglig intraperitoneal injektion af 200 mg/kg probenecid eller PBS i 3 dage før aflivning. Den endelige injektion blev administreret 2 timer før aflivning. Datasættene brugt til denne analyse er også blevet delvist beskrevet (23, 24). Oat1 KO-datasættet er delvist undersøgt ud fra et kemoinformatisk perspektiv, men detaljeret pathway-analyse blev ikke udført (23). Oat3 KO-datasættet blev genanalyseret, og kun to grupper blev sammenlignet (24).

Humane undersøgelser med probenecid

Alle eksperimentelle protokoller blev gennemgået og godkendt af Institutional Review Board og overholder Helsinki-deklarationens etiske principper. Der blev udtaget fuldblodsprøver fra 20 individer (14 kvinder, seks mænd). Gennemsnitsalderen var 30,85 ± 10,98, og den gennemsnitlige BMI var 24,18 ± 3,52. Deltagere, der ikke tog nogen medicin og var på vegetarisk diæt i hele undersøgelsens varighed. En oral dosis på 1 gram probenecid blev administreret, og efter 5 timer blev fuldblod opsamlet igen. Hver prøve blev holdt frosset ved -80 grader indtil metabolomisk analyse.

Metabolomics Humane serumprøver blev straks opbevaret ved -80 grader og sendt på tøris til Metabolon Inc. Museserumprøver blev opsamlet og analyseret som tidligere beskrevet (23, 24). For kort at rekapitulere, for hver prøve, blev målrettet metabolomisk profilering udført af Metabolon Inc. MicroLab STAR-systemet fra Hamilton Company blev brugt til at forberede hver prøve, og flere genvindingsstandarder blev tilføjet til kvalitetskontrol. Serummet blev præcipiteret med methanol og omrørt med Glen Mills GenoGrinder 2000 for at fjerne proteiner fra serummet og frigive molekyler bundet til disse proteiner. Den resulterende opløsning blev adskilt i fire mindre prøver. To blev analyseret ved omvendt fase (RP) ultraperformance væskekromatografi (UPLC) massespektrometri (MS) med positiv ion-mode elektrospray-ionisering (ESI). En prøve blev analyseret med RP/UPLC-MS/MS med negativ ion-mode ESI. En prøve blev analyseret med HILIC/UPLC-MS/MS. Det organiske opløsningsmiddel blev fjernet ved at placere hver prøve på en TurboVap (Zymark).

Statistikker

For både menneske- og museprøver blev råværdier normaliseret til volumen, log-transformeret, og manglende værdier blev erstattet med den lavest observerede værdi for hver forbindelse. I de humane serumprøver blev statistisk signifikans bestemt ved anvendelse af ANCOVA-kontraster, der inkorporerer BMI og alder. For museserumprøver blev signifikans bestemt ved hjælp af Welchs to-prøve t-test med metabolitter, der opnåede statistisk signifikans (p Mindre end eller lig med 0.05), såvel som dem, der nærmede sig signifikans ( 0.05 Mindre end eller lig med p Mindre end eller lig med 0,10) inkluderet i efterfølgende analyser. Berigelsen blev bestemt ved hjælp af ligning 1, hvor k er antallet af signifikant ændrede metabolitter i en Subpathway, m er antallet af metabolitter i en Subpathway, n er antallet af signifikant ændrede metabolitter i det samlede datasæt, og N er antallet af målte metabolitter i det samlede datasæt.

Metabolisk opgaveanalyse

Vi brugte den metaboliske opgaveanalyse, som implementeret i CellFie-modulet i GenePattern, til at kvantificerenyrernesmetaboliske funktioner og indflydelsen af ​​OAT-transportørændringer fra genekspressionsdata (41) (dvs. mikroarray-data fra nyrerne af Oat1 KO, Oat3 KO og deres vildtypekontroller). Denne analyse forudsiger aktiviteten af ​​en kureret samling af hundredvis af opgaver, der dækker syv hovedmetaboliske aktiviteter i en celle (energigenerering, nukleotid, kulhydrat, aminosyre, lipid, vitamin og cofaktor og glycanmetabolisme) direkte fra transkriptomiske data ved at bruge genom- skalamodeller af menneskelig metabolisme. Mere specifikt afhænger beregningen af ​​den relative aktivitet af en metabolisk opgave (dvs. metabolisk opgavescore) først på forbehandlingen af ​​de tilgængelige transkriptomiske data og tilskrivningen af ​​en genaktivitetsscore for hvert gen (67). Genomskalamodellen for menneskelig metabolisme bruges yderligere til at identificere listen over reaktioner, der kræves for at udføre hver metabolisk opgave og, ved at gøre det, til at identificere listen over gener, der kan bidrage til erhvervelsen af ​​en metabolisk funktion baseret på GPR-regler (dvs. , regler for genproteinreaktion). Derfor beregnes den metaboliske opgavescore som den gennemsnitlige aktivitetsscore for alle de gener, der bidrager til en metabolisk funktion. Ved at gøre det kan transkriptomiske data direkte bruges til at kvantificere den relative aktivitet af hver metabolisk funktion i en specifik tilstand.

In vitro transportanalyser

Menneskets embryonalenyre(HEK)-293 celler, der stabilt overudtrykker human OAT1 og OAT3 (Solvo Biotechnology) blev dyrket til sammenløb i Dulbeccos Modified Eagle's Medium (Invitrogen) suppleret med 10 procent føtalt bovint serum og 1 procent penicillin/streptomycin og vedligeholdt i 5 procent CO2 ved 37 C. De OAT1--udtrykkende celler blev udvalgt i nærvær af blasticidin, og de OAT3--udtrykkende celler blev udvalgt i nærvær af puromycin. Begge cellelinjer testede negative for Mycoplasma-kontamination. Forud for funktionelle assays blev celler udpladet på 96-brøndsplader, inkuberet i 24 timer og suppleret med medier. Konkurrerende optagelsesforsøg blev udført ved at inkubere celler i bufferopløsning med en fast koncentration på 10 μM 6-carboxyfluorescein og en serielt fortyndet koncentration af det foreslåede substrat begyndende ved 2 mM. Buffer blev fjernet efter en 10-min. inkubation ved stuetemperatur, og cellerne blev skyllet med DPBS tre gange. FL-fluorescensen blev derefter vurderet under anvendelse af en FL-fluorescerende pladelæser. IC50-værdier blev bestemt ved hjælp af GraphPad Prism 8.

Fluorescerende intensitetsværdier blev normaliseret, så den laveste værdi blev sat til 0 procent, og den højeste værdi blev sat til 100 procent. Efter normalisering blev dataene tilpasset til en ikke-lineær model, og IC50 blev bestemt ved hjælp af ligning 2.

Ki blev derefter beregnet for hver metabolit ved hjælp af Cheng-Prusoff-ligningen (ligning 3), med Km for hOAT1 HEK293-celler afledt af tidligere eksperimenter (68).

Datatilgængelighed

Alle relevante metabolomiske data er indeholdt i artiklen og det supplerende materiale. Transkriptomiske data er tilgængelige efter anmodning fra snigam@health.ucsd.edu. hypotese, overvågede projektet, designede eksperimenterne og skrev og redigerede artiklen.

Finansiering og yderligere information— Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra National Institutes of Health (NIH) til SKN fra National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) (R01GM132938). Støtte til JCG kommer fra uddannelsestilskuddet tildelt af National Institute of Biomedical Imaging and bioengineering (NIBIB) (T32EB009380) og et supplement til R01GM132938. Dette arbejde blev delvist finansieret af generøse midler fra NIGMS til NEL (R35GM119850), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) til NEL (UH2AI153029), et LIFA-stipendium til AR og et stipendium til JMG fra Mexicos regering ( CONACYT) og University of California Institute for Mexico og USA (UC-MEXUS). Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis NIH's officielle synspunkter. Nogle figurer blev genereret ved hjælp af Biorender. Denne artikel er dedikeret til minde om Vibha Bhatnagar, MD, MPH.

Interessekonflikt—Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter med indholdet af denne artikel.

Forkortelser—De anvendte forkortelser er: AhR, arylcarbonhydridreceptor; CKD, kronisknyresygdom; DMI, lægemiddel-metabolit interaktion; ESI, elektrospray ionisering; HEK, menneskelig embryonalnyre; ILA, indoleddikesyre; KO, knockout; RP/UPLC/MS, omvendt fase ultraperformance væskekromatografi-massespektrometri.

Cistanche tubulosa forebygger nyresygdom, klik her for at få prøven

Fra 1 Institut for Bioteknik, 2 Institut for Pædiatri, 3 Institut for Biologi, 4 Afdeling for Biostatistik og bioinformatik, Institut for Familiemedicin og Folkesundhed, 5 Institut for Familie og Forebyggende Medicin, 6NovoNordisk Foundation Center for Biosustainability ved UC San Diego, og 7. University of California SanDiego, La Jolla, Californien, USA Redigeret

af Mike Shipston

Referencer

1. LopezNieto, CE, You, GF, Bush, KT, Barros, EJG, Beier, DR og Nigam, SK (1997) Molekylær kloning og karakterisering af NKT, et genprodukt relateret til den organiske kationtransportørfamilie, der næsten udelukkende er udtrykt inyre. J. Biol. Chem. 272, 6471-6478

2. Brady, KP, Dushkin, H., Fornzler, D., Koike, T., Magner, F., Her, H., Gullans, S., Segre, GV, Green, RM, og Beier, DR (1999) ) En ny formodet transportør kortlægger osteosklerose (oc)-mutationen og udtrykkes ikke i OC-mutantmusen. Genomics 56, 254-261

3. Riedmaier, AE, Nies, AT, Schaeffeler, E., og Schwab, M. (2012) Organiske aniontransportører og deres implikationer i farmakoterapi.Pharmacol. Åb. 64, 421-449

4. Ahn, SY og Bhatnagar, V. (2008) Opdatering om den molekylære fysiologi af organiske aniontransportører. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 17, 499-505

5. Nigam, SK (2018) SLC22-transportørfamilien: Et paradigme for virkningen af ​​lægemiddeltransportører på metaboliske veje, signalering og sygdom. Annu. Rev. Pharmacol. 58, 663-687

6. Lowenstein, J., og Grantham, JJ (2016) Genfødslen af ​​interesse for renal tubulær funktion. Er. J. Physiol. Renal 310, F1351–F1355

7. Govindarajan, R., og Sparreboom, A. (2016) Narkotikatransportører: Fremskridt og muligheder. Clin. Pharmacol. Ther. 100, 398-403

8. Dig, GF og Morris, ME (2014) Forord. I Drug Transporters Molecular Characterization and Role in Drug Disposition, 2. udgave. Wiley Ser Drug Disc, Hoboken, NJ. Xix

9. Nigam, SK, Wu, W., Bush, KT, Hoenig, MP, Blantz, RC og Bhatnagar, V. (2015) Håndtering af lægemidler, metabolitter og uremiske toksiner afnyreproksimale tubuli lægemiddeltransportere. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 10, 2039-2049

10. Bhatnagar, V., Richard, EL, Wu, W., Nievergelt, CM, Lipkowitz, MS, Jeff, J., Maihofer, AX og Nigam, SK (2016) Analyse af ABCG2 og andre urattransportører i urinsyre homeostase i kroniskenyresygdom: Mulig rolle for fjernmåling og signalering. Clin.NyreJ. 9, 444-453 Rolle af OAT1 og OAT3 i tryptofan metabolisme

12 J. Biol. Chem. (2021) 296 100575

11. Nigam, SK og Bhatnagar, V. (2018) Urinsyretransportørers systembiologi: Rollen af ​​fjernmåling og signalering. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 27, 305-313

12. Nigam, SK og Bush, KT (2019) Uræmisk syndrom af kronisknyresygdom: Ændret fjernmåling og signalering. Nat. Rev. Nephrol. 15, 301-316

13. Saito, H. (2010) Patofysiologisk regulering af renal SLC22A organisationstransportører i akuttenyreskade: Farmakologiske og toksikologiske implikationer. Pharmacol. Terapeut. 125, 79-91

14. Lepist, EI og Ray, AS (2017) Beyond drug-drug interaktioner: Effekter af transportørhæmning på antibiotika, næringsstoffer og toksiner. Ekspert udtalelse. Drug Metab. Toxicol. 13, 1075-1087

15. Duan, P., Li, SS, Ai, N., Hu, LQ, Welsh, WJ og You, GF (2012) Potente inhibitorer af humane organiske aniontransportører 1 og 3 fra kliniske lægemiddelbiblioteker: Opdagelse og molekylær karakterisering . Mol. Pharmaceut. 9, 3340-3346

16. Evers, R., Piquette-Miller, M., Polli, JW, Russel, FGM, Sprowl, JA, Tohyama, K., Ware, JA, de Wildt, SN, Xie, W., Brouwer, KLR og Consortium, IT (2018) Sygdomsrelaterede ændringer i lægemiddeltransportører kan påvirke lægemidlers farmakokinetik og/eller toksicitet: En hvidbog fra International Transporter Consortium. Clin. Pharmacol. Ther.104, 900-915

17. Masereeuw, R., Mutsaers, HA, Toyohara, T., Abe, T., Jhawar, S., Sweet, DH og Lowenstein, J. (2014).nyreog uremisk toksinfjernelse: Glomerulus eller tubuli? Semin. Nephrol. 34, 191-208

18. Liu, Y., Prentice, KJ, Eversley, JA, Hu, C., Batchuluun, B., Leavey, K., Hansen, JB, Wei, DW, Cox, B., Dai, FHF, Jia, WP , og Wheeler, MB (2016) Hurtig stigning i CMPF kan fungere som et vendepunkt i diabetesudvikling. Cell Rep. 14, 2889-2900

19. Prentice, KJ, Luu, L., Allister, EM, Liu, Y., Jun, LS, Sloop, KW, Hardy, AB, Wei, L., Jia, WP, Fantus, IG, Sweet, DH, Sweeney , G., Retnakaran, R., Dai, FF og Wheeler, MB (2014) Furanfedtsyremetabolitten CMPF er forhøjet ved diabetes og inducerer beta-celledysfunktion. Celle Metab. 19, 653-666

20. Engelhart, DC, Granados, JC, Shi, D., Saier, MH, Jr., Baker, ME, Jr., Abagyan, R., og Nigam, SK (2020) Systembiologisk analyse afslører otte SLC22-transportørundergrupper, herunder OAT'er, OLT'er og OCTN'er.Int. J. Mol. Sci. 21, 1791