Sammenligning af to diagnostiske assays til påvisning af serumneutraliserende antistof mod svinepidemi diarrévirus

Abstrakt:

Laktogen immunitet er vigtig for beskyttelsen af ​​smågrise mod mange patogener, herunder svinepidemi-diarrévirus. Cirkulerende neutraliserende antistofniveauer i sosera kan hjælpe med at afgøre, om en påviselig immunrespons kunne give pattegrise beskyttelse. Neutraliserende antistoffer kan påvises gennem forskellige diagnostiske assays. Denne undersøgelse evaluerede de diagnostiske egenskaber af to neutraliserende antistof-assays for porcin epidemisk diarré-virus-neutraliserende antistoffer i serum fra angrebne gylte. Fire behandlingsgrupper, kontrol, ikke-vaccineret, vaccineret før udfordring og vaccineret efter udfordring, bestod af 20 gylte. Serumprøver blev opsamlet fra hver gylte før og efter udfordringen med svinepidemi-diarrévirus. Prøver blev evalueret for tilstedeværelsen af ​​neutraliserende antistoffer via et fluorescerende fokus neutraliseringsassay og et high-throughput neutralisationsassay. Diagnostisk sensitivitet og specificitet for fluorescerende fokus-neutraliserings- og high-throughput-neutraliseringsassays for denne undersøgelse blev optimeret ved en cutoff af en fortynding på henholdsvis 80 og 80 % fluorescerende reduktion og viste moderat overensstemmelse baseret på kappa-statistikken. Fokus fluorescerende neutraliserings- og højkapacitetsneutraliseringsassays kan bruges til at overvåge status for neutraliserende antistoffer i dyr eller en population af dyr. High-throughput assayet har fordele i forhold til fokus fluorescerende assay, idet det har en højere specificitet ved den angivne cut-off, og karakteren af ​​resultaterne giver mulighed for mere diskrimination mellem individuelle resultater.

cistanche supplement fordele-øge immunitet

Nøgleord: PEDV; neutraliserende antistof; diagnostisk assay

1. Introduktion

Porcin epidemisk diarrévirus (PEDV) er et alfacoronavirus, der er blevet endemisk i Amerika efter dets fremkomst i USA i 2013 [1-3]. Biosikkerhedsforanstaltninger er fokuseret på at holde patogener såsom PEDV ude af svinebesætninger for at afbøde virkningen af ​​sygdommen [4]. Serologisk test er et nyttigt værktøj til at afgøre, om grise tidligere har været udsat for og inficeret med et patogen. Eksponering kan forekomme naturligt (f.eks. indtagelse af virusfyldt materiale) eller bevidst (f.eks. sammenblanding med udgydende frødyr, oral-næsepodning eller maveskylning). Til formålet med denne undersøgelse blev eksponering opnået ved bevidst udfordring med et PEDV-positivt vævshomogenat fra et bekræftet, klinisk udbrud af PEDV. Song et al. [5] påviste serumneutraliserende antistoftitere ikke adskilte sig mellem søer, der fik en oral eller intramuskulær Vero-celle svækket PEDV DR13-vaccine. Denne undersøgelse viste også, at oralt vaccinerede søer havde lavere pattegrisedødelighed sammenlignet med intramuskulær vaccination. Derudover har de Arriba et al. [6] viste en sammenhæng mellem IgA og IgG antistof-secernerende celler (ASC) i blodet og tarm-associeret lymfoid væv. Søernes diffuse, epitheliochriale placenta forhindrer immunceller og antistoffer i at blive overført til pattegrise in utero, hvilket gør grise agammaglobulinemiske ved fødslen [7]. Maternel immunitet overføres fra søer til deres pattegrise via brystsekret og spiller en afgørende rolle i beskyttelsen mod enteriske patogener såsom PEDV, TGEV og rotavirus. Derfor er smågrise afhængige af råmælk og mælkeantistoffer til beskyttelse mod disse patogener. Serumimmunoglobuliner er en stor bidragyder til colostrum, hvorimod immunglobuliner i mælk produceres i mælkekirtlen [8]. Neutraliserende antistofassays kan således hjælpe med at afgøre, om en påviselig immunrespons i præ-fødselsso-sera kan give pattegrise beskyttelse. Mekanismerne for neutraliserende antistoffer omfatter aggregering, inhibering af viral indtrængen af ​​målcellen og inhibering af viral replikation i målcellen [9]. Diagnostiske assays er blevet udviklet til at påvise neutraliserende antistoffer for PEDV, herunder virusneutralisering (VN), fluorescerende fokusneutralisering (FFN) og high-throughput neutralisationstest (HTNT) [2,10-13]. Som beskrevet af Sarmento et al. [2], FFN-assayet er en forbedring i forhold til VN-assayet, da assayet er mere følsomt, fordi assayet er baseret på påvisning af virale antigener udtrykt på overfladen af ​​inficerede Vero-celler, mens VN-assayet er baseret på den forårsagede cytopatiske effekt. af virussen. Derudover kan FFN-resultater opnås hurtigere end VN-resultater, da den cytopatiske effekt tager længere tid at blive observeret sammenlignet med viral binding med FFN. HTNT-analysen er en yderligere forbedring i forhold til FFN-analysen, da HTNT-analysen er afhængig af digital billedcytometri frem for teknikerfortolkning for at opnå resultaterne. Tillader således en hel plade at blive læst på mindre end 3 minutter, hvilket giver en kvantitativ måling af fluorescerende intensitet og mulighed for at gemme billeder til gennemsyn. Således så HTNT ud til at være egnet til brug i kommercielle svinebesætninger. Den foreliggende undersøgelse sammenlignede de diagnostiske karakteristika (sensitivitet og specificitet) og positive og negative prædiktive værdier for to neutraliserende antistofassays for PEDV-, FFN- og HTNT-assays. Dette bygger på arbejdet af Sarmento et al. [2] ved at teste naive, inficerede og vaccinerede dyr for at hjælpe med at validere analysen til brug i et diagnostisk laboratorium med høj kapacitet. Baseret på resultaterne af Sarmento et al. [2], vores nulhypotese er, at der ikke er nogen forskel i de diagnostiske karakteristika af de to assays til at påvise neutraliserende PEDV-antistoffer i serum fra PEDV-udfordrede gylte.

cistanche supplement fordele-øge immunitet

2. Materialer og metoder

2.1. Kilder og udvalg af svin

Som tidligere beskrevet af Brown et al. [14], denne undersøgelse brugte 4 behandlingsgrupper, der refereres til som kontrol, NV (ikke-vaccineret), Pre (vaccineret før challenge) og Post (vaccineret efter challenge). Hver gruppe var oprindeligt sammensat af 20 kommercielle, krydsede, gylte. I alt 60 gylte blev bekvemt udvalgt fra en kommerciel svinefarm i det centrale Iowa, som ikke havde nogen historie med PEDV. De 20 gylte i kontrolgruppen blev genbrugt til NV-gruppen. NV-gruppen bestod af kun 18 grise, da to gylte blev fjernet fra undersøgelsen på grund af komplikationer, der ikke var relateret til PEDV-udfordringen.

Som yderligere bevis på PEDV-negativ status blev 12 mL blod opsamlet via halsvenepunktur ved hjælp af en 16-gauge, 1.5-inch nål og 12 mL sprøjte. Serum blev høstet fra blodprøver via centrifugering ved 1.500 x g i 8 minutter (min), opdelt i 1 ml alikvoter og opbevaret ved -80 ◦C. Serumprøver blev testet med en wv-ELISA på Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory (ISU-VDL, Ames, IA, USA) [15].

2.2. Tildeling af dyr til behandlingsgrupper

De 60 gylte var ligeligt opdelt i 3 grupper, der hver bestod af 20 kommercielle, krydsningstæver. For at danne fire behandlingsgrupper blev der brugt 20 gylte sekventielt til to af behandlingsgrupperne, CONTROL og NV. Genbrug af de 20 gylte gav mulighed for udvikling og kontrol af en gruppe PEDV-positive gylte, der var blevet udsat for PEDV, og reducerede det samlede antal dyr, der blev brugt i undersøgelsen. De resterende 40 gylte omfattede PRE- og POST-grupperne, med 20 gylte inden for hver gruppe. Tidslinjen for hændelser efter behandlingsgruppe er beskrevet i Brown et al. [14]. Kort fortalt blev individuelle blodprøver indsamlet en gang om ugen i hver behandlingsgruppe efter udfordringen. Yderligere uddybning er diskuteret i afsnit 2.4 og 2.5. Behandlingsgruppen "PRE"-gylte blev vaccineret inden ankomsten til offsite-faciliteten. Behandlingsgruppen "POST"-gylte blev først vaccineret efter udfordringen.

2.3. Opstaldning og pasning af svin

Ved ankomsten til forskningsfaciliteten blev gylte opstaldet af en behandlingsgruppe: alle 20 gylte i en behandlingsgruppe var i en sti med ad libitum foder og vand. Alle kuglepenne var i samme rum. En pen blev efterladt tom mellem NV PRE- og POST-grupperne for at minimere kontaminering. Foder, vand, høje og lave rumtemperaturer og høje og lave fugtigheder blev overvåget for at sikre overensstemmelse med produktionsstandarder. Sundhedsobservationer blev udført og registreret én gang dagligt for at vurdere ambulation, sløvhed, fækal konsistens og andre kliniske tegn på sygdom. Et øremærke (Integra Hog, Allflex, Dallas, TX, USA) blev anbragt i højre øre på hver gylte til individuel dyrs identifikation.

2.4. Mundtlig udfordring

Efter en 4-dages akklimatiseringsperiode blev hver gylte i CONTROL oralt eksponeret for PEDV ved hjælp af et vævshomogenat indsamlet fra et bekræftet klinisk udbrud af PEDV på en kommerciel gård. Homogenatet blev sekventeret af Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory og viste sig at være den amerikanske prototypestamme, genogruppe G2b. Ti milliliter af homogenatet blev blandet med 590 ml phosphatbufret saltvand, og 30 ml af blandingen blev indgivet ironisk til hver gylte. Podestoffet blev bekræftet PEDV-positivt ved real-time, revers transkriptase-polymerase-kædereaktion med en CT-værdi på 19,6 og 14,23 × 107 genomiske kopier pr. ml og udvikling af diarré i gyltene efter udfordring. Individuelle blodprøver blev indsamlet hver 7. dag efter belastningen via halsvenepunktur som beskrevet ovenfor til og med dag 42 efter belastningen. Serum blev høstet og opbevaret som beskrevet ovenfor, og prøver blev sendt til ISU VDL til påvisning af neutraliserende antistoffer ved hjælp af et fokus fluorescerende neutraliseringsassay og en virusneutraliseringstest med høj gennemstrømning. På dag 60 efter den indledende udfordring af CONTROL, blev de resterende 40 gylte bragt til forskningsfaciliteten, og 18 af CONTROL-gyltene blev NV. To gylte blev fjernet fra KONTROL på grund af forhold, der ikke var relateret til undersøgelsen. Efter en akklimatiseringsperiode på 3-dage efter ankomsten blev 18 polte genudfordret (NV) og 40 polte (PRE og POST) blev udfordret, blodprøver blev indsamlet, serum høstet og prøver indsendt til test som beskrevet heri .

2.5. Vaccination af gylte

Fyrre gylte var blevet på oprindelsesbedriften og blev bragt til forskningsfaciliteten 8,5 uger efter CONTROL's ankomst. Tyve gylte var blevet vaccineret 5 og 2 uger før udfordringen, som anbefalet af firmaet, der producerede vaccinen, med en kommercielt tilgængelig, dræbt PEDV-vaccine, genogruppe G2b, (porcine epidemic diarrhea vaccine, Zoetis, Inc., Florham Park, NJ , USA), der omfatter PRE-gruppen. De resterende tyve blev vaccineret med den samme vaccine, 1 og 3 uger efter PEDV-udfordringen omfattende POST-gruppen. Atten af ​​de oprindelige tyve KONTROL-gylte forblev i undersøgelsen og omfattede NV-gruppen og modtog ikke vaccinationen for PEDV

cistanche planteforøgende immunsystem

2.6. Neutraliserende antistofanalyser

2.6.1. Fluorescent Focus Neutralization (FFN) Procedure

FFN blev udført af Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory, standard operationsprocedure 9.5324 [16]. Kort fortalt blev Vero 76-celler fremstillet ved at skylle og inkubere med trypsin-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) i 5 minutter ved 37 ◦C. En 1:20 fortynding af celler og celleformeringsmedium blev lavet, og 200 µL blev tilsat til hver brønd i en 96-brøndsplade og inkuberet i 48 timer. Plader blev dumpet og skyllet med viruspodningsmedium. Serumprøver blev varmeinaktiveret i et vandbad ved 56 ◦C i 30 minutter og derefter fortyndet i en 2-fold seriel fortynding startende ved 1:10 i pladen. Stamvirus blev fortyndet til 100-200 foci-dannende enheder pr. 100 µL og 100 µL tilsat til hver brønd og inkuberet i 60 minutter ved 37 ◦C med 5 % kuldioxid (CO2). Testpladen blev dumpet, skyllet og 150 µL serum/virus-blanding tilsat til tilsvarende brønde og inkuberet i 60 minutter ved 37 ◦C. Serum/virus-blandinger blev dumpet, og brøndene blev vasket med viruspodningsmedium. 150 µL viruspodningsmedium blev tilsat til hver brønd og inkuberet i 24 timer ved 37 ◦C og 5 % CO2. Medier blev fjernet fra pladen, og cellerne blev fikseret ved tilsætning af 80 % acetone, som er blevet afkølet i et isbad, i 15 min. Acetone blev kasseret, og pladen blev lufttørret. En 1:100 fortynding af FITC-konjugeret PEDV NP monoklonalt antistof fortyndet i PBS (pH 7,2) blev fremstillet, og 50 µL blev tilsat til alle brønde og inkuberet ved 37 ◦C i 60 min. Pladen blev vasket med PBS og derefter aflæst under anvendelse af et fluorescensmikroskop (Olympus BX51, 10X objektiv, FITC-filter). Positive brønde viser ikke fluorescerende plaques, og negative viser grønne plaques. Neutraliserende antistoftitre blev udtrykt som den højeste serumfortynding med en 90 % reduktion af virusreplikation sammenlignet med viruskontrollen. Prøver med en titer større end eller lig med 20 blev klassificeret som positive for PEDV-neutraliserende antistoffer. En højere titer indikerer en højere koncentration af neutraliserende antistoffer i prøven. Et eksempel på positive og negative seraprøver er tilgængelige i de supplerende materialer.

2.6.2. High Throughput Fluorescent Neutralization Test (HTNT) Procedure

HTNT blev udført af Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory, standard operationsprocedure 9.5324 Version 2 [17]. Serumprøver blev varmeinaktiveret i et vandbad ved 56 ◦C i 30 min. Virusstamopløsning blev seriefortyndet 10- gange i viruspodningsmedium (DMEM med 2 µg/mL Trypsin-TPCK), overført til Vero 81-celler (ATTC® CCL-81™) og inkuberet ved 37 ◦C med 5 % CO2 i 5 dage. Den sidste fortynding, hvor cytopatisk effekt blev observeret, blev brugt til at bestemme den mediane vævskultur infektiøs dosis (TCID50) ved brug af Spearman og Karber-metoden [18]. Et hundrede mikroliter celleopløsning (celleformeringsmedium, trypsin-EDTA og Vero 81-celler) blev fortyndet med 100 µL celleformeringsmedium (DMEM med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin) for at lave en 1:1 fortynding . Et hæmocytometer blev brugt til at tælle og beregne fortyndingen for at lave 5 × 104 celler/brønd og tilsat til hver brønd på en klarbundet sort 96-brøndsplade (Coring 96-brønd CellBind mikroplade, Sigma) og inkuberet i 48 timer ved 37 ◦C med 5 % CO2 for at gøre cellesammenflydende (100 % sammenflydende). Hver plade havde positiv kontrol, negativ kontrol og viruskontrolbrønde. Derefter blev fem mikroliter varmeinaktiverede kontroller og prøver placeret i duplikatbrønde for at lave 1:40 fortynding med først 1:20 ved at tilsætte 95 µL viruspodningsmedium, derefter 100 µL 1:10 fortyndet PEDV-virus (3,16 × 105) TCID50/ml). Serum/virus-blandingen blev inkuberet i 1 time ved 37 ◦C med 5% CO2. Alle cellebrønde på testpladen blev vasket 3 gange med 150 µL cellevaskemedium (DMEM med 1 % penicillin-streptomycin), og 150 µL serum/virus-blanding og viruskontroller blev overført til testpladen og inkuberet i 90 min. ved 37 ◦C. Serum/virus-blandingen blev kasseret, og pladerne blev vasket én gang med et cellevaskemedium som beskrevet ovenfor, efterfulgt én gang med et viruspodningsmedium. Viruspodningsmedium (150 µL) blev tilsat til hver brønd og inkuberet i 24 timer ved 37 ◦C med 5 % CO2. Viruspodningsmediet blev kasseret, og pladen blev vasket med PBS pH 7,4. Celler blev fikseret ved at tilsætte 4 ◦C, 80 % acetone til hver brønd og inkuberet ved stuetemperatur i 15 minutter. Acetone blev derefter fjernet, og pladen blev lufttørret i 30 min. Hver brønd blev skyllet med PBS pH 7,4. 50 µL FITC-konjugeret PEDV NP monoklonalt antistof (SD6-29 klon, Medgene Labs) fortyndet 1:100 i PBS pH 7,4 blev tilsat til hver brønd og inkuberet i 60 minutter ved 37 ◦C. Pladen blev vasket fire gange med PBS pH 7,4, efterladt den sidste vask i pladen i 5 minutter og derefter kasseret og erstattet med 100 µL PBS pH 7,4. Plader blev derefter aflæst med SpectraMax i3× ved hjælp af SoftMax Pro 6.5 (Molecular Devices, San Jose, CA, USA) ved brug af 30 ms eksponeringstid og 20 um brændvidde justeringer for 541 bølgelængder. Prøver med en total fluorescensreduktion (%FR) større end eller lig med 85% blev klassificeret som positive for neutraliserende antistoffer [2]. Total fluorescensreduktion blev beregnet som 100 − ([Gennemsnitlig prøve total fluorescensintensitet/gennemsnitlig negativ kontrol total fluorescensintensitet]) × 100). En højere total fluorescensreduktion indikerer højere neutraliserende antistofkoncentrationer i prøverne. Et eksempel på positive og negative seraprøver er tilgængelige i de supplerende materialer.

2.7. Diagnostiske egenskaber: Sensitivitet og specificitet og positive og negative forudsigelige værdier

Diagnostisk sensitivitet og specificitet blev beregnet for HTNT ved hjælp af en %FR cutoff på 70, 75, 80, 85 og 90 og FFN ved hjælp af prøvefortynding cutoffs på 20, 40, 80 og 160 for at bestemme den optimerede cutoff. Optimeret blev defineret som cutoff, hvor diagnostisk specificitet er maksimeret med minimalt tab af diagnostisk specificitet. En undergruppe af seksoghalvfjerds kendte PEDV-negative prøver blev udvalgt fra de første to prøveudtagningspunkter for KONTROL- og POST-grupperne. 36 kendte PEDV-positive prøver blev udvalgt fra de sidste to prøveudtagningspunkter for NV-gruppen. Et cutoff på mere end 85 blev brugt til at definere positive prøver i overensstemmelse med ISU VDL-standarddriftsproceduren for analysen [17]. Diagnostisk sensitivitet blev estimeret ved at dividere antallet af kendte positive prøver, der testede positive, med det samlede antal kendte positive prøver. Diagnostisk specificitet blev estimeret ved at dividere antallet af kendte negative prøver, der testede negative, med antallet af kendte negative prøver. Afskæringen, der optimerede diagnostisk specificitet og sensitivitet, blev valgt til assaysammenligning. Til formålet med denne undersøgelse blev diagnostisk specificitet (DSp) og sensitivitet (DSe) maksimeret, hvor den absolutte værdi af forskellen mellem sensitivitets- og specificitetsværdier er mindst. Positiv prædiktiv værdi (PPV) blev estimeret ved at dividere antallet af kendte positive prøver, der testede positive (TP) med de samlede test positive prøver (TP plus falsk positive [FP]). Negativ prædiktiv værdi (NPV) blev estimeret ved at dividere antallet af kendte negative prøver (TN), der testede negative, med de samlede testnegative prøver (TN plus falsk negative [FN]).

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.8. Statistisk analyse

Der var ingen ubestemte resultater eller manglende data i denne undersøgelse. Alle data blev analyseret ved hjælp af SAS Version 9.4 (SAS Instit. Cary NC). 609 observationer fra 6{{10}} grise, der tilhører en af ​​4 grupper, blev brugt. To mulige cutoff-værdier (40 og 80) for FFN-analysen blev overvejet og sammenlignet med en cutoff på 85 for HTNT. For hver var en lineær blandet effektmodel egnet til at forklare gruppens effekt på overensstemmelsen mellem FFN og HTNT assays med en svinespecifik tilfældig effekt. Alle parvise sammenligningsanalyser af grupper blev udført. For to af de tre cutoff-værdier anvendt til FFN-assayet blev Cohens Kappa-koefficient desuden beregnet for at bestemme den overordnede overensstemmelse mellem FFN- og HTNT-assayene. Kappa-koefficienter blev fortolket som følger: mindre end 0.0, "dårlig" overensstemmelse; mellem 0.0 og 0.20, "let" enighed; mellem 0.21 og {{30}}.40, "rimelig" aftale; mellem 0,41 og 0,60, "moderat" enighed; mellem 0,61 og 0,80, "væsentlig" aftale; og mellem 0,81 og 1,0, "næsten perfekt" overensstemmelse [19]. Signifikans blev sat til p Mindre end eller lig med 0,05. Box og whisker plots blev udviklet ved hjælp af R software.

3. Resultater

Tabel 1 viser den diagnostiske sensitivitet og specificitet for FFN- og HTNT-assays ved de valgte cutoffs. Diagnostisk sensitivitet og specificitet for de to assays til denne undersøgelse blev optimeret ved en cutoff på en fortynding på henholdsvis 80 og 80 % FR.

Tabel 1. Diagnostisk sensitivitet (DSe), diagnostisk specificitet (DSp), positiv prædiktiv værdi (PPV) og negativ prædiktiv værdi (NPV) for HTNT- og FFN-assays ved brug af forskellige cutoffs angivet i anden række i tabellen. For eksempel, for HTNT-analysen ved en cutoff på 70, DSe=0.97 (97%), DSP=0.91 (91%), PPV=0.83 ( 83 %) og NPV=0,95 (95 %). U=udefineret.

Figur 1 viser boks- og whiskerplot af HTNT-resultater efter dage efter udfordring efter undersøgelsesbehandlingsgruppe. Prøver fra KONTROL- og POST-grupperne (n=76) blev klassificeret som negative på dagene −4, 0 og 7 som forventet på grund af den tidligere status for grisene. NV-gruppen udviklede et anamnestisk svar efter udfordringen. Nedsat variabilitet forekom blandt HTNT-resultaterne som vist ved et fald i værdiintervallet i begge vaccinerede grupper (PRE og POST) efter udfordringen med PEDV. Denne formindskede variation kan observeres i figur 1, da whiskers og outliers af POST- og PRE-plots bliver kortere 14 dage efter udfordring. Figur 2 viser boks- og whiskerplot af de naturlige log-transformerede FFN-resultater efter dage efter udfordring efter behandlingsgruppe, som har lignende resultater som HTNT-assayet. Både HTNT (Figur 1) og FFN (Figur 2) resultater viser et respons på challenge og vaccination som set med en stigning i %FR og titere fra begge assays. Skønt de var af samme størrelsesorden, blev variationen af ​​hvert assays resultater reduceret efter homolog udfordring (NV). Nedsat variation forekom også efter vaccination (PRE og POST). Denne variation af neutraliserende antistofværdier efter uge efter eksponering falder efter vaccination og homolog udfordring med PEDV (figur 1 og 2). Der var en lignende tendens i faldet i variation af neutraliserende antistof set i begge assays resultater af vaccinerede og homologe udfordrede behandlingsgrupper. Den homologe udfordring af PEDV og anden vaccination frembragte et anamnestisk respons, der genererede et højere niveau af neutraliserende antistoffer med reduceret variation mellem grise sammenlignet med værdier før udfordring og efter vaccination som målt ved begge assays (figur 1). Baseret på analysen af ​​den diagnostiske sensitivitet og specificitet blev cutoffs på 80 (titer) og 85 (%FR) udvalgt til at analysere testoverensstemmelse for henholdsvis FFN- og HTNT-assays. Kappa-testen viste "moderat" overensstemmelse på 0.5257 med et 95 % konfidensinterval på 0.461, 0,5904 af assayene for cutoff 80 (titer) og 85 (%FR) for FFN og HTNT assays.

Figur 1. Box-and-whisker-plot af HTNT-antistofresponskurverne i dagene efter udfordring for hver behandlingsgruppe. Den midterste bjælke repræsenterer medianværdien af ​​resultaterne pr. uge. Hængslerne (øverst og nederst i kassen) repræsenterer den første (Q1) og tredje (Q3) kvartil. Det skraverede område repræsenterer interkvartilområdet (IQR). Whiskers bestemmes som følger: Top whisker=Q3 + 1.5∗IQR; Bundhårhår=Q1 + 1.5∗IQR. Hvis intet datapunkt er ved den beregnede værdi, er det næste datapunkt tættest på Q1 eller Q3 grænsen for whiskeren. Åbne cirkler (◦) angiver afvigere. Et snit på 85 er angivet med den stiplede linje ved 85 på y-aksen.

Figur 2. Box-and-whisker-plot af FFN-antistofresponskurverne efter dagene efter udfordring for hver behandlingsgruppe. Den midterste bjælke repræsenterer medianværdien af ​​resultaterne pr. uge. Hængslerne (øverst og nederst i kassen) repræsenterer den første (Q1) og tredje (Q3) kvartil. Det skraverede område repræsenterer interkvartilområdet (IQR). Whiskers bestemmes som følger: Top whisker=Q3 + 1.5∗IQR; Bundhårhår=Q1 + 1.5∗IQR. Hvis intet datapunkt er ved den beregnede værdi, er det næste datapunkt tættest på Q1 eller Q3 grænsen for whiskeren. Åbne cirkler (◦) angiver afvigere. Et snit på 40 er angivet med den stiplede linje ved ln(40) på y-aksen.

4. Diskussion

Vi antager, at reduceret variation og et anamnestisk respons er forbundet med homogen flokimmunitet og beskyttelse mod sygdom, selvom kliniske tegn stadig blev observeret i PRE-gruppen som beskrevet tidligere [14]. Den kliniske virkning og sværhedsgraden af ​​sygdommen hos disse dyr blev ikke evalueret med henblik på denne undersøgelse. Sygdommen viser sig forskelligt mellem voksne og nyfødte med mere alvorlige kliniske tegn og død hos nyfødte sammenlignet med voksne dyr [1,20]. Mens cirkulerende neutraliserende antistofniveauer alene ikke giver beskyttelse [21], kan de bruges til at vurdere et antistofrespons efter forsætlig eksponering eller vaccinationsadministration i besætninger. Mens fravær af viræmi er karakteristisk for PEDV, er viræmi blevet rapporteret hos smågrise op til 4 ugers alderen [22,23]. Cirkulerende neutraliserende antistoffer kan således påvirke det kliniske sygdomsforløb [21]. Imidlertid ville laktogen immunitet, specifikt IgA i brystsekretioner, være en mere præcis måling af beskyttelse for pattegrise [21]. Analyserne beskrevet i denne undersøgelse kunne bruges til at overvåge serumneutraliserende antistoffer efter vaccinationsadministration i grupper af søer eller gylte ud over at indsamle brystsekreter for at teste for laktogent/sekretorisk IgA. Det ville være fordelagtigt, hvis data genereret fra disse assays kunne forudsige mængden og stabiliteten af ​​laktogen immunitet produceret efter vaccination. Det er dog ikke analyseret i denne undersøgelse. Serum-IgG-antistofresponser efter vaccination har vist sig at være prædiktive for colostral IgG-respons, men der var ingen korrelation mellem serumneutraliserende antistoffer og dem fra brystsekretioner [15]. Selvom der ikke var nogen sammenhæng mellem serumneutraliserende antistoffer og dem fra brystsekreter, blev vaccinerede dyr vist at have højere neutraliserende antistoffer i brystsekreter sammenlignet med kontroldyr [15]. Derfor, som støttet af, Bjustrom-Kraft, et al. [15], hvis serumneutraliserende antistoffer er høje, kan IgG og IgA i brystsekretioner også øges. Således ville indsamling af serumprøver forud for flytning af hunnerne til farestalden minimere stress og smerte induceret under den periparturiente indsamling af blod- og brystsekret, som kan have en negativ indvirkning på soen og kuld [24]. Det er vigtigt for brugerne at forstå, hvordan cut-off-værdien kan påvirke den diagnostiske sensitivitet og specificitet af et assay. Forøgelse af cut-off-værdien vil mindske antallet af falsk positive resultater og øge antallet af falsk negative resultater. Omvendt vil en reduktion af cut-off-værdien øge antallet af falsk positive resultater og reducere antallet af falsk negative resultater. Denne viden giver en bruger mulighed for at vælge, hvilken afskæringsværdi der skal bruges til deres specifikke situation. For denne undersøgelse, baseret på resultaterne af denne undersøgelse og tidligere resultater offentliggjort af Sarmento et al. [2], valgte vi 80 % FR for HTNT og en fortynding på 80 FFN. Ved disse cut-offs er diagnostisk specificitet højere for HTNT (97 %) sammenlignet med FFN (76 %) og giver en højere positiv prædiktiv værdi fra HTNT sammenlignet med FFN. Det skal også forstås, at prædiktive værdier er afhængige af forekomsten af ​​sygdom [25,26]. I denne undersøgelse, baseret på de klassificerede prøver, var prævalensen 32,1 % (36 positive og 76 negative prøver). Når prævalensen stiger, vil PPV også stige, fordi det testede dyr (prøven) er mere tilbøjelige til at være positivt; efterhånden som prævalensen falder, vil NPV falde. Figur 3A og B illustrerer dette for HTNT- og FFN-assays ved de forskellige cutoffs evalueret i denne undersøgelse efter metoder beskrevet af Erb [25]. Derfor bør man, når man overvejer diagnostiske resultater, overveje analysens diagnostiske sensitivitet og specificitet og forstå prævalensen inden for gruppen, hvis man bruger prædiktive værdier.

Figur 3. (A). Positive prædiktive værdier for HTNT (sorte linjer) og FFN (grå linjer) assays ved forskellige cutoffs. En cutoff på 90 er ikke repræsenteret for HTNT. (B). Negative prædiktive værdier eller HTNT (sorte linjer) og FFN (grå linjer) assays ved forskellige cutoffs. En cutoff på 20 er ikke repræsenteret for FFN-analysen.

HTNT har overlegen diagnostisk sensitivitet og specificitet sammenlignet med FFN. Når man analyserer antistofresultater, er dette ideelt til at minimere antallet af falsk positive og falsk negative resultater. For eksempel, når vi brugte en cutoff på 80 for FFN, observerede vi en sensitivitet på 97% og en specificitet på 76%. Det betyder, at der ville være få falske negative resultater, men der ville være et stort antal falske positive. Hvis resultaterne fejlagtigt kategoriseres som positive, kan dette føre til en fejlfortolkning af, at en besætning har antistoffer mod PEDV, mens de faktisk ikke har det. Da HTNT har højere diagnostik og specificiteter på tværs af forskellige cutoffs, er det det foretrukne assay til påvisning af PEDV-antistoffer. Resultater fra Sarmento et al. [2] viste meget højere diagnostiske specificiteter for FFN og sammenlignelige sensitiviteter og specificiteter for HTNT. Disse diagnostiske assays viste moderat overensstemmelse ifølge kappa-statistikken (K). En svaghed ved κ er, at en test skal betragtes som guldstandarden. Når man sammenligner to uperfekte analyser, kan dette skævvride fortolkningen af ​​κ. Til denne undersøgelse evaluerede vi den diagnostiske ydeevne af assayene i forbindelse med κ for at bestemme, at testen stemmer overens, men kan have forskellig nytte. En yderligere fordel ved HTNT i forhold til FFN-analysen er, at HTNT-resultaterne beregnes ud fra kontinuerlige data sammenlignet med de kategoriske værdier (titreringer) fra FFN. Den kontinuerlige karakter af HTNT-dataene giver mulighed for større skelnen mellem prøveresultater for at beskrive søernes neutraliserende antistofstatus. Som rapporteret af Sarmento et al. [2], HTNT har en kortere læsetid på en plade med 96 brønde til mindre end 4 minutter, hvilket giver mulighed for en hurtigere vending af resultaterne. Cirkulerende systemiske antistoffer kan bidrage til pattegrisebeskyttelse mod PEDV-infektioner [21]. Der er dog ingen litteratur om, hvilken mængde cirkulerende neutraliserende antistof i soen, der ville give pattegrise PEDV-beskyttelse. Høje niveauer af cirkulerende antistoffer fører til højere koncentrationer i råmælken og giver øget beskyttelse. Yderligere evaluering er berettiget for at bestemme en sammenhæng mellem, hvornår prøverne skal indsamles under graviditeten, og colostral antistofbeskyttelse mod PEDV-infektion. Laktogen og slimhindeimmunitet er af vital betydning for overlevelsesevnen hos grise, der er udsat for PEDV. Antistoffer samles i mælken via tarm-MG-sIGA-aksen og føres til pattegrise for at give beskyttelse. Langel et al. [27] fandt, at gylte eksponeret i andet trimester havde signifikant højere niveauer af cirkulerende IgA, IgG og neutraliserende antistoffer sammenlignet med gylte i første og tredje trimester. Derudover har Langel et al. [27] fandt, at pattegrise af gylte udsat for PEDV i andet trimester havde en overlevelsesrate på 100 % sammenlignet med mindre end 87,2 % i andre trimestre, hvilket tyder på, at højt serum IgA, IgG og neutraliserende antistoffer er forbundet med pattegriseoverlevelse i forhold til PEDV. Selvom serumantistoffer ikke giver beskyttelse mod PEDV, tyder resultater fra vores undersøgelse på, at serumneutraliserende antistofniveauer er forbundet med beskyttelse mod PEDV-infektion. Som tidligere rapporteret af Brown et al. [14], PEDV udskilles i fæces efter homolog udfordring og vaccination af gylte. Den nuværende undersøgelse brugte prøver fra de samme dyr som Brown et al. [14]. viser endvidere, at øget serumneutraliserende antistof efter belastningseksponering eller vaccination ikke påvirker virusudskillelsesmønsteret, da antistofniveauer steg efter belastning og vaccination. Yderligere undersøgelser er berettigede for at bekræfte, om mængden af ​​virus, der udskilles i fæces, er forbundet med mængden af ​​neutraliserende antistof, der er til stede i serumet [21].

cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet

5. Konklusioner

Nulhypotesen for denne undersøgelse var, at der ikke var nogen forskel i de diagnostiske karakteristika af to PEDV-neutraliserende antistofassays, FFN og HTNT. Resultater viser, at disse assays moderat stemmer overens baseret på kappa-statistikken, mens der er variation i deres diagnostiske karakteristika og prædiktive værdier baseret på cutoff for assayet. Disse assays kunne bruges til at måle vaccinationsresponset i en besætning. Manglende afvisning af nulhypotesen viser, at HTNT er den foretrukne test til påvisning af PEDV-neutraliserende antistoffer i serum. Efter vaccination i både PRE- og POST-gruppen fandt denne undersøgelse et flertal af resultaterne som positive. I PRE-gruppen fulgte nedsat variation blandt resultaterne også udfordringen. Disse resultater tyder på, at svineudøvere kunne måle serum-neutraliserende antistoffer for at afgøre, om PEDV-vacciner bliver administreret korrekt i besætningen.

Referencer

1. Saif, L.; Wang, Q.; Vlasova, A.; Jung, K.; Xiao, S. Coronaviruss. In Diseases of Swine, 11. udg.; Zimmerman, JJ, red.; Wiley Blackwell: Hoboken, NJ, USA, 2019.

2. Sarmento, LV; Poonsuk, K.; Tian, ​​L.; Mora-Diaz, JC; Main, RG; Baum, DH; Zimmerman, JJ; Gimenez-Lirola, LG Påvisning af porcin epidemisk diarrévirus-neutraliserende antistof ved hjælp af high-throughput billedbehandlingscytometri. J. Vet. Diagn. Undersøg. 2020, 32, 324-328. [CrossRef]

3. Stevenson, GW; Hoang, H.; Schwartz, KJ; Burrough, ER; Sun, D.; Madson, D.; Cooper, VL; Pillatzki, A.; Gauger, P.; Schmitt, BJ; et al. Fremkomsten af ​​porcin epidemisk diarrévirus i USA: Kliniske tegn, læsioner og virale genomiske sekvenser. J. Vet. Diagn. Undersøg. 2013, 25, 649-654. [CrossRef]

4. Kim, Y.; Yang, M.; Goyal, SM; Cheeran, MC; Torremorell, M. Evaluering af biosikkerhedsforanstaltninger for at forhindre indirekte overførsel af svinepidemi-diarrévirus. BMC dyrlæge. Res. 2017, 13, 89. [CrossRef]

5. Sang, DS; Åh, JS; Kang, BK; Yang, JS; Moon, HJ; Yoo, HS; Jang, YS; Park, BK Oral effekt af Vero-celle svækket svineepidemi diarrévirus DR13-stamme. Res. Dyrlæge. Sci. 2007, 82, 134-140. [CrossRef] [PubMed]

6. de Arriba, ML; Carvajal, A.; Pozo, J.; Rubio, P. Slimhinde- og systemisk isotype-specifikke antistofresponser og beskyttelse hos konventionelle grise udsat for virulent eller svækket svineepidemi-diarrévirus. Dyrlæge. Immunol. Immunopathol. 2002, 85, 85-97. [CrossRef] [PubMed]

7. Furukawa, S.; Kuroda, Y.; Sugiyama, A. En sammenligning af den histologiske struktur af placenta i forsøgsdyr. J. Toxicol. Pathol. 2014, 27, 11-18. [CrossRef] [PubMed]

8. Bourne, FJ; Curtis, J. Overførsel af immunglobiner IgG, IgA og IgM fra serum til råmælk og mælk i soen. Immunology 1973, 24, 157-162. [PubMed]

9. Parren, PW; Burton, DR Den antivirale aktivitet af antistoffer in vitro og in vivo. Adv. Immunol. 2001, 77, 195-262. [CrossRef]

10. Bjustrom-Kraft, J.; Woodard, K.; Gimenez-Lirola, L.; Rotolo, M.; Wang, C.; Sun, Y.; Lasley, P.; Zhang, J.; Baum, D.; Gauger, P.; et al. Porcin epidemisk diarrévirus (PEDV) påvisning og antistofrespons hos kommercielt voksende grise. BMC dyrlæge. Res. 2016, 12, 99. [CrossRef]

11. Åh, JS; Sang, DS; Yang, JS; Sang, JY; Moon, HJ; Kim, TY; Park, BK Sammenligning af et enzymbundet immunosorbent-assay med serumneutraliseringstest for serodiagnose af svinepidemi-diarrévirusinfektion. J. Vet. Sci. 2005, 6, 349-352. [CrossRef]

12. Okda, F.; Liu, X.; Singrey, A.; Clement, T.; Nelson, J.; Christopher-Hennings, J.; Nelson, EA; Lawson, S. Udvikling af en indirekte ELISA, blokerende ELISA, fluorescerende mikrosfære-immunoassay og fluorescerende fokusneutraliseringsanalyse til serologisk evaluering af eksponering for nordamerikanske stammer af porcin epidemisk diarrévirus. BMC dyrlæge. Res. 2015, 11, 180. [CrossRef] [PubMed]

13. Chen, Q.; Li, G.; Stasko, J.; Thomas, JT; Stensland, WR; Pillatzki, AE; Gauger, PC; Schwartz, KJ; Madson, D.; Yoon, KJ; et al. Isolering og karakterisering af svinepidemi-diarrévirus forbundet med sygdomsudbruddet i 2013 blandt svin i USA. J. Clin. Microbiol. 2014, 52, 234-243. [CrossRef]

14. Brown, J.; Rademacher, C.; Baker, S. Effektiviteten af ​​en kommerciel svineepidemi-diarrévirusvaccine til at reducere varigheden af ​​viral udskillelse hos gylte. JSHAP 2019, 27, 256-264.

15. Bjustrom-Kraft, J.; Woodard, K.; Giménez-Lirola, L. Serum- og brystsekretionsantistofresponser hos svinepidemi diarré-immune gylte efter vaccination mod svinepidemi diarré. JSHAP 2018, 26, 34-40.

16. Iowa State University. Procedure for Porcin Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) Fluorescent Focus Neutralization (FFN) test. Serologi 2017, 1–7.

17. Iowa State University. Procedure for Porcin Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) High-Throughput Virus Neutralization Test (HTNT). Serologi 2017, 1-16.

18. Hierholzer, JC; Killington, RA; Kangro, HO; Mahy, BWJ Virology Methods Manual; Academic Press: London, Storbritannien, 1996; s. 21.

19. Thrusfield, M. Veterinary Epidemiology, 2. udg.; Blackwell Science LTD: Hoboken, NJ, USA, 1995; s. 479.

20. Lee, C. Porcin epidemisk diarrévirus: En ny og genopstået epizootisk svinevirus. Virol. J. 2015, 12, 193. [CrossRef]

21. Poonsuk, K.; Gimenez-Lirola, LG; Zhang, J.; Arruda, P.; Chen, Q.; Correa da Silva Carrion, L.; Magtoto, R.; Pineyro, P.; Sarmento, L.; Wang, C.; et al. Spiller cirkulerende antistof en rolle i beskyttelsen af ​​smågrise mod svinepidemi-diarrévirus? PLoS ONE 2016, 11, e0153041. [CrossRef]

22. Niederwerder, MC; Nietfeld, JC; Bai, J.; Peddireddi, L.; Breazeale, B.; Anderson, J.; Kerrigan, MA; An, B.; Oberst, RD; Crawford, K.; et al. Vævslokalisering, udskillelse, virustransport, antistofrespons og aerosoltransmission af svinepidemi-diarrévirus efter podning af 4-ugegamle fodersvin. J. Vet. Diagn. Investere. 2016, 28, 671-678. [CrossRef]

23. Madson, DM; Arruda, PH; Magstadt, DR; Burrough, ER; Hoang, H.; Sun, D.; Bower, LP; Bhandari, M.; Gauger, PC; Stevenson, GW; et al. Karakterisering af svinepidemi-diarrévirus-isolater US/Iowa/18984/2013 Infektion i 1-daggamle kejsersnit-afledte råmælk-depriverede smågrise. Dyrlæge. Pathol. 2016, 53, 44-52. [CrossRef]

24. Mainau, E.; Manteca, X. Smerter og ubehag forårsaget af fødsel hos køer og søer. Appl. Anim. Opfør dig. Sci. 2011, 135, 241-251. [CrossRef]

25. Erb, HN Forudgående sandsynlighed (det bedste gæt på forhånd) påvirker prædiktive værdier af diagnostiske tests. Dyrlæge. Clin. Pathol. 2011, 40, 154-158. [CrossRef] [PubMed]

26. Tenny, S.; Hoffman, MR Prævalens. I StatPearls; StatPearls Publishing: Treasure Island, FL, USA, 2022. 27. Langel, SN; Paim, FC; Alhamo, MA; Buckley, A.; Van Geelen, A.; Lager, KM; Vlasova, AN; Saif, LJ Drægtighedsstadiet ved svinepidemi Diarré Virusinfektion hos gravide svin påvirker moderimmunitet og laktogen immunbeskyttelse af neonatale pattegrise. Foran. Immunol. 2019, 10, 727. [CrossRef] [PubMed]