Kombination af adoptiv NK-celle-infusion med et dopaminfrigivende peptid reducerer ældende celler i gamle mus

Venligst kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mere information

INTRODUKTION

Aldring er en af ​​de største risikofaktorer for mange sygdomme [1], og udviklingen af ​​metoder til at gribe ind over for aldring vil betydeligt reducere risikoen for en række aldersrelaterede sygdomme såsom hjerte-kar- og cerebrovaskulære sygdomme [2, 3], kræft. [4] og Alzheimers sygdom [5]. Ældrende celler (SNC'er) akkumuleres gradvist i væv under ældningsprocessen og betragtes som hovedårsagen til aldersrelaterede sygdomme [6-8]. Fjernelse af SNC'er i musemodeller har vist sig at forhindre eller forsinke vævsdysfunktion og forlænge sunde levetider [9, 10]. I modsætning hertil forårsager transplantation af små mængder SNC'er fysiologisk dysfunktion hos unge mus [1]. Disse undersøgelser har åbnet døre for udvikling af metoder, der målretter fjernelse af SNC'er for at lindre aldersrelaterede kroniske sygdomme.

Klik venligst her for at vide mere

Målretning af clearance af SNC'er, benævnt "senolytika" var den første kemoterapi, der med succes blev testet i en præklinisk in vivo-model, og der eksisterer i øjeblikket adskillige senolytiske midler [12]. Mange af disse lægemidler retter sig mod opregulerede anti-apoptotiske veje i SNC'er for selektivt at fjerne visse typer af SNC'er og har vist potentialet til at forlænge levetiden og forbedre kropsfunktioner [13, 14].Cistanche Extract Anti RadiationPå trods af den vellykkede vending af aldersrelateret patologi i dyremodeller kan der være nogle hindringer for at bruge senolytiske lægemidler hos mennesker på grund af heterogeniteten af ​​SNC'er og den høje risiko for toksicitet [15]. Derfor bør en alternativ metode, der sikkert kan eliminere en bred vifte af SNC'er hos mennesker, undersøges.

SNP'er kan genkendes og fjernes af immunsystemet [16]. Tidligere undersøgelser har vist, at SNC'er aktiverer naturlige dræberceller (NK) ved at opregulere den store histokompatibilitetsklasse I kæde-relaterede protein A- og B-aktiverende ligand [17]. Men med stigende alder falder immunsystemets effektivitet, hvilket kan føre til immunflugt fra SNC'er [18]. Metoder til at overvinde immunflugt forårsaget af nedsat immunfunktion er blevet undersøgt i cancerterapi [19]. For nylig er der gjort fremskridt med adoptiv overførsel af NK-celler for at eliminere tumorer, hvilket har vist en vis effektivitet [20]; således var det rimeligt at antage, at den adoptive infusion af NK-celler kunne producere cytotoksicitet i SNC'er.

Nerve- og immunsystemet er de to vigtigste adaptive systemer i kroppen. Adskillige undersøgelser har vist, at dopamin (DA) som immunregulator er en nøgle til neuroimmun kommunikation [21]. DA udfører sine biologiske funktioner ved interaktion med og aktivering af dopaminreceptorer (DR), som er opdelt i 2 undergrupper, D1-lignende (D1 og D5) og D2-lignende (D2, D3, og D4). Med hensyn til deres forskellige funktioner stimulerer engagementet af D1-lignende DR cAMP-produktion, mens engagementet af D2-lignende DR hæmmer cAMP-produktionen [22]. Tidligere undersøgelser har vist, at D1-lignende DR-stimulering øger cytotoksiciteten af ​​NK-celler både in vitro [23] og in vivo [24]. DA-niveauer falder dog, når menneskets alder stiger [25]. Således antog vi, at dopaminerge lægemidler kunne øge cytotoksiciteten af ​​den adoptive infusion af NK-celler.

Cistanche kan anti-aging

Her foreslår vi brugen af ​​nonapeptidet Acein, som interagerede med et angiotensin-konverterende enzym (ACE I) for at inducere DA-sekretion [26], i kombination med systemisk NK-celleterapi for at eliminere SNC'er. In vitro-resultater viste, at NK-celler fjernede SNC'er, uafhængigt af senescens-inducere og celletyper.cistanche herbaI en aldrende musemodel reducerede NK-celleterapi i kombination med Acein signifikant antallet af senescens-associerede -galactosidase (SA- -gal)-positive celler i flere væv, reducerede ekspressionen af ​​senescens-associerede gener i større organer og lindrede senescens-associerede sekretoriske fænotyper (SSP'er). Resultaterne af denne undersøgelse giver indsigt i den mulige genoprettelse af immunovervågningen af ​​kroniske SNC'er ved hjælp af NK-celleterapi i kombination med Ace.

RESULTATER

Adoptiv infusion af NK-celler reducerer senescent CD3 plus T-celler i perifert blod

Seksogtyve frivillige, der modtog NK-celleinfusion, blev rekrutteret til undersøgelsen. Karakteristikaene og NK-celleegenskaberne for de frivillige er vist i tabel 1. Tidsintervallet for blodopsamling efter NK-celletransfusion var ca. 37(25-57) dage. Andelen (fig. 1A) og det absolutte antal (fig. 1B) af NK-celler i det perifere blod var omvendt relateret til de frivilliges alder. Overraskende nok var renheden af ​​NK-celleproduktet reinfunderet i hvert individ også omvendt korreleret med de frivilliges alder (fig. 1C).cistanche penis vækstDette kan skyldes det gradvist faldende antal NK-celler med stigende alder. For at afspejle anti-aldringseffekten af ​​NK-celleadministration, blev der detekteret flere ældningsmarkører i CD3 plus T-celler i perifert blod, som stort set afspejler den aldersrelaterede fænotype af kroppen [27], før og efter NK-celleinfusion. Sammenlignet med senescensmarkørerne og SASP-faktoren for CD3 plus T-celler i perifert blod før og efter autolog NK-celleinfusion, var andelen af ​​SA- -gal-positive T-celler signifikant reduceret efter infusion (fig. 1D). mRNA-niveauerne af P16, P21 og plasminogenaktivatorhæmmer 1(Pai1) var signifikant faldet, mens ændringerne i mRNA-niveauer af monocytkemoattraktant protein-1 (MCP-1) og IL-6 var ikke signifikante (fig. 1E). Der var ingen signifikant forskel i de biokemiske indekser (Supplerende tabel 1) i det perifere blod.

Humane NK-celler reducerer fedtvævets senescensmarkører og sekretion af proinflammatoriske cytokiner

Fedtvæv blev indsamlet fra tre overvægtige individer, da fedme har tendens til at forårsage en ophobning af SNC'er [28]. Derudover blev fedtvævet dyrket i et konditioneret medium fra SNC'er for yderligere at inducere ældning af fedtvæv. Fedtvæv dyrket i et konditioneret medium fra ikke-SNC'er blev betragtet som kontrollen. Perforin (Fig. 2A) og CD69 (Fig. 2B) ekspression i NK-celler var signifikant opreguleret efter co-inkubation med senescent fedtvæv sammenlignet med co-inkubation med kontrol fedtvæv. Udtrykket af senescent markører p16 og p21 in

senescent fedtvæv blev signifikant reduceret efter NK-cellebehandling (Fig.2C, Supplerende Fig.1A,B). Vi fandt også, at nøglekomponenten af ​​SASP i det konditionerede medium efter co-inkubation med NK-celler i den senescerende gruppe var signifikant reduceret (fig. 2D). Disse resultater antydede, at NK-celler kunne eliminere SNC'er fra fedtvæv og reducere SASP-fænotypen.

Muse NK-celler kan aktiveres mod SNC'er og udøve cytotoksicitet

Vi inducerede først senescensen af ​​muse-fedtstamceller ved bestråling eller Adriamycin som tidligere beskrevet [29]. For at bestemme, om NK-celler blev specifikt aktiveret af SNC'er, blev ikke-bestrålede kontrolceller eller bestrålede SNC'er co-inkuberet med NK-celler i 24 timer. Flowcytometri viste, at ekspressionsniveauerne af CD69 (fig. 3A) og IFN-y (fig. 3B) i NK-celler var signifikant opreguleret i SNC-målceller sammenlignet med kontrolmålceller. I mellemtiden, efter co-inkubation med NK-celler, var det apoptotiske niveau af SNC'er signifikant højere end for kontrolceller (fig. 3C). Dernæst detekterede vi ekspressionen af ​​NK-celleaktiverende og inhiberende ligander i SNC'erne. qPCR-resultaterne viste, at ekspressionsniveauet af aktiverende ligander i NK-celler var signifikant opreguleret sammenlignet med kontrolceller, og ekspressionsniveauet af nogle inhiberende ligander, såsom beta 2 mikroglobulin (2m), var nedreguleret sammenlignet med kontrolceller (fig. .3D). Vi har også undersøgt NK-cellers evne til at eliminere SNC'er in vivo.cistanche salsa fordeleDiR-mærkede kontrolceller og DiR-mærkede SNC'er blev transplanteret ind i bughulen hos mus, og NK-celler blev administreret gennem halevenen. In vivo billeddannelsesresultater viste, at fluorescensintensiteten i mus transplanteret med SNC'er efter NK-cellebehandling var signifikant svagere end hos mus transplanteret med kontrolceller (fig. 3E). Dette indikerede, at NK-cellers evne til at dræbe SNC'er var signifikant højere end SNC'ers in vivo. Dernæst bestemte vi, om cytotoksiciteten af ​​NK-celler mod SNC'er var dosisafhængig og cellespecifik. Samtidig brugte vi også doxorubicin-induceret senescens til at bestemme, om cytotoksiciteten af ​​NK-celler mod SNC'er var begrænset til strålingsinduktion. Resultaterne viste, at NK-celler havde signifikant cytotoksisk aktivitet mod SNC'er på en dosisafhængig måde, men lille cytotoksicitet mod kontrolceller. Forskellige senescensstimuleringsmetoder havde ingen effekt på NK-cellers evne til at dræbe SNC'er (fig. 3F). Disse resultater antydede, at NK-celler kunne aktiveres specifikt af SNC'er og producere signifikant cytotoksicitet mod SNC'er in vitro og in vivo.

DA øger cytotoksiciteten af ​​muse NK-celler mod SNC'er gennem D1-lignende receptorer

I lyset af den vigtige neuroimmune kommunikationsfunktion af DA [30] vurderede vi, om DA kunne forbedre cytotoksiciteten af ​​muse-NK-celler mod SNC'er. NK-celler blev co-inkuberet med strålingsinducerede SNC'er, og forskellige koncentrationer af DA blev tilsat til mediet. Resultaterne viste, at DA kunne øge cytotoksiciteten af ​​NK-celler mod SNC'er (fig. 4A, B). For at karakterisere signalvejen, hvorved DA øgede drabseffekten af ​​NK-celler på SNC'er, blev ændringerne i DR-ekspression, cAMP-indhold og cAMP-responselementbindende protein (CREB)-phosphorylering i NK-celler evalueret. I NK-celler co-inkuberet med SNC'er sammen med DA var indholdet af cAMP (fig. 4C) og phosphoryleringsniveauet af CREB (fig. 4D, supplerende fig. 2A) signifikant forøget sammenlignet med NK-celler og SNC co-inkubation uden DA. For at afklare, hvorfor DA øger drabsaktiviteten af ​​NK-celler mod SNC'er, sammenlignede vi ændringerne af DR på NK-celler, efter at NK-celler blev co-inkuberet med SNC'er eller kontrolceller. Resultaterne viste, at D1- og D5-DR-ekspressionsniveauet var signifikant opreguleret, efter at NK-celler var co-inkuberet med SNC'er sammenlignet med kontrolceller (fig. 4E). Dernæst DA og D1-lignende receptorantagonister eller D2-lignende

receptorantagonister blev tilføjet sammen i co-inkubationssystemet af NK-celler og SNC'er. Sammenlignet med tilsætningen af ​​DA alene blev apoptoseniveauet af SNC'er reduceret ved tilsætning af DA plus SCH-23300(D1-lignende receptorantagonist) (fig. 4F, G). I mellemtiden blev cAMP-indholdet (fig. 4H) og phosphoryleringsniveauet af CREB (fig. 4l, supplerende fig. 2B) i NK-celler nedreguleret. I modsætning hertil ændrede tilføjelsen af ​​DA plus haloperidol (D2-receptorantagonist) ikke signifikant apoptoseniveauet af SNC'er, cAMP-indholdet og CREB-phosphoryleringen i NK-celler sammenlignet med tilsætningen af ​​DA alene. Disse resultater viste, at DA øgede dræbende aktivitet af muse NK-celler mod SNC'er gennem D1-som Dr.

Ace kombineret med muse-NK-celler forbedrer signifikant clearance af SNC'er in vivo

En tidligere undersøgelse har vist, at dopamin falder med alderen hos mennesker [22]. Vi målte først det perifere dopaminniveau i unge og gamle mus. Resultaterne indikerede, at plasmadopaminniveauerne hos de gamle mus var lavere end hos de unge mus (fig. 5A). Dernæst blev perifer dopaminfrigivelse efter intraperitoneal injektion af Acein undersøgt i gamle mus. Vi fandt, at plasmadopaminniveauer steg signifikant efter en 10 mg/kg Acein-injektion (fig. 5B, supplerende fig. 3). I lyset af dette udførte vi muse-NK-celler kombineret med Acein for at behandle gamle mus. Vi påviste status for NK-celler i det perifere blod hos mus efter behandling og fandt ud af, at antallet af NK-celler i det perifere blod ved infusion af NK-celler alene eller NK-celler kombineret med Acein var signifikant højere end antallet af NK-celler i den Ace-behandlede gruppe og PBS-gruppen, hvorimod antallet af NK-celler ikke var signifikant forskelligt mellem den NK-cellebehandlede gruppe og NK-cellerne kombineret med den Acein-behandlede gruppe (fig. 5C, D).cistanche tubulosa dosering redditYderligere påvisning af aktiveringsniveauet af NK-celler viste, at ekspressionsniveauet af CD69 i NK-celler fra perifert blod i den kombinerede behandlede gruppe var signifikant opreguleret sammenlignet med den NK-cellebehandlede gruppe (fig. 5E). Dernæst evaluerede vi SNC'erne i vævet. Vi fandt, at infusion af NK-celler alene reducerede ekspressionen af ​​nogle senescerende markører sammenlignet med PBS-gruppen og den Acein-behandlede gruppe, hvorimod infusion af NK-celler kombineret med Acein signifikant reducerede de SA- -gal-positive celler (fig. 5F) ) såvel som ekspressionsniveauerne af P16 og P21 (Fig. 5G, Supplerende Fig. 4A, B) i fedtvævet sammenlignet med behandlingen af ​​NK-celler alene. Antallet af Ki67BrdU-celler i fedtvævet blev også signifikant forøget (fig. 5H), hvilket yderligere beviser, at indholdet af SNC'er i fedtvævet var lavere i den kombinerede behandlede gruppe. SA- -gal-farvning af lever-, lunge-, nyre- og fedtsektioner viste også det laveste niveau af SNC'er i den kombinerede behandlede gruppe (Supplerende Fig. 5A-D). Disse resultater viste, at NK-celler kombineret med Acein-terapi øgede aktiveringsniveauet af NK-celler i mus og forårsagede signifikant eliminering af SNC'er in vivo.

Ace kombineret med NK-celler reducerer aldersrelaterede fænotyper i gamle mus

For yderligere at bekræfte aldersrelaterede fænotyper i mus, blev lever-, lunge-, nyre-, fedt- og øjenvæv indsamlet for at påvise en række ældningsmarkører, herunder P16-, P21- og SASP-faktorer. Disse prøver blev valgt, fordi disse væv er mere tilbøjelige til at gennemgå ældning med alderen [31]. I hvert væv, efter NK-celleinfusion alene, var mRNA-niveauerne af P16-, P21- og SASP-faktorer signifikant lavere end dem i kontrolgruppen, hvorimod niveauerne af alderdomsmarkører i lever-, fedt- og eve-væv i de kombinerede behandlede gruppen blev yderligere reduceret sammenlignet med gruppen behandlet med NK-celleinfusion alene (fig. 6A). Tilsvarende har vi også detekteret den vigtigste SASP-faktor i serum fra mus, og resultaterne var i overensstemmelse med resultaterne i væv (fig. 6B). Derudover har vi også undersøgt NAD-niveauer i leveren og fedtvævet, som er forbundet med aldring [32]. Vi fandt, at infusion af NK-celler alene eller i kombinationsterapi signifikant øgede indholdet af NAD i leveren og fedtvævet, idet forbedringsniveauet var signifikant højere i den kombinerede terapigruppe (Fig. 6C). Nogle biokemiske serumindekser inklusive ALT, AST, CREA, UA, CHOL og BUN er forbundet med ældningsniveauer [33]. Vi har fundet ud af, at kun UA var signifikant reduceret i serum fra mus i den kombinationsbehandlede gruppe, mens de andre biokemiske nøgleindekser ikke

MATERIALE OG METODER Infusion af humane NK-celler

Autolog NK-celleinfusion blev udført af Shanghai Mengchao Cancer Hospital (Shanghai, Kina), og alle protokoller blev godkendt af deres etiske udvalg (nr. 05,2020, Medical Ethics Committee of Shanghai Mengchao Cancer Hospital). Alle frivillige gav underskrevet informeret samtykke til at få perifert blod. Kort fortalt blev 50 ml perifert blod ekstraheret fra hvert individ, hvorefter perifert blod mononukleære celler (PBMC'er) blev isoleret og overført til en T75-kolbe med ExCellerate" Human NK Cell Expansion Media (R&D Systems, USA) indeholdende 1×Cloudz CD2/NKp46 , Rekombinant Human IL-2(27ng/mL), rekombinant Human L-12 (10 ng/ml), rekombinant Human IL-18 (10 ng/ml og rekombinant Human L{{ 13}}(10 ng/mL)(R&D Systems, USA) i 48 timer og derefter erstattet med aktiveret medium (270 ng/mL rekombinant humant IL-2, 20 ng/ml rekombinant humant IL-12 20 ng/ml rekombinant human IL-18 og 20 ng/ml rekombinant human IL-21) til yderligere dyrkning. Celletætheden blev holdt på 1×10 grader celler/ml. På dag 28 af dyrkning , blev et lille antal autologe NK-celler opsamlet til kvalitetskontrol og intravenøst ​​reinjiceret sammen med autologe NK-celler ved en tæthed på 4,15×10 grader (3.76-5.87×10) celler med en infusionstid på 30 min. Den eksperimentelle proces blev udført i overensstemmelse nce med god klinisk praksis. Tidsintervallet for den anden blodprøvetagning var omkring 37 (25-57) dage.

Isolering af humane perifere blod-T-celler og NK-celler. Frisk blod blev opnået fra raske frivillige efter at have givet informeret samtykke, og protokollen blev godkendt af det institutionelle revisionsudvalg ved China Pharmaceutical University (tilladelsesnummer: SYXK2016-0011). Lymphoprep (STEMCELL Technologies, Canada) blev brugt til at isolere humane PBMC'er. Humane CD3 plus T-celler blev opnået fra PBMC'er under anvendelse af humane CD3 T-celle sorterende magnetiske perler (Miltenyi Biotec, Tyskland) i overensstemmelse med producentens protokol. NK-celler blev isoleret fra perifert blod under anvendelse af RosetteSep" Human NK Cell Enrichment Cocktail (STEMCELL Technologies) i henhold til producentens protokol

Adskillelse og udvidelse af muse NK-celler in vitro

NK-celler fra musemilt blev isoleret under anvendelse af NK Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev musemilte opnået, miltceller blev filtreret ved hjælp af et 70μm cellefilter, og miltlymfocytter blev opnået ved tæthedsgradientcentrifugering ved hjælp af et musemiltlymfocytseparationskit (Solarbio, Kina). Miltlymfocytterne blev opsamlet for at opnå NK-celler med høj renhed under anvendelse af magnetiske perler til at adskille muse-NK-celler. De isolerede milt-NK-celler blev dyrket i et vedligeholdelses-RPMI-1640-medium suppleret med 10 procent føtalt bovint serum (FBS), 1 procent L-glutamin, 1 procent penicillin/streptomycin, 1 procent minimalt essentielt medium (MEM) non- essentiel aminosyre, 1 procent natriumpyruvatsyre og 50 uM mercaptoethanol (alle fra Life Technologies, USA). Derudover blev 200 IE/mL rekombinant interleukin 2 (RL-2)(PeproTech, USA) og 10 ng/mL mus I-15(ml-15)(PeproTech) føjet til medium. Derefter blev 10 graders NK-celler og 10 graders bestrålede miltlymfocytter opsamlet, og 5 ml amplifikationsmedium (vedligeholdelsesmedium suppleret med 1000 IE/mL rlL-2, 10ng/mL ml-15 og 30ng/mL anti -NKp46-antistof (PA5-46986, Invitrogen, USA)) var

Fig. 3 SNC'er aktiverer NK-celler og blev dræbt af NK-celler. Flowcytometri for at påvise ekspressionen af ​​(A) CD69 og (B) IFN-y blev udført efter en 24 timers co-inkubation med muse NK-celler og præadipocytter eller bestrålingsinducerede præadipocytter. n =3. Data præsenteres som middel±SD. Forskelle blev vurderet ved den tosidede uparrede ikke-parametriske t-test. **P<0.01.c snc="" apoptosis="" was="" detected="" after="" a="" 24-h="" co-incubation="" with="" dir-labeled="" nk="" cells="" by="" flow="" cytometry.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="" test.=""><0.01.d activating="" ligands="" and="" inhibitory="" ligands="" of="" nk="" cells="" on="" preadipocytes,="" doxorubicin-induced="" preadipocytes,="" or="" irradiation-induced="" preadipocytes="" were="" measured="" by="" pcr.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means="" ±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" one-way="" anova="">< 0.05(irradiation="" vs=""><0.05(doxorubicin vs="" con).e="" 1×="" 10°dir-labeled="" control="" preadipocytes="" or="" irradiation-induced="" senescent="" preadipocytes="" were="" implanted="" into="" the="" abdominal="" cavity.="" representative="" images="" showing="" fluorescence="" activity="" in="" mice="" seven="" days="" after="" 5×="" 10°nk="" cell="" treatment.="" quantification="" of="" fluorescence="" activity.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova=""><><0.0001.f quantification="" of="" cytotoxicity="" of="" non-senescent="" and="" senescent="" counterparts="" induced="" by="" irradiation="" or="" adriamycin="" incubated="" with="" increasing="" nk="" cells="" for="" 24="" h.="" n="3.Data" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="">< 0.01,=""><><0.0001. two="" parallel="" samples="" were="" set="" in="" each="" experiment="" and="" three="" independent="" experiments="" were="" performed="" for="" each="" result.="" added="" to="" a="" t25="" flask.="" every="" three="" days,="" 1000="" iu/ml="" rll-2="" was="" added="" and="" a="" fresh="" amplification="" medium="" was="" added="" on="" the="" 9th="" day="" to="" maintain="" the="" cell="" density="" at="" 1×10°cells/ml.="" nk="" cells="" were="" collected="" on="" the="" 20th="" day,="" and="" nk="" cells="" were="" amplified="" 50-fold.="" then="" the="" purity="" of="" the="" nk="" cells="" was="" determined="" by="" flow="">

Ekstraktion af præadipocytter og muskelsatellitceller

Præadipocytterne blev ekstraheret som tidligere beskrevet [11]. Kort fortalt blev menneske- eller musefedt fjernet under sterile forhold og skåret i 1-2 mm stykker, vasket to gange med PBS og fordøjet med collagenase ll (Solarbio) ved 37 grader i 1 time. Derefter blev celler filtreret med et 100 μm cellefilter, centrifugeret ved 300 g i 5 minutter og opsamlet. De adhærente celler blev dyrket i a-MEM suppleret med 20 procent FBS i 12 timer og fordøjet med trypsin for at opsamle adhærente celler. Muskelsatellitcellerne blev isoleret som tidligere beskrevet [34]. Quadriceps-musklen blev skåret i 1-2 mm stykker, og 5 ml collagenase ll blev tilsat til fordøjelse ved 37 grader C i 12 min. Blandingen blev blandet med en pipette, og et 5 ml komplet medium blev tilsat efter yderligere fordøjelse i 12 min. Cellerne blev filtreret ved hjælp af et 70 μm cellefilter og centrifugeret ved 300 g i 5 min. Så var celler

dyrket med 5 ml medium tilsat dagligt i 4 dage. De vedhæftede celler blev blæst væk med en pipette og centrifugeret ved 2000 xg i 5 min. Efter trypsinfordøjelse ved 37 grader i 5 minutter blev cellerne centrifugeret ved 2000 xg i 5 minutter og opsamlet. Derefter blev 5 ml F-10 skinkemedium suppleret med 20 procent FBS og 4 ng/ml basisk fibroblastvækstfaktor (PeproTech) tilsat.

Cytotoksicitet af NK-celler fra musemilt til SNC'er blev påvist ved lactatdehydrogenase-assayet

SNC'erne blev induceret af 0.2 μM Adriamycin (MedChemExpress, USA) i 24 timer eller ved fortsat dyrkning i 20 dage efter 10 Gy røntgenstråling. Derefter blev 5000 SNC'er anbragt i en plade, og milt-NK-celler (cellelevedygtighed: 93.5-97.1 procent) blev tilsat ved effektor-til-mål-forhold på 50:1,25:1,12,5:1, 6,25: 1,3.125:1 og 1.563:1. Supernatanterne blev opsamlet efter samdyrkning ved 37 grader C i 24 timer, og et lactatdehydrogenase (LDH) Cytotoksicitetsdetektionskit (Cayman Chemical, USA) blev brugt til påvisning. Cytotoksicitet blev beregnet ved følgende formel: cytotoksicitet (procent)=(blandingscelleeksperiment-målcelle spontan-effektorcelle spontan)/(målcelle maksimum-målcelle spontan)× 100.

Live billeddannelse

Tolv 10-uge gamle C57BL/6-mus blev købt fra Changzhou Cavens Laboratory Animal Co, Ltd. (Jiangsu, Kina). Derefter 1×10 grader 1,1'-octadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanin iodid (DiR) (Invitrogen)-mærket kontrol

præadipocytter eller strålingsinducerede senescerende præadipocytter blev resuspenderet i 200 µl phosphatpufret saltvand (PBS) og injiceret i mavehulen på mus med en 22 gauge nål. Efter tre dage blev 5×10 graders allogene NK-celler (cellelevedygtighed: 93.6-96.2 procent) i 100 uL PBS injiceret gennem halevenen. På den 10. dag blev musene bedøvet med isofluran. Fluorescens blev påvist under anvendelse af MS 100 Series In Vivo Imaging System (PerkinElmer, MA, USA).

Flowcytometri

For at påvise apoptosen af ​​SNC'er co-inkuberet med DiR-mærkede milt-NK-celler (cellelevedygtighed: 91.8-93.2 procent), blev 1×10 graders SNC'er fordøjet med nøjagtighed ved 37 grader i 10 minutter og derefter farvet med et Annexin V og Propidium iodide (PI) Apoptosis Staining Kit (Multisciences Biotech Co, Ltd., Kina) i henhold til producentens protokol. SNC'er blev lukket i den DiR-negative position. For at teste aktiveringen af ​​NK-celler blev muse-NK-celler opsamlet og farvet med mNK1.1-allophycocyanin (APC)(S17016D) og med museklynge af differentiering 69-R-phycoerythrin-cyanine7 (mCD{{ 17}}PE-Cy7)(H1.2F3)(Biolegend, USA) ved 4 grader i 30 min. Derefter blev celler behandlet med CytodexCytoperm Plus Kit (BD Biosciences, USA) og farvet med muse interferon gamma-brilliant violet 421 (mlFNy-BV421) (XMG1.2) ved 4 grader i 30 min. Perforin-APC(S16009A)-farvning af humane NK-celler blev udført under anvendelse af den samme protokol som den, der blev brugt til ekstracellulær farvning (CD56-fluorescein-isothiocyanat [FITC](5.1H11), CD69-PE(FN50) ) og intracellulær farvning (perforin-APC) (Biolegend).

For at påvise NK-celler fra perifert blod blev der opsamlet 100 uL antikoagulerende blod. For perifert museblod blev CD3-FITC, NK1.1-APC og CD69-PE-Cy7 tilføjet. For humant perifert blod blev CD3-BV421 (OKT3) og CD56-FITC tilsat og inkuberet i 20 minutter ved stuetemperatur.

Derefter blev 400 μL 1 x erytrocytlysat (BD Biosciences) tilsat og inkuberet i 3 minutter efterfulgt af tre vask med PBS. For at påvise celleproliferation i fedtvæv blev musene intraperitonealt injiceret med 200 μL 10 mg/ml bromodeoxyuridin (BrdU) 24 og 72 timer før eutanasi. Efter eutanasi blev lyskefedtdepoterne fjernet og skåret i fragmenter, fordøjet ved 37°C i 30 minutter med collagenase II og DNase og filtreret ved anvendelse af et 100 um cellefilter. Celler blev behandlet med Cytofix/Cytoperm Plus-kittet og farvet med BrdU-FITC (3D4) og Ki67-PE (16A8). Flowcytometri blev udført på et CytoFLEX flowcytometer. LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit (Thermo Fisher Scientific, USA) blev brugt til at udelukke døde celler i alle eksperimenter. Data blev analyseret ved hjælp af FlowJo-software (FlowJo LLC, Ashland, OR, USA).

Omvendt transkription-kvantitativ PCR

RNA blev ekstraheret under anvendelse af Trizol-reagens og reverseret og transskriberet til cDNA under anvendelse af Hair 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Yepsen Biotechnology, Kina). Kvantitativ PCR (qPCR) blev udført ved hjælp af reaktionsblandingen af ​​SYBR Green (Yepsen Biotechnology) på ABC QuantStudio 3 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA), med GAPDH fungerende som en intern kontrol. Data blev analyseret ved hjælp af 2-△ACt-metoden. Listen over primersekvenser er rapporteret i Supplerende materiale (tabel 2-3).

Ældre-associeret -galactosidase-farvning

Til cellefarvning blev cellerne vasket én gang med PBS, fikseret i alderdomsassocieret -galactosidase(SA- -gal) opløsning (Cell Signaling Technology, USA) ved stuetemperatur i 15 minutter, vasket tre gange med PBS og inkuberet natten over i SA- -gal farvningsopløsning ved 37 grader C. Pladen blev forseglet med parafilm for at forhindre fordampning af farvningsmediet. Celler

blev vasket med PBS og observeret med et mikroskop. Til farvning af frosne sektioner blev sektionerne tørret ved 37 grader i 30min. og fikseret ved stuetemperatur i SA- -gal fikseringsopløsning i 15 min. Sektionerne blev vasket tre gange med PBS og inkuberet natten over i SA- -gal-farvningsopløsning ved 37 grader C. Derefter blev de farvet med eosin i 1 minut og skyllet med vand i 2 minutter. SA- -gal-farvningsdata blev analyseret ved hjælp af Image-Pro Plus 6.0-software.

Eksplantater af menneskeligt fedtvæv

Fedtvæv fra tre individer blev opnået ved fedtsugning. En af forsøgspersonerne var en mand, og to var kvinder. Gennemsnitsalderen for forsøgspersonerne var 57.0±7,6 år (gennemsnit±SD: interval, 50-65). Gennemsnitlig BMI var 40,5±5,1 kg/m² (gennemsnit ± SD; interval, 36.7-46.2）. Den etiske komité på Shanghai Mengchao Cancer Hospital (nr. 05, 2020, Medical Ethics Committee of Shanghai Mengchao Cancer Hospital) godkendte forsøgsordningen. Der blev indhentet informeret samtykke for alle frivillige. Fedtvæv blev skåret i små stykker med en diameter på ca. 2 mm. Fem stykker væv blev anbragt i hver brønd på en 96-brøndsplade, og 200 µl af enten præadipocytter eller konditioneret medium fra strålingsinducerede senescent præadipocytter, suppleret med 10 procent humant AB-serum, 1 procent L-glutamin, 1 procent penicillin/streptomycin, 1 procent MEM ikke-essentielle aminosyrer og 1 procent natriumpyruvatsyre blev tilsat til co-kulturen i 24 timer. Derefter blev mediet erstattet med et frisk medium indeholdende 5×10 graders autologe NK-celler (cellelevedygtighed: 92. 3-95,7 procent 6) og dyrket i yderligere 48 timer, hvorefter NK-celler blev opsamlet til flowcytometri. Fedtvævet blev vasket fem gange med PBS, og det samme medium blev tilsat til en yderligere kultur i 48 timer; supernatanten (100 µl) blev anvendt til multi-faktor detektion. Præadipocytter eller strålingsinducerede senescerende præadipocytter blev afledt af fedtvævet fra det samme individ.

Denne artikel er uddraget af Celledød og sygdom (2022) 13:305