Netværksfarmakologi og eksperimentel validering afslører Cistanche-phenylethanoidglykosiders mekanistiske rolle i behandlingen af NAFLD via TNF/PI3K/Akt Pathway
Oct 29, 2025
3. Resultater
3.1 Netværksfarmakologi
3.1.1 Aktive forbindelser og potentielle mål
Baseret på tidligere forskning fra projektgruppen og information fra databaser og litteratur blev ti repræsentative forbindelser med farmakologisk aktivitet udvalgt [10-11]:verbascosid, isoverbascosid, echinacosid, 2'-acetyl-verbascosid, cistanosid A, cistanosid B, salidrosid, isocrenatosid II, cistanche glycosid A og cistanche glycosid F.
Højt indhold af Verbascoside(acteosid) Cistanche-ekstrakt til blodlipidbehandling
Specifikationsliste for Cistanche-ekstrakt
BrugerSwissTargetPrediction44 mål blev opnået;NetInferforudsagde de 20 bedste mål, hvilket gav 45 mål;SuperPredgav 118 mål. Efter at have flettet og fjernet dubletter,195 unikke målblev identificeret.
FraGSE89632datasæt, som omfattede 39 NAFLD prøver og 24 normale prøver,589 differentielt udtrykte generblev screenet. Kombinere data fraGeneCardsogDisGeNET, 2.315 NAFLD-relaterede sygdomsgenerblev opnået efter deduplikation (figur 1A-1B). Ved at krydse forbindelsesrelaterede mål med sygdomsmål,77 overlappende målblev identificeret som potentielle terapeutiske mål for Cistanche phenylethanoid glycosider mod NAFLD (figur 1C).
Disse mål blev importeret tilSNOR database with an interaction threshold >0,400. Isolerede noder blev fjernet, og netværket blev visualiseret viaCytoscape, hvilket resulterer i enPPI-netværk med 75 noder og 408 kanter(Figur 1D). Ved at bruge funktionen "Analyze Network" i Cytoscape blev de 10 bedste mål baseret på gradværdi identificeret som kernemål:TNF, NFKB1, TLR4, HSP90AA1, ESR1, HIF1A, STAT1, APP, PRKACA, SMAD3.
3.1.2 GO, KEGG og DO berigelsesanalyser
GO berigelsesanalyse afslørede 93 vilkår formolekylær funktion (MF), 38 forcellulær komponent (CC)og 989 forbiologisk proces (BP). De 10 bedste poster i hver kategori blev visualiseret (figur 2). Resultaterne indikerede, at Cistanche phenylethanoid glycosider kan udøve anti-NAFLD virkninger gennem veje relateret tilinflammation, cytokiner, stofskifte og immunrespons.
DO berigelse identificeret833 sygdommeforbundet med målene, med de øverste 25 visualiseret (figur 4), herundermetaboliske, immun-, kardiovaskulære, fedme-relaterede og leversygdomme, alle tæt knyttet til NAFLD.
3.1.3 "Compound–Target–Pathway" netværk
Baseret på KEGG berigelse resultater, en"compound–target–pathway" netværkblev bygget vhaCytoscape 3.9.1. Grønne firkanter repræsenterer aktive forbindelser, blå cirkler repræsenterer mål, og orange V-formede noder repræsenterer veje (figur 5). Dette illustrerer, at Cistanche phenylethanoid glycosider udøver anti-NAFLD virkninger gennemflere forbindelser, mål og veje, medechinacoside og verbascosideer de mest udbredte og listede markørforbindelser i 2020-udgaven afKinesisk farmakopé.
3.1.4 Molekylær docking
De fem øverste kernemål i PPI-netværket (TNF, NFKB1, TLR4, HSP90AA1, ESR1) blev docket med de aktive forbindelser, og deres minimale bindingsenergier blev beregnet (figur 6). Alle docking-score var mindre end–6 kcal/mol, hvilket indikerer stærke bindingsaffiniteter.TNF udviste den stærkeste affinitet. Nogle docking-resultater blev visualiseret vhaPyMOL(Figur 7).
3.2 Celleeksperimenter
3.2.1 Effekter af FFA på lipidakkumulation i HepG2-celler
Som vist iFigur 8, førte stigende FFA-koncentrationer fra 0,5 til 2 mmol/L til en stigning i røde lipiddråber, som smeltede sammen til store lipiddråber, hvilket indikerer vellykket lipidladning.
3.2.2 Virkninger af FFA og Cistanche Phenylethanoid Glycosider på cellelevedygtighed
Som vist iFigur 9A, FFA koncentrationer af1 mmol/L og derunderhavde ingen signifikant effekt på cellelevedygtighed (P > 0,05); således,1 mmol/Lblev valgt til modellering. Som vist iFigur 9B, Cistanche phenylethanoid glycosider op til200 μg/mlpåvirkede ikke levedygtigheden signifikant (P > 0,05), men400 μg/mlsignifikant hæmmet levedygtighed (P < 0,01). Derfor,25, 50 og 100 μg/mlblev udvalgt som lave, mellemstore og høje doser til behandling.
3.2.3 Effekter på lipidakkumulation
Som vist iFigur 10, udviste modelgruppen signifikant akkumulering af røde lipiddråber sammenlignet med kontrolgruppen (P < 0,01), hvilket bekræfter vellykket modellering. Behandling med50 og 100 μg/mlaf Cistanche phenylethanoid glycosider reducerede signifikant lipiddråbedannelse (P < 0,01). IFigur 11, TG og TC niveauer var forhøjede i modelgruppen (P < 0,01), mens alle behandlingsgrupper viste signifikant reducerede niveauer sammenlignet med modelgruppen (P < 0,01).
3.2.4 Virkninger på mitokondriel skade
JC-1 farvestof akkumuleres i sunde mitokondrier og udsender rød fluorescens; i beskadigede mitokondrier forbliver det i monomer form og udsender grøn fluorescens. Som vist iFigur 12, dominerede rød fluorescens i kontrolgruppen, mens grøn fluorescens var fremtrædende i modelgruppen. Behandlingsgrupper viste reduceret grøn fluorescens og øget rød fluorescens, hvilket indikerer forbedret mitokondriemembranpotentiale.
3.2.5 Effekter på intracellulære ROS-niveauer
Som vist iFigur 13, viste modelgruppen signifikant øget fluorescensintensitet (P < 0,01), hvilket indikerer forhøjet ROS. Behandling med Cistanche phenylethanoid glycosider reducerede ROS-niveauer signifikant ved alle koncentrationer (P < 0,01).
3.2.6 Effekter på apoptose
Hoechst 33342 farver kerner med apoptotiske kerner, der viser lyseblå, kondenseret eller fragmenteret morfologi. Som det ses iFigur 14, kontrolgruppen havde minimal lys fluorescens, hvorimod modelgruppen viste rigelige lyse blå apoptotiske kerner. Behandlingsgrupperne udviste reduceret fluorescensintensitet, hvilket indikerer nedsat apoptose.
3.2.7 Effekter på TNF/PI3K/Akt-signalvej og Bax-udtryk
Som vist iFigur 15, sammenlignet med kontrolgruppen viste modelgruppen signifikant forhøjet ekspression afTNF-a, PI3K p85, Akt og Baxproteiner (P < 0,05, P < 0,01). Ved behandling:
Alle Cistanche phenylethanoid glycosidgrupper viste reduceredeTNF-audtryk (P < 0,01),
De50 μg/mlgruppe viste reduceretPI3K p85udtryk (P < 0,01),
De100 μg/mlgruppe viste reduceretAkt og Baxudtryk (P < 0,05).
4. Diskussion
NAFLD er en kompleks leversygdom forbundet med metaboliske lidelser, der involvererubalance i lipidmetabolismen, insulinresistens og oxidativt stress[12]. I de senere år hartraditionel kinesisk medicin (TCM)har vist betydeligt lovende i behandlingen af NAFLD.
Det har moderne forskning afsløretphenylethanoid glycosider fra Cistanchekan regulere lipid- og glukosemetabolismen i leveren og hæmme oxidativt stress, inflammation og fibrose [13-15]. Leveren brugerβ-oxidationat omsætte fedtsyrer ogCYP7A1at omdanne kolesterol til galdesyrer til lipidhomeostase [16-18]. I miljøer med højt fedtindhold fører metabolisk ubalance til lipidakkumulering og NAFLD [19].
Denne undersøgelse bekræftede detFFA-inducerede HepG2-cellerviste øgede lipiddråber og forhøjede TC- og TG-niveauer. Behandling med Cistanche phenylethanoid glycosider reducerede signifikant lipiddråbedannelse og TC/TG-niveauer, hvilket forbedrede hepatisk steatose.
Mitochondrial dysfunction leads to reduced β-oxidation, excessive ROS production, and lipid peroxidation [20]. ROS further damages mitochondria, worsening steatosis [21]. Our results show that Cistanche phenylethanoid glycosides reducere ROS, forbedremitokondriemembranpotentiale, og lindreoxidativ stress, og derved mindske fedtophobning.
Netværksfarmakologi indikerede, at anti-NAFLD-virkningerne involverer fleremetaboliske og apoptose-relaterede veje. Molecular docking showed strong binding affinities between active compounds and targets, especiallyTNF, hvilket antyder dens centrale rolle.
DeTNF-vejer kritisk i cellesignalering. TNF-α binder tilTNFR1, aktiverer dødsreceptorveje og inducerer apoptose [22]. Den aktiverer ogsåPI3K/Akt pathwaygennem parakrin signalering [23-24]. Unormal PI3K/Akt-signalering er forbundet med lipidakkumulering, inflammation og fibrose i NAFLD [25]. Vores data viser, at Cistanche phenylethanoid glycosiderhæmmer apoptoseog reducere udtrykket afTNF-a, PI3K, Akt, ogBax, i overensstemmelse med netværksforudsigelser, hvilket bekræfter vigtigheden afTNF/PI3K/Akt-sti.
Konklusion
Cistanche phenylethanoid glycosider regulerer NAFLD igennemflere processer og veje, herunder:
Reduktion af lipidophobning,
Hæmmer oxidativ stress,
Lindring af mitokondrieskader,
Undertrykkelse af apoptose.
Disse effekter kan være tæt forbundet medTNF/PI3K/Akt signalvej. Denne undersøgelse giver ikke kun videnskabelig støtte til anvendelsen af Cistanche phenylethanoid glycosider i NAFLD behandling, men også en reference for udvikling og klinisk forskning af nye terapeutiske lægemidler.
