Cistanche-glykosider dæmper prostatafibrose i benign prostatahyperplasi ved at regulere MiRNA-483-3p

 

ABSTRAKT

Objektiv:At undersøge de forbedrende virkninger af cistanche-glykosider på prostatafibrose ved benign prostatahyperplasi (BPH) og mekanismen, der involverer regulering af mikroRNA (miRNA)-483-3p.

Metoder:Hanmus blev tilfældigt tildelt fem grupper: normal kontrol, BPH-modelkontrol, finasterid, cistanche-glycosider og cistanche-glycosider + miRNA-483-3p-antagonist. BPH-modellen blev etableret ved bilateral orkiektomi efterfulgt af daglig subkutan injektion af testosteronpropionat. Efter 30 dage blev prostatakollagenaflejring evalueret ved Massons trichrom og Sirius Red-farvning, og hydroxyprolin (Hyp) indhold blev målt. Prostata-mRNA-niveauer af transformerende vækstfaktor-1 (TGF-1), mitogen-aktiveret proteinkinase 2 (MK2) og mitogen-aktiveret proteinkinase-kinase 6 (MKK6), samt miRNA-483-3p-niveauer, blev bestemt ved kvantitativ realtids-PCR (qPCR). Prostataproteinniveauer af TGF-1, MK2, phosphoryleret MK2 (p-MK2), MKK6 og phosphoryleret MKK6 (p-MKK6) blev vurderet ved Western blotting. Den direkte binding af miRNA-483-3p til MK2 blev undersøgt ved hjælp af et luciferase-reporter-assay.

Resultater:I forhold til den normale kontrolgruppe viste BPH-modelkontrolgruppen signifikant øget prostatakollagenaflejring; forhøjede mRNA-niveauer af TGF-1, MK2 og MKK6; og højere proteinniveauer af TGF-1, p-MK2 og p-MKK6 (alle P < 0,01), mens miRNA-483-3p-niveauer var signifikant faldet (P < 0,01). Sammenlignet med BPH-modelkontrolgruppen opregulerede cistanche-glycosider miRNA-483-3p, reducerede mRNA-niveauerne af TGF-1, MK2 og MKK6, sænkede proteinniveauerne af TGF-1, p-MK2 og p-MKK6 og lindrede kollagenaflejring. Det er bemærkelsesværdigt, at samtidig administration af miRNA-483-3p-antagomiret med cistanche-glycosider reducerede miRNA-483-3p signifikant, øgede kollagenaflejring og forhøjede mRNA-niveauer af TGF-1, MK2 og MKK6 samt proteinniveauer af TGF-2-p-M, pKKM og pKKM, sammenlignet med pKKM, og pKKM. cistanche-glykosider alene (alle P < 0,01). Luciferase-assayet viste, at miRNA-483-3p er direkte målrettet mod MK2.

Konklusion: Cistanche-glykosider dæmper prostatafibrose i BPH ved at regulere miRNA-483-3p og hæmme MK2-signalering.

Nøgleord: Cistanche-glykosider; miRNA‑483‑3p; prostata;fibrose; benign prostatahyperplasi

 

 

 

Topkvalitets Cistanche Deserticola

Mere viden om urter til BPH-behandling

 

Supportive Service Of Wecistanche - Den største cistanche-eksportør i Kina:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
 

 

Indledning

Benign prostatahyperplasi (BPH)er en almindelig tilstand hos midaldrende og ældre mænd, hvor prævalensen stiger med alderen. Rapporter viser, at forekomsten af ​​BPH overstiger 50% blandt mænd over 50 år. BPH og de tilknyttede symptomer på de nedre urinveje (LUTS) pålægger betydelige byrder på livskvalitet og langsigtede sundhedsomkostninger. Klinisk er 5 -reduktasehæmmere og ‑adrenerge receptorblokkere anbefalede farmakoterapier. ‑blokkere reducerer dog ikke prostatavolumen, og 25-30 % af patienterne viser ingen forbedring i LUTS med 5 -reduktasehæmmere; desuden kan 5-7 % endda forværres. Selvom kirurgiske innovationer såsom thulium laser prostatektomi i stigende grad anvendes sammenlignet med transurethral resektion af prostata, forekommer postoperativ LUTS stadig med hastigheder på over 23 %.

Aktuelle beviser tyder på tre store patobiologiske processer i BPH: kirtelhyperplasi, glatmuskelkontraktion og prostatafibrose. Disse processer virker uafhængigt eller synergistisk for at drive klinisk progression. BPH eksisterer almindeligvis (men ikke uvægerligt) sideløbende med LUTS; fibrose, karakteriseret ved overdreven ekstracellulær matrixaflejring, kompromitterer urethral fleksibilitet i prostata og bidrager til urinobstruktion. Alligevel er terapeutiske muligheder specifikt rettet mod organfibrose stadig begrænsede.

Cistanche (Cistanche spp.) er en traditionel læge- og ernæringsplante. Dets karakteristiske phenylethanoidglycosider (her samlet omtalt som cistanche-glycosider, såsom echinacosid og acteosid) udviser brede bioaktiviteter, herunder antimikrobielle, hypolipidæmiske, antiallergiske, kardiotoniske, antidiabetiske, antitumor-, neurobeskyttende, antioxiderende og immunmodulerende virkninger. Akkumulerende beviser indikerer anti-fibrotiske virkninger af disse glykosider i organer som nyre, lunge, hjerte og lever. Deres virkninger på prostatafibrose er dog ikke blevet rapporteret. Denne undersøgelse undersøgte virkningen af ​​cistanche-glykosider på prostatafibrose og undersøgte de underliggende mekanismer med fokus på miRNA-483-3p/MK2-aksen, der er relevant for ekstracellulær matrix-ombygning.

Topkvalitets Cistanche Deserticola

 

Materialer og metoder

Materialer

 

miRNA-483-3p antagomir (kemisk modificeret): købt fra Shanghai GenePharma Co., Ltd. (batchnr.: 12953).

Testosteronpropionatinjektion: Tianjin Jinyao Pharmaceutical Co., Ltd. (batchnr.: 150822).

Cistanche-glykosider: Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. (renhed større end eller lig med 98 %, batchnr.: M14062). Bemærkning til nutraceutiske udviklere: materiale svarer til standardiseret phenylethanoid glycosid fraktion; sikre specifikation af HPLC-indhold (f.eks. samlede PEGL'er, echinacosid/acteosid).

Finasterid-tabletter: MSD (Hangzhou) Pharmaceutical Co., Ltd. (batchnr.: U011856; 5 mg/tablet).

Luciferase reporter assay kit (batch nr.: E2920) og psiCHECK-2 vektor (batch nr.: C8021): Promega (USA).

qPCR-detektionskit: KAPA Biosystems (batchnr.: KM4101).

Hydroxyprolin (Hyp) assaykit: Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (batchnr.: 20190626).

Primere til TGF-1, MK2 og MKK6 blev syntetiseret af Wuhan Tianyi Huiyuan Biotechnology Co., Ltd.

Topkvalitets Cistanche Deserticola

 

Dyr

Syv uger gamle specifik patogenfri (SPF) C57BL/6-hanmus (22-24 g) blev opnået fra Huazhong Agricultural University (produktionslicensnummer: SCXK Hubei 2015-0019). Dyrene blev anbragt ved 23 ± 2 grader, 50 ± 5 % fugtighed, under en 12 timers lys/12 timers mørke cyklus.

 

Udstyr

 

StepOnePlus PCR-system i realtid (Applied Biosystems, USA).

Luminoskan 5200110 mikropladeluminometer (Thermo Fisher Scientific, USA).

Eksperimentelt design og BPH-model
Efter 1 uges akklimatisering blev mus tilfældigt fordelt (tabel med tilfældige tal) i fem grupper (n=6 pr. gruppe): normal kontrol, BPH model kontrol, finasterid, cistanche glycosider og cistanche glycosider + miRNA-483-3p antagomir. BPH-modellen blev induceret ved kirurgisk kastration plus daglig subkutan injektion af testosteronpropionat ved 7,5 mg·kg⁻1 i 30 dage. Finasteridgruppen modtog oralt finasterid 1 mg·kg⁻¹ dagligt (opløst i 0,5 % CMC‑Na). Cistanche-glycosidergruppen modtog orale cistanche-glycosider 100 mg·kg⁻1 dagligt. Kombinationsgruppen modtog orale cistancheglycosider 100 mg·kg⁻¹ dagligt plus haleveneinjektion af miRNA‑483‑3p antagomir ved 10 mg·kg⁻¹ hver 5. dag efter producentens instruktioner. Normal- og BPH-modelkontrolgrupperne fik et lige så stort volumen på 0,5 % CMC-Na oralt.

Efter 30 dage blev mus bedøvet ved intraperitoneal injektion af natriumpentobarbital (80 mg·kg-1) og aflivet ved cervikal dislokation. Prostata blev skåret ud; portioner blev fikseret og indlejret til Masson's trichrome og Sirius Red-farvning, og friske væv blev behandlet til qPCR, Western blotting og biokemiske assays. Dyreprocedurer overholdt Hubei Provincial Regulations on Laboratory Animal Management (operatørkvalifikationsnr.: TY20190784).

Topkvalitets Cistanche Deserticola

 

Vurdering af prostatafibrose

Kollagenaflejring blev evalueret ved Sirius Red og Massons trikromfarvning. Hyp-indhold i prostatavæv blev kvantificeret pr. kit instruktioner. For hvert objektglas blev tre tilfældige felter analyseret ved hjælp af Image-Pro Plus 6.0 for at beregne procentdelen af ​​positivt farvet område.

Evaluering af MK2 Pathway Activity

qPCR: Prostata-mRNA-niveauer af MK2, TGF-1 og MKK6 blev målt. Primer sekvenser:

MK2 (264 bp) fremad 5'-GGAAGTGCCTGCTGAT-3', omvendt 5'-AGTTGTGACTGGTGGTTT-3';

TGF-1 (153 bp) fremad 5'-AGGAGACGGAATACAGGG-3', omvendt 5'-ATGAGGAGCAGGAAGGG-3';

MKK6 (146 bp) fremad 5'-CCTCAGACCAGTTCCAC-3', baglæns 5'-CGCATCTTCTCCACCA-3'.

Western blot: Proteinniveauer af TGF-1, MK2, p-MK2, MKK6 og p-MKK6 blev bestemt efter tidligere etablerede protokoller.

Måling af miRNA‑483‑3p
miRNA‑483‑3p primere: fremad 5'-GGGTCACTCCTCCCCT-3', omvendt 5'-AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3'; RT-primer 5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAAGACGGG-3'. qPCR blev udført pr. kit instruktioner.

 

Luciferase Reporter Assay

MK2 3'UTR blev klonet ind i psiCHECK-2 vektoren for at konstruere vildtype (WT) og mutant (MUT) reporterplasmider. HEK‑293T-celler blev co-transficeret med miRNA‑483‑3p og reporterplasmiderne ved hjælp af Lipofectamine 3000; kontrolceller modtog tom vektor. Efter 24 timer blev luciferaseaktivitet målt i henhold til kit-protokollen.

Statistisk Analyse
Data blev analyseret ved hjælp af SPSS 17.0. Envejs ANOVA blev anvendt efter bekræftelse af normalitet og varianshomogenitet. Resultater er udtrykt som middel ± SD. LSD post hoc test blev brugt til flere sammenligninger. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikante ved P < 0,05.

 

Resultater

Sammenlignet med den normale kontrolgruppe udviste BPH-modelkontrolgruppen markante stigninger i prostatakollagenaflejring; forhøjede mRNA-ekspressioner af TGF-1, MK2 og MKK6; og højere proteinniveauer af TGF-1, p-MK2 og p-MKK6 (alle P < 0,01). miRNA-483-3p-niveauer blev signifikant reduceret (P < 0,01).

I forhold til BPH-modelkontrollen opregulerede cistanche-glycosider markant miRNA-483-3p, sænkede mRNA-niveauerne af TGF-1, MK2 og MKK6, sænkede proteinniveauerne af TGF-1, p-MK2 og p-MKK6 og mindskede kollagenaflejring.

Sammenlignet med cistanche glycosider alene reducerede kombinationen af cistanche glycosider med miRNA-483-3p antagomir signifikant miRNA-483-3p og øgede kollagenaflejring plus mRNA-niveauer af TGF-1, MK2 og MKK6 af TGF-1,-M-2 og proteinniveauer, samt proteinniveauer. p-MKK6 (alle P < 0,01).

Luciferase-reporter-assayet bekræftede, at miRNA-483-3p er direkte rettet mod MK2.

 

Diskussion (kort, nutraceutisk-fokuseret)

Denne undersøgelse indikerer, at cistanche-glycosider dæmper prostatafibrose i en kastration/testosteron-induceret BPH-model ved at opregulere miRNA-483-3p og undertrykke MK2-pathway-aktivitet nedstrøms for TGF-signalering. I betragtning af begrænsningerne af nuværende BPH-farmakoterapier i forhold til fibrotisk ombygning, kan cistanche-glykosider repræsentere en komplementær ernæringsstrategi, der sigter mod ekstracellulær matrixbalance.

For udvikling af kosttilskud omfatter overvejelser:

Standardisering: definer total phenylethanoidglycosider og markørforbindelser (f.eks. echinacosid større end eller lig med 20 %, acteosid større end eller lig med 10 % ved HPLC).

Dosisoversættelse: 100 mg·kg⁻¹ i mus tilnærmer 8-12 mg·kg⁻¹ human ækvivalent dosis (HED) ved brug af skalering af kropsoverfladeareal, ca. 500-800 mg/dag for en 60-70 kg voksen; klinisk validering er påkrævet.

Kvalitet og sikkerhed: sikre identitet (botanisk kilde, kontaminanter, tungmetaller, pesticider), og vurder potentielle interaktioner med -blokkere eller 5-reduktasehæmmere.

Påstande: struktur-/funktionsanprisninger bør fokusere på "understøttelse af uringennemstrømning og prostatavævsbalance" og undgå sygdomsbehandlingssprog uden klinisk evidens.

 

Konklusioner

Cistanche glykosiderlindre prostatafibrose i BPH ved at regulere miRNA-483-3p og hæmme MK2-signalering. Disse resultater understøtter yderligere translationel forskning i standardiserede cistancheekstrakter som supplerende næringsmidler til prostata sundhed.

 

Anerkendelser

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81703594).

Forfatteroplysninger
Yang Chuhao (1991–), kvinde, Wuhan, Hubei, klinisk farmaceut, MS; hovedforskningsområde: klinisk farmaci. ORCID: 0000-0002-8921-5758; Tlf.: +86-27-82440854.