At vælge en botanisk hudplejeingrediens bør involvere mere end at finde en tiltalende plantehistorie. For et hudplejemærke, kontraktproducent eller ingrediensdistributør er de mere nyttige spørgsmål:

Hvilke forbindelser er til stede i ekstraktet?

Hvor konsekvent kan producenten kontrollere deres koncentrationer?

Hvilke eksperimenter understøtter den foreslåede ansøgning?

Gælder beviserne den faktiske ingrediens, der købes?

Hvilken yderligere test er nødvendig før lancering af et færdigt produkt?

Det tekniske dokument, der undersøges i denne artikel, fokuserer påverbascoside afledt af Cistancheog dets foreslåede anvendelser i hud-lipidproduktion, hydrering og barriererelateret forskning.

Den beskriver både en oprensningsproces og laboratorieeksperimenter, der sammenligner renset verbascoside med flere Cistanche-ekstrakter og andre ingredienser.

 

 

16% verbascoside cistanche ekstrakt

Den centrale kommercielle lektion er ligetil: en generel Cistanche-ekstrakt og en højt oprenset Cistanche-afledt forbindelse bør ikke behandles som udskiftelige ingredienser.

Bevisnotat:Forskningsresultaterne nedenfor er rapporteret i den kinesiske patenttekst, der leveres til oversættelse. Det leverede materiale inkluderer ikke de originale figurer, komplette numeriske datasæt, patentpublikationsdetaljer eller humane kliniske undersøgelser. Det skal derfor læses som en teknisk offentliggørelse, ikke som en uafhængig bekræftelse af det færdige produkts effektivitet eller myndighedsgodkendelse.

 

1. Hvad er Verbascoside?

Verbascoside er også kendt somakteosid. Disse er navne for det samme kemiske stof, snarere end to forskellige aktive ingredienser. FDA-stofregistret viser begge navne under samme stofidentitet. (precision.fda.gov)

 

 

I den medfølgende beskrivelse beskrives verbascoside som et phenylethanoidglycosid opnået fra de tørrede kødfulde stængler af Cistanche-arter. De vigtigste navngivne botaniske kilder er:

Cistanche deserticola

Cistanche tubulosa

Cistanche sinensis

Cistanche salsa

Dokumentet undersøger verbascoside som en potentiel botanisk aktiv for topiske formuleringer, med særlig opmærksomhed på lipidmetabolisme, hyaluronsyreproduktion, tight-junction-proteiner og cellemigration.

Hvorfor navnet betyder noget, når du køber ingredienser

Når du sammenligner leverandørtilbud, skal du anmode om bekræftelse af:

Den botaniske art og plantedel.

Om materialet er et helt ekstrakt, standardiseret ekstrakt eller renset forbindelse.

Det målte verbascoside-indhold.

Den anvendte analysemetode og referencestandard.

Om den angivne procentdel repræsenterer et assay efter masse eller en kromatografisk arealprocent.

Et citat for "Cistanche-ekstrakt" alene giver ikke nok information til at afgøre, om det svarer til det materiale, der er vurderet i et bestemt eksperiment.

2. Hvorfor fokuserer offentliggørelsen på hudbarrieren?

Dokumentet præsenterer et forskningskoncept med flere endepunkter snarere end en simpel overfladefugtende påstand.

Dens foreslåede rækkefølge er:

Epidermal cellefornyelse → stærkere celle-til-celle forbindelser → lipidstøtte → hyaluronsyreproduktion → reparationsrelateret aktivitet

For at undersøge dette koncept brugte forskerne HaCaT-celler. HaCaT er en udødeliggjort human keratinocytcellelinje etableret som en laboratoriemodel til at studere epidermal biologi og keratinisering. Det er ikke en celletype, der naturligt hedder "HaCaT" i en persons hud. (pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

For ingredienskøbere er denne sondring vigtig:resultater i dyrkede celler er et forskningsmæssigt udgangspunkt, ikke en erstatning for at teste et færdigt produkt på menneskelig hud.

De vigtigste endepunkter rapporteret

Forskningsområde	Mål beskrevet i det medfølgende dokument	Praktisk fortolkning
Cellerespons	CCK-8 analyse	Et screeningsendepunkt; yderligere metoder ville styrke en spredningspåstand
Lipid-relateret aktivitet	Fedtsyresyntaseaktivitet; ACC, FASN og N-SMase udtryk	Understøtter yderligere undersøgelse af lipidmetabolisme, men kvantificerer ikke direkte den komplette hudbarriere lipidprofil
Hyaluronsyre	HA indhold; HAS2-, HAS3- og CD44-ekspression	Understøtter yderligere undersøgelse af HA-relaterede veje
Celle-til-celle forbindelser	Claudin-1 og occludin niveauer	Måler udvalgte tight-junction-proteiner frem for fuldstændig barrierefunktion
Reparationsrelateret aktivitet	Celle ridse-assay	Et in vitro gap-closure endpoint, ikke et klinisk sårhelingsforsøg
Fugttilbageholdelse	Formuleringsmasseretention på glasplader	En laboratorietest på formuleringsniveau, ikke en hydreringsundersøgelse på huden

Disse fortolkninger følger af de eksperimentelle metoder beskrevet i den medfølgende tekst.

 

3. Hvad gør denne forskning nyttig for hudplejevirksomheder?

Afsløringen sammenligner flere materialer i stedet for at antage, at hver Cistanche-afledt ingrediens producerer den samme respons.

De testede materialer omfatter:

Et Cistanche polysaccharidekstrakt.

Adskillige phenylethanoid-glycosid-holdige ekstrakter.

En total phenylethanoid glycosid ekstrakt.

Echinacoside.

Oprenset verbascoside.

Ifølge det leverede dokument udviste renset verbascoside aktivitet på tværs af flere af de målte endepunkter. Nogle blandede ekstrakter viste aktivitet i visse assays, men ikke andre.

Indkøbs takeaway

Køb den specifikation, der matcher dit udviklingsmål - ikke kun plantenavnet.

For eksempel:

Hvis dit projekt er baseret på de oprensede-verbascoside-eksperimenter, anmod om data for det oprensede materiale.

Hvis din formulering bruger et standardiseret helekstrakt, skal du anmode om test på det ekstrakt.

Hvis en leverandør citerer forskning om en anden ekstraktionsproces, så spørg, om den testede sammensætning er sammenlignelig med det materiale, der tilbydes.

Beviser for én ingredienskvalitet bør ikke automatisk overføres til en anden.

4. Hvordan er Verbascoside forberedt i offentliggørelsen?

Den beskrevne proces har fire hovedfaser:

Botanisk forberedelse:Forbehandl og pulveriser tørrede Cistanche kødfulde stængler.

Udvinding:Brug 50%-80% vandig ethanol.

Berigelse:Adskil fraktioner ved hjælp af en AB-8 makroporøs adsorptionsharpiks.

Oprensning:Brug silicagelkromatografi efterfulgt af koncentrering og frysetørring.

Den angivne endelige renhed ermindst 98 %, selvom den leverede tekst ikke inkluderer den analytiske validering eller batchdata, der er nødvendige for uafhængigt at bekræfte denne specifikation.

Et kritisk fremstillingsspørgsmål: Resterende opløsningsmidler

Det beskrevne kromatografitrin anvenderchloroform og methanol.

For et kommercielt indkøbsprojekt, spørg producenten om den faktiske produktionsopløsningsmiddelliste, kontroller for fjernelse af opløsningsmidler og batchspecifikke resultater af restopløsningsmiddel. ICH Q3C giver en farmaceutisk ramme til evaluering af risici for resterende opløsningsmiddel; det bør ikke repræsenteres som en universel kosmetisk acceptstandard. (ema.europa.eu)

Antag ikke, at "planteafledt" betyder "kun lavet med vand og ethanol."

 

5. Hvad viser fugtfastholdelsestesten egentlig?

Det medfølgende dokument beskriver en sammenligning af:

Et serum indeholdende2% verbascoside.

Et serum indeholdende2% echinacoside.

Et serum med positiv kontrol5% glycerin.

Prøverne blev placeret kl25 grader og 50% relativ luftfugtighed, og deres masse blev målt over tid.

Afsløringen rapporterer, at den verbascoside-holdige prøve bibeholdt mere masse under disse betingelser.

Det er en potentielt nyttig formuleringsscreeningsobservation. Den beskrevne metode fastslår dog ikke:

Overlegen hydrering på menneskelig hud.

Lavere transepidermalt vandtab.

Klinisk overlegenhed i forhold til glycerin.

Bedre ydeevne i enhver formulering.

At den observerede forskel kun stammer fra den navngivne aktive, uden en fuldstændig afsløret matchet køretøjssammenligning.

For et mærke, der planlægger en sammenlignende påstand, test de færdige formuleringer ved hjælp af en passende designet undersøgelse.

 

6. En praktisk tjekliste til indkøb af Cistanche-ingredienser

Brug følgende spørgsmål, når du vurderer en Cistanche-ekstraktleverandør eller producent af renset verbascoside.

Købsspørgsmål	Dokumentation at rekvirere
Hvad er den botaniske kilde?	Artsidentifikation, plantedelsdeklaration og sporbarhedsoplysninger
Hvad er det præcist, der leveres?	Fuld sammensætning, inklusive bærere, proceshjælpemidler og hjælpestoffer, hvor det er relevant
Hvor meget verbascoside er til stede?	Batchspecifikt certifikat for analyse og analysemetode
Hvordan bekræftes identiteten?	Kromatografisk identifikation og referencestandardoplysninger
Hvilke opløsningsmidler bruges?	Faktisk fremstillingsopløsningsmiddeldeklaration og testresultater for restopløsningsmiddel
Hvor konsekvent er produktionen?	Repræsentative resultater fra flere batches
Er materialet egnet til den påtænkte brug?	Dokumentation til tilsigtet brug og et passende sikkerhedsdossier
Vil det fungere i den valgte formel?	Opløselighed, kompatibilitet, stabilitet og emballage-udviklingsdata
Hvad understøtter de foreslåede påstande?	Undersøgelsesrapporter for samme ingredienskvalitet og helst den færdige formulering

 

Brug ikke "naturlig" som en sikkerhedskonklusion

Den medfølgende patenttekst giver en positiv sikkerhedserklæring baseret på ingrediensens botaniske oprindelse. Denne erklæring kræver kvalifikation til kommerciel udgivelse.

FDA forklarer, at en ingredienss kilde ikke bestemmer dens sikkerhed: planteafledte materialer kan også indeholde giftige eller allergifremkaldende stoffer. Sikkerheden skal vurderes for de tilsigtede brugsforhold. (fda.gov)

Af denne grund skal du anmode om sikkerhedsdokumentation i stedet for at stole på "naturlig", "urte" eller "høj renhed" som selvstændige forsikringer.

 

7. Hvordan bør et brand diskutere forskningen?

Hold tre lag adskilt:

Hvad afsløringen hævder.

Hvad de rapporterede eksperimenter målte.

Hvad det færdige produkt har vist sig at gøre.

For eksempel er "undersøgt i HaCaT-celler for lipid-relateret aktivitet" væsentligt forskellig fra "klinisk bevist at reparere hudbarrieren."

Ligeledes bør henvisninger til behandling af eksem, håndtering af atopisk dermatitis eller heling af sår ikke kopieres direkte ind i almindelige kosmetiske produktanprisninger. I USA kan påstande om at behandle sygdom eller påvirke kroppens struktur eller funktion få et produkt til at blive reguleret som et lægemiddel. (fda.gov)

En forskningsartikel eller patentreference er ikke i sig selv tilladelse til at fremsætte en terapeutisk markedsføringspåstand.

8. Anbefalet udviklingssti

For en virksomhed, der overvejer Cistanche-afledt verbascoside, er en nyttig udviklingssekvens:

Definer den påtænkte produktkategori og målmarked.

Vælg ingredienskvalitet og analytisk specifikation.

Gennemgå sammensætning, kontaminanter, resterende opløsningsmidler og sikkerhedsdokumentation.

Udvikl en prototype og vurder ingredienskompatibilitet.

Evaluer formulering og emballagestabilitet.

Udfør passende mikrobiologiske og sikkerhedsmæssige vurderinger.

Test det færdige produkt mod de tilsigtede præstationskrav.

Gennemgå den endelige hjemmeside, etiket og annonceringssprog før lancering.

Koncentrationsområdet i oplysningen-0.01%–5.0%-bør behandles som et offentliggjort område, ikke som en universelt valideret formuleringsanbefaling.

 

Bundlinje for ingredienskøbere

Den leverede forskning gør Cistanche-afledt verbascoside til en kandidat til yderligere hudplejeudvikling, især til projekter, der udforsker hydrering og barriere-relaterede laboratorieendepunkter.

 

Cistanche acteoside indholdsliste

 

Klik for at besøge andet indhold på listen over akteosidcistanche-ekstrakter

 

 

 

Dens mest nyttige lektie er ikke blot, at "Cistanche er godt for huden." Det er detekstraktionsmetode, indhold af aktive stoffer, ingrediensidentitet og beviskvalitet har alle indflydelse på, om en botanisk ingrediens er egnet til et specifikt kommercielt projekt.

Når du henvender dig til en Cistanche-producent, skal du starte med en præcis anmodning:

"Giv venligst den botaniske identitet, verbascoside-specifikation, analysemetode, repræsentative analysecertifikater, resultater af restopløsningsmiddel, sikkerhedsdokumentation og formuleringsvejledning for den ingredienskvalitet, der er foreslået til vores projekt."

Den anmodning skaber et meget stærkere grundlag for produktudvikling end en generisk forespørgsel om urteekstraktpulver.

 

(54) Opfindelsens titel

Fremgangsmåde til fremstilling af Verbascoside og metode til dets anvendelse til at fremme hudlipidproduktion

(57) Abstrakt

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af verbascoside og en fremgangsmåde til dens anvendelse til at fremme hudlipidproduktion, der hører til det tekniske område hudpleje og topiske produkter.

Metoden omfatter følgende trin:

Udvælgelse af de tørrede kødfulde stængler fra Orobanchaceae-planterneCistanche deserticola, Cistanche tubulosa, Cistanche sinensis, ellerCistanche salsa; pulverisering af stilkene efter forbehandling; ekstrahering af dem under tilbagesvaling med en 50%-80% vandig ethanolopløsning to til fire gange i en til tre timer hver gang; at kombinere ekstrakterne; og koncentrering af dem under reduceret tryk, indtil der ikke er nogen ethanollugt tilbage, hvorved der opnås en koncentreret opløsning.

at lede den koncentrerede opløsning gennem en AB-8 makroporøs adsorptionsharpikssøjle; sekventiel eluering med deioniseret vand og en 30%-50% vandig ethanolopløsning for at fjerne urenheder; derefter eluere målbestanddelene med en 60 %-90 % vandig ethanolopløsning; opsamling af eluatet og koncentrering af det under reduceret tryk; oprensning af det ved silicagelsøjlekromatografi under anvendelse af chloroform-methanol i et volumenforhold i området fra 5:1 til 2:1 som eluent; opsamling af målfraktionerne; og koncentrering af dem under reduceret tryk efterfulgt af frysetørring for at opnå oprenset verbascosid.

De gavnlige virkninger angivet for opfindelsen er, at verbascoside beskytter huden og udviser forbedret hudplejeaktivitet, når det inkorporeres i produkter.

 

Krav

Påstand 1

Fremgangsmåde til fremstilling af verbascoside, kendetegnet ved at omfatte følgende trin:

Udvælgelse af de tørrede kødfulde stængler fra Orobanchaceae-planterneCistanche deserticola, Cistanche tubulosa, Cistanche sinensis, ellerCistanche salsa; pulverisere dem efter forbehandling; ekstrahering af dem under tilbagesvaling med en 50%-80% vandig ethanolopløsning to til fire gange i en til tre timer hver gang; at kombinere ekstrakterne; og koncentrering af dem under reduceret tryk, indtil der ikke er nogen ethanollugt tilbage, hvorved der opnås en koncentreret opløsning.

at lede den koncentrerede opløsning gennem en AB-8 makroporøs adsorptionsharpikssøjle; sekventiel eluering med deioniseret vand og en 30%-50% vandig ethanolopløsning for at fjerne urenheder; derefter eluere målbestanddelene med en 60 %-90 % vandig ethanolopløsning; opsamling af eluatet og koncentrering af det under reduceret tryk; oprensning af det ved silicagelsøjlekromatografi under anvendelse af chloroform-methanol i et volumenforhold i området fra 5:1 til 2:1 som eluent; opsamling af målfraktionerne; koncentrering af dem under reduceret tryk; og frysetørring for at opnå oprenset verbascoside med en renhed på mindst 98%.

 

Påstand 2

2. Fremgangsmåde til fremstilling af verbascoside ifølge krav 1, hvor materiale-til-opløsningsmiddel-forholdet under tilbagesvalingsekstraktion ligger i området fra 1:10 til 1:20, og ekstraktionstemperaturen varierer fra 60 grader til 80 grader.

 

Påstand 3

2. Fremgangsmåde til fremstilling af verbascoside ifølge krav 1, hvor diameter-til-højde-forholdet af den AB-8 makroporøse adsorptionsharpikssøjle ligger i området fra 1:8 til 1:15, og elueringsflowhastigheden varierer fra 1 til 3 BV/time.

 

Påstand 4

2. Fremgangsmåde til fremstilling af verbascoside ifølge krav 1, hvor frysetørringsbetingelserne omfatter en temperatur i området fra -40 grader til -50 grader, et vakuumtryk i området fra 10 til 30 Pa og en tørretid i området fra 12 til 24 timer.

 

Påstand 5

5. Fremgangsmåde til påføring af verbascosid for at fremme hudlipidproduktion ved anvendelse af verbascoside fremstillet ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved, at påføringsmetoden omfatter:

Tilsætning af verbascosid til en topisk produktbase ved en forudbestemt massefraktion og ensartet omrøring for at fremstille et færdigt produkt; påføring af det færdige produkt på hudoverfladen en eller to gange dagligt; at tillade verbascoside at penetrere og virke på epidermale HaCaT-celler for at opregulere gen- og proteinekspressionen af ​​ACC, FASN og N-SMase og øge fedtsyresyntaseaktiviteten; og fortsat brug i en til fire uger for at forbedre hudens lipidsyntese.

Verbascoside fremmer HaCaT-celleproliferation, sårheling, tight-junction-proteinekspression og lipid- og hyaluronsyreproduktion og giver derved multi-target barriere-reparationsfunktioner.

Det bruges i hele hudbarrierevedligeholdelseskæden, der omfatter epidermal cellefornyelse, forbedrede intercellulære forbindelser, genopfyldning af lipidmatrixen og syntesen af ​​hyaluronsyre som en naturlig fugtgivende faktor.

 

Påstand 6

6. Påføringsmetode ifølge krav 5, hvor massefraktionen af ​​verbascosid i det topiske produkt ligger i området fra 0,01 % til 5,0 %.

 

Påstand 7

6. Påføringsmetode ifølge krav 5, hvor 0,1-0,5 g af det færdige produkt anvendes pr. påføring, efterfulgt af blid massage i et til tre minutter for at fremme absorptionen.

 

Påstand 8

6. Påføringsmetode ifølge krav 5, hvor det topiske produkt er en medicinsk bandage, et post-procedure reparationsprodukt, et supplerende behandlingsprodukt til atopisk dermatitis, et hudplejeprodukt specifikt beregnet til følsom hud, eller et intensivt fugtgivende og reparerende hudplejeprodukt.

 

Påstand 9

6. Påføringsmetode ifølge krav 5, hvor excipienser yderligere kan inkorporeres under påføringen af ​​verbascoside.

 

Påstand 10

10. Påføringsmetode ifølge krav 9, hvor excipiensen er valgt blandt et fugtighedsbevarende middel, en emulgator, et konserveringsmiddel, en duft eller et beroligende middel, og doseringsformen af ​​den excipiensholdige sammensætning er valgt blandt en lotion, en creme, en gel, et serum eller en sheet-mask-opløsning.

 

Fremgangsmåde til fremstilling af Verbascoside og metode til dets anvendelse til at fremme hudlipidproduktion

 

Teknisk område

[0001]Opfindelsen hører til det tekniske område af hudpleje og topiske produkter. Især angår den en fremgangsmåde til fremstilling af verbascosid og en fremgangsmåde til dens anvendelse til at fremme hudlipidproduktion.

Mere specifikt drejer det sig om en forberedelsesmetode til verbascoside beregnet til at udøve virkninger på tværs af den komplette hudbarriere-reparationssekvens af epidermal cellefornyelse → forbedrede intercellulære tætte forbindelser → lipid-matrix-genopfyldning → hyaluronsyresyntese → sårheling, til brug for at beskytte huden.

 

Baggrundskunst

[0002]Epidermal cellefornyelse, forbedrede intercellulære tight junctions, lipid-matrix-genopfyldning, hyaluronsyresyntese og sårheling spiller hver især en uundværlig rolle i at opretholde hudbarriere-homeostase.

Epidermal cellefornyelse er grundlaget for barrierekonstruktion. Ved at accelerere proliferationen og differentieringen af ​​basale keratinocytter sikrer det, at et tilstrækkeligt antal celler bevæger sig opad på en ordnet måde, hvilket leverer tilstrækkeligt cellulært materiale til barrieredannelse.

Intercellulære junctional strukturer, herunder tætte junctions og desmosomer, forankrer nydannede celler sammen for at skabe en tæt, kontinuerlig fysisk barriere, der effektivt modstår indtrængen af ​​eksterne irritanter.

Lipidmatrixen, der fylder mellemrummene mellem cellerne, danner en organiseret lamelstruktur og er det vigtigste middel til at forsegle veje, hvorigennem vand går tabt.

Hyaluronsyre syntetiseret i epidermis og dermis danner et kraftfuldt vandtilbageholdende netværk, tilfører fugt til stratum corneum og opretholder cellulær homeostase. Det kan også give et passende fugtigt miljø til disse fysiologiske processer og transmittere cellulære signaler.

Sårheling afhænger i høj grad af disse fire processer. For det første giver hyaluronsyre en provisorisk matrix og signaleringsfunktioner. Epidermal cellefornyelse er derefter nødvendig for at dække såret. Nydannede celler skal genetablere tætte forbindelser og genopbygge lipidmatrixen for at fuldføre genoprettelsen af ​​barrierefunktionen.

Disse fem processer initieres sekventielt under sårheling. Deres indbyrdes forbundne, koordinerede handlinger - fra cellefornyelse og strukturel forstærkning til matrixfyldning og vandlagring - fører tilsammen til en fuldt stabiliseret hudbarriere.

De giver ikke kun den fysiske styrke, der er nødvendig for at modstå ydre irritanter, men også den fugttilbageholdelseskapacitet, der er nødvendig for at forhindre internt vandtab, hvilket gør det muligt for huden at opretholde langsigtet sundhed i en tilstand af dynamisk ligevægt.

Derfor er flerdimensionel, systematisk rekonstruktion mere fundamental end blot at forbedre overfladefugten. Det kan forbedre hudens modstand og fugtretention ved deres kilde, hvilket understøtter en mere holdbar og stabil sund tilstand.

[0003]Hudens egen produktion af lipider og hyaluronsyre er grundlæggende for at bevare hudens sundhed, modstå miljøirritation og bevare en ungdommelig tilstand.

Gennem fugttilbageholdelse og forsvar mod mikroorganismer og forurenende stoffer er disse stoffer med til at sikre normal fysiologisk hudfunktion.

Sammenlignet med eksternt tilskud alene beskrives fremme af hudens egen produktion af lipider og hyaluronsyre som en mere grundlæggende og holdbar strategi, der direkte styrker dens "selv-reparerende kapacitet" og "modstand".

For hudsygdomme som atopisk dermatitis og eksem beskrives styrkelse af lipid- og hyaluronsyreproduktionen som havende central forebyggende og terapeutisk betydning.

Kilden forklarer, at disse tilstande ofte involverer genetiske defekter, der svækker hudens "mursten og mørtel" struktur, hvilket tillader allergener og irritanter at trænge ind lettere og udløser en vedvarende immun-inflammatorisk cyklus.

Derfor kan identifikation af aktive ingredienser, der aktiverer vigtige lipidsyntese-enzymer, såsom FASN og ACC, eller direkte inducerer hyaluronsyreproduktion proaktivt opretholde og reparere cellulær lipid- og hyaluronsyreproduktion.

Ifølge afsløringen kan denne strategi lindre tørhed, kløe og inflammatoriske episoder, mens den reducerer eksterne triggere ved deres kilde, mindsker hyppigheden og sværhedsgraden af ​​tilbagefald og hjælper med at skifte sygdomsbehandling fra passiv behandling til aktiv forebyggelse.

 

[0004]Verbascoside er et phenylethanoid glycosid og en af ​​hovedbestanddelene i Orobanchaceae-planterne:

Cistanche deserticolaYC Ma;

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight;

Cistanche sinensisBeck; og

Cistanche salsa(CA Mey.) Beck.

 

Forskning har vist, at verbascoside er en potent antioxidant og har farmakologiske aktiviteter, herunder antiinflammatoriske, neurobeskyttende, leverbeskyttende og anti-aldringseffekter.

Under screening for hudbeskyttende midler fra talrige planter fandt opfinderne ud af, at verbascoside ikke kun fremmer HaCaT-celleproliferation og tight-junction-proteinekspression, men også regulerer fedtsyresyntaseaktivitet, og derved forbedrer hudens lipidsyntese.

Det aktiverer også veje involveret i hyaluronsyreproduktion og fremmer efterfølgende sårheling.

Disse handlinger omfatter den komplette hudbarrierevedligeholdelse og reparationssekvens af epidermal cellefornyelse → forbedrede intercellulære forbindelser → lipid-matrix-genopfyldning → hyaluronsyresyntese → sårheling.

Verbascoside kan derfor bruges som et multi-target hudbeskyttende og fugtgivende middel i funktionel hudpleje og topiske produkter.

Eksempler omfatter medicinske forbindinger og reparationsprodukter efter proceduren; supplerende produkter til atopisk dermatitis eller eksem; hudplejeprodukter specielt beregnet til følsom hud eller rosacea; og intensive fugtigheds- og reparationsprodukter til daglig brug.

 

Sammenfatning af opfindelsen

[0005]Opfindelsen tilvejebringer en fremgangsmåde til fremstilling af verbascoside og en fremgangsmåde til dets anvendelse til at fremme hudlipidproduktion.

Fremstillingsmetoden vedrører verbascoside beregnet til at understøtte den komplette hudbarriere-reparationssekvens af epidermal cellefornyelse → forbedrede intercellulære forbindelser → lipid-matrix-genopfyldning → hyaluronsyresyntese → sårheling.

Det løser det tekniske problem med at levere en ny kerneaktiv ingrediens med multi-target-effekter til hudpleje eller aktuelle produkter.

Verbascoside beskrives som havende fordelen ved at virke på tværs af den komplette hudbarriere-reparationskæde med effekter, der er overlegne i forhold til eksisterende single-target hudplejeingredienser, såsom ingredienser, der kun fremmer hyaluronsyresyntese, fremmer kun celleproliferation eller giver fugt alene.

[0006]For at opnå de ovennævnte formål anvender opfindelsen følgende tekniske løsning.

[0007]En fremgangsmåde til fremstilling af verbascoside omfatter de følgende trin.

[0008]Vælg de tørrede kødfulde stængler fra Orobanchaceae-planterneCistanche deserticola, Cistanche tubulosa, Cistanche sinensis, ellerCistanche salsa.

Efter blanchering, tørring og pulverisering ekstraheres materialet under tilbagesvaling med en 50%-80% vandig ethanolopløsning to til fire gange i en til tre timer hver gang.

Kombiner ekstrakterne og koncentrer dem under reduceret tryk, indtil der ikke er nogen ethanollugt tilbage, hvorved der opnås en koncentreret opløsning.

[0009]Før den koncentrerede opløsning gennem en AB-8 makroporøs adsorptionsharpikssøjle.

Eluer sekventielt med deioniseret vand og en 30%-50% vandig ethanolopløsning for at fjerne urenheder, efterfulgt af en 60%-90% vandig ethanolopløsning for at eluere målbestanddelene.

Opsaml eluatet og koncentrer det under reduceret tryk.

Rens koncentratet ved silicagelsøjlekromatografi under anvendelse af chloroform-methanol i et volumenforhold fra 5:1 til 2:1 som eluent.

Saml målfraktionerne, koncentrer dem under reduceret tryk og frysetør dem for at opnå oprenset verbascoside med en renhed på mindst 98 %.

[0010]Eventuelt varierer forholdet mellem materiale og opløsningsmiddel under tilbagesvalingsekstraktion fra 1:10 til 1:20, udtrykt i g/ml, og ekstraktionstemperaturen varierer fra 60 grader til 80 grader.

Oversætterens note: Kilden angiver desuden, at dette forhold betyder "1 g råmateriale tilsættes til 1 mL opløsningsmiddel." Denne erklæring er ikke i overensstemmelse med det specificerede 1:10-1:20-interval, hvilket svarer til 10-20 ml opløsningsmiddel pr. gram råmateriale.

[0011]Diameter-til-højde-forholdet for den makroporøse adsorptionsharpikssøjle AB-8 varierer eventuelt fra 1:8 til 1:15, hvor forholdet er søjlediameteren, d, og søjlehøjden, h. Elueringsflowhastigheden varierer fra 1 til 3 BV/h.

[0012]Frysetørringsbetingelserne omfatter eventuelt en temperatur i området fra -40 grader til -50 grader, et vakuumtryk i området fra 10 til 30 Pa og en tørretid i området fra 12 til 24 timer.

[0013]En fremgangsmåde til påføring af verbascoside for at fremme hudlipidproduktion er tilvejebragt som følger.

[0014]Tilføj verbascoside til en topisk produktbase ved en forudbestemt massefraktion og omrør ensartet for at fremstille et færdigt produkt.

Påfør det færdige produkt på hudoverfladen en eller to gange dagligt.

Gennem penetration virker verbascoside på epidermale HaCaT-celler for at fremme celleproliferation og styrke tætte forbindelser.

Samtidig opregulerer det gen- og proteinekspressionen af ​​ACC , FASN og N-SMase, øger fedtsyresyntaseaktiviteten, opregulerer HAS2, HAS3 og CD44 og øger hyaluronsyreindholdet.

Fortsæt brugen i en til fire uger for at opnå en generel forbedring af hudbarrieren.

[0015]Eventuelt varierer massefraktionen af ​​verbascoside i det topiske produkt fra 0,01 % til 5,0 %.

[0016]Brug eventuelt 0,1-0,5 g af det færdige produkt pr. påføring og massér blidt i et til tre minutter efter påføring for at fremme optagelsen.

[0017]Eventuelt er det topiske produkt en medicinsk bandage, et reparationsprodukt efter proceduren, et supplerende behandlingsprodukt til atopisk dermatitis, et hudplejeprodukt specifikt beregnet til følsom hud eller et intensivt fugtgivende og reparerende hudplejeprodukt.

[0018]Eventuelt kan hjælpestoffer også tilsættes under påføringen af ​​verbascoside.

[0019]Yderligere er excipiensen valgt blandt et fugtighedsbevarende middel, en emulgator, et konserveringsmiddel, en duft eller et beroligende middel.

Dosisformen af ​​den excipiensholdige sammensætning er valgt blandt en lotion, en creme, en gel, et serum eller en sheet-mask-opløsning.

 

Opfindelsens gavnlige virkninger

[0020]De gavnlige virkninger af opfindelsen er som følger.

[0021]Opfindelsen viser, at verbascoside har kerneaktiviteter til at fremme hudlipid- og hyaluronsyreproduktion.

Det kan også fremme hud-celle-proliferation, styrke intercellulære stramme forbindelser og accelerere sårheling, der danner en lukket sløjfemekanisme til "fremme celleproliferation → stabilisere intercellulære forbindelser → øge lipid- og hyaluronsyreproduktion → accelerere reparation og heling."

Sammenlignet med den kendte teknik er opfindelsen beskrevet som havende de følgende fordele.

[0022]Verbascoside er en naturlig planteafledt aktiv ingrediens med et højt sikkerhedsniveau og klart defineret farmakologisk aktivitet, der undgår potentielle hudirritationsrisici forbundet med kemisk syntetiserede ingredienser.

Redaktionel kvalifikation: Dette er kildens sikkerhedspåstand, ikke en konklusion, der udelukkende er baseret på botanisk oprindelse.

[0023]Forberedelseseffektiviteten og udbyttet af verbascoside er forbedret.

[0024]Verbascoside virker på et omfattende udvalg af mål og regulerer samtidigt adskillige nøgleprocesser, herunder celleproliferation, tight-junction proteinekspression, lipidsyntese, hyaluronsyreproduktion og sårheling.

Det forbedrer derved hudbarrierefunktionen på en integreret måde, med virkninger beskrevet som overlegne i forhold til single-target ingredienser.

[0025]Dens anvendelsesmuligheder er brede, herunder medicinsk reparation, supplerende behandling af hudsygdomme, følsom hudpleje og daglig fugtgivende og reparation, der opfylder forskellige befolkningsgruppers hudsundhedsbehov.

 

Kort beskrivelse af tegningerne

[0026]For at forklare de tekniske løsninger af udførelsesformerne for opfindelsen eller den kendte teknik mere tydeligt, er de tegninger, der kræves til at beskrive udførelsesformerne eller den kendte teknik, kort introduceret nedenfor.

Tegningerne beskrevet nedenfor repræsenterer kun visse udførelsesformer for opfindelsen. En person med almindelig fagkundskab kan udlede andre tegninger fra dem uden kreativ indsats.

[0027]Figur 1 er et skematisk rutediagram over fremstillingsmetoden ifølge opfindelsen.

[0028]Figur 2 viser HaCaT-cellelevedygtighedsdata.

[0029]Figur 3 viser fedtsyresyntaseaktivitetsdata.

[0030]Figur 4 viser hyaluronsyreindholdsdata.

[0031]Figur 5 viser HaCaT-cellelevedygtighedsdata for opfindelsen.

[0032]Figur 6 viser fedtsyresyntaseaktivitetsdata for opfindelsen.

[0033]Figur 7 viser ekspressionen af ​​gener forbundet med fedtsyresyntese.

[0034]Figur 8 viser ekspressionen af ​​proteiner forbundet med fedtsyresyntese.

[0035]Figur 9 viser Western blot-resultater forbundet med fedtsyresyntese.

[0036]Figur 10 viser hyaluronsyreindholdsdata.

[0037]Figur 11 viser ekspressionen af ​​gener forbundet med hyaluronsyresyntese.

[0038]Figur 12 viser ekspressionen af ​​proteiner forbundet med hyaluronsyresyntese.

[0039]Figur 13 viser Western blot-resultater forbundet med hyaluronsyre.

[0040]Figur 14 viser claudin-1 ekspressionsniveauer.

[0041]Figur 15 viser occludin-ekspressionsniveauer.

[0042]Figur 16 viser sårlukningshastigheder.

[0043]Figur 17 viser billeder fra celleskrabeanalysen.

[0044]Figur 18 viser en evaluering af forskellige prøvers fugtgivende ydeevne.

 

Detaljeret beskrivelse af udførelsesformerne

[0045]Udførelsesformerne for ansøgningen er beskrevet detaljeret nedenfor med henvisning til de medfølgende tegninger.

Eksempel 1: Fremstilling af oprenset Verbascoside

[0046]Eksempel 1.

[0047]Som vist i figur 1 tilvejebringer dette eksempel en fremgangsmåde til fremstilling af verbascoside, forkortet som Ver, omfattende de følgende trin.

[0048]Vælg de tørrede kødfulde stængler afCistanche deserticolaellerCistanche tubulosa, begge tilhører familien Orobanchaceae.

Skær materialet i skiver, blancher det i kogende vand i 10-25 minutter, og ovntør det ved 40 grader -60 grader, hvilket øger indholdet af verbascoside mere end fire gange.

 

 

Note:* vs. tom kontrolgruppe, P<0.05P < 0.05P<0.05.

 

Efter pulverisering ekstraheres materialet under tilbagesvaling med en 50%-80% vandig ethanolopløsning to til fire gange i en til tre timer hver gang.

Kombiner ekstrakterne og koncentrer dem under reduceret tryk, indtil der ikke er nogen ethanollugt tilbage, hvorved der opnås en koncentreret opløsning.

 

[0049]Før den koncentrerede opløsning gennem en AB-8 makroporøs adsorptionsharpikssøjle.

Eluer sekventielt med deioniseret vand og en 30%-50% vandig ethanolopløsning for at fjerne urenheder, efterfulgt af en 60%-90% vandig ethanolopløsning for at eluere målbestanddelene.

Opsaml eluatet og koncentrer det under reduceret tryk.

Rens det ved silicagelsøjlekromatografi under anvendelse af chloroform-methanol i et volumenforhold fra 5:1 til 2:1 som eluent.

Saml målfraktionerne, koncentrer dem under reduceret tryk og frysetør dem for at opnå oprenset verbascoside med en renhed på mindst 98 %.

[0050]Specifikt varierer forholdet mellem materiale og opløsningsmiddel under tilbagesvalingsekstraktion fra 1:10 til 1:20, og ekstraktionstemperaturen varierer fra 60 grader til 80 grader.

[0051]Diameter-til-højde-forholdet for den makroporøse adsorptionsharpikskolonne AB-8 varierer fra 1:8 til 1:15, og elueringsflowhastigheden varierer fra 1 til 3 BV/time.

[0052]Frysetørringsbetingelserne omfatter en temperatur i området fra -40 grader til -50 grader, et vakuumtryk i området fra 10 til 30 Pa og en tørretid i området fra 12 til 24 timer.

 

Tabel 2. Sammenfatning af bioaktivitet af forskellige prøver

Indeks	Blank kontrol	Positiv kontrol	CTE	Ech	Ver
Cellelevedygtighed (%)	100 ± 8.347	/	122.052 ± 8.051*	117.868 ± 7.941*	128.894 ± 9.528*
FAS-aktivitet (U/mg prot)	2.712 ± 0.419	18.488 ± 4.56*	2.069 ± 0.27	9.799 ± 1.356*	10.4 ± 0.697*
HA-indhold (ng/mL)	10.908 ± 0.968	19.925 ± 4.306*	21.644 ± 2.037*	13.517 ± 1.653*	18.486 ± 1.341*
Claudin-1-ekspression (pg/mL)	414.58 ± 25.05	/	505.556 ± 20.518*	478.937 ± 12.419*	554.057 ± 22.106*
Occludin-ekspression (pg/mL)	3.287 ± 0.683	/	4.285 ± 0.575	4.666 ± 0.582*	7.258 ± 0.774*
24 timers sårhelingshastighed (%)	30.581 ± 1.308	70.075 ± 1.781*	40.762 ± 9.68	37.102 ± 7.038	45.173 ± 5.508*
48 timers sårhelingshastighed (%)	55.458 ± 6.674	87.545 ± 3.155*	76.47 ± 2.684*	67.883 ± 5.678*	76.704 ± 4.8*

Note:* vs. tom kontrolgruppe, P<0.05P < 0.05P<0.05.

 

Eksempel 2: Fremstilling af en Cistanche-polysaccharidekstrakt

[0053]Eksempel 2.

[0054]Ekstraher Cistanche to gange under opvarmet tilbagesvaling med 20 gange og 15 gange mængder vand i henholdsvis tre timer og to timer.

Filtrer, kombiner filtraterne og koncentrer ved 80 grader –90 grader.

Tilsæt 215 ml 95 % ethanol for at opnå en endelig ethanolkoncentration på 80 %, og lad stå natten over ved 4 grader.

Opsaml bundfaldet enten ved filtrering, fastholdelse af filterkagen eller ved centrifugering ved 4.000 rpm i 10 minutter.

Vask bundfaldet tre gange med absolut ethanol og tør det ved 50 grader for at opnå en Cistanche-polysaccharidekstrakt, betegnet POL.

 

Eksempel 3: Fremstilling af et phenylethanoidglycosidekstrakt

[0055]Eksempel 3.

[0056]Ekstraher Cistanche to gange under opvarmet tilbagesvaling med 20 gange og 15 gange mængder vand i henholdsvis tre timer og to timer.

Filtrer, kombiner filtraterne og koncentrer ved 80 grader –90 grader.

Tilsæt 215 ml 95 % ethanol for at opnå en endelig ethanolkoncentration på 80 %, og lad stå natten over ved 4 grader.

Opsaml filtratet ved filtrering eller supernatanten ved centrifugering ved 4.000 rpm i 10 minutter.

Koncentrer og tør det for at opnå et Cistanche phenylethanoid glycosid ekstrakt, betegnet POLS.

Test viste et echinacosideindhold på 21,8% og et verbascosideindhold på 1,2%.

 

Eksempel 4: Fremstilling af ekstrakt RE1

[0057]Eksempel 4.

[0058]BlødgørCistanche deserticolai seks gange dens mængde af 52% ethanol ved stuetemperatur i 10 dage.

Filtrer og gem planteresterne.

Efter tørring ekstraheres remanensen én gang under tilbagesvaling med seks gange dens mængde af 95 % ethanol i to timer.

Filtrer, kombiner filtraterne, koncentrer ved 60 grader og tør for at opnå et ekstrakt af Cistanche-phenylethanoidglycosider og deres derivater, betegnet RE1.

Ekstraktet indeholder bestanddele, herunder echinacosid, verbascosid, isoverbascosid og 2'-acetylverbascosid.

 

Eksempel 5: Fremstilling af ekstrakt RE2

[0059]Eksempel 5.

[0060]UddragCistanche tubulosato gange med 75 % ethanol i en time hver gang.

Filtrer og behold resten.

Efter tørring ekstraheres remanensen én gang under tilbagesvaling med seks gange dens mængde af 95 % ethanol i to timer.

Filtrer, kombiner filtraterne, koncentrer ved 60 grader og tør for at opnå et ekstrakt af Cistanche-phenylethanoidglycosider og deres derivater, betegnet RE2.

Ekstraktet indeholder bestanddele, herunder echinacosid, verbascosid, isoverbascosid og 2'-acetylverbascosid.

 

Eksempel 6: Fremstilling af et totalt phenylethanoidglycosidekstrakt

[0061]Eksempel 6.

[0062]Skær Cistanche i skiver og ekstraher to gange med en 75 % ethanolopløsning i 1,5 time hver gang.

Kombiner ekstrakterne, koncentrer og tør for at opnå et Cistanche phenylethanoid glycosid ekstrakt, betegnet CTE.

Test viste et echinacosideindhold på 22,6% og et verbascosideindhold på 4,5%.

 

Eksempel 7: Påføringsmetode

[0063]Eksempel 7.

[0064]Baseret på eksempel 1 tilvejebringer dette eksempel en påføringsmetode, hvorigennem verbascoside udøver virkninger på tværs af den komplette hudbarriere-reparationssekvens af epidermal cellefornyelse → forbedrede intercellulære forbindelser → lipid-matrix-genopfyldning → hyaluronsyresyntese → sårheling.

Den specifikke påføringsmetode er som følger.

[0065]Tilføj verbascoside til en topisk produktbase ved en forudbestemt massefraktion og omrør ensartet for at fremstille et færdigt produkt.

Påfør det færdige produkt på hudoverfladen en eller to gange dagligt.

Gennem penetration virker verbascoside på epidermale HaCaT-celler for at fremme celleproliferation og styrke tætte forbindelser.

Samtidig opregulerer det gen- og proteinekspressionen af ​​ACC , FASN og N-SMase, øger fedtsyresyntaseaktiviteten, opregulerer HAS2, HAS3 og CD44 og øger hyaluronsyreindholdet.

Fortsæt brugen i en til fire uger for at opnå en generel forbedring af hudbarrieren.

[0066]Specifikt varierer massefraktionen af ​​verbascoside i det topiske produkt fra 0,01 % til 5,0 %.

[0067]Brug 0,1-0,5 g af det færdige produkt pr. påføring og massér blidt i et til tre minutter efter påføring for at fremme optagelsen.

[0068]Det aktuelle produkt er en medicinsk bandage, et reparationsprodukt efter proceduren, et supplerende behandlingsprodukt til atopisk dermatitis, et hudplejeprodukt specielt beregnet til følsom hud eller et intensivt fugtgivende og reparerende hudplejeprodukt.

[0069]Hjælpestoffer kan også tilsættes under påføring af verbascoside.

Yderligere er excipiensen valgt blandt et fugtighedsbevarende middel, en emulgator, et konserveringsmiddel, en duft eller et beroligende middel.

Dosisformen af ​​den excipiensholdige sammensætning er valgt blandt en lotion, en creme, en gel, et serum eller en sheet-mask-opløsning.

 

Eksempel 8: Eksperimentelle materialer og udstyr

[0070]Eksempel 8.

[0071]Baseret på eksempel 1 og 7 er de eksperimentelle materialer anvendt i opfindelsen som følger.

[0072]De eksperimentelle celler var udødeliggjorte humane epidermale HaCaT-celler købt fra Shanghai Yaji Biotechnology.

Cellerne blev dyrket i høj-glukose DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin ved 37 grader i en atmosfære indeholdende 5% kuldioxid ved mættet fugtighed.

[0073]De eksperimentelle materialer var:

Echinacoside, forkortet Ech, fra National Institutes for Food and Drug Control, Kina.

Føtalt bovint serum, FBS, fra EXCELL.

Højglukose DMEM fra Gibco.

0,25% trypsin-EDTA fra Gibco.

Fosfatbufret saltvandspulver fra Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology.

CCK-8 Celleproliferation/Cytotoxicity Assay Kit fra TransGen Biotech.

Human Occludin, OCLN, ELISA Kit fra Wuhan CUSABIO.

Human Claudin-1, CLDN1, ELISA Kit fra Wuhan CUSABIO.

Fatty Acid Synthase, FAS, Activity Assay Kit fra Solarbio.

Human Hyaluronsyre ELISA Kit fra Wuhan CUSABIO.

Rekombinant humant EGF-protein, bærerfrit, fra R&D Systems.

DEPC fra Amresco.

M5 HiClear DL2000 DNA-markør fra Mei5 Biotechnology.

TRIzol Reagens fra Ambion.

5X All-In-One RT MasterMix fra abm.

EvaGreen Express 2X qPCR MasterMix–Low ROX fra abm.

Easy II Protein Quantitative Kit, BCA, fra TransGen Biotech.

RIPA lysisbuffer fra Boster.

Proteasehæmmer fra Boster.

Gede Anti-Kanin IgG H&L, HRP, fra Abcam.

Goat Anti-Mouse IgG H&L, HRP, fra Abcam.

Forfarvet proteinmarkør fra Solarbio.

-Mercaptoethanol fra Amresco.

PVDF-overførselsmembran, 0,45 μm, fra Millipore.

Glycin fra Sangon Biotech.

Glycerol fra Sangon Biotech.

SuperSignal West Pico PLUS fra Thermo Fisher.

Beta-Actin Loading Control Antibody, Mouse Monoclonal, fra Sino Biological.

ACC1 antistof fra Affinity.

FASN Antistof fra Affinity.

SMPD2-antistof fra Affinity.

Hyaluronan Synthase 2 Antibody, HAS2, fra Affinity.

HAS3 antistof fra Affinity.

CD44-antistof fra Affinity.

[0074]Det eksperimentelle udstyr bestod af:

SmartCell HF-90 kuldioxidcellekulturinkubator, Shanghai Lishen Scientific Equipment Co., Ltd. [上海力康仪器有限公司].

HF1200LC biologisk sikkerhedsskab fra samme producent.

DK-80 lavhastighedscentrifuge på bænk, Shanghai Feige Instrument Co., Ltd.

Heraeus Multifuge X1R højhastigheds kølecentrifuge, Thermo Fisher Scientific.

xMark mikropladespektrofotometer, Bio-Rad.

GL-88B vortex mixer, Haimen Qilin-Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.

Model 2500 gel billeddannelsessystem, Shanghai Tianneng.

MyCycler Thermal Cycler PCR-instrument, Bio-Rad.

7500 Fast Real-Time PCR-instrument, ABI.

Chemiscope 3000 kemiluminescens billeddannelsessystem, Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Co., Ltd.

Mini-PROTEAN Tetra-system proteinoverførselsapparat, Bio-Rad.

DYCZ-24DN elektroforeseapparat, Beijing Liuyi.

Oversætterens bemærkning: Producent- og instrumentbeskrivelser ovenfor følger den medfølgende kilde; katalogoplysninger blev ikke uafhængigt verificeret.

 

 

 

Eksempel 9: Eksperimentelle metoder

[0075]Eksempel 9.

[0076]Baseret på eksempel 1-8 var de eksperimentelle metoder anvendt i opfindelsen som følger.

CCK-8 Assay for celleproliferation

[0077]Forbered en enkeltcellesuspension af HaCaT-celler i komplet dyrkningsmedium ved en tæthed på 5×1045 x 10^45×104 celler/ml.

Så cellerne i en 96-brønds plade ved 100 μL pr. brønd.

Efter at have ladet cellerne binde sig i 24 timer ved 37 grader under 5 % kuldioxid, kasseres dyrkningsmediet og de forskellige teststoffer administreres. Inkluder en tom kontrolgruppe med n=5n=5n=5.

Efter 48 timers behandling kasseres mediet og tilsæt 100 μL frisklavet 10 % CCK-8 opløsning til hver brønd.

Fortsæt inkubationen i cellekulturinkubatoren i en time, og mål derefter den optiske tæthed ved 450 nm ved hjælp af en mikropladelæser.

Fedtsyresyntaseaktivitetsanalyse

[0078]Forbered en enkeltcellesuspension af HaCaT-celler i komplet dyrkningsmedium ved en tæthed på 5×1045 x 10^45×104 celler/ml og pod cellerne i dyrkningskolber.

Efter at have ladet cellerne binde sig i 24 timer ved 37 grader under 5 % kuldioxid, kasseres dyrkningsmediet og de forskellige teststoffer administreres.

Inkluder en tom kontrolgruppe og en positiv kontrolgruppe behandlet med rekombinant human epidermal vækstfaktor, rhEGF, ved 20 ng/mL, med n=3n=3n=3.

Efter 48 timers behandling, opsaml cellerne og mål fedtsyresyntaseaktivitet i henhold til assay-sættets instruktioner.

Hyaluronsyreindholdsanalyse

[0079]Forbered en enkeltcellesuspension af HaCaT-celler i komplet dyrkningsmedium ved en tæthed på 5×1045 x 10^45×104 celler/ml og pod cellerne i dyrkningskolber.

Efter at have ladet cellerne binde sig i 24 timer ved 37 grader under 5 % kuldioxid, kasseres dyrkningsmediet og de forskellige teststoffer administreres.

Inkluder en tom kontrolgruppe og en positiv kontrolgruppe behandlet med rhEGF ved 20 ng/mL, med n=3n=3n=3.

Efter 48 timers behandling, opsaml cellekultursupernatanterne og mål hyaluronsyreindholdet i henhold til assay-sættets instruktioner.

Kvantitativ omvendt transkriptions-PCR

[0080]Forbered en enkeltcellesuspension af HaCaT-celler i komplet dyrkningsmedium ved en tæthed på 5×1045 x 10^45×104 celler/mL og pod cellerne i plader med seks brønde.

Efter at have ladet cellerne binde sig i 24 timer ved 37 grader under 5 % kuldioxid, kasseres dyrkningsmediet og de forskellige teststoffer administreres.

Inkluder en tom kontrolgruppe og en positiv kontrolgruppe behandlet med rhEGF ved 20 ng/mL, med n=3n=3n=3.

Efter 48 timers behandling kasseres supernatanten og tilsæt 1 mL TRIzol til hver brønd for at frigøre og lysere cellerne, og sikre, at reagenset dækker cellelaget.

Ryst dyrkningsbeholderen gentagne gange, indtil cellerne frigives, og overfør materialet til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.

Udtræk totalt RNA og brug qRT-PCR til at bestemme ekspressionen af ​​ACC, FASN, N-SMase, HAS2, HAS3 og CD44.

Western Blotting

[0081]Forbered en enkeltcellesuspension af HaCaT-celler i komplet dyrkningsmedium ved en tæthed på 5×1045 x 10^45×104 celler/ml og pod cellerne i dyrkningskolber.

Efter at have ladet cellerne binde sig i 24 timer ved 37 grader under 5 % kuldioxid, kasseres dyrkningsmediet og de forskellige teststoffer administreres.

Inkluder en tom kontrolgruppe og en positiv kontrolgruppe behandlet med rhEGF ved 20 ng/mL, med n=3n=3n=3.

Efter 48 timers behandling, opsaml cellerne.

Ekstraher totalt protein og brug Western blotting til at bestemme ekspressionen af ​​ACC, FASN, N-SMase, HAS2, HAS3 og CD44.

Vurdering af Tight-Junction Protein Expression

[0082]Forbered en enkeltcellesuspension af HaCaT-celler i komplet dyrkningsmedium ved en tæthed på 5×1045 x 10^45×104 celler/ml og pod cellerne i dyrkningskolber.

Efter at have ladet cellerne binde sig i 24 timer ved 37 grader under 5 % kuldioxid, kasseres dyrkningsmediet og de forskellige teststoffer administreres.

Inkluder en tom kontrolgruppe med n=3n ​​= 3n=3.

Efter 48 timers behandling indsamles cellelysaterne og occludin og claudin-1 måles ved hjælp af ELISA i henhold til kitinstruktionerne.

Cell Scratch Assay

[0083]Forbered en enkeltcellesuspension af HaCaT-celler i komplet dyrkningsmedium ved en tæthed på 5×1055 x 10^55×105 celler/ml.

Udså 500 μL pr. brønd i en 24-brønds plade.

Efter cellevedhæftning administreres behandlingerne, idet cellerne opdeles i en blank kontrolgruppe, en positiv kontrolgruppe behandlet med føtalt bovint serum og teststofgrupper.

Behandl i 48 timer.

Efter behandlingen skal du forsigtigt skabe en lige ridse ved hjælp af en pipettespids.

Udskift mediet med serumfrit medium i alle grupper undtagen den positive kontrolgruppe.

Fotografer de ridsede områder ved 0, 24 og 48 timer.

Brug ImageJ til at beregne ridseområdet og vurdere cellemigrationskapacitet.

 

Eksempel 10: Fugt-retention evaluering

[0084]Eksempel 10.

[0085]En in vitro gravimetrisk metode blev brugt til at evaluere den fugtgivende ydeevne af serum indeholdende Ver, Ech eller glycerin.

Vej specificerede mængder af forbehandlet prøve 1, indeholdende 2% Ver; Prøve 2, indeholdende 2% Ech; og den positive kontrol, der indeholder 5 % glycerin.

Opbevar prøverne i et kammer med konstant temperatur og konstant fugtighed ved 25 grader og 50 % relativ luftfugtighed.

Vej prøverne på forskellige tidspunkter, og plot fugt-retentionskurver.

[0086]Fugtfastholdelsesgraden beregnes som:

Fugttilbageholdelseshastighed (%)=M2−M0M1−M0×100%\\text{Fugttilbageholdelseshastighed (\\%)}=\\frac{M_2-M_0}{M_1-M_0}\\ gange100\\%Fugttilbageholdelseshastighed (%)=M1​−M0​M2​−M0​​×100 %

[0087]Hvor:

[0088]M0M_0M0​ er massen af ​​den tomme plade, i gram.

[0089]M1M_1M1​ er massen af ​​glaspladen efter prøvetilsætning, i gram.

[0090]M2M_2M2​ er massen efter opbevaring i en ekssikkator i flere timer, i gram.

Oversætterens note: Afsnit [0085] beskriver opbevaring i et kammer med kontrolleret temperatur og kontrolleret fugtighed, mens [0090] henviser til en ekssikkator. Begge beskrivelser er tilbageholdt fra kilden.

 

Eksperimentelle resultater

[0091]De eksperimentelle resultater af dette eksempel er som følger.

Effekter på HaCaT-celleproliferation

[0092]Som vist i figur 2 havde forskellige Cistanche-ekstrakter forskellige virkninger på HaCaT-cellelevedygtighed.

Ver og POL øgede cellelevedygtigheden signifikant, med P<0.05P < 0.05P<0.05, and Ver produced the highest viability.

Virkninger på fedtsyresyntaseaktivitet

[0093]Som vist i figur 3 er intercellulære lipider i stratum corneum kerne-"mørtel"-komponenten af ​​hudens "mursten-og-mørtel"-struktur.

Ceramider, kolesterol og frie fedtsyrer danner en tæt lamellær dobbeltlagsstruktur i specifikke proportioner.

Vedligeholdelse af normal lipidsyntese kan forstærke denne struktur, forhindre vandtab, modstå ydre skader, opretholde balancen i hudmikrobiomet og fremme selvreparation.

Det kan derved behandle tørhed, følsomhed og reduceret hudforsvarskapacitet ved deres kilde.

[0094]Fedtsyresyntase beskrives som et kernehastighedsbegrænsende enzym og en central forsyningsmotor, der regulerer hudens lipidsyntese.

Dens hovedfunktion er at katalysere syntesen af ​​palmitinsyre, C16:0, fra acetyl-CoA og malonyl-CoA. Palmitinsyre beskrives som den vigtigste endogene langkædede mættede fedtsyre i huden.

Palmitinsyre har to funktioner.

For det første, som en grundlæggende strukturel byggesten, bruges det direkte i syntesen af ​​stratum-corneum barrierelipider, herunder ceramider og frie fedtsyrer, hvilket giver det materielle grundlag for lamellær dobbeltlagsdannelse.

For det andet, som et vigtigt forløber- og signalmolekyle, kan det bearbejdes yderligere af nedstrøms elongaser, såsom ELOVL1, til meget langkædede fedtsyrer. Disse karakteristiske fedtsyrer er nødvendige for barriereintegritet.

Fedtsyresyntaseaktiviteten bestemmer derfor direkte forsyningen af ​​råmaterialer, der er tilgængelige til hudens egen produktion af barrierelipider.

Opregulering af dets funktion er et indledende og kritisk trin i at fremme epidermal lipidsyntese og derved reparere og styrke den fysiske hudbarriere, hvilket i sidste ende understøtter fugtretention og forsvar.

[0095]Dataene viste, at den positive kontrol rhEGF og Ver signifikant øgede fedtsyresyntaseaktivitet med P<0.05P < 0.05P<0.05.

POL, POLS, RE1 og RE2 øgede ikke fedtsyresyntaseaktivitet.

Although RE2 increased fatty acid synthase activity, the difference was not statistically significant, with P>0.05P > 0.05P>0.05.

Oversætterens note: Kilden inkluderer først RE2 blandt materialer, der ikke øgede aktiviteten, og rapporterer derefter en ikke-signifikant stigning for RE2. Denne uoverensstemmelse bibeholdes.

 

Effekter på indholdet af hyaluronsyre

[0096]Som vist i figur 4 er hyaluronsyre et naturligt forekommende polysaccharid i huden med en stærk vandbindende kapacitet, beskrevet i kilden som hovedsageligt til stede i dermis og stratum corneum.

Øget hyaluronsyreindhold kan holde på fugten på dybere niveauer, opretholde en sund hudstruktur, give antioxidanter og antiinflammatoriske virkninger, fremme sårheling og reparation og forbedre stratum-corneum-funktionen.

Disse effekter beskrives som at producere hydrering, fylde og modstandsdygtighed indefra.

[0097]Dataene viste, at den positive kontrol rhEGF, Ver og RE2 signifikant øgede hyaluronsyreindholdet med P<0.05P < 0.05P<0.05.

POL, POLS og RE1 øgede ikke hyaluronsyreindholdet.

 

Sammenligning af ekstraktklasser og renset Verbascoside

[0098]Cistanche indeholder hovedsageligt phenylethanoidglycosider og polysaccharider.

Aktiviteterne af polysaccharidekstraktet, POL; phenylethanoidglycosidekstrakter, POLS, RE1 og RE2; og verbascoside, Ver, blev derfor sammenlignet.

Resultaterne i figur 2-4 indikerer, at Cistanche phenylethanoid glycosid-ekstrakter fremstillet ved forskellige metoder og den enkelte forbindelse udviste forskellige aktiviteter til at fremme HaCaT-celleproliferation, øge fedtsyresyntaseaktivitet og øge hyaluronsyreindholdet.

Kun Ver udviste aktivitet i alle tre områder, som opsummeret i tabel 1.

[0099]–[0101] Disse afsnitsnumre og indholdet af tabel 1 var ikke til stede i den medfølgende kilde. Ingen oversættelse eller rekonstruktion er mulig for det manglende materiale.

Tabel 1. Sammenfatning af bioaktivitet af forskellige prøver

Indeks	Blank kontrol	Positiv kontrol	POL	POLS	RE1	RE2	Ver
Cellelevedygtighed (%)	100 ± 7.008	/	119.008 ± 7.379*	105.312 ± 6.494	85.851 ± 8.381	95.234 ± 10.065	128.894 ± 9.528*
FAS-aktivitet (U/mg prot)	2.712 ± 0.419	18.488 ± 4.56*	3.786 ± 1.715	2.399 ± 0.717	2.145 ± 0.889	9.34 ± 10.756	10.63 ± 2.228*
HA-indhold (ng/mL)	10.908 ± 0.968	19.925 ± 4.306*	6.881 ± 2.411	6.321 ± 1.021	6.53 ± 1.342	16 ± 2.531*	17.86 ± 3.27*

 

Yderligere sammenligning af CTE, Echinacoside og Verbascoside

[0102]Som vist i figur 5 indbefatter de vigtigste phenylethanoidglycosider i Cistanche echinacosid og verbascosid.

Virkningerne af Cistanche total phenylethanoid glycosid ekstrakt, CTE, indeholdende 22,6% echinacosid og 4,5% verbascoside; echinacoside, Ech; og verbascoside, Ver, på HaCaT-celleproliferation blev derfor sammenlignet yderligere.

[0103]Dataene viste, at CTE, Ech og Ver alle fremmede HaCaT-celleproliferation.

CTE og Ver producerede de stærkeste effekter, hvilket tyder på beskyttende virkninger på hudceller.

Yderligere virkninger på fedtsyresyntaseaktivitet

[0104]Som vist i figur 6 var virkningerne på fedtsyresyntaseaktivitet som følger.

[0105]Dataene viste, at den positive kontrol rhEGF, Ech og Ver signifikant øgede fedtsyresyntaseaktivitet med P<0.05P < 0.05P<0.05.

CTE øgede ikke fedtsyresyntaseaktiviteten.

 

Ekspression af gener og proteiner forbundet med fedtsyresyntese

[0106]Figur 7-9 viser effekterne på ekspressionen af ​​gener og proteiner forbundet med fedtsyresyntese.

[0107]ACC og FASN beskrives som det hastighedsbegrænsende enzym og kernemotoren i lipid-anabolisme.

Sammen katalyserer de dannelsen af ​​langkædede fedtsyrer, herunder palmitinsyre, hvilket giver essentielle råmaterialer til syntesen af ​​vigtige barrierelipider såsom ceramider.

N-SMase er en nøgleinitiator til lipidnedbrydning og stresssignalering med en dobbeltrolle.

Det aktiveres under skade og hydrolyserer sphingomyelin for at generere signalceramider, der udløser inflammation og apoptose og undertrykker normal lipidsyntese.

I normale celler har det imidlertid en regulerende rolle i lipidmetabolismen.

[0108]Som vist i figur 7-9 indikerede qPCR- og Western blot-resultater, at Ver ligesom rhEGF signifikant opregulerede gen- og proteinekspressionen af ​​ACC , FASN og N-SMase med P<0.05P < 0.05P<0.05, and the effects were comparable.

Resultaterne indikerer, at Ver opregulerer ACC og FASN for at regulere cellulær lipidsyntese til membrankonstruktion, energilagring eller sekretion.

Samtidig kan opregulering af N-SMase aktivere sfingolipid metabolisk cyklus.

De producerede ceramider er ikke kun stresssignaler. Under normale fysiologiske forhold er de også vigtige forløbere for syntesen af ​​andre komplekse sphingolipider, såsom glycosphingolipider, eller for dynamisk membranomdannelse.

Således forbedrer koordineret opregulering af disse tre gener og proteiner den overordnede cellulære anabolske aktivitet og membranomdannelseskapacitet.

 

Yderligere effekter på indholdet af hyaluronsyre

[0109]Som vist i figur 10 indikerede dataene, at rhEGF, CTE, Ech og Ver alle signifikant øgede hyaluronsyreindholdet med P<0.05P < 0.05P<0.05.

Rækkefølgen af ​​virkning var CTE, efterfulgt af Ver, efterfulgt af Ech.

 

Ekspression af gener og proteiner forbundet med hyaluronsyresyntese

[0110]Som vist i figur 11-13 danner HAS2, HAS3 og CD44 en "syntese-sensing-respons" feedback-loop i hyaluronsyremetabolisme i HaCaT-celler.

HAS2 og HAS3 er de centrale katalytiske syntesenzymer.

HAS2 producerer hovedsageligt hyaluronsyre med høj molekylvægt og er forbundet med opretholdelse af hudens homeostase og antiinflammatoriske virkninger.

HAS3 har en tendens til at producere hyaluronsyre med lavere molekylvægt og deltager mere direkte i processer, herunder cellemigration og -proliferation.

CD44 er den vigtigste celleoverfladereceptor for hyaluronsyre.

Det medierer ikke kun intracellulær og ekstracellulær signaltransmission, der involverer hyaluronsyre, men regulerer også dynamisk hyaluronsyre gennem endocytose og genanvendelse og regulerer på sin side HAS2 og HAS3 ekspression og aktivitet.

[0111]Som vist i figur 11-13 indikerede qPCR og Western blot resultater, at Ver ligesom rhEGF signifikant opregulerede gen- og proteinekspressionen af ​​HAS2, HAS3 og CD44 med P<0.05P < 0.05P<0.05.

De regulatoriske virkninger af Ver på HAS2-, HAS3- og CD44-genekspression var større end dem af rhEGF.

Resultaterne indikerer, at Ver regulerer HAS2, HAS3 og CD44 for at kontrollere den komplette hyaluronsyre "syntese-samling-signal transmission" proces, hvilket bidrager til epidermal hydrering, reparation og barrierefunktion.

Effekter på Tight-Junction Protein Expression

[0112]Vedligeholdelse af hudens lipid- og hyaluronsyreproduktion beskrives som at give fundamental, synergistisk støtte til og stabilisering af tætte forbindelser mellem HaCaT-celler.

Tilstrækkelige lipider tillader keratinocytter at danne komplette, organiserede intercellulære lipid-dobbeltlag.

Disse strukturer beskrives ikke kun som den fysiske ramme af barrieren, men også som et stabilt, hydrofobt strukturelt miljø til tight-junction proteinsamling og forankring.

Samtidig hjælper den gunstige hydreringstilstand, der opretholdes af hyaluronsyre, med at sikre normal keratinocytmetabolisme og signalering.

Gennem veje, der involverer receptorer såsom CD44, regulerer hyaluronsyre også indirekte tight-junction proteinekspression og distribution.

Sammen giver lipider og hyaluronsyre det fysiske og biokemiske grundlag, der er nødvendigt for dannelse og vedligeholdelse af tætte forbindelser ud fra de respektive perspektiver af strukturel stabilitet og mikromiljømæssig homeostase.

De styrker derved fysiske intercellulære forbindelser og overordnet barriereintegritet.

[0113]Ovenstående resultater indikerede, at Ver udviste den stærkeste aktivitet til at fremme hudens lipid- og hyaluronsyreproduktion.

Yderligere undersøgelse af dets virkninger på intercellulære tight junctions viste, at CTE, Ech og Ver alle signifikant fremmede ekspressionen af ​​tight-junction proteinet claudin-1, med P<0.05P < 0.05P<0.05, as shown in Figure 14.

Som vist i figur 15 fremmede kun Ech og Ver signifikant occludin-ekspression.

Effekten af ​​Ver var betydeligt større end Ech, med P<0.05P < 0.05P<0.05.

Dette var i overensstemmelse med den stærkeste aktivitet, der tilskrives Ver til at fremme hudens lipid- og hyaluronsyreproduktion.

 

Effekter på sårheling

[0114]Som vist i figur 16-17 deltager HAS3 direkte i processer, herunder cellemigration og -proliferation.

CD44 transmitterer information fra hyaluronsyre ind i celler og regulerer i sidste ende cellemigration, proliferation og hydrering, hvilket spiller en central rolle i sårheling, hudfugtning og barrierehomeostase.

De foregående eksperimenter viste, at verbascoside signifikant fremmede HAS3- og CD44-ekspression.

Dens evne til at fremme sårheling blev derfor undersøgt yderligere.

[0115]Som vist i figur 16-17 indikerede resultaterne, at CTE, Ech og Ver alle fremmede sårheling.

Imidlertid viste kun Ver en signifikant fremmende effekt efter 24 timer.

Det udviste den stærkeste sårhelingsfremmende aktivitet, i overensstemmelse med dets betydelige fremme af HAS3-gen- og proteinekspression.

Redaktionel kvalifikation: Den eksperimentelle metode, der leveres til dette resultat, er en celle-ridseanalyse. "Sårheling" er den terminologi, der bruges i kilden og skal her ikke fortolkes som et påvist klinisk resultat.

 

Formuleringernes fugttilbageholdelsesevne

[0116]Som vist i figur 18 blev prøvens fugttilbageholdelseskapacitet vurderet ud fra tendenserne i fugttilbageholdelseskurverne for at evaluere hudens fugtgivende ydeevne.

Dataene viste, at fugtretentionskurven for prøve 1 var over dem for prøve 2 og den positive kontrol.

Under forhold på 25 grader og 50 % relativ luftfugtighed havde prøve 1 en bedre fugtgivende ydeevne end prøve 2 og 5 % glycerinkontrollen, hvilket indikerer den stærkeste fugtgivende ydeevne.

Prøve 1 indeholdt Ver, og prøve 2 indeholdt Ech.

Ifølge kilden indikerer disse resultater, at Ver, når det inkorporeres i produkter, har bedre homogenitet og fugtgivende aktivitet end Ech, som opsummeret i tabel 2.

[0117]Tabel 2. Sammenfatning af aktiviteterne for forskellige prøver.

Tabelindholdet var ikke inkluderet i den medfølgende kilde.

[0118]Bemærk: [Betydningssymbolet blev ikke gengivet i den medfølgende tekst.] Sammenlignet med den tomme kontrolgruppe, P<0.05P < 0.05P<0.05.

 

Overordnet fortolkning præsenteret i offentliggørelsen

[0119]De foregående resultater indikerer, at verbascoside udviser enestående fugtgivende aktivitet ved præcist at aktivere en komplet, lukket kredsløbs-hudbarriere-reparationsmekanisme.

Det virker først på basallaget for at accelerere epidermal cellefornyelse og ordnet differentiering betydeligt, hvilket giver tilstrækkelige cellulære byggesten til barrierekonstruktion.

Det fremmer derefter styrkelsen af ​​tætte forbindelser og desmosomale strukturer mellem keratinocytter, forstærker fysisk forankring mellem celler og øger barrieretæthed og mekanisk styrke.

Samtidig aktiverer den effektivt nøgleenzymer i lipidmetabolismen og genopbygger den intercellulære lipidmatrix og fylder "mørtel"-mellemrummene mellem "klodserne" for at forhindre vandtab.

Endelig, ved at opregulere hyaluronsyresyntase-ekspression, øger den samtidig hyaluronsyreindholdet i dermis og epidermis, og optager og tilbageholder betydelige mængder vand.

Dette danner en komplet funktionel sløjfe, der omfatter fornyelse ved kilden, strukturel forstærkning, matrixopfyldning og vandlagring.

Det kan derved opnå en sekvens med lukket sløjfe med "fremme celleproliferation → styrkelse af fysiske intercellulære forbindelser → fremme lipid- og hyaluronsyreproduktion → fremme sårheling."

Kilden konkluderer, at det giver bedre påføringseffekter end echinacosid fra Cistanche og det almindeligt anvendte fugtighedsbevarende middel glycerin og kan bruges som et hudbeskyttende middel i funktionel hudpleje og topiske produkter.

[0120]De foregående beskrivelser er kun specifikke udførelsesformer for opfindelsen.

Opfindelsens beskyttelsesomfang er ikke begrænset til disse udførelsesformer.

Enhver ændring eller udskiftning, som en fagmand let kunne forestille sig inden for det tekniske omfang, der er beskrevet i opfindelsen, falder inden for beskyttelsesomfanget af opfindelsen.

I overensstemmelse hermed skal beskyttelsesomfanget af opfindelsen bestemmes af kravene.