Cistanche Deserticola polysaccharid kan svække osteoklastogenese og knogleresorption

kontakt: emily.li@wecistanche.com

Dezhi Song, et al

Osteoporose er en metabolisk sygdom karakteriseret ved osteopeni og knoglemikrostrukturel forringelse. Osteoklaster er de primære effektorceller, der nedbryder knoglematrixen, og deres unormale funktion fører til udvikling af osteoporose. Akkumulering af reaktive oxygenarter (ROS) under cellulær metabolisme fremmer osteoklastproliferation og -differentiering, og spiller derfor en vigtig rolle i osteoporose.Cistanche deserticolapolysaccharid (CDP) besidderantitumor, anti‐inflammatorisk, ogantioxidant aktivitet. Imidlertid er virkningen af ​​CDPon osteoklaster uklar. I denne undersøgelse blev tartrat-resistent sur phosphatase-farvning, immunfluorescens, omvendt transkriptionspolymerase-kædereaktion og western blot-analyse brugt til at demonstrere, at CDP hæmmede osteoklastogenese og hydroxyapatitresorption. Derudover hæmmede CDP også ekspressionen af ​​osteoklastmarkørgener, herunder Ctsk, Mmp9 og Acp5, og havde ingen effekt på receptoraktivator af nuklear faktor κB (RANK) ekspression. Mekanistiske analyser afslørede, at CDP øger ekspressionen af ​​antioxidantenzymer for at dæmpe RANKL-medieret ROS-produktion i osteoklaster og hæmmer nuklear faktor af aktiverede T-celler og mitogen-aktiveret proteinkinase-aktivering. Disse resultater tyder på, at CDP kan repræsentere et kandidatlægemiddel til behandling af osteoporose forårsaget af overdreven osteoklastaktivitet.

SØGEORD:knogle resorption, Cistanchedeserticolapolysaccharid, MAPK, osteoklast, reaktive oxygenarter

Klik her for at få mere information om Cistanche

1. INTRODUKTION

Balancen mellem knogledannelse, medieret af osteoblaster, og knogleresorption, medieret af osteoklaster, spiller en afgørende rolle i at opretholde knoglemetabolisk homeostase (Manolagas, 2000; Zhu et al., 2018). Når knogleresorptionen overstiger knogledannelsen, opstår osteoporose, som er karakteriseret ved reduceret knoglemasse og knoglemikrostrukturel skade (Ikeda, 2008). Osteoporose er en almindelig sygdom hos ældre individer og postmenopausale kvinder, og dens patogenese er ikke fuldt ud klarlagt (Cooper & Melton, 1992). Østrogenmangel er en primær årsag til osteoporose (Manolagas, O'Brien, & Almeida, 2013). Derudover kan reaktive oxygenarter (ROS) induceres af receptoraktivator af nuklear faktorκB-ligand (RANKL) og er forbundet med osteoklastdannelse (Yip et al., 2005) og kan således bidrage til udviklingen af ​​osteoporose (Manolagas, 2010) ). Nogle undersøgelser har fundet, at Nrf2-antioxidantmangel øger ROS-niveauer og fremmer rang-induceret osteoklastdifferentiering (Hyeon, Lee, Yang, & Jeong, 2013). Derfor bør reduktion af ROS-produktion under osteoklastdifferentiering vurderes som en terapeutisk strategi til behandling af osteoporose.

Osteoklaster er afledt af den hæmatopoietiske slægt af monocyt eller makrofag og er de eneste flerkernede celler, der udførerknogle resorption(Teitelbaum, 2000). Derfor har forskning, der involverer osteoklastdannelse, stor betydning for udvikling af effektive behandlinger forknoglestofskiftesygdomme(Lorenzo, 2017). Makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) og RANKL, produceret af osteoblaster og aktiverede T-celler, er vigtige cytokiner, der regulerer osteoklastogenese (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003). RANKL inducerer ekspressionen af ​​den nukleare faktor af aktiverede T-celler (NFATc1), som er en kritisk transkriptionsfaktor, der er aktiv under osteoklastdannelse (Ishida et al., 2002). Aktiveret NFATc1 fremmer ekspressionen af ​​osteoklastmarkørgener såsom tartrat-resistent sur phosphatase (TRAcP) og cathepsin K (CTSK), der regulerer osteoklastogenese og osteoklastfunktion (Balkan et al., 2009; Crottiet al., 2008). Disse resultater tyder på, at CDP kan bruges til at behandle osteoporose forårsaget af overdreven osteoklastisk knogleresorption.

2|MATERIALER OG METODER

2.1|Materialer

CDP (renhed > 98 procent) blev købt fra Solarbio (Beijing, Kina) og fremstillet i en stamkoncentration på 1 mM i phosphatbufret saltvand (PBS). Antistoffer er specifikke for c-Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, phosphoryleret (p)-ERK, p-p38, p-JNK og -actin blev opnået fra julemanden Cruz Biotechnology (San Jose, CA). Antistoffer mod V-ATPase d2 blev produceret som tidligere beskrevet (H. Feng et al., 2009). 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) og luciferase assaysystemet blev opnået fra Promega (Sydney, Australien) . Rekombinant M-CSF blev købt fra R&D Systems (Minneapolis, MN). Rekombinant GST-rRANKL-protein blev udtrykt og oprenset som tidligere beskrevet (Xu et al., 2000).

2.2|Cellekultur

RAW264.7-celler (musemakrofagceller) blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og dyrket i modificeret minimalt essentielt medium (Thermo FisherScientific, Scoresby, Australien) suppleret med 10 procent føtalt bovint serum, 2 mM af L-glutamin, 100 U/ml penicillin og 100 ug/ml streptomycin (komplet medium). Knoglemarvs-afledte monocytter (BMM'er) blev isoleret fra 6 uger gamle C57BL/6J-mus, som blev aflivet i henhold til procedurer godkendt af den dyreetiske komité ved University of Western Australia (RA/3/100/1244). Lange knogler blev dissekeret fri for blødt væv, og knoglemarven blev skyllet fra lårbenet og skinnebenet, som derefter blev dyrket i et komplet medium i nærværelse af M-CSF (50 ng/ml).

2.3|Osteoklastogenese assay

BMMs were plated into 96‐well culture plates at a density of 6 × 103cells per well and treated with a complete medium containing M‐CSF(50 ng/ml) and GST‐rRANKL (100 ng/ml), in the presence or absence of varying concentrations of CDP. The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4%paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells(>tre kerner) blev identificeret som osteoklaster.

2.4|Cytotoksicitetsassays

BMM'er blev podet i 96-brøndsplader med 6 × 103 celler pr. brønd og efterladt natten over for at klæbe. Den følgende dag blev cellerne inkuberet med varierende koncentrationer af CDP. Efter yderligere 48 timer blev MTS-opløsning (20 µl/brønd) tilsat og inkuberet med celler i 2 timer. Absorbansen ved 490 nm blev bestemt med en mikropladelæser (MultiscanSpectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA).

2,5|Immunfluorescerende farvning

BMM'er blev podet ved en tæthed på 6 × 103 celler pr. brønd i nærværelse af M-CSF (50 ng/ml) natten over. Celler blev derefter stimuleret med M-CSF og GST-rRANKL (100 ng/ml), indtil modne osteoklaster blev dannet. Osteoklasterne blev derefter behandlet med varierende koncentrationer af CDP i 48 timer før fiksering med 4 procent paraformaldehyd, permeabilisering med 0,1 procent Triton X-100-PBS og blokering med 3 procent bovint serumalbumin i PBS. Forberedte celler blev inkuberet med rhodamin-konjugeret phalloidin i 45 minutter i mørke for at farve for F-actin. Celler blev derefter vasket med PBS, kerner modfarvet med 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) og monteret med dækglas til konfokal mikroskopi.

2,6|Hydroxyapatit-resorptionsassay

For at måle osteoklastaktivitet blev BMM'er (1 × 105 celler pr. brønd) dyrket på kollagenbelagte plader med seks brønde (BD Biocoat; ThermoFisher Scientific) stimuleret med GST-rRANKL (100 ng/ml) og M-CSF (50 ng/ml) ) indtil modne osteoklaster blev genereret (Zhou et al., 2016). Celler blev derefter forsigtigt løsnet fra pladen ved hjælp af celledissociationsopløsning (Sigma-Aldrich), og lige mange modne osteoklaster blev podet på individuelle brønde hydroxyapatit-coatede 96-brønds plader (Corning Osteoassay, Corning, NY). Modne osteoklaster blev inkuberet i et medium indeholdende-rRANKL og M-CSF med eller uden CDP ved de angivne koncentrationer. Efter 48 timer blev halvdelen af ​​brøndene immunhistokemisk farvet for TRAcP-aktivitet som beskrevet ovenfor for at vurdere antallet af multinukleerede celler pr. brønd. De resterende brønde blev bleget i 10 minutter for at fjerne celler og tillade måling af de resorberede områder. Resorberede områder blev fotograferet under standard lysmikroskopi, og Ima geJ softwaren (National Institutes of Health, Bethesda, MD) blev brugt til at kvantificere det procentvise areal af hydroxyapatitoverflade resorberet af osteoklasterne.

2,7|Luciferase reporter assays

For at undersøge NFATc1-transkriptionel aktivering blev RAW264.7-celler stabilt transficeret med en NFATc1-responsiv luciferase-reporterkonstruktion (Cheng et al., 2018; van der Kraan et al., 2013). Transficerede celler blev dyrket i plader med 48 brønde ved en tæthed på 1,5 × 105 celler pr. brønd og forbehandlet med forskellige koncentrationer af CDP i 1 time. Efter forbehandling blev celler stimuleret med GST-rRANKL (100 ng/ml) i 24 timer, og luciferaseaktivitet blev målt ved hjælp af luciferase reporter assaysystemet i henhold til producentens protokol (Promega).

2,8|Kvantitativ omvendt transkriptionspolymerasekædereaktion (RT-PCR) analyse

Total RNA blev isoleret fra celler under anvendelse af Trizol-reagens i henhold til producentens protokol (Thermo Fisher Scientific). Komplementært DNA blev syntetiseret under anvendelse af Moloney murin leukæmivirus revers transkriptase med 1 ug RNA template og oligo-dT primere. Polymerasekædereaktionsamplifikation af specifikke sekvenser blev udført ved hjælp af følgende program: 94 grader i 5 minutter, efterfulgt af 30 cyklusser af 94 grader i 40 s, 60 grader i 40 s og 72 grader i 40 s, og et sidste forlængelsestrin på 5 min ved 72 grader. Den detaljerede information om specifikke primere er vist i tabel 1. Relative messenger-RNA-niveauer blev beregnet ved normalisering til ekspressionen af ​​husholdningsgenet Hmbs.

2,9|Western blot analyse

BMM'er blev dyrket i et komplet medium med M-CSF i plader med seks brønde og stimuleret med GST-rRANKL (100 ng/ml) i de angivne tider. Celler blev lyseret i radioimmunpræcipitationslysebuffer, og proteiner blev opløst ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese og overført til poly(vinylidenfluorid)-membraner (GE Healthcare, Silverwater, Australien). Membranerne blev blokeret i 5 procent skummetmælk i 1 time og derefter probet med forskellige specifikke primære antistoffer under forsigtig rystning natten over ved 4 grader. Membraner blev vasket og efterfølgende inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugerede sekundære antistoffer. Antistofreaktivitet blev derefter påvist med forstærket kemiluminescensreagens (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) og visualiseret med en Image-quant LAS 4000 (GE Healthcare).

2,10|Intracellulær ROS-detektion

Intracellulære ROS-niveauer blev påvist ved hjælp af et 2′,7′‐dichlorfluoresceindiacetat cellulært ROS-detektionsassaykit (Abcam, Melbourne, Australien). BMM'er (5 × 103 celler pr. brønd) blev dyrket i plader med 96 brønde og behandlet med RANKL (100 ng/ml), M-CSF (50 ng/ml) og CDP i 72 timer. Intracellulære ROS-niveauer blev målt ved hjælp af 2′,7′-dichlorfluoresceindiacetat, som oxideres til fluorescerende CSF i nærvær af ROS. Celler blev vasket i Hanks buffer og inkuberet i mørke i 30 minutter med 10 µM DCFH-DA. Billeder blev taget ved hjælp af konfokal mikroskopi.

2.11|Statistiske analyser

Alle data er repræsentative for mindst tre eksperimenter udført i tre eksemplarer, medmindre andet er angivet. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. Envejs-variansanalyse efterfulgt af Student-Newman-Keuls-post hoc-test blev brugt til at bestemme betydningen af ​​forskelle mellem resultater, hvor p < 0.05="" blev="" betragtet="" som="">

3|RESULTATER

3.1|CDP hæmmer RANKL-induceret osteoklastogenese og osteoklastfusion

For at bestemme, om CDP kan undertrykke RANKL-induceret osteoklastdannelse, udførte vi først et osteoklastogeneseassay ved hjælp af muse-BMM'er (Liu et al., 2013; Song et al., 2016). BMM'er blev behandlet med RANKL og M-CSF i 5 dage med stigende koncentrationer af CDP. CDP reducerede antallet af TRAcP-positive multinukleerede celler, når koncentrationen af ​​CDPreached 5 µM eller højere (figur 1a,b). For at evaluere CDP-toksicitet og bekræfte, at disse resultater ikke var en afspejling af celledød eller antal, udførte vi et MTS-assay. BMM'er blev behandlet med RANKL og M-CSF i 48 timer med varierende doser af CDP. CDP havde ingen effekt på BMM-proliferation ved en koncentration på 15 µMor mindre (figur 1c).

For at teste virkningerne af CDP på ​​osteoklastfusion blev osteoklaster induceret med RANKL- og M-CSF-behandling, med eller uden varierende doser af CDP. Osteoklaster blev farvet med rhodamin-phalloidin og DAPI for at vurdere antallet af kerner pr. osteoklast (figur 2a). Både antallet af osteoklaster og det gennemsnitlige antal kerner pr. osteoklast faldt efter CDP-behandling (5-10 µM; figur 2b, c). Derfor havde CDP hæmmende virkninger på RANKL-induceret osteoklastogenese og osteoklastfusion på en dosisafhængig måde.

3.2|CDP dæmper RANKL-induceret osteoklastisk hydroxyapatit-resorptionsaktivitet

Et hydroxyapatitresorptionsassay blev udført for at påvise effekten af ​​CDP på ​​osteoklastfunktionen (figur 3a). Efter en 24-timers inkubation ændredes antallet af osteoklaster pr. brønd ikke, mens hydroxyapatitresorptionsområdet blev signifikant reduceret ved behandling med 5 og 10 µM CDP sammenlignet med kontrolgrupper (figur 3b, c). Disse resultater viser, at CDP har stærke inhiberende virkninger på både osteoklastdannelse og osteoklastresorptionsaktivitet uden nogen cytotoksiske virkninger.

3.3|CDP hæmmer osteoklastmarkørgenekspression

For yderligere at undersøge de hæmmende virkninger af CDP på ​​osteoklastogenese og osteoklastisk knogleresorption blev BMM'er behandlet med RANKL og M-CSF i 5 dage med varierende koncentrationer af CDP.RT-PCR blev derefter udført for at påvise ekspressionen af ​​osteoklastmarkørgener. Ekspressionen af ​​Nfatc1, en afgørende transkriptionsfaktor under osteoklastogenese, blev hæmmet af CDP på ​​en dosisafhængig måde (figur 4a). Derudover nedregulerede CDP (5 og 10 µM) ekspressionen af ​​knogleresorptionsrelaterede gener, herunder Mmp9, Ctsk og Acp5 (figur 4bd).

3.4|CDP undertrykker NFATc1-aktivitet og nedstrøms proteinekspression

For at undersøge effekten af ​​CDP på ​​RANKL-induceret NFATc1-aktivitet blev der udført et luciferase-reporter-assay. Behandling med CDP, ved koncentrationer på 5 µM og højere, hæmmede signifikant RANKL-induceret NFATc1-aktivitet (figur 5a). Derudover viste western blot-analyse, at CDP signifikant undertrykte proteinekspression af NFATc1 og c-Fos i BMM'er behandlet med RANKL og M-CSF i 3 og 5 dage (figur 5b). Desuden blev ekspressionen af ​​osteoklastfunktionsrelaterede proteiner, såsom V-ATPase-d2 og CTSK, nedreguleret i nærvær af CDP sammenlignet med kontrolgrupper. CDP havde imidlertid ingen effekt på RANK-ekspression (figur 5b).

3,5|CDP fremmer ekspressionen af ​​antioxidantenzymer for at fjerne ROS-produktion under RANKL-induceret osteoklastogenese

For at udforske den underliggende mekanisme for CDP-afhængig osteoklastogenesehæmning blev BMM'er behandlet med RANKL (100 ng/ml) og M-CSF (50 ng/ml) sammen med PBS eller CDP i 72 timer. Vi undersøgte effekten af ​​CDP på ​​intracellulær ROS-produktion stimuleret af RANKL. Intracellulære ROS-niveauer blev øget ved RANKL-behandling, som blev svækket af CDP (5 og 10 µM; figur 6a). Både antallet af ROS-positive celler og intensiteten af ​​ROS-farvning blev reduceret ved CDP-behandling på en dosisafhængig måde (figur 6b, c). Western blot-analyse viste, at CDP fremmede thioredoxin (TRX1) og glutathionreduktase (GSR) ekspression, mens det undertrykkede ekspressionen af ​​inducerbar nitrogenoxidsyntase (NOS2) i BMM'er, som blev behandlet med RANKL og -CSF i 3 dage (figur 6d).

For yderligere at undersøge, om CDP undertrykte osteoklastdifferentiering ved at reducere ROS-produktion, behandlede vi derefter BMM'er med peroxid (10 µM) for at efterligne den høje ROS-status i celler. BMM'er blev induceret af RANKL og M-CSF i 3 dage, og resultaterne af western blot-analyse og RT-PCR viste, at peroxid fremmede NFATc1- og c-Fos-ekspression sammenlignet med kontrolgrupperne. I overensstemmelse med resultaterne i figur 5 blev ekspressionen af ​​NFATc1 og c-Fos undertrykt af CDP, mens peroxid reddede den hæmmende virkning af CDP (figur 6e,f). Disse data indikerede, at CDP undertrykte ekspressionen af ​​NFATc1 og c-Fos ved at opfange ROS-produktion.

3,6|CDP undertrykker MAPK-veje under RANKL-induceret osteoklastogenese

Dernæst undersøgte vi effekten af ​​CDP-behandling på RANKL-medieret TRAF6-ekspression og MAPK-pathway-aktivering. Efter inkubation i serumfrit medium i 2 timer blev BMM'er stimuleret med RANKL, med eller uden CDP, i 60 min. Stimulering med CDP (10 µM) havde ingen effekt på TRAF6-ekspression og svækket phosphorylering af JNK2 og ERK1/2 efter 10 og 20 minutter (figur 7). Derudover blev p38-phosphorylering signifikant hæmmet af CDP-behandling på 60 minutter sammenlignet med kontrolgrupper (figur 7). Disse data afslører, at CDP undertrykker RANKL-inducerede MAPK-signalveje, i overensstemmelse med dets hæmmende effekt på osteoklastdannelse og aktivitet.

4|DISKUSSION

Cistanche, kendt som "ørkenginseng", har på det seneste tiltrukket sig stor opmærksomhed for sin evne til at modulere immunitet og virke beskyttende under aldring og oxidativ stress (Jia et al., 2012; Snytnikovaet al., 2012). Phenylpropanoid-substituerede diglycosider, de vigtigste aktive komponenter i Cistanche, har vist sig at hæmme aktiviteten i makrofager (Ahn, Chae, Chin, & Kim, 2017). Derudover reducerede et Cistanche-ekstrakt oxidativt stress i reperfunderet myokardium efter iskæmi og spillede en væsentlig rolle i hæmningen af ​​apoptotiske veje, der førte til kardiobeskyttelse (Yu, Li, & Cao, 2016). Som en vigtig komponent i Cistanche har CDP en række farmakologiske funktioner. Vores nuværende undersøgelse viste, at CDP undertrykte RANKL-aktiveret osteoklastdifferentiering og aktivering ved at dæmpe ROS-produktion samt NFAT- og MAPK-aktivering.

Som en sur phosphatase findes TRAcP i en række forskellige celler og er rigeligt i osteoklaster og alveolære makrofager (Snipes, Lam, Dodd, Gray & Cohen, 1986). TRAcP er et karakteristisk enzym for osteoklaster, og dets ekspression er tæt relateret til osteoklastfunktionen, betragtet som en indikator for osteoklastaktivitet og knogleresorption (Minkin, 1982). I vores undersøgelse hæmmede CDP antallet af TRAcP-positive celler, hvilket indikerer, at RANKL-induceret osteoklastogenese blev blokeret af CDP. Nedbrydning af knoglematrix af osteoklaster afhænger af cathepsin K (CTSK) og MP'er (Gruber, 2015). Her nedregulerede CDP signifikant ekspressionen af ​​osteoklastfunktionelle gener såsom Mmp9, Ctsk og Acp5.

Osteoklastdifferentiering og funktion reguleres af flere signalveje (Boyle, Simonet, & Lacey, 2003). Efter binding til RANK rekrutterer RANKL adapterprotein TRAF6 for at aktivere ekspressionen af ​​NFATc1, som er en vigtig transkriptionsfaktor for osteoklastdannelse, der påvirker osteoklastspecifik genekspression, herunder TRAcP og CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). I denne undersøgelse fandt vi, at CDP ikke havde nogen effekt på RANK- og TRAF6-ekspression i osteoklaster. Imidlertid hæmmede CDP RANKL-induceret NFATc1-aktivering under osteoklastogenese af BMM'er. Desuden blev det påvist, at ROS, produceret af mitokondrier i processen med at levere elektroner, fremmede proliferation og differentiering af osteoklaster og regulerede knoglematrix-nedbrydning (Ha et al., 2004). En nylig undersøgelse viste, at RANKL inducerede Bach1-kerneimport og svækkede Nrf2-medieret antioxidantenzymproduktion, og derved øgede intracellulær ROS-ekspression og osteoklastogenese hos mus (Kanzaki et al., 2017). Derudover øgede øget intracellulær ROS-generering af homocystein osteoklastdannelse og aktivitet (Koh et al., 2006). Vores undersøgelse viste, at CDP reducerede ROS-akkumulering i osteoklaster ved at hæmme NOS2-ekspression og fremme ekspressionen af ​​antioxidantenzymer, såsom TRX1 og glutathionreduktase. Da vi behandlede BMM'er med peroxid for at øge intracellulær ROS-akkumulering, viste resultaterne, at øget ROS kunne forbedre NFATc1-ekspression, at ROS var opstrøms for NFATc1. Vi fandt også, at peroxid reddede den hæmmende effekt af CDPon NFATc1-ekspression. Så vores data tyder på, at CDP undertrykker ROS-akkumulering for at hæmme NFATc1-ekspression og derefter undertrykke osteoklastdannelse og -funktion.

ERK, JNK og p38 tilhører MAPK-familien, som også er involveret i reguleringen af ​​osteoklastdifferentiering (Seger & Krebs, 1995). RANKL aktiverer MAPK-vejen ved at øge phosphoryleringen af ​​ERK, JNK og p38 (Mizukami et al. ., 2002). Vi demonstrerede, at CDP undertrykte den RANKL-medierede phosphorylering af nøgleproteiner i MAPK-vejen og derved bidrog til den hæmmende effekt af CDPon ekspressionen af ​​osteoklastmarkørgener. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse, der viser de hæmmende virkninger af CDP på ​​ROS-produktion, NFAT og MAPK-aktivering, hvilket repræsenterer nye virkningsmekanismer af CDP in vitro.

Sammenfattende viste vi, at CDP dæmper osteoklastogenese og hydroxyapatitresorption og ekspressionen af ​​osteoklastmarkørgener inklusive Ctsk, Mmp9 og Acp5. CDP var i stand til at undertrykke RANKL-medieret ROS-produktion samt NFAT- og MAPK-aktivering (figur 8). Samlet tyder vores resultater på, at CDP kan repræsentere et kandidatlægemiddel til behandling af osteoklast-relaterede tilstande ledsaget af ROS-overproduktion.

ANKENDELSER

Denne undersøgelse blev støttet af Nature Science Foundation of China (81572164), Kinas nationale nøgleteknologiforsknings- og udviklingsprogram (2017YFC1103300), Natural ScienceFoundation i Guangxi-provinsen (2016GXNSFAA380295) og University Science and Technology Research Project i Guangxi-provinsen ( KY2015YB054). Det er også delvist støttet af GuangxiScientific Research and Technology Development Plan Project (GKG13349003, 1598013‐15), Western Australia Medical & HealthResearch Infrastructure Fund, Arthritis Australia Foundation, TheUniversity of Western Australia (UWA) Research CollaborationAwards og Australian Health and Medical Research Council (NHMRC, nr. 1107828 og 1027932).

INTERESSEKONFLIKT

Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter.

REFERENCER

Ahn, J., Chae, HS, Shin, YW, & Kim, J. (2017). Dereplication-guidet isolation af nye phenylpropanoid-substituerede diglycosider fra Cistanche salsa og deres hæmmende aktivitet på NO-produktion i makrofager. Molecules, 22(7), 1138.
Balkan, W., Martinez, AF, Fernandez, I., Rodriguez, MA, Pang, M., & Troen, BR (2009). Identifikation af NFAT-bindingssteder, der medierer stimuleringen af ​​cathepsin K-promotoraktivitet med RANK-ligand. Gene, 446(2), 90-98.
Boyle, WJ, Simonet, WS, & Lacey, DL (2003). Osteoklastdifferentiering og aktivering. Nature, 423(6937), 337–342.
Cai, RL, Yang, MH, Shi, Y., Chen, J., Li, YC, & Qi, Y. (2010). Den antitræthedsaktivitet af phenylethanoid-rig ekstrakt fra Cistanche deserticola. Phytotherapy Research, 24(2), 313-315.

Cheng, J., Zhou, L., Liu, Q., Tickner, J., Tian, ​​Z., Li, X., … Xu, J. (2018). Cyanidinchlorid hæmmer ovariektomi-induceret osteoporose ved at undertrykke RANKL-medieret osteoklastogenese og associerede signalveje. Journal of Cellular Physiology, 233(3), 2502–2512.

Cooper, C., & Melton, LJ, 3. (1992). Epidemiologi af osteoporose. Trends in Endocrinology and Metabolism, 3(6), 224-229.

Crotti, TN, Sharma, SM, Fleming, JD, Flannery, MR, Ostrowski, MC, Goldring, SR, & McHugh, KP (2008). PU.1 og NFATc1 medierer osteoklastisk induktion af muse beta3-integrinpromotoren. Journal of Cellular Physiology, 215(3), 636–644.
Feng, H., Cheng, T., Steer, JH, Joyce, DA, Pavlos, NJ, Leong, C., … Xu, J. (2009). Myocytforstærker faktor 2 og mikrophthalmi-associeret transkriptionsfaktor samarbejder med NFATc1 for at transaktivere V-ATPase d2-promotoren under RANKL-induceret osteoklastogenese. The Journal of Biological Chemistry, 284(21), 14667–14676.
Feng, X. (2005). RANKERING af intracellulær signalering i osteoklaster. IUBMB Life, 57(6), 389-395.
Gruber, R. (2015). Molekylær og cellulær basis for knogleresorption. Wiener Medizinische Wochenschrift, 165(3–4), 48–53.
Guo, Y., Cao, L., Zhao, Q., Zhang, L., Chen, J., Liu, B., & Zhao, B. (2016). Foreløbige karakteriseringer, antioxidant og hepatobeskyttende aktivitet af polysaccharid fra Cistanche deserticola. International Journal of Biological Macromolecules, 93, 678-685.
Ha, H., Bok kwak, H., Woong lee, S., Mi jin, H., Kim, HM, Kim, HH, & Hee lee, Z. (2004). Reaktive oxygenarter medierer RANK-signalering i osteoklaster. Eksperimentel celleforskning, 301(2), 119-127.
Hyeon, S., Lee, H., Yang, Y., & Jeong, W. (2013). Nrf2-mangel inducerer oxidativt stress og fremmer RANKL-induceret osteoklastdifferentiering. Fri radikal biologi og medicin, 65, 789–799.
Ikeda, K. (2008). Osteocytter i patogenesen af ​​osteoporose. Geriatrics & Gerontology International, 8(4), 213–217.
Ishida, N., Hayashi, K., Hoshijima, M., Ogawa, T., Koga, S., Miyatake, Y., … Takeya, T. (2002). Storstilet genekspressionsanalyse af osteoklastogenese in vitro og belysning af NFAT2 som en nøgleregulator. Journal of Biological Chemistry, 277(43), 41147–41156.
Jia, Y., Guan, Q., Guo, Y., & Du, C. (2012). Reduktion af inflammatorisk hyperplasi i tarmen i tyktarmskræft-tilbøjelige mus med vandekstrakt af Cistanche deserticola. Phytotherapy Research, 26(6), 812–819.
Kanzaki, H., Shinohara, F., Itohiya, K., Yamaguchi, Y., Katsumata, Y., Matsuzawa, M., … Nakamura, Y. (2017). RANKL inducerer Bach1 nuklear import og dæmper Nrf2-medierede antioxidantenzymer og øger derved intracellulær reaktive oxygenarter signalering og osteoklastogenese hos mus. FASEB Journal, 31(2), 781–792.
Kim, JH, & Kim, N. (2016). Signalveje i osteoklastdifferentiering. Chonnam Medical Journal, 52(1), 12–17.
Koh, JM, Lee, YS, Kim, YS, Kim, DJ, Kim, HH, Park, JY, … Kim, GS (2006). Homocystein øger knogleresorptionen ved at stimulere osteoklastdannelse og aktivitet gennem øget
intracellulær ROS-generering. Journal of Bone and Mineral Research, 21(7), 1003–1011.
van der Kraan, AGJ, Chai, RCC, Singh, PP, Lang, BJ, Xu, J., Gillespie, MT, … Quinn, JMW (2013). HSP90-hæmmere øger differentiering og MITF-aktivitet (mikroftalmi-transkriptionsfaktor) hos osteoklast-progenitorer. The Biochemical Journal, 451(2), 235-244.
Liu, Q., Wu, H., Chim, SM, Zhou, L., Zhao, J., Feng, H., … Xu, J. (2013). SC-514, en selektiv hæmmer af IKKbeta dæmper RANKL-induceret osteoklastogenese og NF-kappaB-aktivering. Biochemical Pharmacology, 86(12), 1775-1783.
Lorenzo, J. (2017). De mange måder at aktivere osteoklast på. Journal of Clinical Investigation, 127(7), 2530-2532.
Manolagas, SC (2000). Fødsel og død af knogleceller: Grundlæggende reguleringsmekanismer og implikationer for patogenesen og behandlingen af ​​osteoporose. Endocrine Reviews, 21(2), 115-137.
Manolagas, SC (2010). Fra østrogencentreret til aldring og oxidativ stress: Et revideret perspektiv på patogenesen af ​​osteoporose. Endocrine Reviews, 31(3), 266-300.
Manolagas, SC, O'Brien, CA, & Almeida, M. (2013). Rollen af ​​østrogen- og androgenreceptorer i knoglesundhed og sygdom. Nature Reviews Endocrinology, 9(12), 699–712.
Minkin, C. (1982). Knoglesyrefosfatase: Tartrat-resistent sur fosfatase som markør for osteoklastfunktion. Calcified Tissue International, 34(3), 285-290.
Mizukami, J., Takaesu, G., Akatsuka, H., Sakurai, H., Ninomiya-Tsuji, J., Matsumoto, K., & Sakurai, N. (2002). Receptoraktivator af NF-kappaB-ligand (RANKL) aktiverer TAK1 mitogenaktiveret proteinkinasekinasekinase gennem et signalkompleks indeholdende RANK, TAB2 og TRAF6. Molecular and Cellular Biology, 22(4), 992-1000.
Nan, Z., Zeng, K., Shi, S., Zhao, M., Jiang, Y., & Tu, P. (2013). Phenylethanoidglycosider med anti-inflammatoriske aktiviteter fra stænglerne af Cistanche deserticola dyrket i Tarim-ørkenen. Fitoterapia, 89, 167-174.
Seger, R., & Krebs, EG (1995). MAPK-signaleringskaskaden. FASEB Journal, 9(9), 726–735.
Snipes, RG, Lam, KW, Dodd, RC, Gray, TK, & Cohen, MS (1986). Sur phosphatase-aktivitet i mononukleære fagocytter og U937-cellelinjen: Monocyt-afledte makrofager udtrykker tartrat-resistent sur phosphatase. Blood, 67(3), 729-734.
Snytnikova, OA, Tsentalovich, YP, Stefanova, NA, Fursova, AZ, Kaptein, R., Sagdeev, RZ, & Kolosova, NG (2012). Den terapeutiske effekt af mitokondrier-målrettet antioxidant SkQ1 og Cistanche deserticola er forbundet med øgede niveauer af tryptofan og kynurenin i rottelinsen. Doklady Biochemistry and Biophysics, 447, 300-303.
Song, F., Zhou, L., Zhao, J., Liu, Q., Yang, M., Tan, R., … Xu, J. (2016). Eriodictyol hæmmer RANKL-induceret osteoklastdannelse og funktion via hæmning af NFATc1-aktivitet. Journal of Cellular Physiology, 231(9), 1983–1993.
Takayanagi, H., Kim, S., Koga, T., Nishina, H., Isshiki, M., Yoshida, H., … Taniguchi, T. (2002). Induktion og aktivering af transkriptionsfaktoren NFATc1 (NFAT2) integrerer RANKL-signalering i den terminale differentiering af osteoklaster. Developmental Cell, 3(6), 889-901.
Teitelbaum, SL (2000). Knogleresorption af osteoklaster. Science, 289 (5484), 1504-1508.
Teitelbaum, SL, & Ross, FP (2003). Genetisk regulering af osteoklastudvikling og funktion. Nature Reviews Genetics, 4(8), 638–649.
Xu, J., Tan, JW, Huang, L., Gao, XH, Laird, R., Liu, D., … Zheng, MH (2000). Kloning, sekventering og funktionel karakterisering af rottehomologen af ​​receptoraktivator af NF-kappaB-ligand. Journal of Bone and Mineral Research, 15(11), 2178–2186.
Yip, KH, Zheng, MH, Steer, JH, Giardina, TM, Han, R., Lo, SZ, … Xu, J. (2005). Thapsigargin modulerer osteoklastogenese gennem regulering af RANKL-inducerede signalveje og produktion af reaktive oxygenarter. Journal of Bone and Mineral Research, 20(8), 1462–1471.
Yu, Q., Li, X., & Cao, X. (2016). Kardiobeskyttende virkninger af phenylethanoid glycosid-rig ekstrakt fra Cistanche deserticola i iskæmi-reperfusion-induceret myokardieinfarkt hos rotter. Annals of Vascular Surgery, 34, 234-242.
Zhou, L., Liu, Q., Yang, M., Wang, T., Yao, J., Cheng, J., … Xu, J. (2016). Dihydroartemisinin, et lægemiddel mod malaria, undertrykker østrogenmangel-induceret osteoporose, osteoklastdannelse og RANKL-inducerede signalveje. Journal of Bone and Mineral Research, 31(5), 964–974.
Zhu, S., Yao, F., Qiu, H., Zhang, G., Xu, H., & Xu, J. (2018). Koblingsfaktorer og exosomal pakning af mikroRNA'er er involveret i reguleringen af ​​knogleombygning. Biologiske anmeldelser af Cambridge Philosophical Society, 93(1), 469–480.