Hvordan man studerer den genetiske mangfoldighed af Herba Cistanches?

Undersøgelse af genetisk diversitet af Herba Cistanches af RAPD

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Cui Guanghong, Chen Min, Huang Luqi*, Xiao Suping, Li Da

(Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medicine, Beijing 100700)

Abstrakt

Formål:At studere befolkningengenetisk mangfoldighedafCistanche deserticolaogCistanche tubulosa.

Metoder:To vilde bestande afCistanche deserticolaog fire vilde bestande afCistanche tubulosablev analyseret af RAPD, og ​​degenetisk mangfoldighedaf populationerne blev analyseret med softwareversion 1.31 af POPGENE.

Resultater:Den gennemsnitlige procentdel af polymorfe loci afCistanche deserticolavar 47,37 procent, de polymorfe loci af de to populationer var 39,47 procent og 35,53 procent, og den gennemsnitlige Neis gendiversitet var 0.135 8. Shannons s var mere. Statusinformationsindekset er 0.207 2, og gendifferentieringskoefficienten Gst {{1{{20}}}}.254 6. Den gennemsnitlige procentdel af polymorfe loci i Cistanche var 27,59 procent, og procentdelen af ​​polymorfe loci i hver population varierede fra 19,54 procent til 25,29 procent, hvoraf Andier-populationen havde de højeste 25,29 procent, og den gennemsnitlige Neis gendiversitet var 0. { {21}}, Shannons polymorfi-informationsindeks er 0,1258, gendifferentieringskoefficient Gst =0.175 5.

Konklusion:Cistanche deserticolaogCistanche tubulosahar en vis differentiering blandt befolkninger. Detgenetisk mangfoldighedaf Desert Cistanche er betydeligt højere end Cistanche tubulosa og har differentieret sig til to økotyper.

Nøgleord: Cistanche deserticola; Cistanche tubulosa; RAPD; genetisk mangfoldighed

[Kinesisk biblioteksklassifikationsnummer] S 567 [Dokumentidentifikationskode] A [Artikelnummer] 1001-5302 (2004) 08-0727-04

Cistanche er en parasitisk plante, der tilhører slægten Cistanche i Lidanaceae-familien, også kendt som Dayun, som er et dyrebart kinesisk medicinsk materiale. De vigtigste kildeplanter til Cistanche deserticola i mit land erCistanche deserticolaYCMa og C.tubulosa (Schenk) R.Wight[1]. Værtsplanterne i Cistanche deserticola er Haloxylon ammodendron og Haloxylon ammodendron, som hovedsageligt er fordelt i Alashan League i Indre Mongoliet, det nordlige Xinjiang, Qinghai, Gansu og andre steder. Fordelingen af ​​Cistanche deserticola er den samme som værtsplanternes. I mit land er Cistanche cistanche kun distribueret i amter omkring Taklimakan-ørkenen syd for Tianshan-bjergene i Xinjiang, og dens udbredelse er ikke fuldstændig synkroniseret med værten Tamarix. Andre regioner såsom det nordlige Xinjiang, Gansu, Qinghai, Ningxia, Indre Mongoliet, Shaanxi og andre steder i Tamarix Planter er ikke parasitære Cistanche Tubula[2]. På grund af den hurtige stigning i efterspørgslen efter Cistanche i de seneste år, hvilket har resulteret i udryddelsen af ​​dets ressourcer, er vilde cistanche-ressourcer skrumpet til kun nogle få hovedproducerende områder. Begge er blevet opført som truede beskyttede plantearter i mit land [3], heriblandtCistanche deserticolaer medtaget i CITES Appendiks II [4].

Efter flere års forskning har forskningen i kunstig opdræt af Cistanche været succesfuld, og den er på stadiet med storstilet promovering og plantning. Men hvordan man forhindrer tilbagegang af Cistanche-arter under industriel produktion, hvordan man genopretter den begrænsede vilde population så hurtigt som muligt og bevarer dyrebare vilde kimplasma-ressourcer, er nøglerne til at opnå dens bæredygtige brug. Hvad angår den beskyttede arv fra Cistanche [Modtaget dato], 2004-03-11 [Fondsprojekt] Ministeriet for Videnskab og Teknologi Social Velfærdsprojekt (2001.109); Ministeriet for Videnskab og Teknologi "Tiende Femårsplan"-projekt (2001BA701A09a) [Tilsvarende forfatter] * Huang Luqi, Tlf.:( 010) 64014411-2955, E-mail: huangluqi @263.net Undersøgelsen af ​​transmission er stadig blank. Denne undersøgelse bruger RAPD-teknologi til at studere 2 vilde populationer afCistanche deserticolaog 4 vilde bestande afCistanche tubulosa, og analysere begge Forskellen igenetisk mangfoldighedforventes at give et vigtigt eksperimentelt genetisk grundlag for beskyttelsen af ​​Cistanche, en dyrebar kinesisk medicin.

cistanche

1. Materiale og metoder

1.1 Materialer

Cistanche deserticolablev indsamlet fra Jimsar County i Xinjiang og Jilantai-området i Ancient Alxa League i Indre Mongoliet. Cistanche-populationer blev indsamlet fra Minfeng County og Yutian County, Xinjiang. Minfeng County er i øjeblikket det område med det største udbytte af Cistanche-cistanche, med den højeste tæthed og relativt komplette samfund af naturlige skove. Prøveudtagningssteder Andil, Sawuzek, Yatongguz og Daheyan fra Yutian County er de vigtigste produktionsområder, som er placeret i Andir-floden, Yeyike-floden, Yatongguzi-floden og Kelaniya I de nedre dele af floden er afstanden mellem befolkningerne mere end 50 km. Hver population udtog tilfældigt 19-30 individer. Prøverne blev hurtigt tørret i silicagel og brugt til DNA-ekstraktion (tabel 1).

Tabel 1 Prøveudtagning af populationer og produktionsområder af Cistanche deserticola og Cistanche tubulosa

1.2 DNA-ekstraktion

Den totale DNA-ekstraktionsmetode bruger høj salt, lav pH-metode [5]. DNA-prøven blev udsat for et spektrofotometer for at detektere koncentrationen af ​​DNA-skabelon, derefter blev 1 procent agarosegelelektroforese, EB-farvning, observation og fotografering under ultraviolet lys, elektroforese-DNA med klare bånd og mindre hale anvendt til RAPD-analyse.

1.3 Screening af RAPD-primere

Da eksperimentet viste, at den samme primer har en utilfredsstillende effekt på den samtidige amplifikation af beggeCistanche deserticolaog Cistanche tubulosa blev primerne screenet uafhængigt. 150 tilfældige primere (10 bp), 25 μL reaktionssystem fra Shanghai Shenggong Biotechnology Co., Ltd. blev brugt til amplifikation og screening; hver primer brugte 2 populationsskabeloner og 1 steriliseret dobbeltdestilleret vand som en blank kontrol og opnåede 10 primere til amplifikation af Cistanche deserticola med klare bånd, stærk polymorfi og god repeterbarhed: S490, S1 101, S{{ 8}}, S1 137, S1 165, S1 218, S1 222, S2 015, S2 112, S{{15 }}; 10 primere afCistanche tubulosa: S1 141, S1 146, S1 183, S1 208, S1 500, S2 032, S2 042, S2 052, S2 059, S2 155.

1.4 PCR-amplifikation og produktdetektion

De udvalgte primere blev anvendt til at amplificere template-DNA'et afCistanche deserticolaogCistanche tubulosaved PCR. Genomisk DNA blev fortyndet til 50 ng·μL -1 i henhold til den målte koncentration som en skabelon. Det samlede reaktionsvolumen er 25 μL, heraf 10 × PCR-buffer 2,5 μL, Mg2 plus 1,5 μL, Taq (5 U·μL -1) 0,2 μL, dNTP-blanding (hver 2,5 mM) 1 μL, 5 μM Primer 1 μL, template DNA 1 μL, steriliseret dobbeltdestilleret vand 18,8 μL, ovenstående PCR-amplifikationsopløsning er et produkt af Shanghai Sangon. Amplifikation blev udført på en PTC-100 termisk cykler. Amplifikationsprogrammet var 94 graders præ-denaturering i 5 minutter og derefter 40 cyklusser. Hver cyklus inkluderede 94 grader 45 s, 34 grader 1 min, 72 grader 1 min 30 s, og til sidst forlænges ved 72 grader i 5 min. De amplificerede produkter blev underkastet elektroforese på en 2,0 procent agarosegel (indeholdende EB) i 1×TAE-buffer og observeret og fotograferet under SYNGENE-gelbilleddannelsessystemet.

1.5 Statistik og analyse af data

I elektroforesespektret sammenlignes den tilsvarende position af reaktionsproduktet på gelen ifølge molekylvægtstandarden, og molekylvægten af ​​det amplificerede produkt estimeres. Båndet med båndet optages som 1, og båndet uden bånd registreres som 0, danner en 0/1 matrixgraf og indlæser til computeren ved hjælp af POPGENE32 til at beregne procentdelen af ​​polymorfe steder (PPL) for hver population, Nei's gen-diversitetsindeks (H), Shannons polymorfi-informationsindeks (I), gen-differentieringskoefficient (Gst), gen-diversitet (Ht),Genetisk mangfoldighed(Hs), Neis (1978) genetiske identitet (I) og genetiske afstand (D) inden for en population, og klyngeanalyse blev udført ved hjælp af UPGMA-metoden.

2. Resultater og analyse

2.1 Genetisk mangfoldighed af Cistanche

Alle prøver opnåede bånd med en molekylvægt i området fra 200 til 2 200 bp (figur 1, 2). I alt 76 loci blev påvist i 60 prøver fra 2 populationer afCistanche deserticola, hvoraf 36 var polymorfe loci, der tegner sig for 47,37 procent , H=0.135 8, I=0.207 2. Blandt dem er Jimsars PPL 39,47 procent, og Gilantys er 35,53 procent. H er 0. 0 95 3 og 0.1 070 henholdsvis, og jeg er henholdsvis 0.15 12 og 0.163 7. I alt 87 loci blev detekteret i {{20}} individer fra 4 populationer af Cistanche, hvoraf 24 var polymorfe loci, der tegner sig for 27,59 procent , H=0.084 8, I=0.1278. Den højeste PPL var Andil på 25,29 procent, mens PPL var lavere i Savuzek og Yatungusi (begge på 19,54 procent). H er 0.062 1 -0.080 0, I er 0.095 0 -0.116. Størrelsen af ​​H og I er i overensstemmelse med størrelsestendensen for PPL for hver population, og koefficienterne er de største i Andier, efterfulgt af Dayan. I tilfælde af den samme PPL, Savuzeks H=0.{{40}} Summen I=0.097 0 er lidt højere end 0.{{44 }} og 0.095 0 af Yatunguska (tabel 2).

Figur 1 RAPD-amplificerede bånd af nogle prøver af ørkenCistanche deserticola, primer S490 1-10. garanti prøver; 11-20. Jimpster prøver M-DNA-markør (200 - 2 000 bp)

Figur 2 RAPD-amplificerede bånd af nogle prøver af Cistanche Tubulosa, primer S2 042 1-20. Xinjiang Andier prøve M-DNA markør (200 - 2 000 bp)

Tabel 2genetisk mangfoldighedafCistanche deserticolaogCistanche tubulosabefolkninger

2.2 Genetisk variationsanalyse af Cistanche

Ifølge niveauet afgenetisk mangfoldighedi populationer (Hs), differentiering mellem populationer (Dst) og andelen af ​​genetiske forskelle mellem populationer i totale genetiske forskelle (Gst), kan det ses, at den totale genetiske diversitet af Cistanche deserticola Ht=0.{{ 1}}, hvor Hs=0.101 2, Gst =0.254 6. Cistanche Ht=0.082 2, hvoraf Hs=0.067 8, Gst=0.175 5 (tabel 3). Ovenstående resultater indikerer, at der er en vis grad af genetisk variation blandt populationerne. Variationen mellem ørkenpopulationerne i Cistanche deserticola udgjorde 25,46 procent af den samlede variation, og variationen af ​​populationerne af Cistanche tubulosa tegnede sig for 17,55 procent af den samlede variation.

Tabel 3 Genetisk variationsanalyse afCistanche deserticolaogCistanche tubulosa.

2.3 Genetisk afstand og klyngeanalyse blandt Cistanche deserticola-populationer

Den genetiske afstand af de to populationer afCistanche deserticolaer {{0}}.080 0, og den genetiske identitet er 0.9231. Den genetiske afstand af de fire populationer af Cistanche var 0.012 0-0.031 5, og den genetiske identitet var 0.9690-0.988 1 (tabel 4) . Grupperingen af ​​Cistanche deserticola- og cistanche tubulosa-individer viser, at Cistanche deserticola kan grupperes i to adskilte grupper efter populationen, mens de forskellige individer af cistanche tubulosa ikke kan grupperes efter population, hvilket også indikerer, at den genetiske differentiering blandt Cistanche deserticola befolkningen er relativt høj. Stor, men den genetiske differentiering blandt populationer af Cistanche tubulosa er lille.

Tabel 4 Genetisk identitet (nederst til venstre) og genetisk afstand (øverst til højre) afcistanche tubulosa.

3. Diskussion

3.1 Genetisk mangfoldighed af Cistanche

Niveauet afgenetisk mangfoldighedaf planter er uadskillelig fra deres biologiske egenskaber, levesteder, oprindelse og evolution. Blandt dem har avlssystem, udbredelsesområde, livsform og pollen- og frøspredning den største indflydelse [6]. Ifølge de statistiske resultater af allozymdata for 499 plantearter i 165 slægter af Ge Song et al. [7], polymorfi af Cistanche på artsniveau bør være omkring 50 procent, og polymorfi på populationsniveau bør være omkring 40 procent. Omkring 0,17. Polymorfiniveauerne opnået i dette eksperiment er alle lavere end disse gennemsnitlige værdier. Samtidig sammenlignet med niveauerne af polymorfe loci opnået ved RAPD-metoder for flere almindelige truede planter, såsom 32 procent af den truede art Silver Fir[18], 22,5 procent af dværgpæonen og 27,6 procent af den lilla pæon [9] ] Det kan ses, at den genetiske mangfoldighed afCistanche deserticola er lidt lavere end gennemsnitsniveauet, mens den genetiske diversitet af Cistanche tubulosa allerede er ekstremt lav.

3.2 Årsager til lav genetisk diversitet af Cistanche

Cistanche er en specifik snylteplante, som er fordelt i smalle ørkenområder på samme tid. Derfor kan den unikke livsstil og relativt smalle boligareal være den iboende årsag til, atgenetisk mangfoldighedaf Cistanche er generelt lavere end for almindelige planter.

Forskellen igenetisk mangfoldighedmellem Cistanche deserticola og Cistanche tubulosa kan være relateret til forskellen i fordelingsområdet for de to, og om de er synkroniseret med værtsfordelingen. Udbredelsesområdet for Cistanche tubulosa er betydeligt mindre end det for Cistanche deserticola, og dets udbredelse er ekstremt ude af sync med værtsplanten. Undersøgelser har vist, at der er et væld af mangfoldighed blandt Tamarix-arter. For eksempel, Zhang Juan et al. rapporterede, at den genetiske diversitet af Tamarix sibiricus var så høj som 98,7 procent [10], mens den genetiske diversitet af Cistanche er ekstremt ringe, hvilket indikerer den langsigtede udvikling. Cistanche tubulosa kan have oplevet alvorlige flaskehalse i historien, hvilket har resulteret i tab af en stor mængdegenetisk mangfoldighed.

Samtidig blev det ifølge undersøgelser konstateret, at ingen af ​​deCistanche deserticolainden for 20 km fra de menneskelige bosættelser kunne graves frem og blomstrede normalt. De store og små gruber i Cistanche blev udgravet, især i de vigtigste producerende områder af Cistanche-rørblomsten. Derfor var det forårsaget af en stor mængde udgravning. Manglen på herkomst og ødelæggelse af levesteder kan være de vigtigste menneskeskabte årsager til det lavegenetisk mangfoldighedaf Cistanche.

3.3 Genetisk differentiering af Cistanche

På grund af den geografiske afstand mellem Xinjiang og Indre Mongoliet forårsagede den geografiske isolation differentieringen og isolationen mellemCistanche deserticolapopulationer, og de to populationer dannede forskellige genetisk forskellige økotyper på grund af deres tilpasning til de lokale habitatforhold. På grund af dets snævre fordelingsområde og hyppige genudvekslinger blandt populationer er den genetiske differentiering blandt populationer mindre end for Cistanche deserticola.

3.4 Anbefalinger til beskyttelse af Cistanche

Genetisk mangfoldigheder forudsætningen for arternes langsigtede overlevelse for at undgå udryddelse. Reduktionen afgenetisk mangfoldighedvil reducere befolkningernes evne til at tilpasse sig miljøændringer på både kort og lang sigt [11]. Derfor er beskyttelse af den genetiske mangfoldighed af Cistanche meget vigtig for at beskytte denne sjældne og dyrebare kinesiske medicin. Da Cistanche er en art med en særlig økologisk type, bør den hovedsageligt beskyttes in situ, og den naturlige beskyttelsesbase Cistanche bør etableres i henhold til dens genetiske mangfoldighed. For eksempel forCistanche tubulosa, fordi den genetiske diversitet hovedsageligt kommer inde fra befolkningen, vil populationer med stor genetisk diversitet være de prioriterede beskyttelsesobjekter [12], såsom Minfengs Angier og Yutians Daheyan kan være Det er opført som en naturlig beskyttelsesbase for Cistanche. hvad angårCistanche deserticola, har befolkningerne i Indre Mongoliet og Xinjiang undergået væsentlige ændringer, så eksperimentel forskning bør styrkes yderligere for at bestemme de befolkninger, der er prioriteret til beskyttelse. Udfør samtidig grundforskning i Cistanches reproduktive biologi og bestøvningsøkologi for at give information til dens yderligere beskyttelse.

Referencer

[1] He Yanping, Yin Zhezhu, Tu Pengfei, et al. Identifikation afCistancheog undersøgelse af kommercielle medicinske materialer. Chinese Medicinal Materials, 1997, 20(3):117.

[2] Liu Mingting. Omfattende forskning og generel anvendelse af Tamarix-planter. Lanzhou: Lanzhou University Press, 1995.

[3] Fu Guoli. Røde bog af kinesiske planter. Beijing: Science Press, 1992.

[4] Administrationskontoret for import og eksport af truede arter i Folkerepublikken Kina, den videnskabelige komité for truede arter i Folkerepublikken Kina. Konventionen om international handel med truede arter af vilde dyr og planter (CITES), tillæg II. 2003.41.

[5] Zou Yuping, Wang Xiaoquan, Lei Yiding, et al. Ekstraktion og identifikation af samlet DNA fra flere truede planter og deres slægtninge. Acta Botany, 1994, 36:528.

[6] Wang Hongxin, Hu Zhiang. Planteforædlingssystem, genetisk struktur og beskyttelse afgenetisk mangfoldighed. Biodiversitet, 1996, 4(2): 92.

[7] Chen Jiakuan, Yang Ji. Planteevolutionær biologi. Wuhan: Wuhan University Press, 1994.

[8] Wang Xiaoquan, Zou Yuping, Zhang Daming, et al. RAPD-analyse af genetisk mangfoldighed af sølvgran. Chinese Science (C), 1997, 40(2): 145.

[9] Pei Yanlong, Zou Yuping, Yin Zhen, et al. En foreløbig rapport om RAPD-analyse af dværgpæon og lilla pæon. Chinese Journal of Plant Taxonomy, 1995, 33(4): 350.

[10] Zhang Juan, Yin Linke, Zhang Daoyuan. En forundersøgelse vedrGenetisk mangfoldighedaf naturlige populationer af Tamarix lancetformet. Yunnan Botanical Research, 2003, 25(5):557.

[11] Ellstrand NC, Elam D R. Populationsgenetiske konsekvenser af lille populationsstørrelse: Implikationer for plantebevarelse. Annual Review Ecology and Systematics, 1993, 34:217.

[12] Liu Zhanlin, Zhao Guifang. Princippet om populationsgenetik og dets anvendelse i beskyttelsen af ​​sjældne og truede planter. Biodiversitet, 1999, 7(4): 340.

Fra: China Journal of Chinese Materia Medica; Vol. 29, hæfte 8. august 2004