Karakteristisk HPLC–MS-profil af Cistanche Deserticola-formelgranulat
Oct 13, 2025
Forfattere: Mao Dan; Yu Hong; Mao Xiuhong; Hu Qing; Ji Shen*
Tilknytning: Shanghai Institute for Food and Drug Control; NMPA Key Laboratory for Quality Control of Traditional Chinese Medicines, Shanghai 201203, Kina
Abstrakt
En karakteristisk kromatografisk profileringsmetode for Cistanche deserticola-formelgranulat blev etableret baseret på HPLC-MS. Ved at bruge autentificerede Cistanche deserticola-afkogsstykker og et echinacoside-referencestof som referencer blev ti batches af prøver ekstraheret direkte med 50% methanol og analyseret ved HPLC. Separation blev udført på en Phenomenex Luna C18-søjle (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) med en gradient af acetonitril-0,1 % myresyre ved 1,0 ml/min, 30 grader og UV-detektion ved 330 nm. Et referencekarakteristisk kromatogram med ni almindelige toppe blev konstrueret, blandt hvilke fem toppe blev identificeret ved LC/Q-TOF-MS. De ti batches viste lighed større end eller lig med 0,981. Præcisions-, stabilitets- og repeterbarhedsmålinger for den karakteristiske profil var tilfredsstillende. Metoden er enkel, identificerer effektivt Cistanche deserticola-formelgranulat og kan bruges til kvalitetsevaluering.
Nøgleord: Cistanche deserticola; formel granulat; karakteristisk kromatogram; echinacoside; verbascosid (acteosid); HPLC; LC–Q‑TOF‑MS; cistanche fordele; bedste cistanche til salg
Introduktion af Cistanche
Cistanche (Rou Cong Rong)er en berømt tonic traditionel kinesisk medicin (TCM) med nyre-tonificerende, essens-næringsgivende og afførende virkning. Det blev først optaget i Shennongs Classic of Materia Medica og opført som et lægemiddel af overlegen kvalitet. 2020-udgaven af Folkerepublikken Kinas farmakopé (Del I) definerer de autentiske kilder som de tørrede, skællende, kødfulde stængler af Cistanche deserticola YC Ma eller Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, med forarbejdningsmetoder, herunder råproduktet og vinproduktet. Vigtige kemiske komponenter omfatter phenylethanoidglycosider (PhG'er), iridoider, lignaner og sukkerarter, der understøtter farmakologiske aktiviteter såsom neurobeskyttelse, anti-aging, hepatobeskyttelse og afføring; kliniske anvendelsesmuligheder er brede. Blandt disse er PhG'er de mest aktive bestanddele.
Cistanche deserticola-formelgranulat er enkelt-urtegranulat fremstillet af forarbejdet C. deserticola ved hjælp af moderne fremstillingsteknikker til brug i kliniske recepter. Der er i øjeblikket ingen national standard for deres kvalitetskontrol. Tidligere undersøgelser rapporterede om indholdsbestemmelsesmetoder eller fingeraftryk for C. tubulosa-formelgranulat, men ingen litteratur om karakteristiske kromatogrammer specifikt for C. deserticola-formelgranulat. I denne undersøgelse blev ti batches indsamlet for for første gang at etablere en HPLC-karakteristisk profil for C. deserticola-formelgranulat med fem toppe identificeret ved LC-MS. Denne profil giver et effektivt og videnskabeligt grundlag for streng kvalitetskontrol af C. deserticola-formelgranulat.
Eksperimentel af cistanche
1.1 Instrumenter og reagenser
Agilent 1100 HPLC med UV-Vis-detektor og ChemStation (Agilent, USA)
Agilent 1290 Infinity HPLC og Agilent 6530 Q-TOF MS med ESI-kilde (Agilent, USA)
Sartorius elektronisk vægt (Sartorius Scientific Instruments, Beijing, Kina)
Elmasonic P ultralydsrenser (Elma, Tyskland)
Referenceafkogsstykker af Cistanche deserticola og referencestoffer af echinacosid og verbascosid (acteosid) blev købt fra National Institutes for Food and Drug Control (batchnr.. 121101-201603, 111670-201907-2015311, 14120191). Cistanosid A, tubulosid A og isoverbascosid blev opnået fra Shanghai Tauto Biotech (batch nr. . 21040621, 20061231, 21040824). Acetonitril (HPLC-kvalitet) var fra Merck; andre reagenser var analytisk kvalitet (Shanghai Lingfeng Chemical Reagents). Ti partier af C. deserticola-formelgranulat (PFKL1-PFKL10), tre partier af C. deserticola-afkogsstykker (YP1-YP3) og tre partier af C. deserticola-standardafkog (BZTJ1-BZTJ3) blev leveret af Shanghai Wanshicheng Pharmaceutical Ltd.
1.2 Forberedelse af løsninger
1.2.1 Referenceløsninger
Referenceurteopløsning: Afvej 1 g godkendte C. deserticola-afkogsstykker i en konisk kolbe med prop, tilsæt 25 mL 50 % methanol, soniker (250 W, 35 kHz) i 30 minutter, afkøl, bland og centrifuger. Brug supernatanten som referenceurteopløsning.
Referencestofopløsning: Forbered echinacosid ved 0,2 mg/ml i 50 % methanol.
1.2.2 Testopløsning
Slib prøven; vej nøjagtigt ca. 1 g i en 100 ml ravfarvet målekolbe. Tilsæt 50 ml 50 % methanol, prop, ryst, vej, blød i 30 minutter og soniker i 40 minutter (250 W, 35 kHz). Lad det køle af, vej igen og kompensér den tabte vægt med 50 % methanol. Bland, stå, filtrer og opsaml det efterfølgende filtrat til analyse.
1.3 Instrumentelle forhold
Kromatografiske forhold: Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); mobil fase A: acetonitril; mobil fase B: 0,1% myresyre i vand; gradienteluering: 0-5 minutter, 12% A; 5–15 min, 12 %→20 % A; 15–30 min, 20 %→30 % A. Flowhastighed 1,0 ml/min; detektionsbølgelængde 330 nm; kolonnetemperatur 30 grader; injektionsvolumen 10 μL. De teoretiske plader, beregnet på echinacoside-toppen, skal være større end eller lig med 5000.
Bemærk: Den originale tekst viser "15–30 min, 20%→30% A" to gange; dette tolkes som et enkelt trin.
Massespektrometriske forhold: ESI i positiv-ion-tilstand; scanningsområde m/z 50–1200. Kildeindstillinger: forstøver (N2) 35 psi; tørregas (N2) 15 L/min ved 200 grader; kappegas (N2) 12 L/min ved 350 grader; kapillær 3,5 kV; fragmentor 125 V; MS/MS kollisionsenergier (CID) ved 10, 20 og 40 eV.
Resultater og diskussion
2.1 Prøveforbehandling og detektionsbølgelængde
Ekstraktionsopløsningsmidler (methanol, 75 % methanol, 50 % methanol, 25 % methanol), ekstraktionsmåder (ultrasonering, tilbagesvaling) og tider (10, 20, 40, 60 min) blev sammenlignet. Den optimale forbehandling var 50 % methanol med 40 minutters ultralydbehandling. Da PhG'er i C. deserticola viser maksimal UV-absorption ved 330 nm, blev 330 nm udvalgt til påvisning.
2.2 Valg af kromatografiske forhold
2.2.1 Kolonner
Zorbax SB-C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), Kromasil 100-5-C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) og Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) sørgede for tilstrækkelig adskillelsesevne og opfyldt system; relative retentionstider (RRT'er) af de karakteristiske toppe var inden for ±10% af specificerede værdier. Laboratorier kan vælge mellem disse.
2.2.2 Mobil fase
Methanol-0,1 % myresyre gav dårlig adskillelse for de fleste toppe undtagen echinacosid; derfor blev acetonitril-0,1 % myresyre overtaget og optimeret til gradienten i afsnit 1.3, hvilket gav optimal opløsning, pladenumre og en stabil baseline. Da der ikke eluerede yderligere toppe efter 30 minutter, blev re-ækvilibrering startet ved den indledende sammensætning.
2.3 Præcision, repeterbarhed og stabilitet
Under anvendelse af batch PFKL1 blev testopløsningen fremstillet i henhold til afsnit 1.2.2 injiceret seks gange under afsnit 1.3-betingelser. RSD'er af RRT'er og relative topområder for de ni karakteristiske toppe var alle<1%, indicating good instrumental precision. Six independently prepared test solutions of PFKL1 yielded RSDs <1% for both RRTs and relative peak areas, demonstrating repeatability. Stability testing at 0, 3, 9, 14, 21, and 28 h showed RSDs <1% for RRTs and relative peak areas, indicating the test solution was stable within 0–28 h.
2.4 Etablering af det karakteristiske kromatogram og tekniske parametre
2.4.1 Referencekarakteristisk kromatogram
Ti partier af C. deserticola-formelgranulat viste konsekvent ni karakteristiske toppe, der i retentionstid svarede til ni toppe i referenceurteopløsningen (figur 1-2). Fem toppe blev tildelt efter standarder som echinacosid, cistanosid A, tubulosid A, verbascosid (acteosid) og isoverbascosid. Echinacoside-toppen bidrog med en stor og stabil andel af det samlede topareal og blev valgt som referencestof. Den kromatografiske adfærd på tværs af ti batches var i det væsentlige konsistent.
A.Blankopløsning;B.Echinacoside;C.Testopløsning;D.Cistanchedeserticola;E.Referencekarakteristisk kromatogram.
Specifikationsliste for Cistanche Tubulosa
2.4.2 Peak identifikation
Testopløsninger (afsnit 1.2.2) blev analyseret ved LC-MS i både positiv og negativ ESI-tilstand; den positive tilstand gav rigere topinformation og blev brugt (figur 3). Ni forbindelser blev identificeret i alt; fem blev bekræftet ved nøjagtig masse, retentionstid og MS/MS-fragmenter under anvendelse af standarder (tabel 1). Da PhG'er er de vigtigste aktive stoffer i C. deserticola, og at formelgranulatet er fremstillet ved vandig ekstraktion, bekræftede LC/Q-TOF-MS PhG'er som hovedbestanddelene. Følgelig blev ni karakteristiske toppe katalogiseret, og fem toppe med relativt stærke responser blev annoteret i referencekromatogrammet.
Fig. 2 HPLC-referencekarakteristikkromatogram 3(S):Echinacosid;4:CistanosidA;5:TubulosidA; 6:Acteosid;7:Isoacteosid.
Fig.3 Ekstraktionsstrømkromatogramaftestopløsning 3(S):Echinacosid;4:CistanosidA;5:TubulosidA;6:Acteosid;7:Isoacteosid.
2.4.3 Angivne relative opbevaringstider
Baseret på de ti batches var gennemsnitlige RRT'er (i forhold til S-toppen, dvs. echinacosid): 0,77 (Peak 1), 0,86 (Peak 2), 1,00 (Peak 3, S), 1,17 (Peak 4), 1,27 (Peak 5), (Peak 7), (eak. 1,67 (top 8) og 1,81 (top 9). Hver tops RRT bør falde inden for ±10 % af dens specificerede værdi.
Tabel 1. Kromatografiske spidsmassespektrometriparametre relateret tilCistanche deserticolaFormel granulat
| Spids | Navn | Molekylær formel | m/z | Retentionstid (min) |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Ukendt | C₅₁H₃₆O₁₁ | 824.2258 | 6.123 |
| 2 | Ukendt | C₃₆H₃₀O₈ | 590.1941 | 6.876 |
| 3 | Echinacoside | C₃₅H₄₆O₂₀ | 809.2467 | 13.646 |
| 4 | Cistanoside A | C₃₆H₄₈O₂₀ | 823.2642 | 16.285 |
| 5 | Tubulosid A | C₃₇H₄₈O₂₁ | 851.2570 | 17.947 |
| 6 | Acteosid | C₂₉H₃₆O₁₅ | 647.1931 | 18.464 |
| 7 | Isoacteosid | C₂₉H₃₆O₁₅ | 647.1956 | 20.083 |
| 8 | Ukendt | C₃₁H₃₈O₁₆ | 689.2044 | 23.446 |
| 9 | Ukendt | C₃₁H₃₈O₁₆ | 689.2041 | 25.883 |
2.5 Lighedsvurdering
Kromatogrammer fra de ti batches blev importeret til "Similarity Evaluation System for Chromatography Fingerprint of TCM (2012A)." Ved at bruge prøve S1 som reference genererede medianmetoden, et 0,5-min. tidsvindue, flerpunktskalibrering og datamatchning et referencefingeraftryk (figur 4) med ni almindelige toppe. Lighedsværdier for alle ti batcher var større end eller lig med 0,981 (0,981-0,999), hvilket indikerer høj lighed mellem batcherne.
2.6 Overførsel af mængde og kvalitet fra afkogsstykker til standard afkogs- og formelgranulat
Peak-matching viste, at C. deserticola-afkogsstykker, standardafkog og formelgranulat delte ni karakteristiske toppe, inklusive de fem tildelte toppe (echinacosid, cistanosid A, tubulosid A, verbascoside og isoverbascosid) (figur 5). De karakteristiske profiler var stærkt korrelerede, og overførselsregler fra afkogsstykker → standardafkog → formelgranulat var klare. Fra afkogsstykker til standardafkog faldt arealet af Peak 6 (verbascoside) markant, hvilket stemmer overens med verbascosides varmelabilitet.
Fig.4 Overlejring af HPLC Karakteristisk kromatogram af Cistanche deserticola Formulagranules
2.7 Sammenligning af karakteristiske kromatogrammer mellem C. deserticola og C. tubulosa formel granulat
Både C. deserticola og C. tubulosa indeholder echinacosid, cistanosid A, verbascosid, isoverbascosid og tubulosid A. De to arter adskiller sig dog væsentligt i echinacosideindhold, og cistanosid A er kun til stede i sporniveauer i C. tubulosa. Derfor kan echinacosid og cistanosid A tjene som diskriminerende markører til at differentiere den botaniske oprindelse (C. deserticola vs. C. tubulosa).
Fig.5 Sammenligning af karakteristiske kromatogrammer af Cistanchedeserticoladekogsstykker(A), standardafkog(B) og formelgranulat(C) 3(S):Echinacosid;4:CistanosidA;5:TubulosidA;6:Acteosid;7:Isoacteosid.
Konklusion (ændret som anmodet: hvilken art har "bedre" indhold)
Inden for rammerne af den etablerede HPLC–MS karakteristiske profil forCistanche deserticolaformelgranulat, og i betragtning af sammenligningen mellem arter,C. deserticolaudviser en rigere og mere afbalanceret phenylethanoid glycosidprofil: cistanosid A kan let påvises i C. deserticola, men er kun spor iC. tubulosa, mensechinacosideviser markante forskelle mellem arterne. For formuleringer, der sigter mod højere samlede niveauer af nøgle-phG'er og stærkere overordnede cistanche-fordele, anbefales Cistanche deserticola som den bedre art med hensyn til indhold. Hvis et produkt specifikt er målrettetmaksimal echinacoside, vil udvalgte partier af C. tubulosaovervejes afhængigt af udbud og partiprøvning. I praksis bør "bedste cistanche til salg" bestemmes ved batchspecifik kvantitativ testning af echinacosid, verbascosid (acteosid) og cistanosid A under den validerede metode beskrevet heri.
Referencer
[1] Tang SW. Klassificeret Materia Medica. Beijing: Huaxia Publishing House, 1993:192.
[2] Chinese Pharmacopoeia Commission. Farmakopéen for Folkerepublikken Kina (Br.. 1). Beijing: China Medicine Science and Technology Press, 2020:140.
[3] Zhi YJ, Zhen YQ, Tian W, et al. Traditionelle kinesiske lægemidler og urtemedicin, 2021, 52(9):2758.
[4] Zhen YQ, Tian W, Wang XG, et al. Modern Traditional Chinese Medicine, 2019, 39(1):83.
[5] Jing H, Zuo JF, Li JS. Lishizhen Medicine og Materia Medica, 2006, 17(3):440.
[6] Han GQ, Li CF, Wang XQ, et al. China Journal of Chinese Materia Medica, 2015, 40(21):4218.
[7] Lei L, Jiang Y, Liu X, et al. Helv Chim Acta, 2010, 90(1):79.
[8] Liu XM, Li J, Jiang Y, et al. Biochem Syst Ecol, 2013, 47(8):21.
[9] Gong HM, Hu H, Liu YC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences, 2018, 33(6):623.
[10] Gao Y, Guo LN, Ma SC, et al. China Journal of Chinese Materia Medica, 2019, 44(17):3749.
[11] Lu YH, Pi WM, Zhang Y, et al. Modern Chinese Medicine, 2019, 21(8):999.
[12] Wang LW, Cao R, Fang YY, et al. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2017, 40(2):295.
Noter
Navne på forbindelser: echinacosid; cistanosid A; tubulosid A; verbascosid (acteosid); isoverbascoside.
Tilsyneladende typografiske sedler, der henviser til "muskatnød" i kilden, blev gengivet som "Cistanche" i oversættelse baseret på kontekst.
