Kapitel 5 Ændringer i enzymaktivitet under enzymfermentering

Kapitel 5 Ændringer i enzymaktivitet under enzymfermentering

 

Protease, lipase ogSuperoxid Dismutase (SOD)er de vigtigste funktionelle enzymer afMikrobiel enzym sundhedsmad. Blandt dem,Proteasespiller en rolle iFremme af hydrolyse af protein i madi den menneskelige krop. Derudover kan det også nedbrydes nogle døende celler, fjerne snavs på hudoverfladen og porer og spille en rolle i eksfoliering, så det bruges i vid udstrækning i badeprodukter. Lipase virker på esterbindingen mellem fedtsyrer og glycerol, og hydrolysesubstratet er generelt naturlige olier. Derfor ses det i mange vægttab fødevarer og sundhedsprodukter. Mange kvinder er yderst bekymrede over emnet vægttab, hvorfor enzymer hurtigt er blevet populære over hele verden.Enzymer er rige på lipase, hvilket betyder, at de har høje forskningsværdi og applikationsudsigter.Soder et specielt metalenzym, der katalyserer afmonteringsreaktionen afSuperoxidanionradikaler, dervedFjernelse af superoxidanionradikaleri kroppen. Det er en beskyttende barriere for organismer, så den er vidt brugt inden for det medicinske område.
Dette kapitel tager æbleenzym som et eksempel. Start fra det indledende fase af gæring,aktiviteter af superoxiddismutase, amylase, lipase, protease og cellulase i den eksperimentelle gruppe og kontrolgruppen blev målt hver 15. dag til omfattende og systematisk afspejler den skiftende tendens med enzymaktivitet under hele fermenteringsprocessen.

Nye urter cistanche

Klik for at få flere detaljer

 

Støttende service af Wecistanche-den største cistanche-eksportør i Kina:
E -mail: wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tlf: +86 15292862950

 

 

 

 

 

 

5.1 Materialer og metoder

5.1.1 Materialer

(1) Eksperimentelle materialer

Vask friske æbler med sterilt vand under sterile forhold, tør dem naturligt på et sterilt operationsbord, skræl dem og skiv dem til senere brug. Tilsæt hvidt sukker og æbler til en steriliseret glaskrukke i et masseforhold på 1: 1. Aktivér de bakterier, der kræves til eksperimentet, og inokulerer dem i enzymet i henhold til det optimale skema (dette operationstrin er udeladt for kontrolgruppen), forsegle den og placere det på et køligt og tørt sted. Efter 3 måneders gæring af stuetemperatur skal du tage en prøve for at opnå hele enzymvæsken, der indeholder massen og filtrere den. Tag supernatanten som den eksperimentelle prøve. Efter at prøven er centrifugeret ved 10, 000 omdrejninger pr. Minut i 15 minutter i en højhastighedscentrifuge, bruges den til at måle relevante data. Det er værd at bemærke, at i processen med at fremstille enzymer, for at undgå unødvendig forurening, blev alle vores operationer udført under sterile forhold.

(2) Hovedinstrumenter
De instrumenter, der kræves til eksperimentet, er de samme som 3.1.1 (2).

 

5.1.2 Metoder

(1) Bestemmelse af superoxiddismutase (SOD) -aktivitet [66]
Pyrogallolopløsningen blev forvarmet i et 25 graders konstant temperaturvandbad i en periode. I henhold til tabel 5.1 blev der tilsat en passende mængde puffer, destilleret vand og det samme volumen af ​​saltsyre eller pyrogallolopløsning til reagensglaset. Det konstante temperatur vandbad blev indstillet til 25 grader for 2 0 min. Efter at den blandede væske hurtigt blev rystet, blev den straks injiceret i cuvette. Absorbansværdien A0 af prøven blev målt hvert 30. sekund ved en bølgelængde på 325Nm under anvendelse af et spektrofotometer.

Tab.5.1 Tilføj mængden af ​​den tilstødende benzen tre phenolreagens til bestemmelse af autoxidationshastighed

 

Metoden til bestemmelse af SOD -aktivitet er dybest set den samme som ovenstående operation. Den eneste forskel er, at inden tilsætning af pyrogallol, {{0}}. 5 ml enzymprøvopløsning af forskellige koncentrationer skal først tilsættes. På samme tid tilsættes den samme mængde destilleret vand. Den målte absorbans er ASOD. Inhiberingshastigheden og SOD -enzymaktiviteten beregnes i henhold til formel 5.1 og formel 5.2: inhiberingshastighed (%)=(△ a 0- △ ASOD)/△ a {{20} × 100 (5.1) enzymaktivitet (U/ml)=inhibition hastighed/50% × × × × × × × × × × × × × × × × × × × V1/v2 × n (5.2) hvor: v1 er det samlede volumen af ​​opløsningen, ml; V2 er volumenet af enzymprøvens opløsning, ML; △ A0 er auto-oxidationshastigheden for pyrogallol; △ ASOD er ​​hastigheden for ændring af prøveabsorberingsværdien; N er den fortyndingsmultipel (2) bestemmelse af amylaseaktivitet Denne undersøgelse anvendte iod-stark-kolorimetrisk metode til at bestemme amylaseaktivitet. De specifikke operationstrin henviser til "National Clinical Laboratory Operation Procedure" [67]. Det er hovedsageligt opdelt i de følgende to punkter:

 

① Forberedelse af løsning
Bufferet stivelsesopløsning ({{0}}. 4G/L): Vej nøjagtigt 9 g natriumchlorid, 22,6 g vandfri disodiumhydrogenfosfat, og 12,5 g vand) af destilleret vand og opvarm, indtil opløsningen koger; Vej nøjagtigt 0,4 g opløselig stivelse, opløs den i 10 ml destilleret vand, bland jævnt og juster til en pasta; Injicér stivelsesopløsningen justeret til en pasta i den ovennævnte kogende opløsning, og vask bægerglas gentagne gange, indtil stivelsen er fuldstændigt overført til den kogende vandopløsning. Efter omrøring jævnt med en glasstang, kølig til stuetemperatur, tilsættes 5 ml af en 37% hårformaldehydopløsning og fortynd til 1L med destilleret vand. PH -værdien af ​​opløsningen er 7,0 ± 0,1, og den anbringes i køleskabet til brug.
Jodstamopløsning (0. 1 mol/l): Vej nøjagtigt 1,7835 g kaliumiodat og 22,5 g kaliumiodid i et rent 500 ml
Beaker tilsættes langsomt og jævnt 4,5 ml koncentreret saltsyre, omrøres kontinuerligt under tilsætningsprocessen, fortynd til skalaen med destilleret vand og omrøres jævnt. Læg det i køleskabet til brug og opbevar det i en brun reagensflaske.
Jodapplikationsløsning ({{0}}. 01mol/L): Tag en vis mængde jodstamopløsning (0,1 mol/L), fortynd den 10 gange med destilleret vand, læg den i køleskabet til brug og opbevar det i op til 1 måned.

② Eksperimentelle driftstrin
Tag enzymopløsningen og fortynd den 10 gange med fysiologisk saltvand, og betjen i henhold til tabel 5.2. Bland godt, bølgelængden af ​​spektrofotometeret er 660nm, og den lyse sti for den kolorimetriske kop er 10 mm. Nul med destilleret vand og læs absorbansen af ​​hvert rør. Beregn amylaseaktiviteten baseret på den grundlæggende beregningsformel 5.3.

 

Tab.5.2 Betjeningstrin til bestemmelse af amylase

 

(3) Bestemmelse af lipaseaktivitet

Bestemmelsesmetoden blev udført i overensstemmelse med qb/t {{0}} [68]. En 2% enzymtestopløsning blev fremstillet med 0. 0 25 mol/l phosphatbuffer (pH 7,5), phenolphthalein blev anvendt som en indikator, og fedtsyrer blev titreret med en standard natriumhydroxidopløsning. Lipase -aktiviteten blev beregnet baseret på volumenet af natriumhydroxid, der blev konsumeret i eksperimentet. Reglen er: ved en pH -værdi på 7,5 og en omgivelsestemperatur på 40 grader, 1 ml flydende enzymopløsning hydrolyserer lipase i 1 minut for at producere 1 μmol fedtsyre, som er en lipase -aktivitetsenhed, udtrykt som U/ml. Derefter blev lipaseaktiviteten beregnet i henhold til formel 5.4: enzymaktivitet (U/ml)=(Ba) × C/0,05 × 50 × 1/15 × N=200/3 × (Ba) × C × N (5.4) hvor: B er volumenet af natriumhydroxid -standardopløsning, ml; ML; A er mængden af ​​natriumhydroxid -standardopløsning, der forbruges i den tomme kontrolgruppe, ML; C er koncentrationen af ​​natriumhydroxid -standardopløsning, mol/L; 0,05 er konverteringsfaktoren for koncentrationen af ​​natriumhydroxidstandardopløsning; 50 er fedtsyreindholdet i natriumhydroxidopløsning; 15 min er reaktionstiden; n er fortyndingsmultipel.

(4) Bestemmelse af proteaseaktivitet

Se GB/T 23527-2009 [69] med små ændringer.
① Forberedelse af standardkurve
Tag 1 ml tyrosin -standardopløsning med forskellige massekoncentrationer, som er 0, 1 0, 20, 30, 40 og 50 mg/l, og tilsæt 5 ml 0,4 mol/l natriumcarbonatopløsning og 1 ml FOLIN -reagensopløsning på det. Reager i 20 minutter ved en temperatur på 40 grader. Når reaktionen er afsluttet, skal du fjerne reaktionsopløsningen og måle absorbansværdien af ​​opløsningen ved en bølgelængde på 680Nm ved hjælp af et spektrofotometer. Tegn en tyrosin -standardkurve med tyrosinkoncentration som den vandrette akse og absorbansværdi som den lodrette akse.

Nye urter cistanche med stærk antioxidantkraft

② Bestemmelse af proteaseaktivitet
Eksperimentel gruppe: Tag 1 ml kaseinopløsning med en koncentration på 10 g/l og bland den jævnt med 1 ml af prøveløsningen, der skal testes, og reagere i 10 minutter ved en omgivelsestemperatur på 40 grader; Filtrer og få filtratet efter stående, tag 1 ml filtrat, 5 ml natriumcarbonatopløsning og 1 ml folinreagens, bland jævnt og reagere i 20 minutter ved en omgivelsestemperatur på 40 grader; Brug et spektrofotometer til at måle absorbansværdien af ​​opløsningen ved en bølgelængde på 680 nm.
Blank Control Group: Tag 1 ml af prøveopløsningen, der skal testes, tilsættes trichloreddikesyre, reagerer fuldt ud for at inaktivere protease, og andre driftsmetoder er de samme som den eksperimentelle gruppe.

Beregn proteaseaktiviteten i henhold til formel 5.5:
Protease -aktivitet (U/ml)=AK × 4/10 (5.5) hvor: A er absorbansen af ​​enzymopløsningen i den eksperimentelle gruppe; K er mængden af ​​tyrosin, når absorbansen er lig med 1; 4 er det samlede volumen af ​​reaktionsopløsningen, ML; 10 er reaktionstiden, min.

(5) Bestemmelse af cellulaseaktivitet [70]

Aktiviteten af ​​cellulase i enzymer udtrykkes generelt af mængden af ​​glukose, der frigives med en vis mængde enzymopløsning pr. Enhedstid. Princippet om at bruge filterpapirmetoden til at måle cellulaseaktivitet er, at cellulase kan nedbryde cellulose i filterpapiret for at producere sekundære metabolitter, såsom glukose, og glukose kan reagere med 3, 5- dinitrosalicylsyre til dannelse af et gult kompleks. Farven på denne reaktion er relativt lys, som godt kan bestemme mængden af ​​glukose og andre producerede sukkerarter.

 

①3, 5- Dinitrosalicylsyre kolorimetrisk middel
Accurately weigh 10g of 3,5-Dinitrosalicylic acid with a melting point of 168-169 degree , dissolve it with distilled water, add 20g of sodium hydroxide and 200g of potassium sodium tartrate, continue heating until the solid is completely dissolved, dilute to 500mL with distilled water, add 2g of Redistilleret phenol og 0,5 g vandfrit natriumsulfit, omrør kontinuerligt under tilsætningsprocessen, indtil den er helt opløst, stop opvarmning efter blanding jævnt, kølig til stuetemperatur, overfør alt til en 1000 ml volumetrisk kolbe, fortyndet til markeringen med destilleret vand, placering ved stuetemperatur i en uge, filter, få supernatant og butik i en brun reagent.②enzymatisk hydrolyse
Nøjagtigt pipette {{0}}, 0. 5, 1. 0, 1,5, 2,0 ml enzymprøveopløsning i 2 ml eddikesyre-sodatodatatbufferopløsning med en pH-værdi på 4,5. Efter 5 minutters konstant temperatur vandbad ved 40 grader, tilsættes 6 stykker kromatografifilterpapir med et areal på henholdsvis 1 × 1 cm2, og start straks timingen for at gøre reaktionstiden nøjagtig til 60 minutter. Overfør straks til kogende vandbad for reaktion i 10 minutter, og cellulasen mister sin aktivitet.

 

 

③ Farvereaktion
Tag enzymprøvens opløsning, tilsæt 3 ml 3, 5- dinitrosalicylsyre -kolorimetrisk middel tilberedt i ①, varme i kogende vandbad i 15 minutter, tag ud, kølig til stuetemperatur, tilsæt 10 ml destilleret vand, bland jævnt, brug spektrofotometer ved en bølgelængde af 550Nm, juster den blanke kontrolgruppe til zero og måling dens absorberet værdi.
④ Tegning af glukosestandardkurve
Forbered en glukosestandardopløsning med en koncentration på 1 mg/ml nøjagtigt, og brug destilleret vand til at fremstille glukosestandardopløsningen med et volumen på 0, 0. 2, 0. 4, {{6}. 3 ml 3, 5- dinitrosalicylsyre kolorimetrisk middel fremstillet i ① til at udføre farveudviklingsreaktion. Plot standardkurven med glukosekoncentration som den vandrette akse og absorbans som den lodrette akse.
⑤ Beregning
Brug absorbansværdien A efter farveudvikling med enzymopløsning, og bereg derefter glukosefrigørelsesmængden m i henhold til glukosestandardkurven, og beregner i henhold til formlen 5.6:
Cellulaseaktivitet (U/ ml)=m/ (T · m) (5.6) hvor: m er glukoseudgivelsesmængden, UG; t er den enzymatiske hydrolysetid, min; M er enzymindholdet i reaktionen, UG/ml.