BCAT2 former et ikke-betændt tumormikromiljø og inducerer modstand mod anti-PD-1/PD-L1 immunterapi ved negativt at regulere proinflammatoriske kemokiner og anticancerimmunitet

For at forbedre responsraten for monoterapi af immun checkpoint blokade (ICB) er det nødvendigt at finde et fremkommende mål i kombinationsterapi. Gennem analyse af tumormikromiljø (TME)-relaterede indikatorer er det valideret, at BCAT2 former en ikke-betændt TME i blærekræft. Resultaterne af multiomics indikerer, at BCAT2 har en hæmmende effekt på rekruttering af cytotoksiske lymfocytter ved at begrænse aktiviteterne af proinflammatoriske cytokin/kemokin-relaterede veje og T-celle-kemotakse-veje. Immunoassays afslører, at sekretion af CD8+T-celle-relaterede kemokiner holder en robust negativ korrelation med BCAT2, hvilket genererer en faldende tendens af CD8+T-celler omkring BCAT2+ tumorceller fra langt til nær ved. Samtidig behandling af BCAT2-mangel og anti-PD-1-antistof har en synergistisk effekt in vivo, hvilket indebærer potentialet af BCAT2 i kombinationsterapi. Desuden er værdien af ​​BCAT2 til at forudsige effektiviteten af ​​immunterapi valideret i flere immunterapi-kohorter. Sammen, som et nøglemolekyle i TME, er BCAT2 et spirende mål i kombination med ICB og en biomarkør for vejledende præcisionsterapi.

Fordele ved cistanche tubulosa-Antitumor

1. Introduktion

Blærekræft (BLCA) er en af ​​de mest almindelige maligne sygdomme i urinvejene.[1] Det anslås, at over 430,000 patienter diagnosticeres på verdensplan hvert år.[2] På trods af radikal kirurgisk behandling opstår næsten halvdelen af ​​patienter med muskelinvasiv blærekræft metastaser.[3] Derfor spiller systemisk terapi en vigtig rolle ved fremskreden blærekræft. Med udviklingen af ​​immunterapi, især immun checkpoint blokade (ICB), indikerede akkumulerende beviser, at ICB har en fremragende ydeevne i at eliminere tumorbyrde.[4] Der er dog stadig et stort antal patienter, som ikke reagerer på monoterapi af ICB på grund af primær resistens eller erhvervet resistens.[5] For at løse det udækkede kliniske behov giver kombinationen af ​​andre rationelle terapier med ICB en helt ny indsigt i monoterapiresistens. Tumormikromiljøet (TME) er et kompliceret system og har en dyb indvirkning på immunterapiens effektivitet.[6] Med utilstrækkeligt infiltrationsniveau af cytotoksiske T-lymfocytter (CTL'er), blev ikke-betændt TME betragtet som en kritisk faktor i at undlade at generere en potent antitumor-immunrespons under immunterapi.[7] Derfor er det afgørende at finde et nøglemolekyle, der kan omdanne ikke-betændt TME til betændt TME og har potentialet til at blive et kombinationsterapimål. Forgrenet aminotransferase 2 (BCAT2) er et kerneenzym i processen med metabolisme af svovlaminosyrer.[8] Li et al. fandt, at BCAT2 var afgørende for udviklingen af ​​bugspytkirtelkræft ved at mediere forgrenede aminosyrer (BCAA'er) katabolisme.[9] Lee et al. påvist, at BCAT2-mangel hæmmede tumorvækst af pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) ved at regulere lipidmetabolismen.[10] Selvom der var flere undersøgelser dokumenteret, at BCAT2 direkte påvirkede den biologiske proces af tumorer ved at regulere metaboliske relaterede veje, er dens rolle i reguleringen af ​​TME-immunstatus aldrig blevet undersøgt. I vores undersøgelse, gennem en omfattende analyse af TME-relaterede indikatorer i Xiangya BLCA-kohorten og flere offentlige BLCA-kohorter, screenede vi, at BCAT2 sandsynligvis former en immunsuppressiv TME i BLCA. For at udforske molekylære mekanismer udførte vi yderligere enkeltcellet RNA-sekventering (siRNA-seq) og bulk-RNA-seq, hvilket afslørede, at BCAT2 spiller en undertrykkende rolle i rekrutteringen af ​​CTL'er til TME ved at hæmme aktiviteter af cytokin/kemokin-associerede signalveje og Tcell-kemotakse signalveje. In vitro viste multi-immunoassays, at sekretion af CTL-relaterede kemokiner har stabile negative korrelationer med ekspression af BCAT2. Ifølge panoramaanalyse af tissue microarray (TMA) fandt vi et gensidigt eksklusivt forhold mellem CTL'er og BCAT2+-tumorceller i rumlig fordeling. In vivo blev en kooperativ effekt afsløret i kombinationsterapi af BCAT2-tab og ICB. Endnu vigtigere, dets rolle i at forudsige den helbredende effekt af immunterapi blev valideret i Xiangya BLCA immunterapi kohorten.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

2. Resultater

2.1. BCAT2 korrelerer negativt med anticancer-immunitet af TME i BLCA

I de fleste kræfttyper er ekspressionen af ​​BCAT2 højere i kræftvæv end i normalt væv (figur S1A, understøttende information), og dets ekspressionsmønster i BLCA blev valideret i Xiangya BLCA-kohorte (figur S1B, understøttende information). Desuden er BCAT2 bredt udtrykt i forskellige cancercellelinjer (figur S1C, understøttende information). Ydermere indikerede resultaterne af omfattende pan-cancer-analyse på kemokinsystemet, MHC'er, immunstimulatorer og TIIC'er, at BCAT2 har signifikante immunsuppressive effekter i et par kræfttyper, herunder blærekræft (BLCA), brystkræft (BRCA), nyrepapillærcelle. karcinom (KIRP), bugspytkirtel adenokarcinom (PAAD), sarkom (SARC) og thyreoideacarcinom (THCA) (Figur S2A, B, understøttende information). Derudover blev der også fundet negative korrelationer mellem BCAT2 og almindelige hæmmende immunkontrolpunkter (PD- 1, PD-L1, CTLA-4 og LAG-3) (Figur S2C–F, understøttende oplysninger ). Gennem omfattende pan-cancer-analyse fandt vi ud af, at BCAT2 har den mest dybtgående immunsuppressive effekt i BLCA. Derfor undersøgte vi yderligere dens immunologiske rolle i BLCA. På grundlag af den gennemsnitlige ekspressionsværdi af BCAT2 opdelte vi individer i høj-BCAT2-gruppen og lav-BCAT2-gruppen i TCGA-BLCA-kohorten. Det er klart, at en række kemokiner, kemokinreceptorer, MHC-relaterede molekyler og immunstimulatorer blev nedudtrykt i høj-BCAT2-gruppen og overudtrykt i lav-BCAT2-gruppen (figur 1A). Et lignende resultat blev fundet i cancerimmunitetscyklussen, som dækker flere væsentlige trin i rekruttering og infiltrering af immunceller (figur 1B). Desuden påviste vi robuste negative forbindelser mellem infiltrationsniveauer af immunceller (CD8+T-celle, CD4+T-celle, naturdræberceller (NK) og dendritiske (DC)-celler) og BCAT2 i forskellige algoritmer (figur 1C). Ligeledes blev der fundet lavere ekspression af immuncellens effektorgener (CD8+T-celle, NK-celle, makrofag, T-hjælper 1 (Th1)-celle og DC-celle) i høj-BCAT2-gruppen sammenlignet med lav-BCAT2 gruppe (figur 1D). Endnu vigtigere, når korreleret BCAT2 med TIS-score (Figur S3, Understøttende Information) og hæmmende immunkontrolpunkter (Figur 1E), blev åbenlyse negative forhold afsløret mellem dem. Derfor spekulerede vi i, at BCAT2 negativt kan regulere TME-immunresponset og påvirke effektiviteten af ​​immunterapi dybt. Ydermere var ovenstående resultater godt valideret i ni uafhængige BLCA-kohorter (GSE31684, GSE32894, GSE48075, GSE48276, GSE69795, GSE83586, GSE86411, GSE87304 og GSE1287024, der understøtter oplysninger) (Figurer S1287, S). Til sidst bekræftede vi sammenhængen mellem BCAT2 og TME igen i Xiangya BLCA Cohort. Konsekvent har ekspressionen af ​​BCAT2 negative relationer til aktiviteten af ​​cancerimmunitetscyklussen, infiltrationsniveauer af TIIC'er, TIS-score og ekspressionsniveauer af immunkontrolpunkter (figur 2A-C). Samlet afslørede vi, at høj ekspression af BCAT2 danner en ikke-betændt TME i BLCA, og lav ekspression af BCAT2 former en betændt TME i BLCA.

2.2. Udforskning af mekanismen ved BCAT2 i formning af TME ved hjælp af Bulk RNA-seq og siRNA-seq

I TCGA-BLCA-kohorten blev DEG'er mellem høj/lav BCAT2-grupper, høj/lav immunscore-grupper og høj/lav stromal score-grupper identificeret og tog krydset (figur S13A, understøttende information). Interessant nok havde BCAT2-positive-relaterede DEG'er ingen skæring med immun- og stromal score positive-relaterede DEG'er (figur 2D). I mellemtiden opstod det samme fænomen i negativ-relaterede EG'er blandt dem (figur S13B, understøttende information). Disse resultater indikerede, at BCAT2 sandsynligvis negativt regulerer immun-immun-relaterede veje. Tilfældigvis afslørede resultaterne af GO- og KEGG-analyser, at BCAT2--relaterede DEG'er var mest signifikant beriget i veje for leukocytmigrering, T-celleaktivering og cytokin--cytokinreceptorinteraktion (figur 2E, F). Derfor spekulerede vi i, at BCAT2 former en ikke-betændt TME i BLCA ved at hæmme aktiviteterne af cytokin/kemokin-relaterede veje. Karakteristikken for bulk NA-sekventering bestemmer imidlertid dens begrænsning, hvis ekspressionsniveau af genet beregnes ved middelværdien af ​​alle celler i vævet. For at overvinde begrænsningen blev siRNA udført på tre BLCA-prøver. Mere end 19 000 celler blev analyseret og klassificeret i seks kategorier: epitelcelle, fibroblastcelle, T/NK-celle, endotelcelle, B-celle og myeloidcelle (figur 3A), referer til genkendte biomarkører (EPCAM, LYZ, CD3D, COL1A1, CD79A, CD19, PECAM1 og VWF).[11] Påfaldende nok blev BCAT2 hovedsageligt udtrykt i epitelceller (EPCAM+), snarere end endotelceller og immunceller. På basis af CNV-akkumulering blev EPCAM+ epitelceller betragtet som ondartede urotelceller. For at validere ekspressionsmønsteret af BCAT2 blev to eksterne siRNA-kohorter inkluderet i undersøgelsen. I GSE135337 scRNA-kohorten blev mere end 36,000-celler behandlet og opdelt i fem klynger. Den primært udtrykte cellesubtype af BCAT2 var stadig en malign blære-urotelcelle (figur 3B). Et lignende ekspressionsmønster dukkede op igen i GSE145137 siRNA-kohorten (figur 3C). Derfor udledte mønsteret af majoritetsekspression på ondartede celler, at BCAT2 fungerer som en immunoregulator del i TME hovedsageligt ved hjælp af forskellige karakteristika af cancerceller. Baseret på ekspressionsniveauet af BCAT2 blev maligne urotheliale celler opdelt i en høj-BCAT2-gruppe og en lav-BCAT2-gruppe. GSEA-analyse af GO-termer i GSE135337 og GSE145137 siRNA kohorter afslørede, at en masse cytokin/kemokin-relaterede veje var signifikant nedreguleret i høj-BCAT2-gruppen, herunder kemokinproduktion, kemokinsekretion, regulering af kemokin-medieret signalvej, respons på kemokin, kemokinreceptorbinding, cytokinaktivitet, cytokinbinding og cytokinreceptorbinding (figur 3D-G; figur S14B, understøttende information). I mellemtiden havde leukocytkemotaksi, lymfocytkemotaksi, T-cellekemotaksi og deres regulatoriske veje signifikant negative korrelationer til BCAT2 (figur 3E-I; figur S14A, understøttende information). GSEA-analyse af KEGG-udtryk indikerede, at veje for cytokin-cytokinreceptorinteraktion og antigenbehandling og præsentation tydeligvis blev nedreguleret i høj-BCAT2-gruppen (figur 3F). Sammen undertrykker høj ekspression af BCAT2 aktiviteterne af proinflammatoriske cytokiner og kemokiner-relaterede veje, hvilket fører til et reduceret infiltrationsniveau af TIIC'er, som i sidste ende former en ikke-betændt TME.

Figur 1. BCAT2 korrelerer negativt med anticancer-immunitet i TME af BLCA. A) Ekspressionsmønster af kemokiner, kemokinreceptorer, MHC-molekyler og immunstimulatorer i høje og lave BCAT2-grupper. B) Aktivitet af cancerimmunitetscyklus i høje og lave BCAT2-grupper. Syv farver repræsenterer syv trin i cyklussen. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0,001. C) Korrelationer mellem BCAT2 og flere typer immunceller (CD8+T-celle, CD4+T-celle, DC-celle og NK-celle) i seks uafhængige algoritmer. D) Ekspressionsmønstre af flere undertyper af immuncelle (CD8+T-celle, NK-celle, makrofag, Th1-celle og DC-celle) relaterede effektorgener i høje og lave BCAT2-grupper. E) Korrelationer mellem BCAT2 og ICB-relaterede effektorgener. Tal i cirklen betyder korrelationskoefficient.

Figur 2. Validering af BCAT2-funktionen af ​​Xiangya BLCA-kohorte. A) Korrelationer mellem BCAT2/kræftimmunitetscyklus (venstre) og BCAT2/TIIC'er (højre). Optrukne og stiplede linjer betyder positive og negative sammenhænge, ​​tykkelsen af ​​linjerne betyder korrelationskoefficient, linjer med forskellige farver repræsenterer p-værdi af korrelationer. B) Korrelationer mellem BCAT2 og ICB-relaterede effektorgener. C) Korrelationer mellem BCAT2 og TIS score relaterede effektor gener. Tallet i cirklen repræsenterer korrelationskoefficient. D) Skæring af BCAT2, immunscore og stromal score positive relaterede gener. E,F) Top 20 berigelsessignalveje for GO- og KEGG-analyser i de BCAT2-relaterede gener.

Figur 3. Udforskning af mekanismen af ​​BCAT2 til at forme TME ved bulk RNA-seq og scRNA-seq. A, B) tSNE-plot af enkeltcelleekspressionsmønsteret af BCAT2 i Xiangya siRNA-kohorte og GSE135337-kohorte. C) Violinplot af enkeltcelleekspressionsmønsteret for BCAT2 i GSE145137-kohorten. D, E) GSEA-analyse af GO-term indikerer aktiviteter af cytokin/kemokin-relaterede veje og immunceller kemotakse-relaterede veje mellem forskellige BCAT2-grupper i GSE135337-kohorten. F) GSEA-analyse af KEGG-term indikerer aktiviteter af antigenpræsentation og interaktion af cytokin- og cytokinreceptorvej mellem forskellige BCAT2-grupper i GSE145137-kohorten. G-I) GSEA-analyse af GO-term indikerer aktiviteter af cytokin/kemokin-relaterede veje, immuncellers kemotakse-relaterede veje og immuncellers migrationsrelaterede veje mellem forskellige BCAT2-grupper i GSE145137-kohorten. J, K) GO og KEGG analyse af DEG'er mellem BCAT2 OE og BCAT2 KD cellelinjer.

2.3. BCAT2 varierer ekspressionsmønstre af CD8+T-celle-relaterede kemokiner og hæmmer cytotoksisk kapacitet af CTL'er

For at validere de ovenfor nævnte berigelsesveje blev BCAT2-overekspression (BCAT2 OE) og BCAT2 knockdown (BCAT2 KD) humane (T24)/murine (MB49) blærekræftcellelinjer konstrueret med succes (Figur S15A-D, understøttende information) og blev testet med high-throughput RNA-sekventering. Forventet, GO-analyse af T24-cellelinjer afslørede, at DEG'er var signifikant beriget i veje for kemokin-medieret signalering, respons på kemokin, leukocytmigrering og leukocytmigrering (figur 3J). KEGG-vejanalyse af T24-cellelinjer viste, at kemokinsignalvejen, cytokin--cytokinreceptorinteraktionsvejen og blærekræftvejen var signifikant beriget (figur 3K). Tilsvarende blev flere kritiske cytokin/kemokin-relaterede veje fundet i GO- og KEGG-analyser af MB49-cellelinjer (figur S16A, B, understøttende information). Det er klart, at forskellige cytokiner og kemokiner spiller en afgørende rolle i reguleringen af ​​TME. Derfor er det nødvendigt at screene cytokiner/kemokiner, som er specifikt reguleret af BCAT2. Derfor blev ProcartaPlex multiple immunoassays anvendt til at identificere sekretionsvariation af cytokiner/kemokiner i humane og muse blærecancercellelinjer. Sekretionsniveauer af CCL3, CCL4, CCL5 og CXCL10 opregulerede overraskende i humane og murine BCAT2-KD-cellelinjer og nedregulerede i humane og murine BCAT2-OE-cellelinjer (figur 4A, B; figur S16C , D, understøttende information). I tidligere undersøgelser blev CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 og CXCL10 betragtet som afgørende kemokiner til rekruttering af CD8+T-celler til TME.[12] For at få en bedre omfattende analyse af CD8+T-celle-relaterede kemokiner blev dem alle inkluderet til yderligere validering. Påfaldende nok blev RNA-ekspressionsniveauer af CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 og CXCL10 signifikant nedreguleret i BCAT2 OE-celler og signifikant opreguleret i BCAT2 KD-celler (figur 4C). Tilsvarende viste resultater af ELISA, at udskilte proteinniveauer også havde negative korrelationer med en ekspression af BCAT2 (figur 4D). Disse resultater indikerede, at overekspression af BCAT2 hæmmer transkriptom- og proteinniveauer af CD8+T-celle-relaterede kemokiner, herunder CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 og CXCL10. Endnu vigtigere afslørede kemotakseassayet, at BCAT2 OE-cellelinjen signifikant hæmmede kemotakseevnen af ​​CD8+T-celler (figur 4E, venstre). Omvendt var cellesupernatanter af BCAT2 KD-cellelinjen i stand til at tiltrække flere CD8+T-celler end dens negative kontrol (figur 4E, til højre). Disse resultater indikerede, at BCAT2 kan påvirke kemotaksekapaciteten af ​​CD8+T-celler ved at regulere mRNA- og proteinniveauer af relaterede kemokiner. Ydermere blev en T-celle-medieret cancercelle-drab-assay brugt til at udforske cytotoksicitetsvariationen af ​​T-celler efter direkte kontakt med tumorceller, der udtrykker et andet niveau af BCAT2. Som vist i figur 4F og figur S17A, B (understøttende information), undertrykte overekspression af BCAT2 på tumorceller direkte den cytotoksiske funktion af T-celler, og knockdown af BCAT2 på tumorceller vendte signifikant tendensen. Flowcytometrianalyse af indsamlede T-celler viste, at andelen af ​​CD8+TNF-𝛼+ T-celler og CD8+IFN-𝛾+ T-celler havde signifikante forskelle i forskellige samkultursystemer, hvilket betød en massiv ændring i aktiviteten af ​​CD8+T-celler (figur 4G; figur S17C, D, understøttende information). Samlet er BCAT2 i stand til at hæmme rekrutteringsevnen af ​​CD8+T-celler ved at regulere relaterede kemokinniveauer samt undertrykke aktiviteter af CTL'er ved direkte kontakt. Derudover kan resultatet af det T-cellemedierede cancercelledrab-assay (uden T-cellegruppe) udlede, at BCAT2 spiller en onkogen rolle i blærekræft. Derfor blev pladekoloniassay og transwell migration/invasion assay brugt til at validere denne hypotese. Som forventet forbedrede overekspression af BCAT2 signifikant spredningen, migrationen og invasionsevnen af ​​tumorceller, og knockdown af BCAT2 undertrykte markant denne adfærd (figur S18A-F, understøttende information).

2.4. Validering af eksklusivt rumligt forhold mellem BCAT2+-tumorcelle og CD8+T-celle af TMA fra Xiangya BLCA-kohorte

Ifølge resultaterne af bulk RNA-seq, scRNA-seq og vitro eksperimenter viste vi, at BCAT2 spiller en immunsuppressiv rolle i BLCA ved at undertrykke rekruttering og cytotoksicitet af CD8+T-celler. Interaktionen mellem BCAT2+-tumorceller og CD8+T-celler er dog stadig ukendt på humant vævsniveau. I Xiangya BLCA-kohorten afslørede repræsentative billeder og en samlet score af IHC en negativ korrelation mellem BCAT2 og CD8 (R=−0.38, p=0.0 038) (figur 5A, B). Flerfarvet IF-farvning af BCAT2+ tumorceller (BCAT2+CK19+) og BCAT2+CD8+T-celler blev udført i TMA og semiautomatisk analyseret ved hjælp af TissueFAXS panoramisk kvantificeringsplatform. Som vist i figur 5C var ekspressionsomfanget af BCAT2 og CK19 stort set overlappet. Omvendt var ekspressionsomfanget af BCAT2 og CD8 distinkt og adskilt. Detaljerede samekspressionsandele af BCAT2+CK19+-celler og BCAT2+CD8+T-celler var 87,29 % og 5,09 % (figur 5D, E), hvilket var i overensstemmelse med ekspressionsmønster af BCAT2 i scRNA-seq. I den samlede TMA var der stadig en signifikant forskel i samekspressionsproportion mellem dem (Figur S19A, Understøttende information). Endnu vigtigere er det, at i multidimensionel afstandsgradientanalyse (0-25, 25-50, 50-100 og 100-150 μm) omkring BCAT2+ tumorceller blev antallet af CD8+T-celler gradvist øget fra nær til fjern (figur 5F; figur S19B, understøttende information). Sammen påviste vi, at på det humane vævsniveau udtrykkes BCAT2 også hovedsageligt i tumorceller, og BCAT2+ tumorcellen har et eksklusivt rumligt forhold til CD8+T-cellen.

Fordele ved cistanche tubulosa-Antitumor

2.5. Tab af BCAT2 øger effektiviteten af ​​anti-PD-1-terapi

Med en fremtrædende negativ indvirkning på TME og en negativ tæt korrelation til hæmmende checkpoint-blokade, vækker det stor interesse at udforske den synergistiske effekt af BCAT2-tab og anti-PD- 1-behandling. Forud for immunterapi blev en subkutan blærekræftmodel bygget af BCAT2 KD og kontrol murine cellelinjer. Derefter blev anti-PD-1-terapi og kontrolterapi anvendt på tumorbærende mus (figur 6A). I overensstemmelse med dens onkogene rolle og reguleringsmekanisme på kemokiner in vitro, hæmmede BCAT2-mangel tumorvækst og forlængede overlevelsestid in vivo ved at opregulere CD8+T-relaterede kemokiner (figur 6B-E; figur S20A, understøttende information). Med hensyn til immunterapiens effektivitet, selvom anti-PD-1 monoterapi delvist kunne reducere tumorbyrden, indikerede samtidig behandling af BCAT2 KD og anti-PD-1 monoklonalt antistof (mab) en bedre tumorundertrykkende effekt og opnåede mere overlevelsesydelse. På den planlagte dag blev tumorer høstet og forberedt til yderligere analyse. En del af dem blev fordøjet til enkeltcellesuspension og udført flowcytometrianalyse. Med en lignende population af leukocytter og T-celler (Figur S20B–E, Understøttende information) i tumoren blev der vist en højere andel af CD8+T-celler i BCAT2-mangelgruppen end i den negative kontrolgruppe. Tilsvarende havde kombinationsterapigruppen en mere massiv infiltration af CTL'er end monoterapigruppen (figur 6F-H). Endnu vigtigere var cytotoksicitetsindikatorer (GZMB, IFN-𝛾, TNF-𝛼 og Perforin) af CTL'er også forstærket i murine tumorer med BCAT2-tab og kombinationsbehandling sammenlignet med tilsvarende kontrol (figur 6G, I-L). De andre dele af tumorerne blev lavet til frosne sektioner og implementeret IF-farvning. Som forventet viste tætheden af ​​CD8+T-celler i området af interesse (ROI) den samme tendens med flowcytometrianalyse (figur 6M, N). Disse resultater indikerede, at BCAT2-mangel på tumorceller kan forme en betændt TME og have stor effektivitet med behandlingen af ​​immunterapi. For at finde ud af, hvilken rolle CD8+T-celler spiller i den synergistiske effekt af samtidig behandling, blev CD8𝛼 mab anvendt til at antagonisere dem i immunkompetente mus (Figur S21A, Understøttende information) og validerede dens udtømningseffekt ved flowcytometri og IF (Figur S21B, C, Understøttende oplysninger). Efter udtømning blev tumorbyrden og overlevelsestid naturligvis væsentligt vendt (Figur S21D-G, understøttende information). Disse resultater indikerede, at CD8+T-celler spiller en uundværlig rolle i den synergistiske effekt af kombinationsterapi.

Figur 4. BCAT2 varierer ekspressionsmønstre af CD8+T-celle-relaterede kemokiner og hæmmer cytotoksisk kapacitet af CTL'er. A,B) Heatmaps af ProcartaPlex multiple immunoassays viser sekretionsvariation af almindelige cytokiner og kemokiner i BCAT2 OE, BCAT2 KD og negative kontrolgrupper (n=3 pr. gruppe). C,D) Histogrammer viser normaliserede mRNA-ekspressionsniveauer og proteinsekretionskoncentrationer af CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 og CXCL10 i BCAT2 OE (venstre), BCAT2 KD (højre) og negative kontrolgrupper (n {{ 15}} pr. gruppe). *p < 0.{{20}}5; **p < 0.01; ***p < 0,001. E) Kemotakse-assay indikerer forskellige kemotakse-evner af CTL'er i BCAT2 OE, BCAT2 KD og negative kontrolgrupper (n=3 pr. gruppe). *p < 0,05; **p < 0,01. F) T-celle-medieret cancercelledrab-assay indikerer forskellige dræbende evner af T-celler co-dyrket med BCAT2 OE, BCAT2 KD og negative kontrolcellelinjer (n=3 pr. gruppe). G) Flowcytometrianalyse indikerer forskellige aktiviteter af CD8+T-celler i forskellige samkulturgrupper (n=3 pr. gruppe).

Figur 5. Validering af eksklusive rumlige forhold mellem BCAT2+-tumorceller og CD8+T-celler ved TMA fra Xiangya BLCA-kohorte. A) IHC-billede af BCAT2 og CD8 i betændte og ikke-inflammerede typer TME. Målestok: 50 μm. B) Korrelation mellem BCAT2 og CD8 på basis af IHC-score af dem i samlet TMA. C) Flerfarvet IF-billede af BCAT2, CK19, CD8 og kombinationsindeks i betændte og ikke-betændte typer af TME. BCAT2+-celle (lyserød), CK19+-celle (cyan), CD8+T-celle (orange) og cellekerne (blå). Målestok: 50 μm. D,E) Detaljerede samekspressionshastigheder for BCAT2+CK19+- og BCAT2+CD8+-celler i den typiske prøve. F) Afstandsgradientanalyse (0–25, 25–50, 50–100 og 100–150 μm) af CD8+T-celler omkring BCAT2+CK19+-celler i de typiske prøve.

Figur 6. Tab af BCAT2 øger effektiviteten af ​​anti-PD-1-terapi. A) Flowdiagram over behandlingsplanen. B) Høstede tumorer med forskellige terapiregimer (n=5 pr. gruppe). C-E) Kvantificering af tumorvolumen, kropsvægt og overlevelsestid i forskellige behandlingsregimer (n=5 pr. gruppe). ns: ingen betydning; *s< 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. F) Contour plots indicate the proportion of CD8+T cells; G) proportions of GZMB+CD8+T cells, IFN-𝛾+CD8+T cells, TNF- 𝛼+CD8+T cells, and Perforin+CD8+T cells in different therapy regimens. H) Quantified scatter plots exhibit proportion of CD8+T cells; I–L) proportions of GZMB+ CD8+T cells, IFN-𝛾+ CD8+T cells, TNF-𝛼+ CD8+T cells, and Perforin+ CD8+T cells in different therapy regimens (n = 5 per group). ns: no significance; *p<0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. M, N) IF image and quantified histogram show densities of CD8+T cells in different therapy regimens (n = 3 per group). Scale bar: 20 μm. CD8+T cell (green) and cell nucleus (blue). ns: no significance, *p<0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.

Udover tumorceller udtrykkes en lille del af BCAT2 desuden i CD8+T-celler. Derfor undersøgte vi yderligere, om det forskellige ekspressionsniveau af BCAT2 på CD8+T-celler kan påvirke deres aktiviteter. Efter farvning af enkeltcellesuspension af murine milt med BCAT2- og T-celle-relaterede fluorescerende antistoffer sammenlignede vi andele af CD8+ TNF-𝛼+T og CD8+ IFN-𝛾+T-celler mellem BCAT 2+CD8+ og BCAT2−CD8+ grupper. Interessant nok fandt vi, at proportionerne var ens mellem de to grupper, hvilket afslørede, at aktiviteten af ​​CD8+T-cellen er uafhængig af dens ekspressionsniveau af BCAT2 (figur S22A–C, understøttende information).

2.6. BCAT2 forudsiger respons på immunterapi i flere virkelige verdens immunterapi-kohorter

Ovenstående resultater har vist en immunsuppressiv rolle af BCAT2 i TME og den synergetiske effekt af at kombinere BCAT2-tab med anti-PD-1-terapi. Imidlertid er dets forudsigelige potentiale for immunterapieffektivitet uklart. I TCGA-BLCA-kohorten blev berigelsesscore af immunterapi-relaterede veje derfor sammenlignet mellem høje og lave BCAT2-grupper. Som vist i figur S23A (understøttende information) havde lav-BCAT2-gruppen flere aktive gener i immunterapi-relaterede veje, hvilket kan udlede, at lav ekspression af BCAT2 repræsenterer en mere følsom tilstand over for immunterapi. Til yderligere validering blev 58 patienter med muskelinvasiv blærekræft (MIBC), som accepterede neoadjuverende anti-PD-1-behandling på vores hospital, inkluderet i Xiangya BLCA-immunterapi-kohorten. Repræsentative IHC-, IF- og CT-billeder af responderen og non-responderen antydede, at ekspressionsniveauet af BCAT2 har en tæt relation til effektiviteten af ​​immunterapi - et individ med et lavt BCAT2-ekspressionsniveau er mere tilbøjeligt til at reagere på immunterapi end et individ med en højt BCAT2-ekspressionsniveau (figur 7A-C). Desuden indikerede IHC-scoren for Xiangya BLCA-immunterapi-kohorten og mRNA-ekspressionsmatrix af IMvigor210-kohorten en robust negativ korrelation mellem BCAT2 og PD-L1 (R=−{{3{{32} }}}.4, p=0.002; R=−0.41, p < 0.001) (Figur S23B, C, Understøttende oplysninger). Derfor sammenlignede vi direkte effektiviteten af ​​immunterapi mellem høj- og lav-BCAT2-grupper i Xiangya BLCA-immunterapi-kohorten og fandt, at lav-BCAT2-gruppen havde en signifikant højere andel af respondere end gruppen med høj BCAT2 (p=0.001) (Figur 7D). Desuden vurderede vi forudsigelsesværdierne for BCAT2, PD-L1 og kombinationsindeks (BCAT2+PD-L1) på patologisk respons på immunterapi og fandt den store ydeevne af kombinationsindeks (BCAT2+PD- L1) om forudsigelsesnøjagtighed (figur 7E). Inspirerende nok havde lav-BCAT2-gruppen en længere sygdomsfri overlevelse (DFS) end høj-BCAT2-gruppen (p=0.032) (figur 7F), hvilket viser prognoseværdien af ​​BCAT2 i aspektet af overlevelsesresultater. BLCA immunterapi. I kliniske tilfælde er individer med ørken-TME mere tilbøjelige til at have en begrænset immunterapieffektivitet end individer med betændt TME, hvilket yderligere understreger vigtigheden af ​​prognoseindikatorer. Derfor udvalgte vi alle personer med ørken-TME i IMvigor210-kohorten og gennemførte den omfattende vurdering. I en direkte sammenligning af ekspressionsniveauet af BCAT2 blandt forskellige responsgrupper havde CR-gruppen (responder) et signifikant lavere ekspressionsniveau af BCAT2 end SD- og PD-grupperne (non-responder) (figur 7G). Endnu vigtigere er det, at kombinationsindekset (BCAT2+PD-L1) også havde en fantastisk præstation med hensyn til forudsigelsesnøjagtighed (figur 7H). Selvom der ikke var nogen signifikant forskel i den samlede overlevelse (OS) mellem høje og lave BCAT2-grupper i ørkentypen af ​​IMvigor210-kohorte, var prognosetendensen stadig den samme som resultatet af Xiangya BLCA-immunterapi-kohorten (figur 7I). Bortset fra PD-L1 er mikrosatellitinstabilitet (MSI) den anden væsentlige forudsigelse for immunterapiens effektivitet. Status for mismatch reparation (MMR) – dygtig MMR (pMMR) og mangelfuld MMR (dMMR) holder høj overensstemmelse med lavfrekvent MSI (MSI-L) og højfrekvent MSI (MSI-H).[13] Derfor gennemførte vi en omfattende evaluering af alle individer i Xiangya BLCA immunterapi-kohorten baseret på farvningsresultaterne af fire MMR-markørgener (MLH1, MSH2, MSH6 og PMS2). Resultatet afslørede en signifikant højere andel af dMMR (MSI-H) i gruppen med lav BCAT2 sammenlignet med gruppen med høj BCAT2 (p=0.02) (figur S23D, E, understøttende information). Desuden evaluerede vi de prædiktive værdier af MMR, BCAT2 og kombinationsindeks (MMR+BCAT2) på immunterapieffektivitet og fandt ud af, at kombinationsindekset (MMR+BCAT2) havde en kvalificeret præstation på forudsigelsesnøjagtighed (figur S23F, understøttende information). Tilsammen viste disse resultater, at BCAT2 er kvalificeret til at fungere som en komplementær prædiktor for effektiviteten af ​​BLCA-immunterapi. Endelig blev den prædiktive værdi af BCAT2 som respons på immunterapi undersøgt i forskellige cancertyper. Vi fandt ud af, at personer med høj ekspression af BCAT2 viste en signifikant dårligere responsrate (p=0.04) i GSE35640-kohorten (melanom) (figur 7J). Selvom der ikke var signifikante forskelle i responsrate mellem høje og lave BCAT2-grupper i GSE173839 (brystkræft), GSE135222 (NSCLC) og Gide 2019-kohorte (melanom), var patienter med lavt udtryk af BCAT2 stadig mere tilbøjelige til at have et positivt respons til immunterapi (figur 7K-M).

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.7. Værdien af ​​BCAT2 i forudsigelse af molekylær subtype og vejledende præcisionsterapi

Med stor heterogenitet, der eksisterer i traditionel histologisk klassificering, viste stigende beviser, at molekylær subtype er i stand til at give mere nøjagtig klassificering på basis af transkriptomprofil i BLCA.[14] Endvidere, med lignende immunologiske karakteristika i samme subtype, har molekylær klassificering et stort potentiale til at forudsige TME og vejlede præcisionsterapi i klinisk.[15] Gennem omfattende analyse af forskellige molekylære subtypesystemer i TCGA-BLCA kohorten fandt vi ud af, at individer med lav ekspression af BCAT2 er mere sandsynligt klassificeret i en basal subtype, ledsaget af aktiverede veje for basal differentiering, EMT differentiering, immundifferentiering, interferon respons, og så videre. Personer med høj ekspression af BCAT2 klassificeres hovedsageligt i luminale subtyper, ledsaget af aktive veje for luminal differentiering, urothelial differentiering og Ta (figur S24A, understøttende information). Ifølge konsensus af molekylær subtype har den basale subtype mere infiltrationsniveau af effektorlymfocytter og en mere aktiv IFN-𝛾 signalvej end den luminale subtype, [16], hvilket indebærer en bedre effektivitet af immunterapi. Derefter blev AUC brugt til at evaluere nøjagtigheden af ​​forudsigelsen. Forbavsende nok, bortset fra Baylor-undertypesystemet (AUC=0.76), var det meste af AUC over 0.90 i andre systemer (Figur S24B, Understøttende information), hvilket betyder en robust forudsigelsesnøjagtighed af BCAT2 i den molekylære undertype. For yderligere at udforske dens rolle i at forudsige effektiviteten af ​​andre terapier, sammenlignede vi aktiviteten af ​​epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) målterapi og strålebehandlingsrelaterede veje mellem høje og lave BCAT2-grupper. Med åbenlyse opregulerede aktiviteter er patienter i lav-BCAT2-gruppen mere tilbøjelige til at have et positivt respons på EGFR-målterapi og strålebehandling (Figur S24C, understøttende information). For at øge forudsigelsespålideligheden for molekylær subtype og behandlingsfølsomhed, var otte BLCA-kohorter (Xiangya BLCA-kohorte, GSE31684, GSE69795, GSE48075, GSE128702, GSE83586, GSE52329, og E-MTAB-immunterapi){2}CA-immunterapi (1) og en E-MTAB (1) ansøgt om ekstern validering. Sammen med fremragende nøjagtighed af forudsigelse blev lignende resultater fundet i disse kohorter (figur S25-S27, understøttende information). Hyperprogressiv sygdom (HPD) er en ekstremt ufølsom tilstand over for immunterapi. For at udforske indflydelsen af ​​BCAT2 på HPD blev HPD-associerede biomarkører indsamlet fra tidligere undersøgelser[17], og CNV af biomarkører blev sammenlignet mellem lav og høj BCAT2 grupper. Bortset fra EGFR var CNV-amplifikationsraterne for andre HPD-positive associerede biomarkører (rødt symbol) højere i høj-BCAT2-gruppen, især MDM2 (p=0.0116). CNV-sletningshastigheder af HPD-negative associerede biomarkører (grønt symbol) var lavere i høj-BCAT2-gruppen (figur S24D, understøttende information). Resultatet indikerede, at patienter med høj ekspression af BCAT2 har en potentiel risiko for HPD under immunterapi. Neoadjuverende kemoterapi (NAC) er en afgørende terapi ved BLCA. Markører, der forudsiger respons på NAC i BLCA, blev indsamlet fra en gennemgang af Buttigliero et al.[18] og deres mutationshastigheder blev sammenlignet mellem de to grupper. Baseret på højere overordnede mutationsrater af biomarkører og hyppigere mutation af RB1 i lav-BCAT2-gruppen, spekulerede vi i, at individ med lavt udtryk af BCAT2 har en bedre effektivitet af NAC i klinisk (Figur S24E, understøttende information). Derfor blev Drugbank-databasen brugt til at sammenligne effektiviteten af ​​adskillige almindelige kemoterapi-regimer mellem to grupper og fandt ud af, at personer med lav ekspression af BCAT2 er mere tilbøjelige til at reagere på kemoterapi. Derudover viste lav-BCAT2-gruppen også bedre effektivitet i almindelige regimer af immunterapi og ERBB-terapi. Uventet opnår patienter med høj ekspression af BCAT2 sandsynligvis bedre helbredende virkninger i antiangiogene terapi (figur S24F, understøttende information). Samlet tilhører individer med lav ekspression af BCAT2 en betændt molekylær subtype, basal subtype, hvilket betyder en mere positiv respons på immunterapi, kemoterapi, strålebehandling, EGFR-målterapi og ERBB-terapi. Desværre har patienter med høj ekspression af BCAT2 en dårlig respons på disse behandlinger. Imidlertid kan antiangiogene terapi være et glimt af lys for dem.

Figur 7. BCAT2 forudsiger respons på immunterapi i flere virkelige immunterapi-kohorter. A) IHC-billede af BCAT2 og PD-L1 mellem responder og non-responder i Xiangya BLCA immunterapi kohorte. Målestok: 50 μm. B) Flerfarvet IF-billede af BCAT2 og PD-L1 mellem responder og non-responder i Xiangya BLCA immunterapi kohorte. Målestok: 50 μm. BCAT2+celle (grøn), PD-L1+celle (gul) og cellekerne (blå). C) CT-billede af forskel i immunterapieffektivitet mellem personer med høje og lave ekspressionsniveauer af BCAT2. Den røde pil peger på tumorområdet. D) Samlet forskel i responsrate mellem høj og lav BCAT2 grupper i Xiangya BLCA immunterapi kohorte. E) Forudsigelsesnøjagtighed af BCAT2, PD-L1 og kombinationsindeks (BCAT2+PD-L1) på respons på immunterapi i Xiangya BLCA immunterapi kohorte. F) Forskel i sygdomsfri overlevelse (DFS) mellem høje og lave BCAT2 grupper i Xiangya BLCA immunterapi kohorte. G) Forskelle i ekspressionsniveauet for BCAT2 blandt CR-, PR-, SD- og PD-grupper i ørkentypen af ​​IMvigor210-kohorte. *p < 0,05; ns: ingen betydning. H) Forudsigelsesnøjagtighed af BCAT2, PD-L1 og kombinationsindeks (BCAT2+PD-L1) på respons på immunterapi i en ørkentype af IMvigor210-kohorte. I) Forskel i overordnet overlevelse (OS) mellem høje og lave BCAT2-grupper i en ørkentype af IMvigor210-kohorte. J-M) Forskelle i respons på immunterapi mellem høje og lave BCAT2-grupper i GSE35640, GSE173839, GSE135222 og Gide2019 kohorter.

3. Diskussion

Som et nøgleenzym i katabolismeprocessen af ​​BCAA'er fokuserede tidligere forskning hovedsageligt på den metaboliske relaterede rolle af BCAT2 i sygdomme, såsom fedme, diabetes og arytmi. Ma et al. påvist, at udelukkelse af BCAT2 i fedtvæv kan fremskynde fedtbruning og termogenese, hvilket fører til en reduceret fedmerate hos mus.[19] Gennem påvisning af blodprøver fra mere end 2000 individer har Gerszten et al. viste en diabetesrelateret metabolitprofil og fandt ud af, at BCAT2-transformerede BCAA'er spiller en afgørende rolle i udviklingen af ​​sygdom.[20] Portero et al. afslørede, at nonsens-mutationer af BCAT2p.Q300*/p.Q300* resulterer i forhøjede niveauer af BCAA'er og inducerer arytmier hos mus.[21] For nylig fandt et par undersøgelser ud af, at BCAT2 har et tæt forhold til kræft. Lei et al. afslørede, at acetyleringsmedieret nedbrydning af BCAT2 kan forsinke udviklingen af ​​pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) ved at nedregulere metabolismeniveauet af BCAA'er.[22] Wang et al. mente, at et begrænset transkriptionsniveau af BCAT2 fører til et nedsat intracellulært glutamatniveau, hvilket stimulerer ferroptose af hepatomceller.[23] Men al den eksisterende forskning understregede indflydelsen af ​​BCAT2-medieret BCAA-katabolisme på den biologiske proces af kræft i stedet for at udforske en helt ny mekanisme. I denne undersøgelse afslørede vi den immunsuppressive rolle af BCAT2 i TME for første gang. Anvendelse af immunterapi redefinerer kræftbehandling med fantastisk livskvalitet og forlænget overlevelsestid. Ikke desto mindre, på grund af heterogeniteten af ​​det tumorimmune økologiske system, opnår kun en del af individerne tilfredsstillende effektivitet. TME er et kompliceret system, der består af tumorceller, immunceller, stromaceller og kapillærer.[24] I henhold til infiltrationsniveauet for CTL'er kan TME klassificeres i betændte og ikke-inflammerede typer generelt.[25] Voksende beviser tydede på, at betændt TME spiller en positiv rolle i at fremkalde effektive antitumor-immunresponser under behandlingen.[26] Derfor analyserede vi omfattende flere TME-relaterede indikatorer og fandt ud af, at høj ekspression af BCAT2 former en ikke-betændt TME, med hæmmet cancerimmunitetscyklus, undertrykkende ekspressionsmønster af kemokinprofil, MHC-molekyler og utilstrækkeligt infiltrationsniveau af TIIC'er. Derudover er BCAT2 negativt relateret til TIS og effektorgener af ICB, hvilket indebærer, at personer med høj ekspression af BCAT2 er mere tilbøjelige til ikke at reagere på immunterapi. For at validere vores hypotese sammenlignede vi responsraten mellem de høje og lave BCAT2-grupper i Xiangya BLCA-immunterapi-kohorten og andre immunterapi-kohorter. Overraskende nok var der signifikante forskelle i flere kohorter, hvilket indikerede, at BCAT2 også er i stand til at spille en prædiktor for immunterapis effektivitet, især i BLCA. Desuden blev scRNA-seq brugt til at udforske reguleringsmekanismen for BCAT2 i TME og indikerede, at aktiviteten af ​​cytokin/kemokin-relaterede signalveje, T-celle-kemotakse-signalvej og T-celle-migreringssignalvej har signifikante negative korrelationer med BCAT2. Som et kritisk reguleringsnetværk er cytokiner og kemokiner uundværlige for handel med forskellige immunceller til TME. Kemokinsystemet har fire superfamilier: C, CC, CXC og CX3C, med betydelig redundans i parringen af ​​ligander og receptorer.[27] Cytokin kan opdeles i Th1, Th2 og Th17 underfamilier baseret på deres biologiske funktion.[28] Gennem udskillelsen af ​​forskellige niveauer af dem er kampen mellem tumorceller og immunceller nok til at omprogrammere egenskaberne ved TME.[29] Ikke desto mindre, blandt en masse af cytokiner og kemokin, er det nødvendigt at frasortere den mest værdifulde klynge. Ved at bruge et 34-cytokin- og kemokin-immunoassay-panel afslørede vi, at kemokiner, herunder CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 og CXCL10, er robust negativt korreleret med ekspressionen af ​​BCAT2 i den humane og murine blærecancercelle. Det er velkendt, at CXCL9 og CXCL10 er ansvarlige for at rekruttere CD8+T-celler til TME.[30] For at fastslå funktionen af ​​CCL3, CCL4 og CCL5 slog vi tidligere forskning op. Harlin et al. gjort brug af proteinarrays og qPCR for at afsløre, at opreguleringen af ​​CCL3, CCL4 og CCL5 er i stand til at fremme migrationen af ​​CD8+T-celler til melanom.[31] Noman et al. fandt, at en øget sekretionspopulation af CCL5 hjælper med at etablere en proinflammatorisk TME ved at bringe CTL'er ind i tyktarmskræftvæv.[32] Gennem IHC og RNA-seq af kemokinprofil i flere kohorter, Romero et al. påvist, at CCL4 og CCL5 har en stærk sammenhæng med infiltrationsniveauet af CD8+T-celler i bugspytkirtelkræft.[33] Derfor mente vi, at CD8+T-celle-relaterede kemokiner er vigtige kemokiner, der reguleres af BCAT2 i blærekræft. Selvom vi påviste de robuste negative korrelationer mellem BCAT2 og CD8+T-celle-relaterede kemokiner, skal den underliggende reguleringsmekanisme mellem dem stadig undersøges yderligere. Undersøgelsen af ​​Peterson et al. demonstreret, at aktivering af MAP kinase (MAPK) signalvejen kan inducere produktionen af ​​CX3CL1.[34] Xu et al. afslørede, at JAK-STAT-signalvejen regulerede sekretionen af ​​Th1--relaterede kemokiner, hvilket forårsagede et reduceret infiltrationsniveau af TIL'er.[35] For nylig har Peng et al. fandt, at demethylase JMJD3 kan hæmme ekspressionen af ​​CD4+Tcelle-relaterede kemokiner og reducere infiltrationsniveauet af cytotoksicitet T-celler i TME, hvilket repræsenterer en afgørende rolle for epigenetisk modifikation i reguleringen af ​​kemokinekspression.[36] Mayo et al. afslørede også, at en epigenetisk inhibitor, histon-deacetylase 1, har en stor kapacitet til at undertrykke ekspressionen af ​​CXCL8 via aktivering af den nukleare faktor-𝜅B (NF-𝜅B) signalvej.[37] Desuden, som symboler på tumorcellemetabolisme, aerob glykolyse og reaktive oxygenarter (ROS), hvilket indikerer store præstationer med hensyn til at inducere ekspression af CXCL8 og CXCL14 ved at øge aktiviteterne af signalveje for NF-𝜅B og transkriptionsfaktoraktivatorprotein 1 (AP{{93 }}).[38] Interessant nok blev signalveje for NF-𝜅B, STAT og MAPK i vores undersøgelse signifikant beriget mellem høje og lave BCAT2-cellelinjer (figur 3K; figur S16A, B, understøttende information). Derfor vil vi, kombineret med ovenstående undersøgelser, yderligere udforske nøglemolekylet i reguleringsmekanismen for BCAT2 og CD{100}T-relaterede kemokiner. Den begrænsede objektive responsrate af monoterapi med ICB foranlediger fremkomsten af ​​en kombinationsterapistrategi. Til omdannelse af ikke-immunologisk TME til immunologisk TME, Wolchok et al. anvendte samtidig behandling af nivolumab (anti-PD-1-terapi) og ipilimumab (anti-CTLA-4-behandling) hos patienter med melanom og fandt en opmuntrende helbredende effekt, som tilskrives synkron forbedret priming, aktivering og drab af CTL'er .[39] Mere end at kombinere med en anden type ICB, kemoterapi plus immunterapi er den alternative behandlingsmulighed. Som et førstelinjebehandlingsregime for avanceret urothelial carcinom fandt et par undersøgelser, at cisplatin-baseret kemoterapi er i stand til at forme en proinflammatorisk TME ved at øge ekspressionsniveauet af MHC I-klassen på dendritiske celler og beskadige MDSC'er og Tregs.[40] Tilfældigvis kunne Homma et al. afslørede, at et andet almindeligt kemoterapilægemiddel mod blærekræft – gemcitabin – kan forbedre infiltrationsmængden af ​​CD8+T-celler og svække immunsuppressive immunceller i TME.[41] I vores prækliniske dyreforsøg udviste samtidig behandling af BCAT2-tab og anti-PD-1 mab en mere tydelig antitumoreffektivitet sammenlignet med monoterapi af anti-PD-1 mab i immunkompetente mus, hvilket giver en innovativ behandling strategi for ICB-resistenspatienter. I mellemtiden demonstrerede vi gennem flowcytometrianalyse og IF, at nedbrydningen af ​​BCAT2 ikke kun rekrutterer flere populationer af CTL'er til TME, men også øger CTL'ers dræbende aktivitet. Tilsvarende har Peng et al. fandt, at overekspression af LGALS2 reducerer mængden af ​​infiltrerende CTL'er såvel som cytotoksiske biomarkører i brystkræftbærende mus.[42] Yang et al. illustreret, at CXCL13 er i stand til at øge responsen på immunterapi i ovariecancer musemodeller ved at øge infiltrationsniveauet af CD8+T-celler og sekretionsniveauet af GZMB, IFN-𝛾 og IL-2.[43] Ledsagende stærkere anticancer-respons forstyrrer kombinationsterapi yderligere den eksisterende immunfeedback-loop, hvilket sandsynligvis fører til alvorlige bivirkninger. Ifølge ekspressionsmønsteret for BCAT2 på siRNA-niveau, specifikt udtrykt i tumorceller snarere end i immunceller og endotelceller, kan vi foreløbigt udlede, at BCAT2-tab eller inhibitor af BCAT2 er mindre tilbøjelige til at resultere i frygtelige bivirkninger. Den optimale dosering og intervaltid for BCAT2-hæmmer og anti-PD-1 mab i kombinationsbehandling skal dog stadig undersøges.

For at vejlede præcisionsterapi hos individer korrelerede vi BCAT2 til den molekylære undertype af BLCA og kritiske biomarkører for forskellige terapier. Baseret på troværdige forudsigelser i flere kohorter fandt vi ud af, at immunterapi, kemoterapi, strålebehandling og EFGR-målterapi er velegnet til patienter med lavt udtryk af BCAT2. Antiangiogene behandling anbefales til patienter med høj ekspression af BCAT2. Forskellig fra den komplicerede detektionsproces af molekylære undertyper er BCAT2 en bærbar prædiktor for præcisionsterapi. Der er uundgåeligt nogle begrænsninger i vores undersøgelser. For det første var prøvestørrelserne og opfølgningstiden for Xiangya BLCA-kohorten og Xiangya BLCA-immunterapi-kohorten begrænset. Vi er nødt til yderligere at forstørre stikprøvestørrelsen og fortsætte standardiseret opfølgning. For det andet, som en kohorte i den virkelige verden, indeholdt Xiangya BLCA immunterapi-kohorten forskellige operationsmuligheder, som sandsynligvis forårsagede en potentiel bias. Vi vil yderligere udvide vores kohorte og udføre undergruppeanalyse baseret på den samme operationsmulighed. For det tredje skal den kooperative effekt af kombinationsterapi in vivo valideres yderligere ved hjælp af systemapplikationen af ​​BCAT2-hæmmer. Som en immunosuppressiv rolle i TME af BLCA, er BCAT2 et spirende mål i kombinationsterapi af ICB og en nøjagtig biomarkør for præcisionsterapi.

Fordele ved cistanche tubulosa-styrke immunsystemet

4. Eksperimentelt afsnit

cohort: As illustrated in a previous study,[44] 56 eligible BLCA patients accepted surgical treatment (TURBT (transurethral resection of bladder tumor) or radical cystectomy) in Xiangya Hospital. All the samples were conducted through high throughput RNA sequencing (RNA-seq) to acquire transcriptome information. Then, data on RNA-seq, clinicopathologic features, and follow-up information of these patients were utilized to construct the Xiangya BLCA cohort (Table S1, Supporting Information). Xiangya BLCA immunotherapy cohort: 58 MIBC patients were included in the Xiangya BLCA immunotherapy cohort. All the samples were obtained by diagnostic TURBT before the implementation of neoadjuvant anti-PD-1 therapy. After at least two cycles standard neoadjuvant immunotherapy (NAI), TURBT, or radical cystectomy (RC) were conducted based on treatment response and patients' willingness. 17 individuals with complete response (CR) and 16 individuals with partial response (PR) were classified into responders, 17 individuals with stable disease (SD), and 8 individuals with progressive disease (PD) were classified into nonresponders. The detailed clinicopathological characteristics are listed in Table S2 (Supporting Information). Xiangya scRNA cohort: Three samples of muscle-invasive bladder cancer were implemented scRNA-seq, constituting the Xiangya scRNA cohort. Detailed preparation of single-cell suspension, data transformation, and cell quality control have been elaborated in previous articles.[45] In simple terms, three tumor samples were loaded on a Chromium Single Cell Controller instrument (10×Genomics, USA) to produce single-cell gel beads in suspension. Seurat R package was applied to transform the count matrix into Seurat format. Four standards were set up for excluding low-quality cells in the matrix: unique molecular identifier (UMI) amount < 1000, gene quantity < 200, log10GenesPerUMI < 0.70, and mitochondrial-originated UMI counts > 20%. After integrating the samples based on the top 3000 variable traits, principal component analysis (PCA) and the Findclusters algorithm were employed to identify main cell clusters. Based on the level of copy number variation (CNV) in epithelial cells, malignant bladder carcinoma cells were selected from clusters. The study plan was approved by the ethics committee of Xiangya Hospital, Central South University (Item number: 2021101175). All the specific men were collected complying with informed consent rights. The Cancer Genome Atlas (TCGA) Database: RNA expression matrix, survival outcome, and CNV of 33 types of carcinomas were acquired from the UCSC Xena database. Log2 transformation was employed to normalize RNA-seq data and the GISTIC algorithm was applied to process CNV data. Gene Expression Omnibus (GEO) Database: Transcriptome data of 1740 samples from nine BLCA cohorts: GSE31684 (93 samples), GSE48075 (142 samples), GSE69795(61 samples), GSE32894 (308 samples), GSE48276 (116 samples), GSE83586 (307 samples), GSE86411 (132 samples), GSE52329 (20 samples), GSE87304 (305 samples), and GSE128702 (256 samples) were obtained from GEO database. RNA-seq data of three immunotherapy cohorts: GSE35640 (14 samples, melanoma, and MAGE-A3 therapy), GSE173839 (105 samples, breast cancer, and anti-PD-L1 therapy), and GSE135222 (27 samples, nonsmall cell lung carcinoma (NSCLC), and anti-PD-1/PD-L1 therapy) were downloaded from GEO database. Single-cell transcriptomic characterization of two BLCA scRNA cohorts: GSE135337 (8 samples) and GSE145137 (3 samples) was obtained from the GEO database. Data processing was similar to the Xiangya siRNA cohort. Other Databases: RNA expression matrix and clinicopathologic characteristics of immunotherapy cohorts: IMvigor210 (348 samples, bladder cancer, and anti-PD-1 therapy) and Gide2019 (58 samples, melanoma, anti-PD-1, or anti-CTLA-4 therapy) were collected from http://researchpub.gene.com/IMvigor210CoreBiologies and TIDE database (http://tide. dfci.harvard.edu/). Data of RNA-seq and clinical characteristics of a BLCA cohort—E-MTAB-1803 (85 samples)—was downloaded from ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/). BCAT2 expression levels in various types of cancer cell lines were downloaded from the Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) database. Specific clinicopathologic and follow-up information from public databases were listed in our previous studies.[44,46] Assessment of Immunological Identity of TME in BLCA: As depicted in our previous study,[44] a comprehensive evaluation of the immunological trait of TME in BLCA was summarized. The tracking tumor immunophenotype (TIP) website (http://biocc.hrbmu.edu.cn/TIP/) was used to assess the activities of cancer immunity cycles, which reflected the effectiveness of antitumor immunity. It is separated into seven concrete steps: release and presentation of tumor antigen (steps 1 and 2), startup and activation of effector T cells (step 3), trafficking and assisting diverse immune cells into TME (steps 4 and 5), recognition and killing cancer cells (steps 6 and 7).[47] Six independent algorithms (TIMER, CIBERSORT, CIBERSORT-ABS, MCP-COUNTER, TISIDB, and XCELL) were employed to calculate the infiltration levels of tumor-infiltrating immune cells (TIICs).[48] Furthermore, effector genes of immune cells, ligands and receptors of chemokines, major histocompatibility complex (MHC) molecules, and immunostimulators were collected for evaluating immunological characteristics of TME multi-dimensionally. T cell-inflamed score (TIS) and markers of ICB were utilized to assess the host sensitivity state to immunotherapy.[49] Enrichment Pathways Analysis: Limma R package with empirical Bayesian function was employed to screen differentially expressed genes (DEGs) between high and low expression of BCAT2 in the RNA expression matrix.[50] Screening thresholds were |log (fold change) (log FC) |>1,5 og den justerede p-værdi < 0.05. Gene Ontology (GO) og Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) analyser blev udført på identificerede DEG'er af ClusterProfiler R-pakken.[51] Seurat R-pakke med Findmarker-algoritme blev anvendt til at beregne ekspressionsniveauet af BCAT2 på epitelceller i scRNA-seq. På basis af varieret genekspressionsrangering efter fold-ændringsværdi (FC) blev gensætberigelsesanalyse (GSEA) implementeret til at bedømme positive og negative korrelationer. Identifikation af immun-relaterede DEG'er: ESTIMATE R-pakken blev anvendt til at beregne immun- og stromale scores i TCGA-BLCA-kohorten. Ifølge medianværdien af ​​to scores og ekspressionsniveauet af BCAT2 blev Limma R-pakken anvendt til at identificere positive/negative immun-relaterede og stroma-relaterede DEG'er. Venn diagram R-pakke blev brugt til at tage skæringspunktet mellem forskellige grupper og sikre de fælles DEG'er. Klassificering af individer, der bruger molekylære undertyper af BLCA: Syv molekylære undertyper af BLCA (UNC, Baylor, TCGA, MDA, Lund, CIT og Consensus) blev bredt anvendt i kliniske undersøgelser til vurdering af karakteristika for TME og effektiviteten af ​​forskellige terapier.[52] I betragtning af den komplekse interaktion mellem forskellige undertyper opdelte vi dem kollektivt i to hovedkategorier - basale og luminale undertyper.[16] R-pakker med Consensus MIBC og BLCAsubtyping blev anvendt til at klassificere individer i specifikke undertyper. Efter normalisering blev arealet under ROC-kurven (AUC) brugt til at vurdere pålideligheden af ​​BCAT2 til at forudsige klassificering. Præcisionsterapivurdering af patienter: Som illustreret i vores tidligere undersøgelse[53] blev en række kritiske gensignaturer, der kan forudsige effektiviteten af ​​kemoterapi, strålebehandling, målrettet terapi og immunterapi, indsamlet fra forskellige undersøgelser og databaser.[16, 54] ssGSEA-algoritmen blev brugt til at beregne berigelsesscorerne for gensignaturer.[55] Cellelinjer: Humane blærekræftceller (T24) og murine blærekræftceller (MB49) blev købt fra henholdsvis Procell Life Science & Technology (Wuhan, Kina) og Meisen CTCC (Jinhua, Kina). De blev holdt i DMEM-medium (BasalMedia, Kina) med 10% føtalt bovint serum (FBS) (BI, Israel), 1% penicillin og streptomycin (NCM Biotech, Kina) og dyrket i en inkubator ved 37 graders temperatur indeholdende 5 % CO2. Konstruktion og RNA-seq af stabile transfektionsceller: Lentiviral vektor plenti-BCAT2-flag-puromycin (GV341) blev designet og konstrueret af GeneChem (Shanghai, Kina) til stabil BCAT2-overekspression (BCAT2 OE) cellelinje og dens negative kontrol (oe-vektor). Derudover blev BCAT2- kort hårnåle-RNA (shRNA) klonet ind i GV112-lentiviral vektor af GeneChem (Shanghai, Kina) til en stabil BCAT2-knock-down (BCAT2 KD) cellelinje . Målsekvenser af shRNA blev opført i tabel S3 (understøttende information). Derefter blev rekombinante BCAT2 lentivirus transficeret ind i objektive celler i overensstemmelse med producentens instruktioner. 2 ug mL-1 puromycin (Amersco, USA) blev anvendt til at filtrere stabile transfektionsceller i tre dage. Western blot og kvantitativ revers-transkriptions-PCR (qRT-PCR) blev anvendt for at validere transfektionens effektivitet. Til sidst blev en stabil transfektionscelle med den bedste effektivitet udvalgt til RNA-seq og yderligere eksperimenter. Tre duplikatprøver af hver cellelinje blev sendt til BGI RNA-seq platformen (Shenzhen, Kina). Kriterier for udvælgelse af DEG'er og analyse af berigelsesveje var de samme som afbildet i 2.3 (berigelsesvejsanalyser). ProcartaPlex multiple immunoassays til påvisning af sekretionsniveau af kemokiner og cytokiner fra kræftcellelinjer: Humant ProcartaPlex immunoassay-panel (kat: EPX340-12167-901) og muse-ProcartaPlex immunoassay-panel (kat: EPX{{50}}) blev købt fra ThermoFisher Scientific (Massachusetts, USA) til påvisning af proteinekspressionsniveauer af mere end 3 0 afgørende kemokiner og cytokiner i stabile transfektionskræftceller. Kort fortalt blev cellekultursupernatanter opsamlet fra en 24-brøndplade og centrifugering for at fjerne celler og cellerester. Derefter blev klaringssupernatanter inkuberet med perler i panelet efter producentens instruktioner. Luminex detektionsplatform (ThermoFisher Scientific, USA) blev brugt til at udføre kvantitativ analyse på hver prøve. Uopdagede indikatorer blev udelukket fra analysen. qRT-PCR: Total RNA blev isoleret fra celler med Cell Total RNA Isolation Kit og Animal Total RNA Isolation Kit (Foregene, Kina) i henhold til producentens protokol. cDNA blev syntetiseret under anvendelse af UeIris II RTPCR-system til første-strengs cDNA-syntese (US Everbright, Kina). qRTPCR blev udført ved hjælp af SYBR Green qPCR Master Mix (US Everbright, Kina) på CFX Connect System (Bio-Rad, USA). GAPDH blev brugt som intern standardkontrol. Primerne blev designet og syntetiseret af Sangon Biotech (Shanghai, Kina), og detaljerede primersekvenser blev anført i tabel S4 (understøttende information). ELISA: Koncentrationer af CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 (MIG) og CXCL10 (IP10) i humane blærecancercellekultursupernatanter blev bestemt af humane ELISA-kits efter producentens protokol (Proteintech, USA). En bioteknologisk mikropladelæser (ThermoFisher Scientific, USA) blev brugt til at måle optisk tæthed (OD) værdier. I lyset af den enorme mangfoldighed af sekretionsniveauer blandt forskellige cytokiner og kemokiner gennemførte vi datastandardisering (log 2-transformation) før analyse. Western Blot: RIPA-buffer (NCM biotech, Kina) tilsat en 1% proteaseinhibitorcocktail (NCM biotech, Kina) blev brugt til at lysere celler. BCA Protein Assay Kit (NCM biotech, Kina) blev anvendt til at bestemme proteinkoncentrationer. Efter at være blevet overført til PVDF-membraner, blev celleproteiner inkuberet med primære antistoffer og specifikke HRP-konjugerede sekundære antistoffer successivt. Signaler blev fanget af XRS-billeddannelsessystemet (Bio-Rad, USA). Primære antistoffer omfatter et anti-BCAT2-antistof (kat: ab95976, Abcam, USA) og et anti-GAPDH-antistof (kat: ab8245, Abcam, USA). Sekundære antistoffer omfatter HRP ged anti-kanin IgG (kat: 7074, Cell Signaling Technology, USA) og HRP gede anti-mus IgG (kat: 7076, Cell Signaling Technology, USA). T-lymfocyt-medieret kræftcelledrab-assay og samkultur-assay: Blodprøver blev indsamlet fra 10 raske donorer på vores hospital. Ifølge producentens instruktioner blev gradientcentrifugering anvendt til at ekstrahere perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) af Lymphoprep (Cat: 07851, StemCell Technologies, USA). Derudover blev røde blodlegemer lysisbuffer (Solarbio, Kina) brugt til at eliminere røde blodlegemer blandet med PBMC'er. For at aktivere T-celler blev PBMC'er dyrket i DMEM-medium (Gibco, USA), som supplement til Rekombinant Human IL- 2 (10 ng mL−1, Kat: 202-1L-050, R&D , USA), og ImmunoCult Human CD3/CD28/CD2 T-celleaktivator (25 μL mL−1, Kat.: 10970; STEMCELL Technologies, USA) i 1 uge. I forholdet 1:5 blev humane blærekræftceller (BCAT2-OE, BCAT2-KD og deres negative kontroller) dyrket sammen med aktiverede T-celler i DMEM-medium med anti-CD3-antistof (100 ng mL−1, Thermo Scientific, USA) og IL-2 (10 ng mL−1) fra én donator i 12- brøndplade i 72 timer. Derefter blev T-celler opsamlet til flowcytometrianalyse. Den detaljerede gatestrategi for flowanalyse er vist i figur S28 (understøttende information). De resterende cancerceller blev farvet med krystalviolet og målt OD-værdi ved 570 nm af en mikropladelæser. Antistoffer til flowcytometrianalyse omfatter Zombie Aqua Fixable Viability Kit (kat: 423101, Biolegend, USA), APC/Cy7 anti-human CD45 (kat: 368516, Biolegend, USA), Pacific Blue anti-human CD3 antistof (kat: 300329, Biolegend, USA), PerCP/Cy5.5 anti-humant CD4-antistof (kat: 317427, Biolegend, USA), FITC anti-humant CD8a-antistof (kat: 301006, Biolegend, USA), PE/Dazzle 594 anti-humant TNF- 𝛼 Antistof (kat: 502946, Biolegend, USA) og Brilliant Violet 711 anti-humant IFN- 𝛾 antistof (kat: 502540, Biolegend, USA). Kemotakse-assay: Kemotakse-assay blev implementeret i en 24-brøndtranswell-plade med 3 μm kernediameter (Corning, USA). Et humant CD8+T Cell Isolation Kit (Cat: 480012, Biolegend, USA) blev brugt til at ekstrahere CD8+T-celler fra PBMC. 1 × 105 isolerede celler i 200 μL volumen blev tilsat i det øvre kammer, og 600 μL supernatanter af forskellige stabile transfektionscellelinjer blev tilsat i det nedre kammer. Efter inkubation i 6 timer ved 37 grader migrerede cellerne ind i det nedre kammer og blev høstet og talt ved flowcytometri. Celleproliferation, migration og invasionsassays: Et pladekolonidannelsesassay blev anvendt til at vurdere evnen til celleproliferation. BCAT2-OE, BCAT2-KD og negativ kontrol humane blærekræftceller blev dyrket i 6-brøndsplader pr. brønd. Efter inkubering i en 37 grader befugtet atmosfære i 2 uger blev kolonierne fikseret og farvet med henholdsvis paraformaldehyd og krystalviolet. Transwell-kamre med 8,0 μm pore polycarbonatmembranindsatser (Corning, USA) blev anvendt til at evaluere kapaciteten af ​​cellemigration og invasion in vitro. 1 × 105 stabile transficerede celler blev suspenderet i serumfrit medium og podet i det øverste kammer med eller uden Matrigel (Corning, USA) til invasion og migrationsanalyse separat. Efter inkubering i 24 timer (migrationsassay) og 48 timer (invasionsassay) blev celler, der klæber til den nedre overflade af membranen, fikseret og farvet. Celler, der forblev i det øverste kammer, blev fjernet med podninger. Fem tilfældige felter blev udvalgt under et mikroskop for at beregne celleantal. Immunofluorescens (IF) og immunhistokemi (IHC): Multicolor IF på TMA'er af Xiangya BLCA Cohort og Xiangya BLCA immunterapi Cohort blev implementeret af multiple fluorescerende immunhistokemisk farvningskit (Absin, Kina). Kort sagt, efter afvoksning, rehydrering og antigenrenovering blev TMA inkuberet med primære antistoffer og sekundære antistoffer, som ansporer til binding af forskellige luciferiner ved tyramidsignalamplifikation (TSA). Efter aftørring af ubundne antistoffer med citratbuffer blev inkubationsprocessen gentaget to gange. DAPI blev anvendt til at modfarve cellekerner, og billeder blev scannet af Pannoramic MIDI-platformen (3DHISTECH, Ungarn). Primære antistoffer på TMA af Xiangya BLCA-kohorte inkluderer anti-BCAT2 (kat: ab95976, Abcam, USA), anti-Cytokeratin 19 (CK19) (kat: ab52625, Abcam, USA), anti-CD8 (kat: ab237709, Abcam, USA ) og DAPI (Invitrogen, USA). Sekundære antistoffer og fluorokrom på TMA af Xiangya BLCA-kohorte inkluderer HRP Ged Anti-kanin/mus IgG, Absin 520 TSA Plus, Absin 570 TSA Plus, Absin 650 TSA Plus (abs50012, Absin). Primære antistoffer på TMA af Xiangya BLCA immunterapi kohorte inkluderer anti-BCAT2 (kat: ab95976, Abcam, USA), anti-PD-L1 (kat: ab213524, Abcam, USA) og DAPI (Invitrogen, USA). Sekundære antistoffer og fluorochrom på TMA fra Xiangya BLCA immunterapi-kohorte inkluderer HRP Ged Anti-kanin/muse-IgG, Absin 520 TSA Plus og Absin 650 TSA Plus (abs50012, Absin). IF på murint tumorvæv blev inkuberet med primært antistof - anti-CD8 (Cat: 372902, BioLegend, USA) - og sekundært antistof - anti-mus Alexa Fluor 488 farvestofkonjugat (Invitrogen, USA) sekventielt. DAPI blev påført den visualiserede cellekerne. Fem tilfældige felter blev udvalgt under et mikroskop for at beregne positive farvningscelleantal. IHC på TMA'er fra Xiangya BLCA Cohort og Xiangya BLCA immunterapi Cohort blev udført af SP-9000 Kit (ZSGB-BIO, Kina). Efter antigenudvinding og blokering blev primære antistoffer og sekundære antistoffer inkuberet med tumorvæv på skift. Derefter blev diaminobenzidin (DAB) påført til at farve målantigener. Brunt signal blev betragtet som positiv farvning. Score for farvningsintensitet (fraværende=0, svag=1, moderat=2 og stærk=3) multiplicerende score for positiv procentdel (ingen farvning=0, farvning af celler mindre end 25 %=1, 25 %–50 % farvning af celler=2, 50 %–75 % farvning af celler=3 og farvning af celler mere end 75 %=4) var ultimative IHC-score af prøver. Scoringerne af BCAT2/CD8/PD-L1 mindre end seks point blev klassificeret som lav ekspression, scorerne for dem større end eller lig med seks point blev klassificeret som høj ekspression. For at bedømme en persons status på MFR blev alle prøverne fra Xiangya BLCA immunterapi-kohorten vurderet baseret på farvningsresultater af fire MMR-markørgener (MLH1, MSH2, MSH6 og PMS2). Som afbildet i tidligere undersøgelser[56], når alle fire markørgener var positive farvninger, blev individet markeret som MMR. Når et af de fire markørgener havde negativ farvning, blev individet markeret som dMMR. To uafhængige patologer blev inviteret til at udføre vurderingen. Antistoffer inkluderer: anti-BCAT2 (Kat: ab95976, Abcam, USA), anti-CD8 (Kat: ab4055, Abcam, USA), anti-PD-L1 (Kat: ab213524, Abcam, USA), anti-MLH1 (Kat: A4858, Abcolonal, Kina), anti-MSH2 (kat: A22177, Abcolonal, Kina), anti-MSH6 (kat: A16381, Abcolonal, Kina), anti-PMS2 (kat: A4577, Abcolonal, Kina) og HRP Goat Anti - Kanin/mus IgG (ZSGB-BIO, Kina). TissueFAXS panoramaanalyser af rumlig interaktion i TME: Til evaluering af rumlig interaktion mellem BCAT2+ maligne celler og effektor T-celler blev TissueFAXS panoramaplatform (Tissue Gnostics, Østrig) brugt til at scanne og semiautomatisk analysere på objektive flerfarvede celler farvet IF TMA for Xiangya BLCA-kohorte. TMA'en bestod af 1,5 mm kernebiopsier fra paraffinindlejrede prøver af tumorvæv. I detaljer blev BCAT2+-celler, maligne celler og CD8+T-celler farvet af specifikke primære antistoffer og sekundære antistoffer. DAPI (Invitrogen, USA) blev brugt til at farve cellekernen. Detaljerede trin er blevet beskrevet i undersøgelsen af ​​Makarevic et al.[57] Kort sagt, i henhold til fluorescensintensiteter af forskellige indikatorer og fysiske egenskaber af celler, blev positive celler markeret og kvantificeret. Mere vigtigt, rumlige fordelinger af CD8+T-celler omkring BCAT2+CK19+-celler blev afbildet ved spredningsplot på basis af rumafstand (0-25, 25-50, 50- 100 og 100-150 μm). To erfarne patologer blev inviteret til at kontrollere beslutningsresultatet af TissueFAXS panoramaplatformen. Dyreeksperimenter: C57BL/6-hunmus (6-7 uger) blev opnået fra Department of Laboratory Animal, Central South University. Alle operationer på mus blev kontrolleret og godkendt af Animal Care and Use Committee på Xiangya Hospital, Central South University (varenummer: 2021101175). Frem for alt, for at undersøge BCAT2's rolle på tumorvækst in vivo, blev BCAT2 KD MB49-celler (5 × 105) og dets kontrolceller i 100 μL mediumvolumen subkutant injiceret i højre flanke af mus. Efter at have konstrueret en subkutan tumormodel med succes (tumorvolumen op til 100 mm3), 100 ug InVivomAb anti-mus PD-1 (Kat: BE0146, Bioxcell, USA) og IgG2a isotypekontrol (Cat: BE0089, Bioxcell, USA) blev injiceret intraperitonealt i per mus for at vurdere den synergistiske effekt af BCAT2-tab og anti-PD-1-terapi. Anti-PD-1-terapi blev implementeret på mus hver 3. dag og varede op til fem kurser. Yderligere, for at bedømme, om sambehandlingseffekten var afhængig af CD8+T-celler. Ledsagerende kombinationsterapi blev 100 ug InVivoPlus anti-mus CD8𝛼 (Kat: BP0117, Bioxcell, USA) og IgG2b isotypekontrol (Cat: BP0090, Bioxcell, USA) anvendt til at udtømme CD8+T-celler i mus. Kropsvægten af ​​mus blev registreret hver tredje dag. På den planlagte dato blev tumorer høstet, målt og forberedt til flowcytometrianalyse, IF-farvning og qRT-PCR. For at udforske interaktionen mellem ekspressionsniveauet af BCAT2 på CD8+T-celler og aktiviteten af ​​CD8+T-celler blev milt fra C57BL/6 hunmus (6-7 uger) uden tumorbærende dissocieret og forberedt til enkeltcellesuspension til yderligere analyse. Flowcytometrianalyse: Murine tumorer blev formalet og fordøjet til enkeltcellesuspension ved hjælp af collagenase IV (kat: C5138, Sigma, USA), hyaluronidase (kat: H3506, Sigma, USA) og DNase I (kat: DN25, Sigma, USA) ). 70 μm cellefiltre (BIOFIL, Kina) blev brugt til at bortfiltrere urenheder, og en celletæller (Countstar, Kina) blev brugt til at få (3-5) × 106 celler i hver prøve. Efter at have identificeret levende celler ved hjælp af Zombie Aqua Fixable Viability Kit (kat.: 423101, Biolegend, USA) og blokering af Fc-receptor med anti-muse CD16/32-antistof (kat.: 156603, Biolegend, USA), blev cellemembranantigener farvet af APC-Cy7 anti-mus CD45 (Kat: 103116, Biolegend, USA), BV421 anti-mus CD3 (Kat: 100341, Biolegend, USA), BV605 anti-mus CD8a (Kat: 100744, Biolegend, USA) og PerCPCy5.5 anti-mus CD4 (Kat: 100540, Biolegend, USA). Derefter blev bioscience Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (Cat: 2400632, Invitrogen, USA) brugt til at fiksere og permeabilisere cellen og kernemembranen. Cytotoksisk effekt relaterede antigener blev farvet af PE anti-menneske/muse Granzyme B (Kat: 372208, Biolegend, USA), PE-Cy7 anti-mus TNF-𝛼 (Kat: 506324, Biolegend, USA), PE-Dazzle 594 anti- mus IFN-𝛾 (kat: 505846, Biolegend, USA), APC anti-mus Perforin (kat: 154304, Biolegend, USA). Gatestrategien for flowcytometrianalyse er vist i figur S29 (understøttende information). Anti-human/mus BCAT2 (kat: A7426, Abclonal, Kina) blev inkuberet med Flexible 488 antistofmærkningskit (kat: KFA001, Proteintech, USA) til syntetisering af personligt BCAT2 fluorescerende antistof til flowcytometrianalyse. Derefter blev BCAT2-antistof og T-celle-relaterede antistoffer blandet og tilsat til enkeltcellesuspension af murin milt for at udforske interaktionen mellem ekspressionsniveauet af BCAT2 på CD8+T-celle og aktivitet af CD{{357} }T-celle. Gatestrategien for flowcytometrianalyse er vist i figur S30 (understøttende information). Farvede prøver blev påvist på Cytek DxpAthena Flowcytometri (Cytek Biosciences, USA), og data blev analyseret med Flowjo-versionssoftware (BD Biosciences, USA). Statistisk analyse: Data blev præsenteret som middelværdi ± SD. t-test med eller uden Welch-korrektion blev brugt til at sammenligne kontinuerte variable mellem to grupper. Envejs ANOVA-analyse med eller uden Brown-Forsythe- og Welch-test blev brugt til at sammenligne kontinuerlige variable mellem flere grupper. Chi-kvadrattest eller Fishers eksakte test blev anvendt til at sammenligne dikotome variable. Pearson eller Spearman korrelationskoefficienttest blev anvendt til at estimere intensiteten af ​​korrelation mellem forskellige variable. Kaplan-Meier overlevelseskurve blev brugt til at vise prognostiske analyser af dikotome variabler, og log-rank test blev brugt til at bedømme statistiske forskelle. Tosidet p < 0,05 blev defineret som tærsklen for signifikans. R-software (version 4.0) og GraphPad Prism8 blev anvendt til at behandle data i undersøgelsen.

Henvisning

[1] RL Siegel, KD Miller, HE Fuchs, A. Jemal, CA: Cancer J. Clin. 2021, 71, 7.

[2] VG Patel, WK Oh, MD Galsky, Ca-Cancer J. Clin. 2020, 70, 404.

[3] R. Nadal, J. Bellmunt, Cancer Treat. Rev. 2019, 76, 10.

[4] a) MD Galsky, A. Arija JÁ, A. Bamias, ID Davis, M. De Santis, E. Kikuchi, X. Garcia-Del-Muro, U. De Giorgi, M. Mencinger, K. Izumi, S. Panni, M. Gumus, M. Özgüro˘glu, AR Kalebasty, SH Park, B. Alekseev, FA Schutz, JR Li, D. Ye, NJ Vogelzang, S. Bernhard, D. Tayama, S. Mariathasan, A Mecke, A. Thåström, E. Grande, Lancet 2020, 395, 1547; b) MD Galsky, A. Mortazavi, MI Milowsky, S. George, S. Gupta, MT Fleming, LH Dang, DM Geynisman, R. Walling, RS Alter, M. Kassar, J. Wang, S. Gupta, N. Davis, J. Picus, G. Philips, DI Quinn, GK Haines 3., NM Hahn, Q. Zhao, M. Yu, SK Pal, J. Clin. Oncol. 2020, 38, 1797; c) T. Powles, SH Park, E. Voog, C. Caserta, BP Valderrama, H. Gurney, H. Kalofonos, S. Radulovi´c, W. Demey, A. Ullén, Y. Loriot, SS Sridhar, N Tsuchiya, E. Kopyltsov, CN Sternberg, J. Bellmunt, JB Aragon-Ching, DP Petrylak, R. Laliberte, J. Wang, B. Huang, C. Davis, C. Fowst, N. Costa, JA Blake-Haskins , A. di Pietro, P. Grivas, N. Engl. J. Med. 2020, 383, 1218.

[5] a) RW Jenkins, DA Barbie, KT Flaherty, Br. J. Cancer 2018, 118, 9; b) AJ Schoenfeld, MD Hellmann, Cancer Cell 2020, 37, 443.

[6] a) DS Chen, I. Mellman, Nature 2017, 541, 321; b) TF Gajewski, L. Corrales, J. Williams, B. Horton, A. Sivan, S. Spranger, Adv. Exp. Med. Biol. 2017, 1036, 19; c) DC Hinshaw, LA Shevde, Cancer Res. 2019, 79, 4557.

[7] a) SM Vareki, J. Immunother. Kræft 2018, 6, 157; b) B. Zhang, Q. Wu, B. Li, D. Wang, L. Wang, YL Zhou, Mol. Kræft 2020, 19, 53.

[8] JR Mayers, ME Torrence, LV Danai, T. Papagiannakopoulos, SM Davidson, MR Bauer, AN Lau, BW Ji, PD Dixit, AM Hosios, A. Muir, CR Chin, E. Freinkman, T. Jacks, BM Wolpin, D. Vitkup, MG Vander Heiden, Science 2016, 353, 1161.

[9] JT Li, M. Yin, D. Wang, J. Wang, MZ Lei, Y. Zhang, Y. Liu, L. Zhang, SW Zou, LP Hu, ZG Zhang, YP Wang, WY Wen, HJ Lu , ZJ Chen, D. Su, QY Lei, Nat. Cell Biol. 2020, 22, 167.

[10] JH Lee, YR Cho, JH Kim, J. Kim, HY Nam, SW Kim, J. Son, Exp. Mol. Med. 2019, 51, 146.

[11] a) H. Lai, X. Cheng, Q. Liu, W. Luo, M. Liu, M. Zhang, J. Miao, Z. Ji, GN Lin, W. Song, L. Zhang, J. Bo, G. Yang, J. Wang, WQ Gao, Int. J. Cancer 2021, 149, 2099; b) D. Lambrechts, E. Wauters, B. Boeckx, S. Aibar, D. Nittner, O. Burton, A. Bassez, H. Decaluwé, A. Pircher, K. Van den Eynde, B. Weynand, E. Verbeken, P. De Leyn, A. Liston, J. Vansteenkiste, P. Carmeliet, S. Aerts, B. Thienpont, Nat. Med. 2018, 24, 1277.

[12] N. Nagarsheth, MS Wicha, W. Zou, Nat. Rev. Immunol. 2017, 17, 559.

[13] a) E. Stelloo, AML Jansen, EM Osse, RA Nout, CL Creutzberg, D. Ruano, DN Church, H. Morreau, V. Smit, T. van Wezel, T. Bosse, Ann. Oncol. 2017, 28, 96; b) AS Tjalsma, A. Wagner, WNM Din jens, PC Ewing-Graham, LSM Alcalá, MER de Groot, KE Hamoen, AC van Hof, W. Hofhuis, LN Hofman, KJ Hoogduin, J. Kaijser, ACF Makkus, SJJ Mol, GM Plaisier, K. Schelfhout, HPM Smedts, RA Smit, PJ Timmers, P. Vencken, B. Visschers, AAM van der Wurff, HC van Doorn, Gynecol. Oncol. 2021, 160, 771.