dkSprog
Hjem / Viden / Indhold

Viden

Autofluorescens som en ikke-invasiv biomarkør for ældning og avancerede glykeringsslutprodukter i Cistanche Tubulosa

Apr 11, 2023

DISKUSSION

Tidligere er autofluorescens blevet brugt til at overvåge lipofuscin, alderspigmentet, som en biomarkør for senescens4,13. Selvom vi observerede rødtFluorescens, der indikerer lipofuscin som set i tidligere undersøgelser9, blåFluorescens blev opdaget på et tidligere stadium af livet, da orme blev undersøgt ved hjælp af en M165 FCFluorescens stereomikroskop (Leica Microsystems, Tokyo, Japan) (data ikke vist). Formålet med denne undersøgelse var at undersøge, om den blå autofluorescens kunne tjene som en mere følsom markør til sporing af alderdommen af ​​individuelle orme.

anti- senescence cistanche function

Cistanche ForAnti-ældning

Buy Cistanche

Anti-aging Cistanche-produkt klar til forsendelse


DetFluorescens målt i individuelle orme steg med alderen; jo færre ormeFluoresced, jo længere deres forventede levetid. Altså blåFluorescens kan give en alternativ biomarkør til sporing af senescens. Imidlertid har Pincus et al. rapporterede, at orme, der efterfølgende døde (inden for 24 timer)Fluorescerede på grund af biosyntesen af ​​kynurenin; disse forskere navngav dette blå lys"dødFluorescens". Efter sigende dødFluorescens vedrFlects emission af en glycosyleret form af anthranilsyre produceret af kynurenin-vejen; bilenFluorescerende materiale påvises i lysosomlignende tarmgranulat31. Dette blå lys kunne være den samme dødsmarkør, som Coburn et al. observeret iC. elegansi flere timer før og efter døden, og det sås angiveligt hos både unge orme, der blev udsat for dødelig skade, og orme, der døde naturligt af alderdom. Faktisk observerede vi, atvenlig-1mutant, som mangler kynureninaseaktivitet, var autofluorescerende mindre end vildtypen. Vores resultater viste imidlertid, at en del af det blåfluorescens er forbundet med aldring snarere end med død. Især, som vist i fig.3b, aldrende orme udviste øget blåFluorescens, selv når man udelukker data opnået inden for de 2 dage forud for dødsfaldet. Desuden orme stadigFluoresced mere med aldring, uanset tilstanden afkynu-1gen. ReduceretFluorescens ikynu-1mutant skulle altså skyldes tabetaf acceleration af AGE-syntese af kynureniner snarere end manglen på dødFluorescens32.


Visse AGE-forbindelser erFluorescerende27. Vi udledte, at den blåFluorescens kan omfatte emission fra disse AGE'er, adskilt fra det, der kan tilskrives dødenFluorescens. Når ekstraherede ormeproteiner blev inkuberet med sukker in vitro,Fluorescensintensitet og niveauerne af AGE'er steg over tid. Orme dyrket på et medium indeholdende riboseFluorescerede mere end kontroldyr dyrkes i fravær af supplerende ribose, selv nårkynu-1var muteret. I modsætning hertil udviste orme dyrket i nærvær af rifampicin, en kendt hæmmer af AGEs-produktion, nedsatte niveauer af blåtFluorescens. Faktisk indikerede fluorescensmikroskopi, at 13-daggamle orme udsendte mere blåt lys end 3-daggamle unge voksne. Immunfarvning med anti-CML eller anti-pentosidin-antistoffer viste ikke tilstedeværelsen af ​​diffust spredte AGE'er i et distributionsmønster, der ligner blåtFluorescens. DetFluorescens kunne stamme fra andre rigeligeFluorescerende AGE'er såsom vespertin A, LM-1 og argpyrimidin33,34.


For at give blommen til oocyster,C. eleganshermafroditter indtager deres egen tarmbiomasse, hvilket resulterer i tarmatrofi og ektopisk blommeaflejring senere i livet. Vitellogeniner (blommeproteiner) var til stede i to gange højere niveauer i gamle orme (sammenlignet med yngre dyr), som tidligere rapporteret35, og udstillet seks gange størreFluorescens efter glykering in vitro. Disse data antydede, at vitellogeniner i sig selv ville generere 12-fold øgetFluorescens hos ældre orme sammenlignet med unge voksne teoretisk. Western blotting viste, at de vigtigste bånd, der reagerede med anti-CML-antistoffet, var blommeproteinerne. Dette fund stemmer overens med de tidligere rapporter fra Nakamura et al., der påviste kraftig glykering af vitellogenin36, og Golegaonkar et al., som påviste nedsat glycation i vitellogenin-2, vitellogenin-6 og forlængelsesfaktor 1 alfa i rifampicin-behandlede nematoder30. Efter sigende virker vitellogeniner som antioxidanter og bidrager til honningbidronningernes levetid37. IC. elegans, spiller vitellogeniner en afgørende rolle i stressresistens 38. Da antioxidanter let kan oxideres selv, kan ophobningen af ​​glyceret vitellogenin forringe beskyttelsen mod oxidativ skade, hvilket resulterer i det omvendte forhold mellem forventet levetid og intensiteten af ​​blåtFluorescens observeret i denne undersøgelse. Imidlertid har Sornda et al. for nylig rapporteret, at levetid ikke er relateret til oxidativ stress-resistens medieret af YP115/YP88 (vitellogenin-6)39. Disse forskere foreslog, at akkumuleringen af ​​vitellogenin YP170, afledt af vitellogeniner 1–5, forårsager intestinal atrofi og nedsat levetid, mens akkumulering af YP115/YP88 kan forsinke intestinal atrofi og forlænge levetiden. Glykering af vitellogenin-6 og den resulterende dysfunktion kan derfor bidrage til ældning. Selvom forlængelsesfaktorerFlUorescerede tre gange mere intenst efter in vitro-glykering, var mængderne af disse proteiner ens mellem unge og gamle orme. Derfor kan bidraget fra denne faktor til øget autofluorescens være mindre end det, der kan tilskrives vitellogeniner.

anti- senescence cistanche function


Cistanchehar været brugt generelt som model tilundersøgelsealderdoms- og anti-ældningsindgreb. Vi foreslog brugen af ​​ormen som en model til at undersøge de pro-longevity effekteraf mælkesyrebakterier8. Givet demonstrationen (i nærværende undersøgelse), at blåFluorescens i nematoder er en mulig indikator for AGEs akkumulering, det foreslår viCistanche hermafroditter kan tjene som en model til at undersøge nytten af ​​anti-ældningsinterventioner, der virker via undertrykkelse af AGEs produktion. I modsætning hertil er det usandsynligt, at autofluorescens er en biomarkør for alderdom for mandlige orme, fordi vitellogeniner skal være knappe.

anti- senescence cistanche function

Fig. 5 Blå fluorescens fra kynu-1 mutanter, som ikke bør udsende dødsfluorescens. -enFluorescensintensitet (ex 340/em 430) af 7-daggamle og 13-daggamlekynu-1mutanter (n = 37 hver); ældre orme udledte stadig mereFluorescens end yngre orme, på trods af dekynu-1mutation. Dog ingen signiFificant-forskel blev påvist i autofluorescensværdierne af Mann–WhitneyU prøve.b En 7-daggammel orm vedligeholdt med ribose udsendte mere blåtFluorescens på trods afvenlig-1mutation. BlåFluorescens afC. elegansdyrket med ribose (n = 24) eller sorbitol (n = 18) blev sammenlignet med kontrolorme uden sukker (n = 20). Autofluorescensværdierne blev sammenlignet under anvendelse af det ikke-parametriske stål–Dwass metode (**p < 0.01). c Overlevelseskurver afC. elegansdyrket med ribose (n = 62) eller sorbitol (n = 84) blev sammenlignet med kontrolorme uden sukker (n = 64). Orme var 3 dage gamle på dag 0. Nematodes overlevelse blev beregnet af Kaplan–Meier-metoden og overlevelsesforskelle blev testet for signifikans ved brug af log-rank test (**p < 0.01).


METODER

NematoderCistanche Bristol stamme N2 og dens afledte mutantstammer blev venligst leveret af Caenorhabditis Genetics Center, University of Minnesota. Mutationerne anvendt i denne undersøgelse var CB1370daf-2 (e1370)og CB1003kynu-1 (e1003). Nematoder blev opretholdt og opformeret på NGM i henhold til standardteknik 40. Ormeæg blev udvundet fra voksne orme efter eksponering for en natriumhypochlorit/natriumhydroxidopløsning som tidligere beskrevet 41. Ægsuspensioner blev inkuberet natten over ved 25 grader for at tillade udklækning, og suspensionen af orme i L1-stadiet blev centrifugeret ved 156 ×g i 1 min. Supernatanten blev fjernet, og de resterende larver blev overført til friske peptonfrie modificerede NGM (mNGM) plader dækket medE colistamme OP50 (OP50). Stammer blev dyrket på mNGM-agarplader ved 25 grader bortset fradaf-2stamme, som blev dyrket ved 20 grader indtil L4-stadiet. Alle analyser blev påbegyndt med unge voksne orme, der begyndte at lægge æg ved 25 grader. Der krævedes ingen etisk godkendelse for nematoderne.BakteriestammerOP50 blev brugt som den internationalt etablerede føde for nematoder. Trypton sojaagar (Nissui Pharmaceutical, Tokyo, Japan) blev brugt til at dyrke OP50. Bakterier (100 mg vådvægt) blev suspenderet i 0,5 ml M9-buffer; en 50-µL alikvot af bakteriesuspensionen blev derefter spredt på mNGM'et i plader med en diameter på 5.5-cm, medmindre andet er angivet.


anti- senescence cistanche function

Multivariat analyse af autofluorescens

Populationer på 100 voksne hver blev genoprettet ved 3 og 17 dages alderen,vasket tre gange, koncentreret i 3 µL M9-buffer og opbevaret frossetpå–80 grader indtil brug. Før ekstraktion, 3 µL lyseringsbuffer (bestående af50 mM Tris-HCl-buffer (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1 procent natriumdodecylsulfat(SDS), 1 procent Triton X-100, 1 mM phenylmethylsulfonylFluoride (PMSF), og
2 procent 2-mercaptoethanol) og 4 µL 15 procent SDS blev fordelt til hvert rør. Prøver blev derefter udsat forfihar fryse-tø-cyklusser for at frigive protein. Fotoluminescerende spektre blev opsamlet med enFluorescensspektrofotometer (Hitachi FL{{0}}) med datafortolkningssoftware (FL Solutions ver. 2.0). Fluorescensegenskaber af nematodesuspensioner var

analyseret ved hjælp af en excitation-emission matrix (EEM)Fluorescensspektroskopi. Multivariat analyse (enkeltbølgelængde excitation med multiplebølgelængdeemission og synkron scanningFluorometri) gav EEM-plot bestående af single-scan excitation og den synkronefluorescensspektre for hver serie blev tegnet.



Fluorescensspektre af aldrende orme

Orme (3–13 dage gamle) blev udvundet fra et vækstmedium indeholdende 2'-deoxy-5-Fluorouridin (Tokyo Chemical Industry, Tokyo, Japan). Det herforbindelse blokerer den embryonale udvikling af afkom og udelukker derved kontaminering af afkom. Individuelle aldrende orme blev samlet indrør, vasketfemgange, koncentreret i 3 µL M9-buffer og opbevaret frosset kl–80 grader indtil brug. Før ekstraktion, 100 µL lyseringsbuffer(bestående af 50 mM Tris-HCl-buffer (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM PMSF og 1 µL proteaseinhibitorcocktail (Sigma, St. Louis, MO, USA)) blev tilsat til hvert rør. Prøver blev derefter formalet ved hjælp af en Mini Cordless Grinder (Funakoshi, Tokyo, Japan) for at frigive dem
protein. Proteinindholdet blev målt kvantitativt under anvendelse af Pierce™ 660 nm Protein Assay Reagens (Thermo Fisher Scientific Meridian,Waltham, MA, USA) og et NanoDrop OneC-instrument (Thermo Fisher Scientific). Detfluorescensspektrum blev bestemt for hver 30-µL prøve (indeholdende 1,5μg totalt protein) ved hjælp af en multimode-rist

mikropladelæser model SH-9000Lab med SF6 Data Treatment Software(Corona Electric, Ibaraki, Japan). Hver måling blev udført tre gange.


image

Måling af autofluorescens af individuelle levende orme (wrap-drop metode)

Tilfældigt udvalgte orme blev vasket med M9-buffer og derefterindividuelle orme blev anbragt i 1.0 µL M9 buffer på Saran Wrap clingfilm (Asahi Kasei, Tokyo, Japan) strakte sig over en 384-brøndsort plade(STEM, Tokyo, Japan). Små fordybninger blev dannet på hver brønd ved hjælp af enreplikator (Watson, Kobe, Japan). Denne modifikation var at genvinde orme sikkert efter målingen, så den aldersafhængige ændring af autofluorescens for hver orm kunne spores. Klæbetfilm blev valgt, fordi det autofluorescerede mindre end andre kommercielt tilgængeligefilms.

De tomme data (kun M9 buffer) blev dog kontrolleret tre gange forhver brønd i betragtning affluktuationfra brønd til brønd. Minimale detektionsgrænser og kvantificerbare grænser blev bestemt på basis af blankdata for hver dag somμ (gennemsnit af det tomme)plus3.29σ (standardafvigelse) ogμplus√2 × 10σ, henholdsvis. Autofluorescensen i kroppen af ​​hver orm

blev fanget med en multimode gitter mikropladelæser. Eftermåling blev hver orm individuelt holdt på en 4.0-cmdiameterplade dækket med OP50 (2 mg/10μL M9 buffer) ved 25 grader. HverAssay blev udført på mindst 20 orme og gentaget to gange.


Måling af forventet levetid

Orme blev holdt på mNGM plader dækket med OP50 ved 25 grader indtil 13 dage gamle. Efter evaluering affluorescensanalyse, 30 orme hver varflyttet over på separate nye mNGM plader dækket med OP50. Pladerne blev inkuberet ved 25 grader, og levende og døde orme blev scoret hver 24. time. En orm blev betragtet som død, da den ikke reagerede på en blid berøring med en ormeplukker.

anti- senescence cistanche function


AGE'er efter in vitro-glykering

Proteinekstraktion blev udført som tidligere beskrevet. Tre dage gamle orme blev brugt til kunstig glykering. Proteinprøverne (2 mg/ml)blev inkuberet med 500 mM glucose, 100 mM ribose eller 500 mM fructose(fislutkoncentration). Alle prøver blev inkuberet ved 37 grader i 0–4 uger. Alikvoter (50μL) blev dispenseret til brøndene på en polystyrenplade
(Sumitomo Bakelite, Tokyo, Japan) og inkuberet i 2 timer ved 37 grader. Efterfjernelse af prøveopløsningen blev pladen vasket med PBS-T(phosphatbufret saltvand (PBS), 0,05 procent Tween 20); 250μL af 3 procent skummetmælkblev tilsat til hver brønd, og pladen blev inkuberet i 2 timer ved 37 grader. Hvergodt derefter blev vasket med PBS-T og 100μL af en anti-AGE (anti-CML)
monoklonalt antistof (klon nr. 6D12, Trans Genic, Fukuoka, Japan; 75 ng/ml) blev dispenseret til hver brønd; pladen blev derefter inkuberet i rummettemperatur i 1 time. Efter vask med PBS-T, 100μL af en peroxidase-konjugeretgede-anti-muse-IgG-antistof (Rockland Immunochemicals, Inc., Limerick, PA, USA; 1:150,000) blev dispenseret til hver brønd, og
pladen blev inkuberet ved stuetemperatur i 1 time. Efter vask med PBS-T, 100μL af en arbejdsopløsning (tetramethylbenzidin (TMB) farveopløsning: peroxidopløsning= 1:1; ELISA POD substrat TMB kit, populær,Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) blev dispenseret til hver brønd, og pladen blev holdt ved stuetemperatur i mørke indtil bratkøling af

tillæg af 100μL 1 mol/L svovlsyre pr. brønd. Absorbansen af ​​hverbrønd ved 450 nm (under: 650 nm) blev derefter straks målt med en mikropladelæser. ELISA blev udført tre gange for hver af testbetingelserne.


Western blotting til aldrende orme

Prøver blev behandlet med 4× Bolt™ LDS prøvebuffer (Thermo Fisher ScientiFific) og 10× Bolt™ Prøvereduktionsmiddel (Thermo Fisher ScientiFific), og hver prøve indeholder 1,5μg totalt protein blev kørt på en Bolt™ 4–12 procent Bis-Tris Plus Gel (Thermo Fisher ScientiFific). Derefter blev proteinerne overført fra gelen til en polyvinylidenFluoridmembran (ATTO, Tokyo, Japan) og blokeret med 5 procent skummetmælk i PBS- 0.1 procent Tween 20 i 1 time. Membranen blev inkuberet natten over ved 4 grader med et anti-AGE (anti-CML) monoklonalt antistof (klon nr. 6D12 ved 1:1 000), vasket med PBS-T og derefter inkuberet ved stuetemperatur i 1 h med et peroxidase-konjugeret gede-anti-muse IgG-antistof (1:25,000). Efter vask med PBS-T blev membranen inkuberet med ECL prime western blotting detektionsreagens (GE Healthcare UK, Little Chalfont, England) og scannet ved hjælp af et ChemiDoc Touch Imaging System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) eller ImageQuant LAS 500 (GE Healthcare UK). Membraner blev derefter vasket med PBS-T, inkuberet med Western BLoT-strippingbuffer (Takara, Shiga, Japan) i 30 minutter ved stuetemperatur og vasket igen med PBS-T. Membranen blev re-probet af anti-vitellogenin antistoffer YP115 og YP170 (hver 1:10.000) ved 4 grader natten over42Den blev vasket med PBS-T og inkuberet med gede-anti-rotte-IgG-antistof konjugeret med peroxidase (1:2000) (Proteintech, Rosemont, IL, USA) ved stuetemperatur i 2 timer. Til belastningskontroller blev membranerne re-probed under anvendelse af et anti-actin-antistof (Klon nr. C4; Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) og peroxidase-konjugeret anti-muse-antistof (GE Healthcare UK). Tæthederne af vitellogenin (YP170 og YP115) og CML-bånd i hver bane blev normaliseret mod dem for actin-båndene i den respektive bane. Båndtætheder blev analyseret ved hjælp af ImageQuant TL-software (GE Healthcare). Hvert assay blev udført to gange.


Virkninger af ribose og rifampicin på AGE'er in vivo

Tre dage gamle orme blev dyrket på mNGM indeholdende 400 mM riboseeller 400 mM sorbitol for at matche osmolariteten af ​​høj ribose; ormefoder blev leveret som varme (100 grader, 10 min)-dræbt OP50 for at forhindre bakterierne i at fermentere sukkeret. For at forhindre kontaminering med afkom blev orme overført til friske tallerkener dagligt i 4 dage, indtil de var helt

færdigæglægning (ved 7 dage gammel). For at vurdere indflydelsen af ​​ribose udførte vi overlevelsesassays og målte autofluorescens. En orm varbetragtes som død, da den ikke reagerede på en blid berøring med en ormeplukker. Orme, der døde som følge af at have klæbet til pladens væg, blev ikke inkluderet i analysen og blev censureret. I et separat eksperiment,MGM indeholdende 50 µM (endeligkoncentration) rifampicin (opløst iDMSO) blev brugt. Hvert assay blev gentaget to gange.


anti- senescence cistanche function

Fig. 6 Autofluorescens af vitellogenin (Vit) og forlængelsesfaktor (EF). -enSpektrofotometri (ex 325/em 350–600) af vitellogenin ogforlængelsesfaktor før og efter glykering in vitro med ribose i 14 dage: gly-Vit og gly-EF er glykeret vitellogenin og glycatforlængelsefaktor. RiboFLFLavin (Rib) er vist som repræsentantLFLuorescerende forbindelse. Uddrag fra 17-daggamle orme (vildtype N2) er vist til sammenligning (C. elegans). b In vitro-glykering af vitellogenin og forlængelsesfaktor med ribose gav stigninger i autofluorescens
over tid.c Western blotting-analyse af AGE og vitellogeniner i prøver ekstraheret fra ormepopulationer (vildtype N2) i forskellige aldre. Blots blev afledt af den samme gel og blev behandlet med hvert antistof i rækkefølge.d Kvantificeringaf vitellogeniner og AGE'er fra vestligeblotting ved hjælp af densitometri. Eksperimenter blev gentaget to gange, og data fra et repræsentativt eksperiment er vist. Både linje og stiplet linje i rød farve viser foldændringerne af AGE'er, mens dem i sort farve indikerer mængder af vitellogeniner. Lukkede cirkler og krydser er til data for bånd, der matcher henholdsvis YP170 og YP115


Identifikation af gamle ormespecifikke proteiner

Massespektrometrianalyse af ekstrakter fra 3- og 17-daggamle nematoderblev udført på et AB SCIEX 5800 LC-MALDI-TOF massespektrometer (Newark, NJ, USA) med Protein Pilot version 4.0. Begge matricer varfordøjet med trypsin og blandet med en matrixopløsning (7 mg/l - cyano-4-hydroxykanelsyre i 0,1 procent (v/v) trifluoreddikesyre (TFA), 70 procent
(v/v) acetonitril (ACN)). Detfyrhastigheden brugt til adskillelse var 300 ml/min.og adskillelse blev opnået ved anvendelse af en lineær gradient af to mobile faser ({{0}},1 procent (v/v) TFA i 2 procent ACN (opløsningsmiddel A) og 0,1 procent (v/v) TFA i 80 procent ACN(opløsningsmiddel B)) i følgende forhold: A/B= 100/0–50/50 (60 min), A/B= 50/50–0/100 (20 min.), A/B= 0/100 (10 min.). Et MALDI-TOF Mass-system blev anvendt til at opnå en peptidmassefingeraftryk. Peptid matchende ogproteinsøgninger blev udført mod Swiss-Prot version 57.0-databasen.


Ekstraherede proteiner blev opløst i 50 mM ammoniumbicarbonat(AmBic) for at give proteinkoncentrationer mellem 0,1 og 1 µg/µL. For at maksimere opløseligheden af ​​proteiner, et beregnet volumen af ​​vandRapigest (Waters Corporation, Milford, MA, USA) blev tilsat for at givefislutkoncentrationer af 0.1–0,2 procent Rapigest i prøver før fordøjelse. Prøverne
blev opvarmet til 40 grader under omrystning i 10 minutter; indholdet dengang varcentrifugeret, og den resulterende pellet blev suspenderet i AmBic indeholdende 10 mM DTT. Prøverne blev opvarmet ved 80 grader i 15 minutter og pelleteret ved stuetemperatur. En alikvot på 200 mM iodacetamid (IAM) i 50 mMAmBic blev tilsat til hver prøve for at give enendeligIAM koncentration af

20 mM (i nærvær af et 2 x molært overskud af DTT); blandingen så varinkuberes i mørke ved stuetemperatur i 30 minutter for at tillade alkyleringsreaktionen at forløbe. Trypsin i 50 mM AmBic blev blandet med hver opløsning ved 1:50 (trypsin: proteinkoncentration). Prøver blev fordøjet i mindst 4 timer eller natten over ved 37 grader under omrystning. Følgecentrifugering, blev TFA og ACN tilsat for at giveendeligkoncentrationer på 0.5–1.0 procent TFA og 2 procent ACN i volumen. Prøver blev rystet i 2 timer ved 60 grader. Efter centrifugering ved 22.200 ×g i 5 minutter var supernatantenpipetteres i et autosampler-hætteglas. Proteiner blev fordøjet med trypsin tidligeretil analyse ved omvendt-fase væskekromatografi under anvendelse af et Ultimate3000RSnanoLC-system (Thermo Fisher Scientific) koblet til et ESI-Q-TOF-system (Impact II Bruker Daltonics). Gær alkohol dehydrogenase(ADH1_GÆR)-protein blev tilsat i prøverne som en intern standard;spiking blev udført for at tilvejebringe en mængde på ca. 50 fmol afstandard på søjlen.


Autoflfluorescens efter in vitro-glykering

Vitellogenin i PBS-opløsning ({{0}}.053 µM) blev købt fra Biosense Laboratories AS (Bergen, NORGE). Forlængelsesfaktoropløsning (1,17 µM) blev købt fra Abnova Corporation (Taipei City, Taiwan). Disse opløsninger blev glyceret med 0,1 mM ribose i 23 dage ved 37 grader. RiboFLFLavin blev købt fra Sigma (Tokyo, Japan) og opløst i PBS ved 0,1 mM. Hver opløsning blev målt ved fluorescensspektrofotometri under de samme betingelser.

Immunfluorescensaf unge og gamle ormeAlderssynkroniseret CB1003 fodret med OP50 blev inkuberet ved 25 grader. Tre dage gamle og 13-dage gamle voksne blev permeabiliseret ved hjælp af Bouin's rørfikseringsprotokol43.


anti- senescence cistanche function

Fig. 7 Fluorescensbilleder af 3-daggamle og 13-daggamle kynu-1 mutanter. a–cTre dage gamle orme ogd–f 13-daggamle orme med råbilleder i kolonne 1. For at udelukke de mulige virkninger af dødenFluorescens, der starter fra 2 dage før ormene' død, mutantenkynu-1var brugt. Autofluorescens ses på billederne i kolonne 2 og 3. Billeder i kolonne 3 blev forstørret fra de angivne (med rektangler) områder af billederne i kolonne 2. Ældre orme (13-daggamle) autofluoresceredesigniFifiklart højere end unge orme (3-daggamle). Hver skalabjælke angiver 50μm. g Kvantificeringaf blåfluorescensved hjælp af ImageJ og ImageQuant TL software. Hver søjle repræsenterer gennemsnitsværdierne afFluorescensintensitet pr. 1 mm2 af ni orme. ** angiver en statistisk signiFifider er ingen forskel mellem 3-daggamle og 13-dages orme ved enp værdi < 0.01. Fejlbjælker repræsenterer SE.

Prøver varfasti Bouin's fikseringsmiddelmed methanol/ -mercaptoethanolved stuetemperatur i 30 min. For at knække neglebåndet blev der lagt orme indisopropanol og opbevares ved–80 grader i 10 minutter, derefter inkuberet ved stuetemperatur i yderligere 30 minutter. Detfikseringsmiddelopløsning blev fjernet ogerstattet med BTB-opløsning (25 mM boratbuffer, 0,5 procent Triton X-100, 2 procent
-mercaptoethanol) ved stuetemperatur i 1 time; inkubation i BTB vargentages i alt tre gange. Ormene blev derefter overført fra BTB til BT (25 mM boratbuffer, 0,5 procent Triton X-100), inkuberet i antistofbufferopløsning (1× PBS, 0,5 procent Triton X-100, 0,1 mM EDTA, {{10}},1 procent bovint serumalbumin (BSA), 0,05 procent natriumazid, pH 7,2) ved stuetemperatur i

1 time og blokeret med en antistofbufferopløsning indeholdende 10 procent gedeserum(Cosmo Bio, Tokyo, Japan) ved 4 grader natten over. De primære antistoffer bestod af et muse monoklonalt anti-AGE (anti-CML) antistof (klon nr. 6D12; 1:125) og et anti-pentosidin antistof (klon nr. PEN-12, Trans Genic; 1:5 0). Det sekundære antistof bestod af Alexa Fluor 555- konjugeret gede-anti-muse-antistof (Abcam, Cambridge, England; 1:100). Alle antistoffortyndinger blev udført under anvendelse af antistofbuffer indeholdende 0,5 procent BSA. Prøver blev monteret på objektglas under anvendelse af VECTASHIELD antifade monteringsmedium (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA).



Fluorescensmikroskopi

Fluorescensbilleder af 3- eller 13-daggamle voksne orme, monteret på objektglas som beskrevet ovenfor, blev optaget med en omvendtFluorescensmikroskop (BZ-X700; Keyence) med en 10× objektivlinse (CFI Plan Fluor DL10×/0,30). AutoFLFLuorescens af orme en rødfluorescensfra AlexaFluor 555 blev set med BZ-X DAPI (excitationsbølgelængde (Ex), 360 ±20 nm; emissionsbølgelængde (Em), 460 ± 25 nm) og TRITC (Ex, 545 ±12,5 nm; Em, 605 ± 35 nm)filtre, henholdsvis. Afsnit billeder varfanget af Sektionstilstand med en-dimensionel spaltetype med enwidth 32, og Z-stack pitch 0.7μm for 40-μm-tykke prøver. For at kvantificere det blåfluorescens, detfluorescensintensiteter målt ved billede
Quant TL-software (GE Healthcare) blev normaliseret til tæthedsværdier pr. 1 mm2 af en orm's projektionsområde. Kropsstørrelsen blev bestemt med Adobe Photoshop Elements og ImageJ-software udviklet af National Institutes of Health. I dette system, området af en orm's projektionblev beregnet automatisk og brugt som et indeks for kropsstørrelse.



Statistisk analyse

Korrelationen af ​​den forventede levetid blev beregnet ved hjælp af Spearman's rangkorrelationskoefficient. Autofluorescensniveauerne efter in vitro-glykering blev sammenlignet under anvendelse af to-faktor faktoriel ANOVA og Scheffe's F prøve. DetELISA-værdier efter in vitro-glykering blev sammenlignet under anvendelse af enkeltfaktor ANOVA og Dunnett-testen for flere sammenligninger. Nematode overlevelseblev beregnet af Kaplan–Meier-metoden og overlevelsesforskelle blev testet for signifikans ved brug af log-rank test. Autofluorescensværdierne efter rifampicinbehandling og aldring afdaf-2ogkynu-1mutanter blev sammenlignet for hver under anvendelse af Student's t test, gentaget måling to-faktor ANOVA og Mann–WhitneyU prøve. Autofluorescensværdierne efter ribosebehandlinger for N2 ellerkynu-1mutant blev sammenlignet under anvendelse af det ikke-parametriske stål–Dwass metode. Tæthederne fra autofluorescensmikroskopi blev sammenlignet med Student's T-test. Hvor signifikans blev observeret, blev data klassificeretFified som *p < 0.05 and **p < 0.01. All statistiske analyser blev udført med Microsoft Excel suppleret medtilføjelsessoftwarenplusStatcel 3 (OMS, Tokyo, Japan) og JSTAT til Windows(Nankodo, Tokyo, Japan).


Rapporteringsoversigt

Yderligere information om forskningsdesign findes i NaturforskningenRapporteringsoversigt linket til denne artikel.


DATA TILGÆNGELIGHED

De datasæt, der er genereret under den aktuelle undersøgelse, er tilgængelige fra den tilsvarendeforfatter efter rimelig anmodning.



REFERENCER

1. Brenner, S. Genetik afCaenorhabditis elegans. Genetik 77, 71–94 (1974).
2. Riddle, DL, Blumenthal, T., Meyer, BJ, Priess, JR (red.).C. elegans II. (KoldForår havn laboratorium presse% 2c kold forår havn% 2c 1997).
3. Herndon, LA et al. Stokastiske og genetiske faktorer påvirker vævsspecifikt fald i aldringC. elegans. Natur 419, 808–814 (2002).
4. Klass, MR Aldring i nematodenCaenorhabditis elegans: væsentlige biologiske og miljømæssige faktorer, der påvirker levetiden.Mech. Aging Dev. 6, 413–429 (1977).
5. Son, HG, Altintas, O., Kim, EJE, Kwon, S. & Lee, SV Aldersafhængige ændringer og biomarkører for aldring iCaenorhabditis elegans. Aldrende celle 18, e12853 (2019).
6. Yoshino, J., Mills, KF, Yoon, MJ & Imai, S. Nicotinamid-mononukleotid, en nøgle-NAD(plus) mellemliggende, behandler patofysiologien af ​​diæt- og aldersinduceret diabetes hos mus.Celle Metab. 14, 528–536 (2011).
7. Denzel, MS, Lapierre, LR & Mack, HID Nye emner iC. elegansAldringsforskning: transkriptionel regulering, stressrespons og epigenetik.Mech. Alder ing Dev. 177, 4–21 (2019).
8. Ikeda, T., Yasui, C., Hoshino, K., Arikawa, K. & Nishikawa, Y. InFLFLindflydelse af mælkesyrebakterier på levetiden afCaenorhabditis elegansog værtsforsvar mod Salmonellaenteriskserovar Enteritidis.Appl. Environ. Microbiol. 73, 6404–6409 (2007).
9. Komura, T., Ikeda, T., Yasui, C., Saeki, S. & Nishikawa, Y. Mekanisme, der ligger til grund for pro-longevity induceret af bifidobakterier iCaenorhabditis elegans. Biogerontologi 14, 73–87 (2013).
10. Clark, LC & Hodgkin, J. Commensals, probiotika og patogener iCae Caenorhabditis elegansmodel.Cellemikrobiol. 16, 27–38 (2013).
11. Cabreiro, F. & Gems, D. Orme har også brug for mikrober: mikrobiota, sundhed og aldring iCaenorhabditis elegans. EMBO Mol. Med. 5, 1300–1310 (2013).
12. Kim, Y. & Mylonakis, E.Caenorhabditis elegansImmunkonditionering med den probiotiske bakterieLactobacillus acidophilusstamme NCFM øger Gram-positive immunresponser.Inficere. Immun. 80, 2500–2508 (2012).
13. Gerstbrein, B., Stamatas, G., Kollias, N. & Driscoll, M. In vivo spektrofluorimetriafslører endogene biomarkører, der rapporterer om sundhed og kostbegrænsningerCaenorhabditis elegans. Aldrende celle 4, 127–137 (2005).
14. Coburn, C. et al. Antranilitfluorescensmarkerer en kalkudbredt nekrotisk bølge, der fremmer organismedød iC. elegans. PLoS Biol. 11, e1001613 (2013).
15. Pincus, Z., Mazer, TC & Slack, FJ AutoFLFLuorescens som et mål for alderdom iC. elegans: se til rødt, ikke blåt eller grønt.Aldring (Albany NY) 8, 889–898 (2016).
16. Sebekova, K. & Sebekova, KB Glycerede proteiner i ernæring: ven eller fjende?Exp. Gerontol. 117, 76–90 (2019).
17. Giacco, F. & Brownlee, M. Oxidativt stress og diabetiske komplikationer.Oplag Res. 107, 1058–1070 (2010).
18. Srikanth, V. et al. Avancerede glykeringsslutprodukter og deres receptor RAGE i Alzheimers's sygdom.Neurobiol. Alder 32, 763–777 (2011).
19. Zhuo, Q., Yang, W., Chen, JY & Wang, Y. Metabolisk syndrom møder slidgigt.Nat. Rev. Rheumatol. 8, 729–737 (2012).
20. Gkogkolou, P. & Bohm, M. Avancerede glycation slutprodukter: nøglespillere i hudens aldring?Dermatoendokrinol 4, 259–270 (2012).
21. Liu, J. et al. Receptor til avancerede glykeringsslutprodukter fremmer for tidligtsenescens af proksimale tubulære epitelceller via aktivering af endoplasmatiskreticulum stress-afhængig p21 signalering.Cellesignal 26, 110–121 (2014).

22. Mendler, M., Schlotterer, A., Morcos, M. & Nawroth, PP Forstå diabetisk polyneuropati og lang levetid: hvad kan vi lære af nematodenCae norhabditis elegans? Exp. Clin. Endokrinol. Diabetes 120, 182–183 (2012).


Spørg for mere:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950


























Du kan også lide