Aryl-carbonhydrid-receptor-afhængige og uafhængige veje medierer curcumin-anti-aldringseffekter, del 2

Venligst kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mere information

2.2.6. Dyrkning af primær menneskelig EC

Human primær EC (Lonza, Köln, Tyskland) blev dyrket i komplet endotelbasalt medium (EBM) (Lonza, Köln, Tyskland) suppleret med 1 ug/mL hydrocortison, 12 ug/mL bovint hjerneekstrakt, 50ug/ ml gentamicin, 10 ng/ml human epidermal vækstfaktor og 10 procent (o/v) føtalt kalveserum ved 37 grader og 5 procent CO, indtil den tredje passage. Efter løsrivelse med 0,05 procent (o/o) Trypsin/EDTA (Thermo Scientific, Schwerte, Tyskland) blev celler dyrket i 6 cm kulturskåle eller 6 brønds kulturplader i mindst 18 timer før transfektion eller behandling.

Klik venligst her for at vide mere

2.2.7. Forbigående transfektion af EC

Celler blev transficeret som beskrevet tidligere [65]. Kort fortalt blev EC transficeret ved at bruge SuperFectTransfection Reagent (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til producentens instruktioner. Overekspression eller knockdown af AhR blev opnået efter henholdsvis 24 eller 48 timer. Transfektionseffektiviteten ved overekspression var ca. 40 procent.

2.2.8. Scratch Wound Assay af EC

Til undersøgelse af migrationskapaciteten af ​​EC blev kradsesår udført som beskrevet tidligere [66]. I detaljer blev sår sat i et cellemonolag med en celleskraber langs en sporlinje. Efter skaden blev ikke-vedhæftede celler fjernet ved forsigtig vask.cistanche salsa ekstraktCurcuminbehandlingen blev udført umiddelbart efter at såret var sat. Cur-cumin blev opløst i DMSO og anvendt i en slutkoncentration på 7,5 uM. EC-migrering blev kvantificeret ved at farve cellerne med 5 ug/mL 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (Carl Roth, Karlsruhe, Tyskland) i PBS i 5 minutter efter, at cellerne var blevet fikseret med 4% (v/v) paraformaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur. Billeder blev taget ved hjælp af et Zeiss AxioVision Observer D1 fluorescerende mikroskop (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland)) med en 200-forstørrelse. Celler, der migrerede ind i såret fra sporlinjen, blev automatisk talt under anvendelse af partikelanalysefunktionen i billede]1.52a]67I efter at overlappende kerner var adskilt.

Cistanche kan anti-aging

2.2.9. Immunfarvning af EC

EC blev fikseret med 4 procent (o/v) paraformaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur. Efter permeabilisering og blokering i 0.3 procent (o/o)Triton-X 100 og 3 procent (o/u) normalt gedeserum i PBS, blev celler inkuberet med et kaninantistof mod AhR(1:100, Abcam, Cambridge, Storbritannien) eller Nrf2 (klon D1Z9C, 1:100, Cell Signaling Technology, Frankfurt, Tyskland) fortyndet i 1 procent (o/v) normalt gedeserum i PBS natten over ved 4 C. Derefter blev cellerne vasket med PBS og inkuberet med en Alexa 594-koblet ged anti-kanin IgG (1:500, Invitrogen, Darmstadt, Tyskland) i 1 time ved stuetemperatur.cistanche stammeTil aktinfarvning blev celler inkuberet med Alexa FluorTM 488 Phalloidin (1:70, Invitrogen, Darmstadt, Tyskland) i 20 minutter ved stuetemperatur. Kerner blev modfarvet med 0,5 ug/ml DAPI i PBS i 5 minutter ved stuetemperatur, og cellerne blev monteret med ProLong'MDiamond Antifade Mountant (Invitrogen, Darmstadt, Tyskland). Fluorescerende billeder blev taget ved hjælp af et Zeiss AxioVision Observer D1 fluorescerende mikroskop med 400× eller 200× forstørrelse.

2.2.10. qPCR i celler

Det totale cellulære RNA blev isoleret ved at kombinere lysis i TRIzolTM med nedstrømsbehandling ved anvendelse af RNeasy Mini Kit (Qiagen (Hilden, Tyskland)) i henhold til producentens instruktioner. cDNA-syntese blev udført ved hjælp af QuantiTect9 Reverse Transcription Kit (Qiagen (Hilden, Tyskland)) med 1 ug RNA i henhold til producentens instruktioner. Relative transkriptniveauer blev bestemt ved PCR under anvendelse af 2x SYBR③ Green qPCR Master Mix og en Rotor-Gene Q termisk cycler (Qiagen (Hilden, Tyskland)). Transkriptet for det ribosomale protein L32 (rpl32) blev brugt som reference, og den relative ekspression blev beregnet ved AC-metoden [68]. Følgende Intron-spændende primerpar blev brugt: hovedstad (genaccessionsnummer NM_000499.5):5'-TCGCTACCTACCCAACCCTT-3',5'-TGTGTCAAACCCAGCTCCAA-3';ahr(gen accessionsnummer NM_001621.5):5'-CGTGGGTCAGATGCAGTACA-3',5'ACCAGGGT-CAAAATTGGGCT3';sod2(genaccessionsnummer NM_000636.4):5'-GCCCTGGAACCTCAC ATCAA -3';5'-AGCAACTCCCCTTTGGGTTC-3';rpl32(genaccessionsnummer NM_000994.4):5'-GTGAAGCCCAAGATCGTCAA-3',5'-TTGTTGCACATCAGCAGCAC{{ 41}}'.

2.3. Mus

2.3.1.Muselinjer og avl

Kvinde 8-12-uge gammel ("ung") og 18- måned gammel ("gammel") AHR-deficient B6.129-AHRtmlBra/J (Schmidt et al., 1996; refereret til hertil som AHR-KO)-mus blev opdrættet som heterozy-gotes i IUF's dyreanlæg. Vildtype kuldkammerater blev brugt til kontrol. Mus blev opdrættet og holdt under specifikke patogenfrie forhold på en 12/12 timers lys-mørke cyklus og modtog standard foder (ssniff"MZ, SSNIFF, Soest, Tyskland) ad libitum. 2.3.2.qPCR i mus

Total RNA blev isoleret fra organvæv fra tre WT- og tre AHR-deficiente mus med TriZol[. Derefter blev 400 ng RNA revers transskriberet under anvendelse af revers transkriptase M-MLV (Promega, Madison, WI, USA) og tilfældige hexamer-primere. Genekspressionsniveauer blev målt i to eksemplarer for hvert musevæv på en Rotor-Gene Q (Qiagen, Hilden, Tyskland), i 15 μL slutvolumen, indeholdende 7,5 μL Rotor Gene SybrGreenTM (Biorad, Feldkirchen, Tyskland), 1 uM af hver primer ,1,5 μL cDNA- og RNase-frit vand. Primereffektiviteten var mellem 90 procent og 146 procent. Se tabel S2 for primersekvenser og effektiviteter. Ekspressionsniveauer blev kalibreret til ekspressionen af ​​RPS6 som et husholdningsgen i den samme prøve ved hjælp af {{ 14}}CT-metode [69].

2.4.I Silico-analyser

Homologimodellering af CeAhR LBD

Den strukturelle model af C. elegans AhR LBD (rester 267-372) blev genereret ved homologimodellering. Røntgenstrukturerne af PASB-domænerne af homologe bHLH-PAS-familiemedlemmer, der deler den højeste sekvensidentitet (ca. 20 procent) med CeAhR PASB, blev brugt som skabeloner: de cirkadiske lokomotoriske outputcyklusser kaput (CLOCK, PDB: 4F3L), neuronalt PAS-domæne-holdigt protein 3(NPAS3, PDB:5SY7), de hypoxi-inducerbare faktorer 20(HIF2o, PDB:3H82,4ZP4,3F1N) og lo(HIFlo, PDB:4H6J). Modellen blev opnået med MODELLER[70-72].cistanche tubulosa fordele og bivirkningerDen optimale model blev valgt blandt de 10 genererede, baseret på den bedste DOPE SCORE [73]. Kvaliteten af ​​modellerne blev evalueret ved hjælp af PROCHECK [74]. Sekundære strukturer blev tilskrevet af DSSPcont [75]. Bindingskaviteten i de modellerede LBD'er blev karakteriseret ved hjælp af CASTp-serveren[76]. Visualisering af modellerne blev udført ved hjælp af PYMOL[77].

2.5.Statistisk analyse

Medmindre andet er angivet, blev statistiske analyser udført i GraphPad Prism (version 6.01) (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA). For livs-/sundhedsspændsassays blev statistisk analyse udført ved hjælp af OASIS[53]. Statistisk analyse af mikroarray-dataene blev udført i R (R Foundation (Wien, Østrig)). Boxplots blev oprettet i GraphPad Prism (version 6.01) (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA) og viser medianen (linje), 25-75th percentil (box) og 10-90th percentil (knurhår).

3. Resultater

3.1. Curcumin fremmer sundheden på en AhR-afhængig og uafhængig måde

Tab af ahr-1 fremmer C.elegans' sundhed og levetid under basale tilstande[14], og det påvirker aldersrelaterede egenskaber negativt som reaktion på pattedyrs AhR-modulatorer, såsom benzo[a]pyren (BaP), UVB lys og mikrobiota [25]. Diætpolyfenoler, såsom cur-cumin, udgør en vigtig gruppe af pattedyrs AhR-modulatorer med langtidsvirkninger i C. elegans [78,79], og vi undersøgte derfor curcumins levetidsforlængende effekt for dets ahr-1 afhængighed. Curcumin forlængede reproducerbart og væsentligt levetiden og helbredet for C. elegans på en ahr-1-afhængig måde (figur 1A,B). Tidligere har vi vist, at tab af ahr-1 også forlænger levetiden i modellerne for Huntingtons sygdom og Parkinsons sygdom med muskeloverekspression af henholdsvis aggregeringstilbøjelig polyglutamin (polyQ40) og -synuclein (-syn), mens kl. samtidig øge deres indhold af proteinaggregater [25]. Interessant nok øgede curcuminbehandling antallet af polyQ40- og -syn-aggregater i samme grad som ahr-7 funktionstab (figur 1C). Curcumin fremmede også levetid og bevægelsesevne i disse sygdomsmodeller (Figur 1DE), men virkningerne af ahr-1 tab og curcumintilskud var additive i PolyQbackground (Figur 1D), hvilket afslører AHR-1-uafhængige beskyttende funktioner af curcumin i det mindste i denne kompromitterede baggrund.

Figur 1. Curcumin fremmer sundheden på en AHR-1-afhængig og uafhængig måde. Kurver for levetid (A) og helbredsspændvidde (B) for DMSO- eller curcuminbehandlede wt- og ahr-1-nematoder. Overlevelseskurver viser samlede data for 290-300 orme/tilstand i 5 eksperimenter. Statistisk test:log-rank test, # signifikans vs. DMSO,*signifikans vs.wt, Bonferronip-værdi<0.05.(c) quantification="" of="" aggregates="" in="" 10-day-old="" polyq;wt="" and="" poly="" air-1="" (left="" panel)="" or="" 7-day-old="" async;wt="" and="" an;ahr-1="" (right="" panel).="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 59-111="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05><0.05 vs.dmso.(d,e)life/health="" span="" of="" polyq;wt="" and="" polyq;ahr-1.survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 180="" worms/conditions="" in="" 3="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,significance="" vs.="" dmso,="" *="" significance="" vs.="" wt,="" bonferroni="" p-value=""><>

3.2.ugt-45 medierer de anti-aldringseffekter af curcumin og ahr-1 udtømning

I vores søgen efter mulige nedstrøms ahr-1-afhængige effektorer af curcumin tog vi målrettede og objektive tilgange. Vi undersøgte ekspressionen af ​​klassiske pattedyrs AhR-målgener og fokuserede på Cyp-generne, da curcumin ændrer CyplA1- og CyplB1-ekspression i pattedyrsceller [80,81]. Kvantificeringen af ​​47 forskellige cyps i C.elegans ved semi-kvantitativ realtids-PCR (qPCR) afslørede imidlertid, at kun cyp-13B1 var signifikant opreguleret enten af ​​ahr-1-udtømning eller af curcumin på en ahr-1-afhængig måde (figur S1A-B), mens de tre andre cyps(dvs.,cyp-13A5, cyp-13A8 og cyp-42A1) var kun øget med curcumin i fravær af ahr-1(Figur S1). Disse data, sammen med andre værker [25,82], tyder på, at cyps sandsynligvis ikke er de vigtigste mål for CeAhR. Dette understøttes også af vores transkriptomiske analyse i vildtype- og ahr-1-mutanter. Faktisk, i overensstemmelse med rollen af ​​AHR-1 i neuronal bestemmelse [37,38,40,41], viste genekspressionsændringerne mellem vildtype- og ahr-1-mutanter berigelse i processer forbundet med neuronal udvikling og differentiering og ingen større ændringer i klassiske afgiftningsgener (figur 2A).qPCR-analyse af nogle af de mest op- og nedregulerede gener mellem ahr-1(jul45) og vildtype (atf-2 , K04H4.2, egl-46, T20F5.4, ptr-4, dyf-7,clec-209, C01B4.6, C01B4.7, F56A4.3) bekræftede deres ahr-1-afhængighed under basale forhold (Figur 2B), men hverken UVB [25] eller curcumin (Figur 2C) påvirkede ekspressionen af ​​disse gener signifikant. Vi spekulerede på, om ekspressionsændringerne i disse gener er evolutionært konserverede og vurderede deres ekspression i forskellige væv (dvs. hjerne, lever, tarm og blod) af 8- og 18-måned gammel vildtype og AhR KO mus. Nogle gener viste en tendens til øget ekspression hos unge(atf-2 homolog) eller gamle(lpr-4/5 homologer) mus på en vævsspecifik måde, men hverken et åbenlyst mønster eller bevarede ændringer var observeret (Figur S2). Disse resultater afspejler mulige artsspecifikke forskelle eller vævsafhængig AhR-transkriptionel aktivitet hos pattedyr overset af transkriptomisk analyse af hele dyr i C. elegans. En grundig undersøgelse af de mest differentielt udtrykte gener mellem C. elegans vildtype og ahr-1(jul45) viste, at ekspressionen af ​​mange af disse gener påvirkes i C.elegans under aldring og af diætpattedyrs AhR-modulatorer ( fx quercetin og resveratrol)[25], hvilket tyder på en rolle for AHR-1 i polyphenol-moduleret genekspression. I overensstemmelse med dette scenarie viste mikroarray-dataene, at de fleste af generne differentielt udtrykt ved curcuminbehandling faktisk blev reguleret på en ahr-1-afhængig måde (figur 2D; tabel 1).cistanche tubulosa ekstraktUd af 47 gener ændret af curcumin i vildtypen (43 op- og 4 nedregulerede), blev kun 5 også induceret af curcumin i ahr-1(ju145). Blandt generne reguleret af curcumin på en AHR-1-afhængig måde var fase Il-enzymer, og interessant nok blev nogle af dem (ugt-9 og ugt-29) reguleret i samme retning af curcumin eller ved tab af ahr-1 (tabel 1). Derfor kontrollerede vi deres udtryk og det for yderligere ugts(ugt-45 og ugt-57), der blev udtrykt differentielt ved anvendelse af en mindre restriktiv statistisk analyse, der ikke var korrigeret for flere sammenligninger. Af de undersøgte gener blev ugt-45 øget i ahr-1(ijul45) og ved curcuminbehandling (figur 3A,B). Vi observerede også ændringer i ekspressionen af ​​nogle afgiftningsgener mellem vildtype og AhR KO mus på en vævsafhængig måde. Den differentielle ekspression af disse gener var højest i hjernen, hvor Ugt2a3 (ugt-9 og ugt-29 i C.elegans) var ned- og Hpgds (gst-4 i C. elegans) blev opreguleret (figur S3A). Der var ingen ændring i ekspressionen af ​​nogen af ​​de testede gener i leverprøverne hos mus (figur S3B). I overensstemmelse med C,elegans data viste den murine ugt-45 homolog Ugt3a2 en tendens til overekspression i tarme fra Ahr KO-mus (figur S3C). Navnlig forhindrede ugt-45 RNAi de gavnlige virkninger på livs- og helbredsspændvidder fremmet af curcumin (Figur 3C,D) eller ahr-1-udtømning (Figur 3E,F), hvilket indikerer, at de to interventioner kan stole på fælles moduleret downstream-signalering for at fremkalde deres anti-aldringsaktivitet.

Figur 2. Gener differentielt reguleret af curcumin er primært reguleret på en ahr-1-afhængig måde.(A)Genontologi(GO)berigelse for biologiske processer efter GO-termfusion i ahr-1 vs. wt. (B, C) Ekspressionen af ​​de stærkeste ned- og opregulerede gener mellem wt og ahr-1 [25]blev vurderet ved qPCR i wt vs.ahr-1(B) og DMSO-vs . curcuminbehandlede nematoder(C). Boxplots viser data fra 3 eksperimenter. Udtrykket er vist i forhold til DMSO-behandlet vægt (stiplet linje). Statistisk test:1-måde ANOVA med Tukeys test af flere sammenligninger,*p-værdi<0.05 vs.wt.="" (d)venn="" diagram="" of="" differentially="" expressed="" genes="" on="" the="" microarray.="" the="" number="" of="" genes="" that="" were="" differentially="" up-or="" down-regulated="" between="" the="" indicated="" conditions="" is="" shown="" in="" red="" and="" blue,="" respectively.="" the="" numbers="" in="" the="" interchanges="" refer="" to="" the="" genes="" that="" occurred="" in="" both="" comparisons.="" the="" values="" in="" the="" lower="" right="" corner="" show="" the="" number="" of="" genes="" on="" the="" array="" that="" were="" not="" differentially="">

Figur 3.ugt-45 er påkrævet til forlængelse af levetiden af ​​curcumin og ahr-1 mutanter. (A, B) Genekspression blev vurderet ved qPCR i wt vs.ahr-1(A) og DMSO- vs. curcumin-behandlede wt nematoder (B). Boxplots viser data fra 3 eksperimenter. Udtrykket er vist i forhold til DMSO-behandlet vægt (angivet som en stiplet linje). Statistisk test: 2-Måde ANOVA med Sidaks multiple sammenligningstest, *p-værdi<0.05vs.wt,><0.05 vs.="" dmso.="" (c,d)effect="" of="" ugt-45="" rnai="" on="" the="" curcumin-mediated="" life/health="" span="" extension="" in="" the="" wt.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" "significance="" vs.="" dmso,*="" significance="" vs.control="" rnai,="" bonferroni=""><0.05.(e,f)effect of="" ugt-45="" rnai="" on="" ahr-1-mediated="" life/healthspan="" extension.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 120="" worms/condition="" in="" 2="" replicates.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,#="" significance="" vs.="" wt,*="" significance="" vs.="" control="" rnai,="" bonferroni=""><>

3.3. AHR-1 og curcumin beskytter uafhængigt mod oxidativ stress

De gavnlige egenskaber ved polyphenoler tilskrives ofte deres evne til at beskytte mod reaktive oxygenarter (ROS)|83,84]. Da AhR er involveret i oxidativ stress-medierede processer [85-87], spekulerede vi på, om curcumin kan påvirke dyrenes fysiologi via AhR-regulerede antioxidantresponser. Vi observerede, at ahr-1-mutanter producerer mere mitokondriel(mt)ROS og har et reduceret mitokondrielt membranpotentiale (figur 4A,B), to parametre, der korrelerer med levetid [88,89]. Selvom det er i overensstemmelse med mitohormesis-paradigmet ahr-1(jul45) producerer lidt mere mtROS og lever længere, var disse dyr mere følsomme over for oxidativ stress end vildtypen. Specifikt var de skadelige virkninger induceret af juglone og H2O2 på dyrenes spring, motilitet og overlevelse signifikant stærkere i ahr-1(jul45) sammenlignet med vildtypen (figur 4C-F). Disse data tyder på, at AHR-1-udtømning har gavnlige motoriske metiske virkninger under basale tilstande, mens dets tilstedeværelse er påkrævet for beskyttelse mod oxidativ stress, og dermed afkobler to ofte korrelerende aldersrelaterede parametre, nemlig levetid og stressmodstand. I stedet forbedrede curcumin signifikant H,O og juglone-resistens i både vildtype- og ahr-1-mutanter (figur 4E,F), hvilket tyder på, at curcumin fremkalder en ahr-1-uafhængig antioxidantrespons. I overensstemmelse med den ukoblede regulering af levetid og modstandsdygtighed over for oxidativ stress påvirkede ugt-45-dæmpning ikke følsomheden over for oxidativ stress, hverken for ahr-1-mutanter eller curcumin-behandlede dyr (figur 4G).cistanche tubulosa anmeldelserCurcumin har således langtidsvirkninger via ahr-1 og ugt-45, men beskytter mod oxidativt stress gennem ahr-1-uafhængige mekanismer.

3.4. Nrf2/SKN-1 medierer de AhR-uafhængige effekter af curcumin

For yderligere at evaluere AhR-curcumin-krydstale i yderligere aldersrelaterede funktioner målte vi migrationskapaciteten i menneskelig primær EC - et kendetegn for karfunktionalitet, som falder med alderen [90] og reduceres ved AhR-aktivering [14]. I overensstemmelse med anti-aldringsaktiviteten af ​​ahr-1-undertrykkelse og curcumin, blev AhR-overekspression betydeligt hæmmet, mens curcumin øgede migrationskapaciteten af ​​primær human EC (figur 5A). Det skal bemærkes, at induktionen af ​​migrationsevne med curcumin var sammenlignelig i tomme vektor- eller AhR-ekspressionsvektortransficerede celler (figur 5A). Migrationen af ​​curcumin-behandlede celler blev imidlertid signifikant reduceret ved AhR-overekspression: curcumin inducerer i tomme vektortransficerede celler op til 60 migrerede celler pr. højeffektfelt, mens der i AhR-overudtrykkende celler kun er op til 25 celler pr. højeffektfelt (figur 5A). Disse data tyder på, at den pro-migrerende effekt af curcumin er moduleret af AhR-uafhængige mekanismer, men muligvis også af en reduktion i AhR-aktivitet. Vi bestemte derefter intracellulær AhR-fordeling og ekspressionen af ​​cVplal i curcumin-behandlet humant EC, Curcumin påvirkede ikke AhR-nuklear translokation (figur 5B) eller cyplal ekspression (figur 5C). I søgen efter veje moduleret af curcumin på en AhR-uafhængig måde, vendte vi tilbage til nematode transkriptomiske profiler for at finde transkriptionsfaktorer, der regulerer gener signifikant moduleret af tab af ahr-1 eller ved curcuminbehandling i vildtypedyr (tabel 1) ). Denne i silico-søgning identificerede redox-transkriptionsfaktoren SKN-1, ortologen af ​​human Nrf2 (nuklear faktor erythroid 2-relateret faktor 2), hvis aktivering af curcumin [91] ofte rapporteres som en mulig mediator af dets antioxidantaktivitet [92,93]. Følgelig er prototypen C.elegans Nrf2/SKN-1-afhængigt gen, gst-4, overudtrykt i alhr-1 mutanten [25] og induceret af curcumin i vildtype og endnu mere i ahr-1 mutanter (figur 5D). Desuden øgede curcumin stabilisering og nuklear translokation af Nrf2 i primær human EC (Figur 5E) og inducerede ekspressionen af ​​mangansuperoxiddismutase (Sod2) - et klassisk Nrf2 målgen - i cellerne transficeret med en tom vektor eller i celler, hvori AhR dæmpes af shRNA (figur 5F). Manglen på Sod2-induktion af AhR shRNA i EC kan skyldes en delvis reduktion (50 procent) i ekspressionen (figur S3D), som muligvis ikke er tilstrækkelig til at udløse aktiveringen af ​​Nrf2 eller af yderligere transkriptionsfaktor (TF), som , i C.elegans, kan stemme overens med induktionen af ​​gst-4 [94]ved fuldstændig AhR-udtømning. Interessant nok var Hpgds, en homolog af C.elegans gst-4, signifikant forøget i hjernen hos AhR KO-mus (Figur S3A), men det er ikke et mål for Nrf2. Yderligere beviser for mulig Nrf2/SKN-1-uafhængig signalering aktiveret af ahr-1-depletering er, at aktiveringen af ​​gst-4 af curcumin er fuldstændig undertrykt af hud-7 RNAi i C.elegans vildtype, hvorimod ahr-1 mutanter stadig inducerer gst-4 på trods af hud-1 udtømning (figur 5G, H). Imidlertid reducerede hud-1 RNAi oxidativ stressresistens i både vildtype og ahr-1(ju145)(figur 5I). Uventet påvirkede hud-1 lyddæmpning ikke jugloneresistensen hos curcuminbehandlede dyr (figur 5I). Vores data afslører et komplekst scenarie, hvor curcumin fremmer forskellige anti-aldringsfunktioner, der enten er afhængige af AhR-afhængig eller AhR-uafhængig, men Nrf2/SKN-1-afhængig (og yderligere) signalering.

Figur 4. AHR-1 og curcumin beskytter uafhængigt mod oxidativt stress. (A) Repræsentative billeder (venstre) og DSRed intensitetskvantificering (højre) i MitoSOX-farvede wt eller ahr-1 nematoder. Boxplots viser poolede data fra 129-135 orme/tilstande i 3 eksperimenter. (B) Mitokondriernes membranpotentiale blev vurderet ved TRME-farvning i nematoder af angivne aldre. Repræsentative billeder (til venstre) og kvantificeringen af ​​TMRE-fluorescensen (højre) er præsenteret. Boxplots viser poolede data fra 3 eksperimenter.(C,D) Pharyngeal pumpeaktivitet(C) og motilitet(D) af wt- og ahr-1-mutanter efter H2O2-behandling. Boksplot viser poolede data fra 39-54(C) eller 35-36 orme/tilstand (D)i 3-4eksperimenter.*p-værdi<0.05 vs.wt,$=""><0.05 vs.control="" treatment,="" statistical="" test:="" 1-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (e)pharyngeal="" pumping="" of="" curcumin-treated="" nematodes="" after="" h,="" o,="" treatment.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" from="" 32="" worms/conditions="" in="" 2experiments.="" *=""><0.05><0.05cur vs.="" dmso="" treatment,="" $=""><0.05 h2o2="" vs.="" control="" statistical="" test:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.(f)influence="" of="" curcumin="" on="" juglone-induced="" toxicity.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 500="" worms/condition="" in="" 20="" experiments.="" *significance="" alhr-1="" vs.wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05.(g) effect="" of="" ugt-45="" rnai="" in="" curcumin-fed="" wt="" and="" ahr-1="" worms.="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 150="" worms/condition="" in="" 6experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,#significance="" curcumin="" vs.dmso,="" bonferroni=""><0.05. no="" statistical="" significance="" was="" observed="" in="" ugt-45="" vs.="" control="" rnai-treated="">

Figur 5. Curcumin aktiverer Nrf2/SKN-1 uafhængigt af AhR.(A) Ridsesårassay i curcumin (cur)- eller DMSO-behandlet human primær EC transficeret med en tom vektor(EV) eller en ekspressionsvektor for menneskelig AhR. Øverste panel: repræsentative billeder; den stiplede linje repræsenterer migreringsstart. Målestok: 100 um. Nedre panel: kvantificering; boxplots viser data fra 4-6eksperimenter. Statistisk test:1-måde ANOVA,*p<0.05><0.05 ys.dmso.(b,c)human="" primary="" ec="" were="" treated="" with="" cur="" or="" dmso.="" (b)representative="" immunostainings:="" ahr="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin="" (green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control="" (-con),="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.scale="" bar:50="" um.(c)="" relative="" capital="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr.="" mean="" expression="" in="" the="" dmso-treated="" controls="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" from="" 7="" experiments.="" (d)pgst-4:gfp="" expression="" in="" dmso-and="" curcumin-treated="" (cur)wt="" and="" alr-1="" worms.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 118-138="" worms/conditions="" in4=""><0.05><0.05 vs.="" dmso="" treatment,="" statistical="" test:1-way="" anova.(e)representative="" immunostaining="" images="" of="" human="" primary="" ec="" treated="" with="" cur="" or="" dmso:="" nrf2="" is="" stained="" in="" red,="" nuclei="" were="" visualized="" with="" dapi="" (blue),="" the="" cytoskeleton="" is="" counterstained="" with="" phalloidin(green),="" merge="" shows="" an="" overlay="" of="" all="" fluorescence="" channels.="" in="" the="" negative="" control(-="" con)="" the="" first="" antibody="" was="" omitted,="" and="" cells="" were="" stained="" with="" alexa="" 488-coupled="" phalloidin="" and="" dapi.="" scale="" bar:="" 50="" um.(f)="" human="" primary="" ec="" was="" transfected="" with="" an="" empty="" vector(ev)or="" an="" expression="" vector="" for="" an="" shrna="" targeting="" the="" human="" ahr="" transcript="" (shahr).="" relative="" sod2="" expression="" was="" assessed="" by="" qpcr,="" and="" mean="" expression="" in="" the="" ev="" transfected="" cells="" was="" set="" to="" 1.="" boxplots="" show="" data="" of="" 7experiments.=""><0.05 vs.="" respective="" control.="" (g,h)="" post-4:gfp="" expression="" in="" dmso-or="" cur-treated="" wt="" and="" ahr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skin-1="" rnai.="" representative="" images(g)="" and="" gst-4-driven="" gfp="" quantification(h)="" are="" shown.="" boxplots="" show="" pooled="" data="" of="" 103-189="" worms/conditions="" in="" 4="" experiments.="" (i)="" juglone="" stress="" survival="" in="" curcumin-="" or="" dmso-treated="" wt="" and="" alhr-1="" nematodes="" subjected="" to="" control="" or="" skn-1="" rnai.="" kaplan="" meier="" survival="" curves="" show="" pooled="" data="" of="" 100="" worms/condition="" in="" 4="" experiments.="" statistical="" test:="" log-rank="" test,="" *="" significance="" ahr-1="" vs.="" wt,="" #significance="" curcumin="" vs.="" dmso,="" $="" significance="" skn-1="" vs.="" con="" rnai,="" bonferroni="" p-value=""><>

3.5. Curcumin og pro-oxidanter viser modsatte virkninger på AHR-1 aktivitet

I overensstemmelse med anti-aldringseffekten af ​​reduceret AhRekspression/aktivitet tyder vores data på, at curcumin kan forlænge levetiden for C.elegans ved at undertrykke AHR-1-regulerede veje gennem reduktion af AHR-1 udtryk/aktivitet eller handling på fælles nedstrøms signalveje. Derfor forsøgte vi at kvantificere AHR-1-aktivitet i C.elegans, men adskillige forsøg på at evaluere AHR-1-ekspression og subcellulær lokalisering ved hjælp af antistoffer (mod pattedyrs AhR eller tilpassede antistoffer mod CeAhR) eller fluorescensmærkede reportere (OP562, UL1709, ZG93) gav ikke meningsfulde beviser. I betragtning af at AHR-1 binder til XRE'er in vitro [35], tænkte vi at bruge XRE-drevet genekspression som en udlæsning for AHR-1-aktivitet. Derfor vendte vi os til abe-afledte Cos7-celler, som ikke udtrykker endogen AhR og således ikke viser nogen endogen AhR-aktivitet [95,96] og kan udnyttes til at overvåge XRE-drevet Luciferase-induktion som en udlæsning for AHR-1 aktivitet (Larigot et al.; indsendt sammen med denne undersøgelse). Når Cos7-celler blev co-transficeret med vektorer, der udtrykker C.elegans AhR/alr-1, ARNT/aha-1 og en luciferasekoblet XRE-holdig promotor af det humane CYPIA1-gen [64] AHR{ {27}} viste lav aktivitet under basale (bilbehandlede) tilstande. Det er værd at bemærke, at behandling med curcumin eller andre næringsstoffer, der fremmer sund aldring hos C.elegans, såsom lutein [97] og resveratrol [98,99], undertrykte AHR-1 aktivitet signifikant (figur 6A-C). I stedet påvirkede BaP og leflunomid, kendte AhR-aktivatorer i pattedyr, ikke AHR-1-aktivitet (figur 6A,B) ved de koncentrationer, vi brugte. Navnlig blev AHR-1-aktivitet afskaffet i Cos7-celler transficeret med en vektor, der udtrykker ahr-1(jul45)-allelen i stedet for vildtype-allelen (figur 6A-C), hvilket tyder på, at jul45 er en sand funktionstabsallel, og at den målte luciferaseintensitet skyldes funktionel AHR-1.

Vi søgte derefter at undersøge, om curcumin reducerer aktiviteten af ​​AHR-1 ved direkte binding eller indirekte modulering. Til dato er ingen ligander af C.elegans AHR-1 blevet identificeret, og da der ikke er nogen tilgængelig information om dets LBD, udførte vi en in silico-analyse for at karakterisere den. De to AHR-1 isoformer, la og 1b, blev justeret, og selvom deres længde er forskellig, er deres PASB-domænesekvens identisk. Denne sekvens blev derefter justeret til PASB-domænet af Drosophila melanogaster og til dem af to AhR'er fra hvirveldyr, for hvilke der tidligere blev genereret strukturelle modeller, nemlig mus (Mus musculus)[100] og zebrafisk (Danio rerio)[101](figur 6D). Justeringen viste klare forskelle mellem arter med de vigtigste ejendommeligheder ved hvirvelløse dyr, der blottede sekvensdeletioner i den mest variable region i PAS-domænet, svarende til den fleksible regionen, inklusive det spiralformede bundt (C , D , E-helixer) og de korte sløjfer, der forbinder disse elementer (figur 6D, E). Disse deletioner kunne reducere den tilgængelige plads i bindingskaviteten af ​​disse AhR'er. Vi genererede derefter en 3D-model af AHR-1 PASB ved homologimodellering. Denne model præsenterer den typiske PAS-fold, men med en kortere Do-helix sammenlignet med andre AhR'er. Imidlertid har det indre hulrum nogle ejendommeligheder; det indeholder flere hydrofobe rester og er afkortet i to af nogle indre sidekæder. Især H365 og H274 er vendt og kunne danne en hydrogenbinding i midten af ​​hulrummet; Y332-, L363- og L302-sidekæderne kunne desuden blokere hulrummet, hvilket reducerer det indre rum, der er tilgængeligt for ligander (figur 6E). Dette lille og trunkerede hulrum tillader højst sandsynligt ikke binding af store ligander (f.eks. TCDDor curcumin). I lighed med AHR-1-strukturmodellen viste en model af zebrafisken zfAhRla, at LBD-hulrummet er afkortet sammenlignet med de TCDD-bindende paraloger zfAhR1b og zfAhR2 [101]. Små og fleksible ligander, såsom leflunomid, binder og aktiverer zfAhRla, men den leflunomidkoncentration, vi testede, aktiverede ikke AHR-1 i vores Cos7-cellesystem (figur 6B). Vi spekulerede derefter på, om mutationer i aminosyrer, der er ansvarlige for det lille hulrum i LBD, kunne tillade klassiske ligander at aktivere CeAhR. CeAhR L363-resten (figur 6D) svarer til A375 i mAhRb-I og V375 i Madrid, og denne rest har en stor indflydelse på ligandbinding [102]. Tilsvarende bidrager T386 af zfAhRla (figur 6D), der matcher med A375 i mAhRb-1 og A386 i zfAhR1b og zfAhR2, til manglen på TCDD-binding af zfAhRla, og når den er muteret til alanin, genopretter følsomheden også, når YTC29 introduceret [101]. Aminosyren Y296 er allerede et histidin i C.elegans(H274). Således muterede vi kun leucinen i positionen L363 i CeAhR-vektoren til en alanin (L363A) (figur 6D,E angivet med en pil). Desuden muterede vi det nærliggende histidin i position H365 til glutamin (H365Q), som er Q377 i mus (Figur 6D, E angivet med en pil), da det sandsynligvis danner en hydrogenbinding med H274 og kan bidrage til det lille hulrum i AHR{ {49}} (Figur 6E). Vi testede derefter, om pattedyrs AhR-ligander påvirker AHR-1-aktiviteten, når L363 og H365 er muteret. Imidlertid afskaffede disse ændringer, i stedet for at genoprette respons på xenobiotiske ligander som i zebrafisk [101], selv den basale AHR-1-aktivitet, svarende til ju145-allelen (figur 6F). Disse resultater viser klare forskelle mellem LBD'erne for C.elegans og zebrafisk, men viser, at LBD'en er fundamental for basal AHR-1 aktivitet. Sammen med tidligere undersøgelser [35,38,82] tyder vores resultater på, at AHR-1 sandsynligvis ikke er involveret i det klassiske xenobiotika-inducerede transaktiveringsrespons, som derfor muligvis ikke er relevant for ahr-1-reguleret fysiologisk aldring. I stedet kan planteafledte forbindelser udøve konserverede effekter i det mindste delvist via undertrykkelse af AHR-1-modulerede veje. Vores 3D-model antyder, at curcumin ikke modulerer AHR-1-aktivitet ved at binde dets LBD. Curcumins undertrykkelse af AHR-1-aktivitet kan derfor skyldes dets antioxidantvirkning. I overensstemmelse med denne mulighed og C.elegans ahr-1-mutanternes øgede følsomhed over for oxidativt stress, fandt vi ud af, at AHR-1-aktivitet faktisk øges af ROS-inducerende midler. Cos7-celler behandlet med pro-oxidanten rotenon udviste nemlig øget AhR-aktivitet, når de blev transficeret med enten C.elegans eller murine AhR, men ikke når de blev transficeret med jul45-allelen eller allelen med LBD-mutationer (figur 6G,H).

Overordnet set, mens CeAhR-aktivering beskytter mod oxidativ stress tidligt i livet, modvirker dets nedsatte udtryk ældning og medierer den gavnlige anti-aldringseffekt af curcumin (figur 7). Curcumin kan således hjælpe med at balancere redox TF-aktivering på en kontekst- og tidsafhængig måde og favorisere AhR-undertrykkelse direkte gennem dets antioxidantvirkning og/eller gennem aktiveringen af ​​Nrf2/SKN-1 (eller anden TF), som kan sideløbende mediere anti-aging aktivitet af curcumin.

Figur 6. Curcumin og pro-oxidanter har modsatte virkninger på AHR-1 aktivitet. (AC)Evaluering af AHR-1-aktivitet efter behandling med de angivne forbindelser i Cos7-celler transficeret med enten wt AHR-1(wt) eller AHR-1, der bærer ju145-punktmutationen(ju145) og AHA-1 samt en XRE-inducerbar luciferase. Boksplot viser data for 3-5eksperimenter.* p-værdi<0.05><0.05 vs.="" dmso/etoh,="" statistical="" test:="" 2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.="" (d)="" alignment="" of="" the="" lbds="" from="" c.elegans,="" drosophila,="" and="" zebrafish="" ahrs.="" the="" color="" scheme="" for="" residues:="" red,="" acidic;="" blue,="" basic;="" purple,="" polar;="" yellow,="" cys;="" brown,="" aromatic;="" green,="" hydrophobic;="" orange,="" ser,="" thr;="" gray,="" pro;="" white,="" gly.="" (e)="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" to="" the="" ceahr="" pasb="" are="" indicated="" on="" top(light="" gray="" bars="" for="" helices="" and="" dark="" gray="" bars="" for="" β-strands)="" and="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" asterisks="" mark="" the="" amino="" acids="" likely="" contributing="" to="" the="" inability="" of="" ceahr="" to="" bind="" big="" ligands.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" the="" investigation="" of="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).i3dmodels="" of="" the="" ceahr="" (left)="" and="" the="" mahr="" (right)="" pasb="" domains="" were="" obtained="" by="" homology="" modeling,="" shown="" in="" a="" cartoon="" representation.="" secondary="" structures="" attributed="" by="" dsspcont="" are="" labeled="" according="" to="" the="" pas="" domain="" nomenclature.="" the="" colored="" internal="" area="" (blue="" for="" ceahr="" and="" yellow="" for="" mahr)defines="" the="" molecular="" surface="" of="" the="" binding="" cavity="" identified="" by="" castp.="" in="" the="" car="" model,="" the="" amino="" acids="" protruding="" into="" the="" binding="" cavity="" (asterisks="" in="" panel="" d)="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" blue="" sticks.="" the="" mahr="" amino="" acids="" corresponding="" to="" those="" displayed="" in="" the="" ceahr="" model,="" are="" labeled="" and="" shown="" as="" yellow="" sticks.="" amino="" acids="" highlighted="" by="" an="" arrow="" were="" mutated="" for="" studying="" the="" lbd="" function="" (panels="" f,="" h).="" (f)="" ahr="" activity="" in="" bap-or="" mnf-treated="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" an="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365o="" mutations="" (lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr),="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt,"=""><0.05 vs.dmso.(g)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" ahr-1(either="" wt="" or="" ju145)="" as="" well="" as="" aha-1="" and="" an="" xre-driven="" luciferase.="" boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" and="" tukey's="" multiple="" comparisons="" test.*=""><0.05vs.wt, #=""><0.05 vs.="" dmso.(h)effect="" of="" rotenone="" on="" ahr="" activity="" in="" cos7="" cells="" transfected="" with="" either="" ahr-1,="" ahr-1="" with="" l363a="" and="" h365q="" mutations(lbd="" mutant),="" or="" mouse="" ahr(mahr).boxplots="" show="" data="" from="" 3="" experiments.="" statistical="" analysis:2-way="" anova="" with="" tukey's="" multiple="" comparisons=""><0.05 vs.wt/ahr-1,="" #="" p-value=""><0.05 vs.="">

Figur 7. Foreslået model af AHR-1-signalvejen i C.elegans respons på pro- og antioxidanter. Under "normale" forhold (midterste panel) aktiveres AHR-1 af intracellulær ROS. Dette fører til udskillelse af chaperonerne fra cytosolisk AHR-1 og den efterfølgende nuklear translokation af AHR-1. I kernen danner AHR-1 en heterodimer med AHR nuklear translokatoren (AHA{ {7}}) og binder til XRE'er af målgener, hvilket igen fører til reduktion i intracellulære ROS-niveauer. Under disse forhold fører tab af ahr-1-funktion til en forlænget levetid. I nærvær af antioxidanter (venstre panel) er de intracellulære ROS-koncentrationer lave, hvilket fører til, at AHR-1 findes i cytoplasmaet, bundet af dets cofaktorer. Hæmningen af ​​den basale AHR-1-aktivitet fører til en længere levetid. I nærvær af pro-oxidanter (højre panel) aktiveres AHR-1 af overdreven ROS, hvilket resulterer i dets nukleare translokation, AHR-1-AHA-1-heterodimerdannelsen og initiering af målgentransskription. I ahr-1 KO fører den nedsatte afgiftning af ROS gennem AHR-1-inducerede målgener til en akkumulering af ROS og gør ahr-1 KO modtagelig.

4. Diskussion

AhR blev oprindeligt opdaget i pattedyr for dets xenobiotiske responsaktivitet induceret ved binding af miljøgifte eller endogene ligander, men modulatorer, der ikke er afhængige af ligandbinding, eksisterer også, men er meget mindre undersøgt. C.elegans repræsenterer en unik modelorganisme til at undersøge AhR-aktiviteter uafhængigt af dens klassiske xenobiotiske respons, da CeAhR ikke binder prototype AhR-ligander [35,39]. Ved hjælp af denne model identificerede vi en evolutionært bevaret funktion for AhR i ældningsprocessen [14] og viste, at nogle af pattedyrs AhR-modulatorer (dvs. bakterier, Bal og UVB) påvirker ældningsparametre gennem AHR-1 i en kontekstafhængig måde [25]. Her fulgte vi op på vores tidligere resultater med en mere mekanistisk undersøgelse af AhR-regulerede aldringstræk på tværs af arter af kosten polyphenol curcumin. Vores kombinerede in vivo-, in vitro- og silico-analyser afslørede et nyt og komplekst scenarie: mens curcumin fremmer anti-aldringsegenskaber i nematoder og human primær EC, i det mindste delvist på en AhR-afhængig måde, er dets antioxidantvirkninger i begge arter afhængige på AhR-uafhængige, men primært Nrf2/SKN-1 afhængige mekanismer.

Vi viste for første gang, at curcumin forsinkede C.elegans' fysiologiske aldring på en AHR-1-afhængig måde. I søgen efter mulige nedstrøms ahr-1-afhængige effektorer af curcumin brugte vi målrettede og uvildige tilgange og fandt ud af, at størstedelen af ​​differentielt regulerede gener ved curcuminbehandling er reguleret på en AHR-1-afhængig måde. Desuden viste mange af disse gener et lignende ekspressionsmønster i AHR-1-udtømte og curcuminbehandlede dyr, hvilket tyder på, at curcumin fremmer levetidsforlængelse via undertrykkelse af AHR-1-aktivitet. Overraskende nok indikerede hverken den målrettede eller den transkriptomiske analyse en vigtig rolle for klassiske AhR-målgener såsom kopper, som i stedet for stort set viste sig at være underudtrykt i neuroner (Larigot et al.; indsendt sammen med denne undersøgelse). Interessant nok kan disse fund tyde på, at transkriptomik fra hele dyr kan maskere de neuronspecifikke virkninger af AhR, i dette specifikke tilfælde gennem cps-gener. Vi fandt ud af, at blandt de differentielt udtrykte gener, hører mange til fase II-afgiftningsenzymer, såsom tarm-45, som blev øget ved både ahr-1-udtømning (og i hjernen på AhR KO-mus) og curcuminbehandling for at formidle deres levetidsforlængelse. I stedet øgede curcuminbehandling og ahr-1-depletering ekspressionen af ​​et andet fase-II-afgiftningsenzym, GST-4, gennem forskellige mekanismer: førstnævnte er afhængig af, mens sidstnævnte hovedsageligt er uafhængig af, Nrf2/ SKN-1, en klassisk redox-TF, der inducerer GST-4 ved oxidativ stress i C.elegans [103]. Desuden, mens curcumin inducerer Nrf2/SKN-1-afhængige responser i C.elegans (GST-4-udtryk) og human primær EC (Sod2-ekspression og migrationskapacitet), beskytter det også C.eleans mod oxidativt stress i en SKN-1-uafhængig måde. Hos C.elegans kan curcumin ikke forlænge levetiden i den meget syge hud-1(zu67) mutanter [104], mens GST-4 kan induceres på en SKN-1-uafhængig måde ved EGF-signalering [94] og krydstale mellem EGF-vejen og AhR blev rapporteret hos pattedyr [105].

Interessant nok, og i modsætning til vildtype-stammen, observerede vi en AHR-1-uafhængig effekt af curcumin på sundhedsspænd i nematodemodeller for henholdsvis Huntingtons og Parkinsons sygdom. Hos disse stammer øgede curcuminbehandling antallet af proteinaggregater i samme omfang som AHR-1-mangel, hvilket indikerer enten en beskyttende effekt af selve proteinaggregationen og/eller curcuminaktivering af veje, der beskytter mod proteinaggregation uafhængigt af en/ hr-1 udtømning. Curcumins indflydelse på proteinaggregering er kontroversiel: det viste sig at hæmme fibrildannelse, men også at binde præ-fibrillære/oligomere arter af amyloidogene proteiner og derved accelerere deres aggregering og reducere den samlede neurotoksicitet [106]. Det skal bemærkes, at koffein, som også beskytter mod træk ved kardiovaskulær aldring [66.107], også forhindrer A-induceret lammelse uden at reducere A-aggregater, men gennem aktiveringen af ​​den beskyttende Nrf2/SKN-1-afhængige vej [108]. Det vil være vigtigt at vurdere, om den beskyttende effekt induceret af curcumin eller al-1 udtømning i C.elegans sygdomsmodeller er medieret af mekanismer, der fremmer fjernelse af oligomere/præfibrillære arter til mindre toksiske aggregater og/eller af aktivering af andre mekanismer, såsom Nrf2/SKN-1, som samtidig kan beskytte mod proteotoksicitet. Det skal bemærkes, at afgiftningsenzymer kan indeholde både XRE og ARE (antioxidant-responsive elementer), og et samspil mellem Nrf2/ARE og AhR/XRE-reguleret signalering er blevet beskrevet [109]. Det vil derfor være interessant at afklare, hvordan curcumin fremmer dets forskellige gavnlige anti-aging effekter gennem balancen mellem Nrf2 og AhR-reguleret signalering.

Vores kombinerede tilgange viste, at curcumin hæmmer AHR-1-aktivitet. Hos pattedyr blev det foreslået, at den AhR-hæmmende virkning af curcumin medieres af direkte LBD-binding [110] eller hæmning af proteinkinase C, der phosphorylerer AhR[79]. En anden undersøgelse indikerede, at transkriptionsaktiviteten af ​​AhR er afhængig af den cellulære redoxstatus og kromatinstrukturen, som begge er påvirket af curcumin[111]. Mens AHR-1 ikke binder TCDD, binder det XRE in vitro[36], men systematiske undersøgelser, der adresserer potentialet for polyaromatiske kulbrinter, eller andre pattedyrs AhR-ligander til at modulere AHR-1, mangler primært pga. manglen på egnede værktøjer til at vurdere det. Vores undersøgelser forsøger at udfylde dette hul og udnytter Cos7-celler, der udtrykker AHR-1 koblet til luciferase-assays (Larigot et al.; indsendt sammen med denne undersøgelse) og i silico-modellering af C. elegans LBD, afslørede, at curcumin undertrykker AHR -1 aktivitet, men sandsynligvis ikke ved direkte LBD-binding. In vitro-assayet brugt i vores undersøgelse bekræftede, at CeAhR ikke aktiveres gennem den klassiske xenobiotika-signalering. Alligevel ville det ikke afsløre aktiviteter på grund af AhR-binding til andre DNA-sekvenser end den "klassiske" XRE fundet i CYP1A1, såsom den polyphenol(quercetin)-responsive XRE fundet i PON1 [112,113]. Immunfarvning i human primær EC argumenterer også imod curcumin-inducerende AhR-kernetranslokation, hvilket sammen med den fremmende effekt af migrationskapaciteten i AhR-overudtrykkende celler også kan indikere, at curcumin undertrykker AhR-aktivitet.

Vi foreslår, at den hæmmende virkning af curcumin, snarere end at stole på AhR-binding, involverer dets antioxidantevne, som faktisk kan være forbundet med eller endda afhænge af aktiveringen af ​​Nrf2/SKN-1. Pattedyrs AhR aktiveres af ROS via LBD-uafhængig oxidativ modifikation [85], men vores data viser, at induktionen af ​​AHR-1-aktivitet af pro-oxidanten rotenon kræver LBD. En indirekte mekanisme for ROS-medieret AhR-aktivering er dannelsen af ​​den potente AhR-ligand FICZ[114]. Alligevel er FICZ et stort plant molekyle, som ifølge vores in silico-model ikke ville passe til AHR-1 LBD. Mens den nøjagtige mekanisme, hvorved AHR-1-aktivitet fremmes af ROS og hæmmes af curcumin (enten via direkte ROS-quenching eller indirekte via aktivering af Nrf2 eller andre antioxidantregulerende gener), er endnu ikke fastlagt, understøttes dette stærkt af vores resultater: AHR-1 aktiveres af rotenon, og ahr-1-mutanter viser mere mtROS, reduceret mitokondriemembranpotentiale og er mere følsomme over for H, O og juglone samt over for UVB og BaP [25] , som begge producerer ROS[115,116]. I denne sammenhæng er det interessant at bemærke, at ahr-1-mutanter udviser mild ændring af mitokondriefunktioner, som ligner mitohormesis [117. Dette tyder på, at al-1 udtømning (og eventuel curcumin ved at hæmme AHR-1) kan fremme sundheden gennem mild mitokondriel stress, som vides at forlænge C.elegans levetid gennem afgiftningsgener, der på samme måde moduleres i den anden{ {20}} mutanter [118,119]. Hvorvidt Nrf2/SKN-1 og mitokondrier spiller en rolle i at modulere AHR-1-aktivitet ved curcuminbehandling, er desuden en interessant mulighed, som stadig mangler at blive valideret.

Samlet set, ved at udnytte de mange funktioner, der tilbydes af nematoden C.elegans til in vivo undersøgelser, foreslår vi, at AhR's forfædres funktion kan være i reguleringen af ​​fase-ll-enzymer relateret til antioxidant snarere end xenobiotiske reaktioner. I modsætning til de skadelige virkninger induceret af høje niveauer af ROS, kan de gavnlige virkninger fremmet af AhR-mangel medieres af mild mitokondrie-stress og/eller mild ROS-produktion (mitohormesis), som også er afhængig af Nrf2/SKN-1. Vi giver også stærke beviser for interaktionen mellem curcumin og AhR. Curcuminhæmning af AhR-signalering er evolutionært konserveret og medieres sandsynligvis ikke af binding til AhR LBD, men snarere gennem curcumins ROS-fjernende egenskaber eller aktivering af Nrf2/SKN-1. Nrf2-signalvejen kan faktisk aktiveres af curcumin på forskellige måder [91]. Endelig viste vores data, at curcumin fremmer anti-aldringseffekter også på en uafhængig måde i både C.elegans (øget GST-4-ekspression og oxidativ stressresistens) og human primær EC (øget Sod2-ekspression og migrationskapacitet ), hvilket også kunne forklare de additive virkninger af curcumin og tab af AHR-1-funktion på sundhedsområdet for dyr, der udtrykker polyQ.

5. Konklusioner

Som konklusion viste vi gennem en original kombination af in silico, vitro og in vivo tilgange, at mens CeAhR-aktivering beskytter mod oxidativt stress tidligt i livet, modvirker dets nedsatte udtryk aldring og medierer den gavnlige anti-aging effekt af curcumin (Figur 7) . Curcumin kan således hjælpe med at afbalancere aktiviteten af ​​forskellige transkriptionsfaktorer involveret i afgiftnings-/antioxidantresponser (undertrykke AhR og aktivere Nrf2) under forhold, hvor disse er ændret (øge AhR og mindske Nrf2/SKN-1), såsom aldring eller aldersrelaterede lidelser. Vores arbejde tilføjer et yderligere niveau af kompleksitet til AhR's allerede store multifunktionelle og kontekstspecifikke aktiviteter med vigtige konsekvenser for organismers sundhed og levetid. Desuden åbner det døren til yderligere undersøgelser ved at bruge nematodesystemet til at opdage og undersøge forfædres funktioner af AhR, som er mindre tilbøjelige til at blive identificeret hos pattedyr.

Denne artikel er uddraget af Antioxidants 2022, 11, 613. https://doi.org/10.3390/antiox11040613 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants