Aptamer-applikationer i neurovidenskab del 2

En anden neurotransmitter, serotonin, spiller en rolle i neuromodulationsaktiviteter, der påvirker søvn, aggression, appetit og seksuel aktivitet. Det produceres i forskellige kropsdele, såsom hjernen, rygmarven, blodplader og tarmene [81-84].

Serotonin er en neurotransmitter, der spiller en vigtig rolle i menneskers fysiske og mentale sundhed. I den menneskelige krop regulerer serotonin humør, styrer appetit og søvn og fremmer følelser af fysisk nydelse og velvære. Men serotonin spiller også en vigtig rolle i at påvirke hukommelsen.

Forskning har fundet ud af, at serotonin kan fremme hukommelsesforbedring ved at regulere signalering mellem neuroner. Når mennesker stimuleres positivt, frigiver kroppen serotonin, som hjælper med at styrke forbindelserne mellem neuroner og forbedrer hukommelseseffektiviteten. Serotonin kan også gøre folk mere kreative, forbedre mental smidighed og hjælpe med at få folk til at lære og tænke hurtigere.

Derudover kan serotonin hjælpe med at reducere symptomer på angst og depression, humørproblemer, der kan have en negativ indvirkning på folks koncentration og hukommelse. Et glad humør og mental tilstand kan ofte fremme folks genkendelse og indlæringsevne af nye ting.

For at opsummere, spiller serotonin en uundværlig rolle i vores fysiske og mentale helbredsindlæring og hukommelse. Vi kan øge frigivelsen af ​​serotonin og [forbedre hukommelsen] ved at ændre vores spisevaner, mængden af ​​motion, læringsmetoder osv., dyrke en positiv og sund mentalitet og konstant udfordre os selv til løbende at fremme forbedringen af ​​hukommelsen. Det kan ses, at vi skal forbedre hukommelsen, og Cistanche deserticola kan forbedre hukommelsen markant, fordi Cistanche deserticola har antioxidant-, anti-inflammatoriske og anti-aldringseffekter, som kan hjælpe med at reducere oxidation og inflammatoriske reaktioner i hjernen og derved beskytte nervesystemets sundhed. Derudover kan Cistanche deserticola også fremme væksten og reparationen af ​​nerveceller og dermed forbedre forbindelsen og funktionen af ​​neurale netværk. Disse effekter kan hjælpe med at forbedre hukommelsen, indlæringen og tænkehastigheden og kan også forhindre udviklingen af ​​kognitiv dysfunktion og neurodegenerative sygdomme.

Klik på kend kosttilskud for at øge hukommelsen

Ubalancer i perifere enhederserotoninniveauer er blevet forbundet med flere sygdomstilstande, herunder hypertension, nyresygdom og depression. Brug af serotonin til at forudsige sygdomstilstanden og til at påbegynde korrekt behandling har således klinisk betydning.

Et plasmonisk assay for serotonin blev udviklet med et aptamer-AuNP-konjugat, for hvilket aggregeringen er ændret i nærvær af serotonin. Ændringen i partikelaggregation kan måles som et skift i absorptionsspidsbølgelængden.

Assayet viste et specifikt respons på serotonin og gav intet statistisk signifikant signal med dets metabolitter, 5-hydroxyindoleddikesyre(5-HIAA), epinephrin eller noradrenalin, når hver blev testet ved 1 µM.

Fetal bovineserum, som en efterligning af humant serum, initierede heller ikke noget signal [85]. For nylig er implanterbare aptamer-field-effect transistor (FET) neuroprober blevet udviklet til overvågning aferotoninniveauer i hjernevæv. Ultratynde In2O3 overflader af FET'er i nanoskala blev modificeret med aptamerer, og disse neuroprober muliggjorde fM serotonin detektionsgrænser in vivo med minimal biobegroning [86].

Med yderligere neuroprober vil spatiotemporale optagelser af neuralaktivitet være mulige, så hjernefunktioner kan forstås på et meget dybere niveau. Adrenalin er en katekolamin neurotransmitter med en bred vifte af fysiologiske funktioner, for hvilke unormale niveauer kan forårsage helbredsproblemer såsom arytmi, myokardieinfarkt, blod trykstigning og lungeødem.

Det er vigtigt at kvantificere cirkulerende epinephrin for at observere disse relaterede sygdomstilstande. Med dette formål blev der udviklet en kolorimetrisk detektionsmetode, baseret på interaktionen af ​​adrenalin med aptamer-funktionaliseret Au-NP. Systemet er billigere og mere specifikt end andre teknikker til kvantificering af epinephrin, såsom ved væskekromatografi og spektrofotometri.

En detektionsgrænse på 0,9 nM blev også bestemt ved UV-visiblespectroscopy, som er den laveste detektionsgrænse, der er registreret for adrenalin ved brug af en kolorimetrisk metode. Analoger af epinephrin, 3,4-dihydroxyphenyleddikesyre (DOPAC),tryptophan, ascorbinsyre, dopamin, tyrosin og homovanillinsyre, viste meget lidt eller ingen respons, hvilket indikerer en høj specificitet af aptasensoren [87].

En ændring i niveauet af en enkelt neurotransmitter kan indikere en hvilken som helst af flere sygdomme, hvilket gør det meget usandsynligt, at en sygdomsdiagnose kan opnås baseret på temamåling af en enkelt neurotransmitter. Derfor vil de fleste aptasensorers evne til at blive integreret i en multipleks platform resultere i diagnostiske værktøjer, der er bedre egnet til klinikker og med potentiale til at understøtte mere nøjagtige sygdomsidentifikationer.

2.3. Biomarkør påvisning
En biomarkør er ethvert stof, struktur eller proces i kroppen, der enten resulterer i et resultat eller indikerer tilstedeværelsen af ​​en specifik sygdom. Mange biomarkører er stoffer, der kan måles i biovæsker som blod, spyt og urin.

Hovedproblemet med karakterisering af biomarkører for neurologiske sygdomme er blod-hjerne-barrieren (BBB), som mange molekyler, herunder mange proteiner, ikke kan passere igennem. Selvom proteiner er de dominerende biomarkører for visse sygdomme, er det mere sandsynligt, at små peptider, såsom neuropeptid Y eller fragmenter af proteiner, passerer gennem BBB og bliver opdaget i kredsløbet.

Metabolitter er en anden vigtig gruppe af biomarkører for neurologiske lidelser. NeoVentures Biotechnology Inc. har udviklet en aptamer-selektionstilgang kaldet FRELEX, som tillader udvælgelse af aptamerer baseret på konkurrence mellem et kortoligonukleotid knyttet til en overflade og målet. Ligesom for celle-SELEX og andre former for strukturskiftende SELEX, kan denne protokol udføres med en prøve, der indeholder en blanding af komponenter uden forudgående kendskab til det eller de mål, som aptamerer vil blive udvalgt til.

Med disse former for SELEX udføres modudvælgelser med særlige undersæt af komponenter for at drive udvælgelsen af ​​aptamerer, der opfylder de ønskede specificiteter. Ved hjælp af FRELEX blev aptamerer udvalgt mod serum fra transgene mus, der overudtrykte det humane tau-protein.

For at drive aptamer-selektion mod human tau og konsekvenserne af tau-overekspression blev serum fra vildtypemus brugt i modselektionen. Gruppen identificerede de berigede aptamer-sekvenser ved hjælp af NGS og karakteriserede visse aptamerer for transgene mus i sent stadium og vildtype-mus ved at sammenligne deres relative mængder.

De antog, at forskellen i overflod afspejler deres respektive koncentration af epitoperne (øget som reaktion på tau-overekspression), som aptamererne kan interagere med [29].

3. Diagnostiske og terapeutiske applikationer

Neurodegenerative sygdomme (ND'er) involverer degeneration af neuroner i hjernen, der resulterer i tab af strukturer og funktioner i centralnervesystemet. ND kan være forårsaget af aldring, genetiske og miljømæssige faktorer.

Demens er en af ​​de mest almindelige aldersrelaterede ND'er, ligesom Alzheimers sygdom (AD). Parkinsons sygdom (PD) kan skyldes genetiske mutationer og/eller miljøgifte. Amyotrofisk lateral sklerose (ALS), multipel sklerose (MS), Huntingtons sygdom (HD) og prionsygdomme er andre almindelige ND'er med genetiske forbindelser.

Desværre er hverken effektive helbredelser eller tidlige detektionsstrategier tilgængelige for disse sygdomme. Ligesom de meget udbredte antistoffer er aptamerer blevet attraktive midler at anvende til at udvikle nye biosensorer til tidlig diagnose af ND'er og helbredelse af disse sygdomme [88].

3.1. Alzheimers sygdom

Som en aldersrelateret progressiv hjernesygdom, der resulterer i mentale mangler, er AD den mest almindelige form for demens. Dets patologi er karakteriseret ved aggregeringen af ​​amyloid-(A) afledt af amyloid-precursorproteinet (APP) og initieret i hjerneregionen af ​​hippocampus.

Selvom videnskabsmænd antog, at A-induceret neurotoksicitet var korreleret med uopløselige A-plakker (AP) og fibriller (AF), tyder nylige beviser på, at opløselige A-oligomerer (AO) også er forbundet med AD-debut.
Derfor er AO blevet identificeret som en attraktiv biomarkør til tidlig diagnose af AD, og ​​A og tau betragtes som væsentlige terapeutiske mål til behandling af AD [89].

3.1.1. AD Diagnostik

Tidligt beskrevne aptamerer mod AO havde lave affiniteter og specificiteter, men senere undersøgelser var mere vellykkede med at identificere aptamerer, der selektivt genkendte fibriller af en 40-restform af A (A 40) men ikke A 40-polymerer [90].

Imidlertid manglede aptamererne høj specificitet for A40-fibriller i forhold til fibrillerne af adskillige andre amyloidogene proteiner, der blev testet. En DNA-aptamer udvalgt til at interagere med -synuclein (-syn) oligomer med 68-nM affinitet blev også vist at binde AO med 25-nM affinitet [91]. I 2019, ved hjælp af de samme aptamerer opnået af Tsukakoshi et al., blev en etiketfri elektrokemisk aptasensor udviklet til mere specifik genkendelse af AO [92].

Aptameren selvsamler ongold stangelektroder via thiol (-S) interaktion, og systemet har en detektionsgrænse på 30 ppm, bestemt af EIS. Dette var den første aptasensor, der med succes blev brugt til at overvåge A-proteinaggregation baseret på EIS, hvilket var muligt på grund af aptamerens høje selektivitet blandt A-arter. Med nem fremstilling og effektiv regenerering kan denne aptasensor være et lovende diagnostisk værktøj til tidlig påvisning af AD og til at demonstrere A-proteinakkumulering [92].

En aptasensor til påvisning af A-oligomerer blev udviklet under anvendelse af -syn DNA-aptameren [91] i kompleks med methylenblåt (MB) og bundet til nanoporøst anodicalumina. Den høje absorptionskoefficient på MB for hvidt lys resulterede i en lav intensitet af reflekteret hvidt lys.

I nærvær af A-oligomerer dissocierede aptamer/MB-komplekset, og stigningen i reflekteret lys blev detekteret ved interferometrisk reflektansspektroskopi (IRS) [93]. Aptasensoren havde en detektionsgrænse på 8 pM og en god respons på A-oligomererne i koncentrationsområdet fra 0,5 til 50 nM. Neurofibrillære sammenfiltringer (NFT'er) er patologiske kendetegn for AD.

Dannelsen af ​​NFT'er initieres i hippocampus, og omfanget af NFT-dannelse er forbundet med sværhedsgraden af ​​demens i AD. Hyperphosphorylering af det mikrotubuli-associerede protein, tau fremmer dets evne til at rekruttere og organisere normal tau i filamenter, som bliver til NFT'erne. Således foreslås hyperphosphorylering af tau som en af ​​hovedårsagerne til AD.

Ud over dets normale roller i at fremme mikrotubuli-samling og stabilisering af de samlede mikrotubuli, blev tau observeret ved ikke-ligevægt kapillærelektroforese (CE) for at binde tre tilfældigt udvalgte ssDNA-oligonukleotider, hvoraf den ene, ssDNA1, bundet til tau381 med høj{ affinitet (Kd-affinitet) 3}} nM) [94].

Et aptamer/antistofsandwich-assay blev udviklet ved hjælp af ssDNA1 til at detektere femtomolære koncentrationer af protein i humant plasma ved overfladeplasmonresonans (SPR) [95].

I en anden undersøgelse blev DNA-aptamerer udvalgt mod hele tau-proteinet på 441 aminosyrer (tau441) ved en hurtig selektionsteknik baseret på kapillærelektroforeseopdeling med tre selektionsrunder gennemført på en enkelt dag. Fem aptamerer valgt blandt resultaterne for høj gennemløbssekventering blev evalueret af SPR for deres tau-genkendelsesevne.

Det analytiske potentiale af aptameren med højere affinitet blev demonstreret ved en homogen-fasefluorescens anisotropi assay. Denne højaffinitetsaptamer bandt tau441-protein og de kortere isoformer, tau352, tau381 og tau383 med detektionsgrænser på henholdsvis 28 nM, 6,3 nM, 3,2 nM og 22 nM i dette assay [96].

3.1.2. AD Terapeutik

Som en af ​​de potentielle terapier blev RNA-aptamerer udvalgt til at inhibere A40-aggregation. Under selektion blev en A-oligomer konjugeret til guldnanopartikler (A-AuNP'er), og to aptamerer blev identificeret som aptamer-kandidater efter SELEX.

The Kids of the 10–20 nM. Disse aptamerer hæmmede A-plak og fibrildannelse som afsløret ved transmissionselektronmikroskopi og en A 40 enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) [97].

Alkoholdehydrogenase (ABAD) lokkepeptid (DP), som interagerer med A , antagoniserer A-peptidets cytotoksicitet. ABAD-DP-sekvensen blev indsat mellem to thioler, der danner en disulfidbinding i thioredoxin (TRX) for at skabe TRX1-ABAD-DP-TRX2-peptidaptameren. Dets stabile ekspression i NIH 3T3-celler under anvendelse af adeno-associerede vira blev verificeret med immunfluorescerende farvning.

Den udtrykte aptamer kunne binde A-peptidet og forbedre cellelevedygtighed. Denne undersøgelse bekræftede den effektive hæmning af den cytotoksiske virkning af A-peptid af peptid-aptamerer [98]. Tau-proteiner associerer normalt med og stabiliserer mikrotubuli, men deres hyperphosphorylering kan resultere i proteinaggregater kaldet "tauopati", som er giftigt.

DNA-aptamer Tau-1, som blev udvalgt mod den humane tau441, hæmmer Tau1-oligomerisering in vitro [99]. Denne hæmning blev også valideret i cellekulturstudier ved hjælp af HEK293-celler [100]. Beta-sekretase (BACE1) spiller en rolle i A-produktion, og hæmning af BACE1-ekspression er dødelig hos mus. Behandling for AD kan involvere BACE1-modulation.

Imidlertid gør dets store aktive sted BACE1 til et udfordrende mål for hæmmere af små molekyler. For at omgå dette kan nukleinsyreaptamerer være nye værktøjer til at hæmme BACE1-aktivitet. Dette enzym har en cytoplasmatisk hale, B1-CT, der tjener som et dockingsted for proteiner såsom kobberchaperonen for superoxiddismutase-1 (CCS) og ADP-ribosyleringsfaktorbindende (GGA1)-protein.

Den fysiologiske rolle af B1-CT er stort set ukendt. RNA aptamerstargeting B1-CT bandt den membran-proksimale halvdel af C-terminalen af ​​BACE1 forhindrede CCS-rekruttering, mens det tillod GGA1-binding til BACE1 og regulerede BACE1-transport til genbrugsendosomer [101].

For specifikt at målrette BACE1 blev DNA-aptamererne, BI1 og BI2, genereret mod BACE1, som hæmmede BACE1, men hverken alfa- eller gamma-sekretase. Ved hjælp af en stabilt transficeret HEK293-cellelinje udtrykte de amyloidproteinprecursoren (APP), og ved hjælp af en in vitro fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) assay viste de, at A-niveauet var reduceret, og cellulær mangel blev reddet i en primær dyrket neuronalcellelinje [102]. Aptamer-effektiviteten blev yderligere forbedret ved tilsætning af cholesteryltetra-ethylenglycol (TEG).

3.2. Parkinsons sygdom

Parkinsons sygdom (PD) er den næsthyppigste neurodegenerative sygdom, som påvirker omkring syv millioner mennesker globalt. Selvom det er en progressiv sygdom karakteriseret ved motoriske og ikke-motoriske egenskaber, har den betydelige kliniske virkninger på patienter på grund af deres tab af mobilitet og muskelkontrol.

Tab af striatale dopaminerge neuroner og neuronalt tab i ikke-dopaminerge områder karakteriserer PD. Tab af neuroner er generelt forbundet med karakteristisk Lewy-legemedannelse. Tilstedeværelsen af ​​Lewy-legemer indeholdende -syn-oligomerer i hjernen betragtes således som et muligt terapeutisk og diagnostisk mål for PD.

3.2.1. PD diagnostik

Den første aptamer, "M5-15", udvalgt mod -syn manglede specificitet for oligomerer og kunne også binde til -syn-monomerer [103]. DNA-aptamerer, der derefter blev udvalgt, viste sig at interagere med -syn-oligomerer og ikke -syn-monomerer, men bandt A 1-40-oligomerer.

Forskerne undersøgte også aptamerens specificitet for -syn-oligomerer i forhold til andre proteiner med strukturer, der overvejende er -sheet, såsom -sheet propelstrukturen af ​​pyrroloquinolin quinin glucose dehydrogenase (PQQH), og demonstrerede, at aptameren ikke bandt PQQH sort [91]. af aptasensorer er blevet rapporteret at være i stand til at kvantificere -synoligomerer.

En kolorimetrisk aptasensor, der anvender en DNA-aptamer mod -synoligomeren, blev adsorberet til guldnanopartikler (AuNP'er), hvilket forhindrede salt-induceret aggregering af nanopartiklerne. Dens binding til -syn-oligomeren forhindrer absorptionen af ​​aptamer på overfladen af ​​AuNP'er, hvilket tillader aggregering af AuNP'er at blive udløst i høje saltkoncentrationer og resulterer i en farveændring.

Dette system blev rapporteret med en LoD på 10 nM. Serum (selv ved 2%) bidrog imidlertid til at absorbere forbindelser inden for farveændringsområdet i assayet og interfererede med den saltafhængige aggregering af aptamer-Au-NP'erne.

Aptasensorer, der brugte EIS og SPR, var mere følsomme med LoDs på henholdsvis 1 pM og 8 pM [104]. En EIS-aptasensor blev fundet meget specifik for oligomerer over monomerer og ikke påvirket af tilstedeværelsen af ​​serum [104]. Et omfattende design for en elektrokemisk aptasensor til at detektere -syn-oligomer involverede en hybrid dannet af den komplementære sekvens til en -syn-oligomer aptamer bundet til en guldoverflade gennem en thiolbinding og inkluderede terminal deoxynucleotidyltransferase (TdT) og dTTP for at forlænge aptamerens 30 ender og dens supplere med yderligere polyp.

Det udvidede ssDNA bandt methylenblåt og fremmede dets tilknytning til guldoverfladen og skabte derved et elektrokemisk signal. Derudover indeholdt systemet exonuklease I (Exo I), som er specifik for ssDNA. Når aptameren blev fjernet fra det binære kompleks med dets komplement ved dets binding til -syn-oligomeren, blev de komplementære strenge fordøjet af Exo I, hvilket forhindrede akkumulering af methylenblåt ved guldoverfladen og reducerede dermed det elektrokemiske signal.

Detektionsgrænsen var 10 PM (S/N=3) og genvinding af signalet i nærværelse af 10 % og lavere koncentrationer af serum var meget acceptabelt 95,3-107 % [105]. Dets kompleksitet og inkorporeringen af ​​enzymer gør imidlertid, at dette system er mindre tilbøjeligt til at være stabilt til opbevaring og reproducerbart i felten. En kombination af kapillær elektroforese-massespektrometri (CE-MS) med fastfaseekstraktion (SPE) for at prækoncentrere målet med en aptamer-modificeret mikropatron i en stor mængde injicerede prøver reducerede detektionsgrænsen 100-fold sammenlignet med CE-MS-systemer.

I dette nye system renses prøven, og volumen minimeres for forbedret analyse ved brug af en mikropatron, der selektivt fastholder målet. En aptamer affinitet (AA) sorbent i patronen blev fundet at være et bedre alternativ til et antistof -baseret immunoaffinitet (IA) sorbent, da de baggrundselektrolytter, der kræves for at skylle systemet, også denaturerer antistofferne.

Udviklingen af ​​en AA-SPE-CE-MS blev opnået ved at modificere mikropatronen med M5-15 DNA-aptameren. Systemet demonstrerede en LoD på 2,8 nM og havde et lineært detektionsområde mellem 7 og 140 nM af -syn i blodprøven.

Også identifikation af frie og N-acetylerede -syn-proteoformer var mulig som et resultat af MS's meget nøjagtige massedetektion og opløsningsevne. Endelig blev mikropatronen fundet stabil selv med surt BGE og kunne bruges til omkring 20 analyser med en lav chance for fejlagtig kvantificering af målet [106].

For more information:1950477648nn@gmail.com