En effektiv metode til behandling af nyrefibrose

for flere oplysninger:ali.ma@wecistanche.com

Del Ⅰ: Endoplasmatisk retikulumprotein TXNDC5 fremmer nyrefibrose ved at fremtvinge TGF-signalering i nyrefibroblaster

Yen-Ting Chen, Pei-Yu Jhao & et al.

Introduktion

Nyrefibrose, karakteriseret ved tubulointerstitielfibroseog glomerulær sklerose, er en almindelig patologisk manifestation af de fleste, hvis ikke alle, typer afkronisknyresygdomme(CKD)(1). Progressionen afnyrefibrosehos patienter med CKD fører til gradvist tab afnyrefungere, hvilket i sidste ende kan resultere i nyresygdom i slutstadiet (ESRD), der kræver dialyse ellernyretransplantation (2). Mens flere molekylære determinanter og veje har vist sig at bidrage til processen mednyrefibrose, bliver transformerende vækstfaktor-beta (TGF-) generelt betragtet som hovedregulatoren af ​​nyrefibrogenese (3). Efter en skade pånyre, bliver beskadigede tubulære epitelceller (TEC'er) standset i G2/M-fasen og udskiller store mængder TGF-, hvilket udløser aktiveringen og transformationen af ​​tilstødende nyrefibroblaster til myofibroblaster (4-6). Aktiverede myofibroblaster, kendetegnet ved ekspressionen af ​​a-glat muskel-aktin (en SMA), er meget proliferative og producerer ekstracellulære matricer (ECM)-proteiner som fibrillært kollagen, elastin, fibronectin og CCN2 (almindeligvis kendt som bindevævsvækstfaktor, CTGF)(7,8). I de tidlige stadier af nyreskade,fibroseblev initieret som en adaptiv og selvbegrænset fysiologisk respons, der hjælper med at reparere væv og opretholde strukturel integritet(9). Efter kronisk, gentagen nyreskade fortsætter aktiveringen og proliferationen af ​​myofibroblaster imidlertid, hvilket resulterer i overdreven ECM-produktion og -akkumulering, hvilket fører til tab af funktionelt nyreparenkym og i sidste ende nyresvigt (1O,11).

Klik for at Cistanche para que sirve for nyresygdom

På trods af fremskridtene inden for moderne medicin, er få kliniske terapier bevist effektive modnyrefibrose. Angiotensin-konverterende enzymhæmmere (ACEI'er) og angiotensinreceptorblokkere (ARB'er) har for eksempel vist sig at reducere proteinuri, lindrenyrefibrose, og sænke progressionen af ​​CKD (12,13). Pentoxifylline, en uspecifik fosfodiesterasehæmmer, har på den anden side vist sig at hæmme TGF- 1-induceret ECM- og CCN2-ekspression, hvilket fører til svækket tubulointerstitielfibrose(14). Brugen af ​​ACEI'er og ARB'er er imidlertid begrænset af deres hypotensive virkninger og potentielle bivirkninger såsom hyperkaliæmi. Derudover kunne hverken ACEler/ARB'er eller pentoxifyllinbehandling standse progressionen afnyrefibroseog CKD(15,16). Det er derfor bydende nødvendigt at identificere nye mediatorer eller veje, der er kritiske for patogenesen afnyrefibroseat udvikle effektive terapier mod CKD(kroniske nyresygdomme).

For nylig identificerede vi thioredoxin-domæne indeholdende 5 (TXNDC5), et ER-resident, fibroblastberiget protein med enzymaktiviteten af ​​en proteindisulfide-isomerase (PDI), som en kritisk mediator af hjertefibrose(17). Vi viste, at overdreven TXNDC5 fremmer udviklingen af ​​hjertefibrosegennem redoxafhængig hjertefibroblastaktivering og ECM-produktion. Genetisk deletion af Txndc5 forbedrer hjertefibroseog kontraktil dysfunktion induceret af agonist i mus (17). Baseret på den observerede essentielle rolle af TXNDC5 i myokardiefibrogenese, antog vi, at TXNDC5 også kunne bidrage kritisk til udviklingen af ​​vævfibrosei ikke-hjerteorganer, isærnyrefibrose.

I denne undersøgelse viste vi, at TXNDC5 var stærkt opreguleret i både humane og muse fibrotiske nyrer, specifikt i de kollagen-udskillende nyrefibroblaster. Global sletning af Txndc5 svækkede markant omfanget afnyrefibrosei flere musemodeller af nyreskade. Mekanisk viste vi, at overdreven TXNDC5, induceret af TGF- 1 via ATF6-afhængig ER-stressvej, øgernyrefibroseved at fremme nyrefibroblastaktivering/-proliferation og ECM-produktion gennem posttranslationel stabilisering og opregulering af TGF-receptor type I(TGFBR1). Det er vigtigt, at vi viste, at inducering af fibroblastspecifik deletion af Txndc5 effektivt forbedrede udviklingen og progressionen afnyrefibroseinduceret af forskellige typer skader hos mus, hvilket tyder på, at målretning mod TXNDC5 kunne være en ny og kraftfuld tilgang til behandlingnyrefibroseog bevarenyrefungere.

Figur 1. TXNDC5 var signifikant opreguleret i fibrotiske musenyrer og nyreprøver fra patienter med CKD( kroniske nyresygdomme).

(A) IHC-farvning (n=3) og (B) immunoblots (n=6) viste, at proteinekspression af TXNDC5 var opreguleret i fibrotiske musenyrer induceret af UUO eller uIRI sammenlignet med kontralaterale nyrer (CL) . Målestok: 50 μm.

(C) Kvantitativ RT-PCR viste, at Txndc5-transkriptet var opreguleret i fibrotiske musenyrer induceret af UUO og uIRI (n=4-7).

(D) Reanalyser af mikroarray-data på humane nyreprøver fra patienter med CKD (GSE66494) viste, at TXNDC5, COL3A1 og FN1 var signifikant opreguleret i nyrevævet fra CKD-patienter (sund kontrol n=8, CKD n {{ 6}}). For A-C er data repræsentative for 3 eller flere uafhængige eksperimentelle replikater.

For alle paneler præsenteres data som middel ± SEM. *P < {{0}}.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" ved="" 2-sidet="" t-test="" (a–c)="" eller="" mann-="" whitney="" test="">

Resultater

TXNDC5 var signifikant opreguleret i humane og muse fibrotiske nyrer. For at undersøge den potentielle involvering af TXNDC5 i patogenesen afnyrefibrose, bestemte vi først dets proteinekspressionsniveauer i det fibrotiske musenyrevæv induceret af unilateral ureteral obstruktion (UUO), unilateral iskæmi-reperfusionsskade (uIRI) eller ved administration af folinsyre (FA). Immunhistokemiske undersøgelser afslørede markante stigninger i intensiteten af ​​TXNDC5-farvning i nyresektionerne fra alle 3 musemodeller afnyrefibrose(Figur 1A og Supplerende Figur 1A; supplerende materiale tilgængeligt online med denne artikel; https://doi.org/10.1172/JCI143645DS1). Immunoblotting og kvantitativ revers transkription PCR(RT-PCR) viste også signifikant opregulering af proteinet (figur 1B) og transkriptet (figur 1C og supplerende figur 1B) ekspressionsniveauer af TXNDC5 i fibrotiske musenyrer. I overensstemmelse med disse resultater viste reanalyse af mikroarray-data opnået fra nyrebiopsiprøver fra patienter med CKD(GSE66494)(18), at ekspressionsniveauerne for TXNDC5 (med 2,24 gange, P<0.001), as="" well="" as="" of="" markers="" for="">nyrefibrosesåsom COL3A1 og FN, var også signifikant øget i nyreprøverne fra patienter med CKD sammenlignet med dem fra raske kontroller (Figur 1D og Supplerende Figur 1C). Tilsammen antyder den observerede opregulering af TXNDC5/Txndc5-ekspression i fibrotiske humane/musenyrer og dens positive korrelation med fibrogene ECM-proteingener en potentiel rolle for TXNDC5 i patogenesen afnyrefibrose.

Figur 2. TXNDC5 var stærkt opreguleret i nyrefibroblaster, men ikke i TEC'er, endotelceller eller podocytter i de fibrotiske nyrer.

(A og C) IF-farvning af TXNDC5 (rød) på sektioner af fibrotiske nyrer induceret af UUO i Col1a1-GFPTg-mus viste, at TXNDC5 hovedsageligt blev udtrykt i kollagen-udskillende nyrefibroblaster (grøn), både i nyrebarken og medulla (n=6). Cellekerner blev farvet med DAPI (blå). Målestok: 100 μm.

(B) IF-farvning af TXNDC5 (grøn) på sektionen af ​​fibrotiske nyrer induceret af UUO i Cdh16-Cre, NPHS2-Cre og Tie2-Cre/ERT2 tdTomato-mus. Cellekerner blev farvet med DAPI (blå). Målestok: 100 μm.

(D) Et cirkeldiagram for at illustrere andelen af ​​TXNDC5 plus celler i forskellige typer nyreceller i de UUO-inducerede fibrotiske nyrer.

Data er repræsentative for 3 eller flere uafhængige eksperimentelle replikater. Data i C er præsenteret som middel ± SEM.

TXNDC5 var stærkt beriget i kollagenudskillende nyrefibroblaster i de fibrotiske nyrer. Flere typer af nyreceller er blevet impliceret i processen med nyrefibrogenese. Efter nyreskader blev residente (19) og perivaskulære (20) renale fibroblaster vist at differentiere til aktive myofibroblaster og resultere i akkumulering af ECM. TEC'er og endotelceller blev også rapporteret at bidrage til udviklingen afnyrefibrosegennem henholdsvis epitel- og endotel-til-mesenchymal overgang (10,21). For at bestemme celletyperne, hvor TXNDC5 blev udtrykt under nyreprocessenfibrose, flere reportermuselinjer, der tillader fluorescensmærkning af nyrefibroblaster(Colla1-GFP', GFP drevet af Collal enhancer/promoter, ref.22), TECs(Cdh16-Cre ROSA26- tdTomato), endotelceller (Tie2-Cre/ERT2 ROSA26-tdTomato) og podocytter (NPHS2-Cre ROSA26-tdTomato) blev udsat for UUO, uIRI eller FA behandling for at inducerenyrefibrose. Immunofluorescens (IF)-farvning af nyresektionerne fra disse dyr afslørede, at TXNDC5 var markant opreguleret og stærkt kolokaliseret med GFP-positive, kollagenudskillende nyrefibroblaster i fibrotiske musenyrer induceret af UUO (81 procent) (Figur 2, A og C) , uIRI (76,8 procent) og FA-behandling (73,4 procent) (Supplerende figur 2, A og B). I UUO-inducerede fibrotiske nyrer blev TXNDC5 kun udtrykt sporadisk i TEC'er (5,94 procent), podocytter (0.63 procent ), og endotelceller (2,05 procent ) (Figur 2, B og D). Flowcytometrianalyse af fibroblaster isoleret fra musenyrer udsat for UUO afslørede en markant udvidelse i TXNDC5* nyrefibroblaster samt en signifikant opregulering af TXNDC5 i disse celler, sammenlignet med dem fra kontralaterale kontrolnyrer (Supplerende figur 2C). Den observerede stærke berigelse af TXNDC5 i nyrefibroblaster i fibrotiske antyder, at TXNDC5 kunne bidrage tilnyrefibroseved at regulere aktiviteten/adfærden af ​​disse kollagen-udskillende fibrogene celler.

TXNDC5 var både essentiel og tilstrækkelig til at inducere aktivering, proliferation og ECM-produktion af nyrefibroblaster. Dernæst bestemte vi den funktionelle rolle af TXNDC5 i nyrefibroblaster. Primære humane nyrefibroblaster (HKF'er) stimuleret med TGF- 1(10 ng/ml) viste stærk opregulering i proteinet (figur 3A) og transskriptionsniveauer (figur 3B) af TXNDC5 såvel som af fibroblastaktiveringsmarkør periostin og ECM-proteiner (COL1Al, fibronectin og CCN2). Knockdown af TXNDC5 med shRNA svækkede signifikant TGF- 1-protein/mRNA-opregulering af periostin og flere ECM-proteiner i HKF'er (figur 3, A og B). Derudover forbedrede TGF1-behandling den proliferative aktivitet af HKF'er, som blev ophævet fuldstændigt ved TXNDC5 knockdown (figur 3D). Disse resultater tyder på, at TXNDC5 er afgørende for TGF- 1-induceret HKF-aktivering, -proliferation og ECM-produktion. Overekspression af TXNDC5 resulterede på den anden side i markant opregulering af periostin, COL1A1 og fibronectin (figur 3C) samt øget proliferativ aktivitet (figur 3E) i HKF'er. Samlet viser disse resultater, at TXNDC5, nedstrøms for TGF- 1, er både essentiel og tilstrækkelig til at fremme aktivering, proliferation og ECM-produktion af nyrefibroblaster.

Figur 3. Knockdown af TXNDC5-dæmpet TGF- 1-induceret HKF-aktivering og ECM-produktion; overekspression af TXNDC5 var tilstrækkelig til at udløse HKF-aktivering og ECM-produktion.

(A) Protein- og (B) transkriptekspressionsniveauer af fibroblastaktiveringsmarkør (periostin) og ECM-proteiner (COL1A1, fibronectin og CCN2) blev øget i kontrol (Scramble) HKF'er efter TGF- 1 (10 ng/mL) behandling. Knockdown af TXNDC5 svækkede opreguleringen af ​​disse fibrogene markører induceret af TGF - 1 i HKF'er (n=5-10).

(C) Overekspression af TXNDC5 var tilstrækkelig til at inducere opregulering af fibroblastaktiveringsmarkør (Periostin) og ECM-proteiner (COL1A1, fibronectin) i HKF'er (n=3-10).

(D) Behandling af TGF- 1 (10 ng/ml) øgede den cellulære proliferationsaktivitet af HKF'er, som blev ophævet ved TXNDC5 knockdown.

(E) Overekspression af TXNDC5 øgede den cellulære proliferationsaktivitet af HKF'er. I D og E, n=10. Data er repræsentative for 3 eller flere uafhængige eksperimentelle replikater.

For alle paneler præsenteres data som middel ± SEM. Den statistiske signifikans af forskelle for 2 grupper blev bestemt ved en 2-sidet t-test, og blandt 3 eller flere grupper blev den bestemt ved hjælp af 1-måde ANOVA, efterfulgt af Sidaks post hoc test. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p=""><>

Global sletning af Txndc5 beskyttet mod nyre b. For at bestemme kravet til TXNDC5 i udviklingen afnyrefibrosein vivo blev WT og Tndc5-/mus udsat for UUO-, uIRI- og FA-behandling. Picrosirius rød og Massons trichrome farvning på nyresektionerne viste omfattendenyrefibrosei WT-mus efter UUO (figur 4A), uIRI (figur 5A) og administration af FA (supplerende figur 3A). Global sletning af Txndc5 reducerede betydeligt omfanget afnyrefibrosei alle 3 nyreskademodeller (Figur 4A, Figur 5A og Supplerende Figur 3A).

Figur 4. Deletion af Txndc5 svækket nyrefibrose induceret af UUO.

(A) Picrosirius rød farvning (øverste 2 paneler) og Massons trichrome farvning (nederste 2 paneler) af nyresektioner fra WT og Txndc5-7mus 10 dage efter UUO. Søjlediagrammer af de kvantitative resultater af Picrosirius rød og Massons trichrome farvningsområder er vist til højre (n=5-10). Skala søjle∶ 100 μm.

(B)SHG-billeder af nyresektionerne fra WT og Txndc5-/mus 10 dage efter UUO. De kvantitative resultater af SHG-positive områder viste øget akkumulering af fibrillært kollagen (grøn) i WT, men ikke i Txndc5-musenyrer efter skade.

For hver af nyresektionerne afbildet for SHG blev TPEF-billeddannelse opnået for at vise profilen af ​​det scannede væv (rød farve i bundpaneler)(n=3). Skalalinje: 50 um. (C)Immunoblots viste proteinekspressionsniveauer af fibroblastaktiveringsmarkør (Periostin) og ECM(COL1A1) i helnyreekstraktet fra WT og Txndc5-/mus 10 dage efter UUO (n= 3-6). Data er repræsentative for 3 eller flere uafhængige eksperimentelle replikater.

For alle paneler præsenteres data som middel ± SEM. Den statistiske signifikans af forskelle mellem 3 eller flere grupper blev bestemt ved hjælp af 1-måde ANOVA, efterfulgt af Sidaks post hoc-test.**P<><>

For at kvantificere patogent fibrillært kollagen (type I og II) specifikt og for at undgå overvurdering af fibrotiske områder med traditionelle farvningsmetoder, anden harmonisk generation (SHG) mikroskopi, et nyt optisk vævsbilleddannelsessystem, der tillader visualisering af fibrillære, men ikke ikke-fibrillære, kollagen i fibrotiske organer(23,24), blev anvendt til at vurdere omfanget affibrosei WT og Tndc5 plus musenyrer efter skade. I overensstemmelse med de førnævnte resultater viste SHG-mikroskopi markante stigninger i fibrillær kollagenaflejring i WTnyrerne efter UUO (Figur 4B), uIRI (Figur 5B) og FA-behandling (Supplerende Figur 3B), hvis omfang var signifikant reduceret i Txndc{{ 4}}/ mus (figur 4B, figur 5B og supplerende figur 3B).

I overensstemmelse med det svækkede fibrotiske respons efter skade i Txndc5-musenyrer observeret ved billeddannelsesundersøgelser, mindskede deletion af Tendc5 også opreguleringen af ​​ECM-proteingener, herunder Collar, Eln, Fnl og Ccn2 i musenyrerne efter skade (Supplerende figur 3, CE). Immunoblots af helnyrevævslysater viste også reduceret proteinniveau af ECM(COLIA1) og fibroblastaktiveringsmarkør (periostin) i Txndc5-/mus sammenlignet med WT-mus efter UUO og uIRI (figur 4C og figur 5C).

Figur 5. Deletion af Txndc5-forbedret nyrefibrose induceret af ulRI.

(A) Picrosirius rød farvning (øverste 2 paneler) og Masson's trichrome farvning (nederste 2 paneler) af nyresektioner fra WT og Txndc5-7mus 28 dage efter ulRI.Søjlediagrammer af de kvantitative resultater af Picrosirius red og Masson's trichrome farvningsområder er vist til højre (n=6). Skala bar∶ 100 μm.

(B) SHG-billeder af nyresektionerne fra WT- og Txndc-5-mus 28 dage efter ulRI. De kvantitative resultater af SHG-positive områder viste øget akkumulering af fibrillært kollagen (grøn) i WT, men ikke i Txndc5-musenyrer efter skade. For hver af nyresektionerne afbildet for SHG blev TPEF-billeddannelse opnået for at vise profilen af ​​det scannede væv (rød farve i bundpaneler) (n=3). Skala bar∶50 μm.

(C) Immunoblots viste proteinekspressionsniveauer af fibroblastaktiveringsmarkør (Periostin) og ECM(COL1A1) i helnyreekstraktet fra WT og Txndc5/mus 28 dage efter ulRI (n=5-9). Data er repræsentative for 3 eller flere uafhængige eksperimentelle replikater.

For alle paneler præsenteres data som middel ± SEM. Den statistiske signifikans af forskelle mellem 3 eller flere grupper blev bestemt ved hjælp af 1-måde ANOVA, efterfulgt af Sidaks post hoc-tests.*P<><><>

For at udelukke muligheden for, at TXNDC5 udtrykt i andre nyrecelletyper såsom TEC'er, podocytter og endotelceller stadig kan bidrage til udviklingen afnyrefibrose, genererede vi Txndc5 betingede knockout-mus specifikke for TEC'er (Cdh16-cre*Txcndc5i eller Txndc5Epeko), podocytter (NPHS2-cre*Txndc5/n eller Tendc5Podxko) og endotelceller (Tie{{ 7}}cre/ERT2*Tendc5/ eller Txndc5Endo.eko). I eksperimenter med Txndc5Pieko og Txndc5 Poio-cko mus, blev Txndc5Wmus brugt som kontroller; i eksperimenter på Txndc5EMio-eko-mus blev Txndc5-deletion induceret under anvendelse af tamoxifen som beskrevet i figur 9A, hvor tamoxifen-behandlede Tie2-Cre/ERT2-mus blev brugt som kontroller. Målrettet sletning af Txndc5 i TEC'er, podocytter eller endotelceller påvirkede dog ikke omfanget afnyrefibroseinduceret af UUO eller FA (supplerende figur 6, BE). Disse resultater tyder på, at TXNDC5 udtrykt i TEC'er, podocytter og endotelceller bidrager lidt, hvis overhovedet nogen, til patogenesen afnyrefibrose.

Sletning af Txndc5 i nyrefibroblaster beskytter mod TEC-apoptose som reaktion på nyreskade. I færd med atnyrefibrose, sårede TEC'er mister mitokondriel funktion og apicobasal polaritet, efterfulgt af apoptose og celledød(30). For at undersøge, om sletning af Txndc5 påvirker apoptose af TEC'er som reaktion på skade, udførte vi TUNEL-farvning på WT og Txndc5-mus afsnit 10 dage efter UUO. Antallet af apoptotiske TEC'er steg signifikant i de UUO-inducerede fibrotiske nyrer af WT-mus, hvorimod deletion af Txndc5 svækkede omfanget af TECapoptosis. Det er blevet rapporteret, at aktiverede nyrefibroblaster kunne inducere TEC-apoptose gennem parakrine effekter (31). Fordi Tendc5 knapt udtrykkes i TEC'er, er det sandsynligt, at den reducerede TEC-apoptose observeret i Txndc5-7mus efter UUO ikke var en celleautonom effekt, men snarere sekundær til reduceret interstitielfibroseog dermed færre proapoptotiske signaler fra omgivende nyrefibroblaster. I overensstemmelse med denne hypotese svækkede fibroblastspecifik deletion af Txndc5 (Tendc5kO) TEC-apoptose i et omfang svarende til det, der blev observeret i Txndc5-/mus 10 dage efter UUO (Supplerende). I modsætning til den observerede reduktion i TECapoptose, antallet af F4/80-positive makrofager og CD31-positive endotelceller var sammenlignelige i WT- og Txndc5-musenyrer, med eller uden UUO, hvilket tyder på, at Txndc5-sletning ikke påvirker makrofaginfiltration eller peritubulær kapillær tæthed i musenyrerne. Tilsammen tyder disse data på, at de reno-beskyttende virkninger af Txndc5-deletion skyldes reduceret tubulær interstitielfibroseog TEC-apoptose uden at påvirke nyrekapillærdensiteten eller makrofager.

Induceret deletion af Tendc5 i nyrefibroblaster mindskede progressionen af ​​etableredenyrefibrose. For at bestemme, om målretning af Txndc5 i nyrerne kunne være gavnligt ved etableretnyrefibrose, Txndc5-deletion i nyrefibroblaster blev induceret i Txndc5eko-mus 10 dage efter UUO, et tidspunkt, hvor omfattendenyrefibrosekan observeres. I disse eksperimenter blev tamoxifen-behandlede Colla2-Cre-mus brugt som kontroller. Som vist havde Colla2-Cre- og Tcndc5eko-mus et lignende omfang afnyrefibrose10 dage efter UUO før tamoxifenbehandling. Elleve dage efter tamoxifen-injektion fortsatte omfanget af nyrefibrose dog med at udvikle sig hos kontrolmus (fibrotisk areal steg fra 5,1 procent til 10,6 procent), hvorimod progressionen afnyrefibrosevar næsten standset (fibrotisk område ændret fra 5,3 procent til 6,9 procent) i Txndc5eko mus. Immunblotting viste også markant svækket opregulering af CCN2, periostin og TGFBR1 i Txndc5eko-mus sammenlignet med kontrolmus mellem D10 og D21 efter UUO. Disse resultater viser, at interventionel deletion af Txndc5 i nyrefibroblaster signifikant mindsker progressionen afnyrefibrose, hvilket tyder på, at in vivo målretning af TXNDC5 kunne være en ny og kraftfuld terapeutisk tilgang til at forbedrenyrefibroseog at bremse udviklingen af ​​CKD.

KLIK HER FOR AT DEL Ⅱ