Acteosid afledt fra Cistanche forbedrer glukokortikoid-induceret osteoporose ved at aktivere PI3K/AKT/mTOR Pathway

Abstrakt

Objektiv

Glukokortikoider er meget udbredt i klinisk praksis; dog kan de give bivirkninger, som f.eksosteoporose. Acteosid(ACT) fra Cistanche er blevet brugt til at bekæmpe en række sygdomme. Undersøgelsen blev udført for at evaluere effektiviteten af ​​ACT i glukokortikoid-induceretosteoporose(GIOP) og dens potentielle mekanisme.

Metoder
Dexamethason (Dex) blev injiceret intramuskulært for at inducereosteoporosei en rottemodel, og ACT blev givet oralt. ACT blev suppleret in vivo i Dex-stimuleretosteoblastiskMC3T3-E1-celler. RT-qPCR blev udført for at vurdere mRNA-niveauerne afknogledannelse(Runx2, CoL1A1) og knogleresorption (OPG og RANKL). Et kommercielt ELISA-kit blev anvendt til at vurdere serum OC- og CTX-niveauer. Western blot blev udført for at vurdere proteinniveauer i PI3K/AKT/mTOR-signalvejen. CCK-8-assay og flowcytometri blev udført for at vurdere osteoblastlevedygtighed og apoptose.

Klik her for at få Cistanche Acteoside til behandling af Dex-stimuleret osteoblastisk

Resultater
ACT reducerede Dex-induceret knoglemikrostrukturforringelse, øgede serumniveauer af OC og reducerede niveauerne af CTX (P< 0.05). In the MC3T3-E1 cells, Dex inhibited cell viability and fremmet apoptose; denne effekt blev dog stærkt dæmpet af ACT (P< 0.05). Concurrently, ACT reversed the reduction in Runx2, osterix, CoL1A1, and OPG mRNA levels, ALP activity, and the promotion of RANKL by Dex. Additionally, ACT attenuated Dex-induced inhibition of p-AKT/AKT, p-mTOR/mTOR, and p-PI3K/PI3K protein levels by Dex (P < 0.05), while the PI3K/AKT/mTOR pathway inhibitor LY294002 diminished the potential effect of ACT (P < 0.05).

Konklusion
ACT fraCistanchekan udøve osteoprotektive virkninger ved at aktivere PI3K/AKT/mTOR-signalvejen for at lindre Dex-induceret osteoporose.

Nøgleord:Acteosid Cistancheglukokortikoider-induceretosteoporose

Introduktion
Osteoporose (OP) er en generaliseret skeletsygdom karakteriseret ved lav knoglemasse, ødelæggelse af knoglevævets mikrostruktur og ubalance i knoglehomeostase [1]. OP forårsager mere end 8,9 millioner frakturer om året, og osteoporotiske frakturer forekommer næsten hvert 3. sekund og fører til livslang invaliditet eller død [2]. Glukokortikoider (GC'er) administreres almindeligvis til behandling af ikke-infektiøse inflammatoriske sygdomme (såsom astma og inflammatorisk tarmsygdom) såvel som autoimmune tilstande [3]. Langvarig GC-brug disponerer imidlertid for mere end 30 procent af OP-tilfældene og mere end 10 procent af osteonekrose-tilfældene [4]. GC'er hæmmer direkte osteoblastproliferation og differentiering [5], mindsker modning og aktivitet og inducerer apoptose af osteoblaster, hvilket igen fører til udvikling af glukokortikoid-induceret osteoporose (GIOP) [6]. Desuden tyder voksende beviser på, at osteoblastdysfunktion er hovedårsagen til knogletab. Derfor ser en stigning i antallet og funktionen af ​​osteoblaster ud til at være hovedstrategien til forebyggelse af OP, især GIOP.

Naturlægemidler, især dem, der er baseret på naturlige forbindelser, er blevet praktiseret i tusinder af år til behandling af forskellige sygdomme [7]. Cistanche er en dyrebar urt registreret i den kinesiske farmakopé, der vokser i det sydlige område af den autonome region Xinjiang Uygur og er kendt som ørkenginseng [8]. Cistanche har vist sig at have forskellige effekter, såsom immunforstærkning, nyrebeskyttelse, anti-aldring, antioxidant, antiinflammatorisk og neurobeskyttende virkning [9].Acteosid(ACT) er et phenylethanolisk glucosid i Cistanche, som har biologiske aktiviteter, såsom hæmning af neuronal apoptose [10], lindring af leverskade [11], anti-inflammation [12], antioxidation [13] , forebyggelse af diabetes [14] og fedme [15], samt degeneration af ledbrusken [16]. Desuden har adskillige undersøgelser rapporteret farmakokinetikken af ​​ACT og bekræftet, at den terapeutiske effekt eksisterer, selvom den orale udnyttelse kun er 0,12 procent. ACT betragtes som et prodrug med aktive metabolitter in vivo [17].

Zhang et al. viste en potentiel beskyttende effekt af ACT på ovariektomi-induceret knogletab hos rotter [18]. ACT modulerer IGF-1/PI3K/mTOR-signalvejen for at forhindre knogletab hos diabetiske rotter [19]. PI3K/AKT/mTOR-vejen er blevet rapporteret at have kritiske regulatoriske roller i forskellige sygdomme, herunder GIOP [20]. Naringin lindrer GIOP ved at regulere PI3K/AKT/mTOR-signalvejen [21]. Derudover regulerer denne signalvej osteoblastdifferentiering [22], knogledannelse [23] og frakturheling [24]. Imidlertid er den potentielle rolle for ACT på GIOP, og hvorvidt den er reguleret af moduleringen af ​​PI3K/AKT/mTOR-signalvejen, ukendt.

Denne undersøgelse havde til formål at forstå de beskyttende virkninger af ACT i en GIOP-rottemodel og osteoblaster in vitro og at belyse de underliggende molekylære mekanismer.

Materialer og metoder
Forsøgsdyr
Fyrre 8-uger gamle Sprague-Dawley (SD) hanrotter med en vægt på 280-340 g blev opnået fra Shanghai Laboratory Animal Center (CAS, Shanghai, Kina). Plejeprocedurerne for forsøgsdyrene blev udført efter protokollen godkendt af The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University Animal Ethics Committee. Og undersøgelsen blev udført i overensstemmelse med ARRIVE-retningslinjerne. Dyrene blev anbragt i dyrecentre fri for patogener, 24 ± 2 grader, 12 timers lys og mørke cyklusser, 50 ± 5 procent luftfugtighed og med fri adgang til mad og vand.

GIOP model konstruktion
Efter 7 dages adaptiv fodring blev rotter tilfældigt opdelt i kontrol- og modelgrupper ved hjælp af tilfældigt tal tabelmetoden, Dexamethason (Dex, Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA) 5 mg/kg to gange om ugen i 6 uger blev injiceret intramuskulært for at inducere OP hos rotter i modelgruppen [25]. Rotter i kontrolgruppen (n = 10) blev injiceret med en tilsvarende mængde saltvand. Ingen signifikante ændringer i kropsvægt blev observeret hos rotterne i begge grupper efter 6 uger. Efterfølgende blev rotterne i modelgruppen underopdelt i modelgruppen, ACT lavdosisgruppe (Model plus ACT-L) gruppe og ACT højdosis gruppe (Model plus ACT-H) gruppe. ACT (HPLC 98 procent) blev opnået fra Baoji Herbest Bio-tech., Ltd. (Baoji, Kina) og behandlet med en vandig opløsningsmiddelsuspension. En dosis på 50 mg/kg/d og 100 mg/kg/d ACT blev administreret oralt til rotter i henholdsvis lav- og højdosisgrupperne (8 rotter pr. gruppe), og blev fortsat i 8 uger. Blandt dem blev stikprøvestørrelsen beregnet baseret på en tidligere undersøgelse [26]. I betragtning af et tosidet signifikansniveau på 0,05 [95 procent konfidensinterval (= 0.05)], 80 procent effekt og en effektstørrelse på 0,5, estimerede effektanalyse en nødvendig stikprøvestørrelse på 6 dyr pr. gruppe under antagelse af en relevant effektniveau på 30 procent osteoporose. Yderligere, med en frafaldsrate på 20 procent, blev 8 dyr pr. gruppe (i alt 32 rotter) betragtet som ideelle.

Rotteserumprøver
Efter 8 uger blev rotter bedøvet med 10 procent chloralhydrat (400 mg/kg, intraperitonealt, Solarbio, Beijing Kina), blod blev opsamlet fra abdominalaorta, størknet ved stuetemperatur og centrifugeret ved 3500 rpm/min i 10 min. Serummet blev opbevaret i 1,5 ml centrifugerør indtil videre brug.

Vurdering af knoglemineraltæthed
Knoglemineraltæthed (BMD) blev anvendt af et DAX-knogletæthedsmål for små dyr (Ranzhe Instrument Equipment Co., Shanghai, Kina). Kort fortalt blev rotterne anbragt i liggende stilling, og bagbenene blev anbragt udad. Rotternes højre lårben blev scannet i henhold til producentens anvisninger, og BMD-værdierne blev registreret [27].

Knoglemorfologisk analyse
Ved afslutningen af ​​eksperimentet blev rotterne aflivet ved intraperitoneal injektion af overskydende chloralhydrat, og lårbenene blev fikseret i 70 procent ethanol. Efterfølgende blev scanninger udført på et VivaCT 40μCT-system som beskrevet i tidligere undersøgelse og knoglevolumen/totalvolumen (BV/TV), knogletrabekulært antal (Tb.N), knogletrabekulær tykkelse (Tb.Tn) og knogletrabekulær separation (Tb.Sp) blev vurderet [28]. Til eutanasi blev SD-rotter bedøvet efter knoglemorfologianalysen ved en intraperitoneal injektion af 10 procent chloralhydrat (350 mg/kg).

Enzym-linked immunosorbent assay (ELISA)
Kommercielle ELISA-sæt blev brugt til påvisning af osteocalcin (OC, E-EL-R0243c, Elabscience) og C-terminal telopeptid (CTX, E-EL-R1405c, Elabscience) niveauer i serum fra rotter. Kort fortalt blev reagenserne fjernet ved 18-25 grad for at ækvilibrere og forberede opløsningen til vask og standardbearbejdning. Enzymplader Pladerne blev sat op med standard-, blank- og prøvebrønde. Ca. 100 μL prøvefortyndingsopløsning blev tilsat til brøndene, inkuberet i 90 minutter ved 37 grader og erstattet med et biotinyleret antistof i 60 minutter ved 37 grader. Efter vask blev den enzymbindende arbejdsopløsning tilsat og inkuberet i 30 min. Substratopløsningen (90 μL) blev tilsat og inkuberet i 15 minutter med beskyttelse mod lys. Da den blå gradient dukkede op i standardbrøndene, blev 50 μL af termineringsopløsningen tilsat, og ændringen i OD450 blev analyseret.

Omvendt transkription-kvantitativ realtids-PCR (RT-qPCR)
TRlzol LS-reagens blev tilsat til serum fra rotter og ACT-behandlede MC3T3-E1-celler, og totalt RNA blev ekstraheret ved inkubation ved stuetemperatur efterfulgt af tilsætning af chloroform. RNA-koncentration og renhed blev bekræftet ved at måle A260/280-absorbans i et Nanodrop ND-1000-spektrofotometer. SuperScript II revers transkriptase-kittet blev brugt til revers transkription af RNA til cDNA. Efterfølgende blev cDNA påført som skabelon, en primer blev tilføjet, og SYBR-Green PCR master mix kit blev blandet og suppleret med ddH2O til 20 μL, og PCR amplifikationsreaktionen blev udført ved hjælp af Applied biosystems AMI7500 Fast Real-time PCR system (ABI, CA, USA). GAPDH blev brugt som en intern reference til normalisering, og de relative ekspressionsniveauer blev beregnet ved hjælp af 2-ΔΔCt-metoden og udført i triplikater. Primersekvensen for Runt-relateret transkriptionsfaktor 2 (Runx2), kollagen type I 1 (CoL1A1), receptoraktivator af nuklear faktor-KB-ligand (RANKL), osterix og osteoprotegerin (OPG) er vist i tabel 1.

Western-blot-analyse
RIPA-lysat indeholdende 1 procent proteaseinhibitor blev tilsat til cellerne, og totalt protein fra hver gruppe blev opsamlet efter lysis af cellerne ved omrystning i 5 minutter ved 4 grader. BCA assay kit blev anvendt til at kvantificere koncentrationen af ​​proteiner i hver gruppe. Efter dette blev proteinprøverne blandet med 10 procent natriumdodecylsulfat (SDS) buffer i lige volumen og kogt i et vandbad ved 95 grader i 5 minutter til proteindenaturering. En 12% SDS-polyacrylamid vertikal gel blev fremstillet, og efter at gelen var størknet, blev der udtaget 30 ug protein til 120 mA 90 min gelelektroforeseadskillelse. Proteinet blev derefter overført til PVDF-membranen ved 90 V i 120 min. Efter forsegling med 5 procent bovint serumalbumin blev PVDF-membranen skåret baseret på molekylvægten af ​​markøren og målproteinbåndet og inkuberet med det tilsvarende primære antistof natten over ved 4 grader. Kanin polyklonale antistoffer mod p-AKT, p-mTOR og p-PI3K blev fortyndet til forholdet 1:1000 (Proteintech, Wuhan, Kina). TBST blev vasket i 30 minutter og inkuberet med det tilsvarende peberrodsperoxidase-mærkede sekundære antistof ved stuetemperatur i 1 time. Blotten blev visualiseret under anvendelse af forstærkede kemiluminescensreagenser. Tætheden af ​​proteinbånd blev kvantificeret under anvendelse af billede J. GAPDH blev anvendt som en kontrol til at beregne relative proteinniveauer.

Cellekultur og gruppering
Muse-præ-osteoblaster MC3T3-E1 blev købt fra Chinese Tissue Culture Collections (CTCC, Kina) og dyrket i -MEM indeholdende 10 procent føtalt bovint serum og 100 U/mL penicillin og 100 mg/mL streptomycin i en befugtet inkubator ved 37 grader og 5 procent CO2. Til knogledifferentieringskultur blev osteogent induktionsmedium fremstillet ved at blande 10 mM - -glycerophosphat og 50 mg/ml ascorbinsyre (Sigma-Aldrich) med -MEM og tilsat til MC3T3-E1-cellerne for at inducere deres differentiering. Mediet blev skiftet efter 3 dage. Kulturer i 14 dage blev anvendt til alkalisk phosphatase (ALP) levedygtighed. Endvidere blev celler forbehandlet med PI3K-hæmmeren LY294002 (10 μM) i 30 minutter, efterfulgt af behandling med Dex og ACT.

Cellelevedygtighedsanalyse
Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assayet blev udført for at vurdere levedygtigheden af ​​osteoblaster behandlet med ACT. MC3T3-E1-cellerne blev inokuleret i 96-brøndsplader med 5 x 103 celler/brønd. En mængde på 1 μM Dex blev overvejet baseret på tidligere undersøgelser [29] og co-inkuberet med gradientkoncentrationer af ACT (10-8, 10-7, 10-6 og 10-5 M). Dyrkningsmediet i 96-brøndpladerne blev udskiftet efter tilsætning af et blandingsmedium og CCK-8-reagens i et forhold på 10:1. Efter fortsat inkubation i 1 time ved 37 grader blev ændringen i OD450 vurderet.

Detektion af osteoblast-apoptosenummer
MC3T3-E1-cellerne, der blev udsat for forskellige behandlinger, blev fordøjet ved hjælp af EDTA-frit trypsin og opsamlet ved centrifugering. Efter vask med en 1 × bindingsbuffer blev 5 μL Annexin V-FITC tilsat og inkuberet ved stuetemperatur i 5 minutter, suppleret med 5 μL PI og ført gennem et 200-mesh nylonnet. Prøverne blev analyseret ved hjælp af FACScan flowcytometrisystem.

ALP aktivitet assay
MC3T3-E1-cellerne blev inokuleret i 24-brøndsplader, og ACT og Dex blev tilføjet efter plastering. Cellekulturmediet blev erstattet med et osteogent differentieringsmedium til dyrkning. Efter anvendelse af lysis af celler ved cellelyseopløsning (P0012J, Beyotime Biotechnology), blev supernatanten opsamlet ved centrifugering, og standardkurven blev plottet. Et ALP-kit (P0132S, Beyotime Biotechnology) blev brugt til at evaluere ALP-aktivitet, og OD450 blev beregnet.

Statistisk analyse
Efter at have udført tre uafhængige eksperimenter i tre eksemplarer blev dataene analyseret ved hjælp af GraphPad Prism 6.0-software og udtrykt som middel ± standardafvigelse. ANOVA blev brugt til at sammenligne statistiske forskelle mellem flere grupper. P-værdi < 0.05 blev betragtet som statistisk forskellig.