En Urinary Common Rejection Module (uCRM)-score for ikke-invasiv nyretransplantationsmonitorering

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Abstrakt

Et fælles afstødningsmodul (CRM) bestående af 11 gener udtrykt i allotransplantatbiopsier blev tidligere rapporteret at tjene som en biomarkør for akut afstødning (AR), korrelere med omfanget af transplantatskade og forudsige fremtidig allograftskade. Vi undersøgte brugen af ​​dette genpanel på urincellepelleten hos nyretransplanterede patienter. Urincelle sedimenter blev indsamlet fra patienter med biopsi-bekræftet akut afstødning, borderline AR (bAR), BK virus nefropati (BKVN) og stabile nyretransplantater med normal protokol biopsier (STA) blev analyseret for ekspression af disse 11 gener ved hjælp af kvantitativ polymerasekæde reaktion (qPCR). Vi vurderede disse 11 CRM gener for deres overflod, autokorrelation og individuelle ekspressionsniveauer. Ekspression af 10/11 gener var forhøjet i AR sammenlignet med STA. Psmb9 og Cxcl10 kunne klassificere AR versus STA lige så præcist som 11-genmodellen ( følsomhed=93,6 procent ,specificitet=97,6 procent). Au CRM-score, baseret på det geometriske gennemsnit af udtryksniveauerne, kunne skelne AR fra STA med høj nøjagtighed (AUC= 0.9886) og korrelerede specifikt med histologiske mål for tubulitis og interstitiel inflammation snarere end tubulær atrofi, glomerulosklerose, intimal proliferation, tubulær vakuolisering eller akut glomerulitis. Denne uringenekspressionsbaserede score kan muliggøre non-invasiv og kvantitativ overvågning af AR.

VIRKNINGER AF CSITANCHE: ANTI-INFLAMMATORISK

Introduktion

Nyretransplantation (KTx) er den foretrukne modalitet til behandling af nyresygdom i slutstadiet (ESRD) uanset årsag [1]. Selvom denne terapeutiske tilgang er blevet en rutinemæssig praksis på verdensplan, hvilket væsentligt forbedrer patientens livskvalitet og overlevelse[2], er langsigtede nyre-allograft-resultater ikke forbedret som forventet på trods af en bedre forståelse af immunbiologien af ​​allotransplantatafstødning og fremkomsten af ​​nye og mere potente immunsuppressive midler [3]. Den væsentligste årsag til vedvarende og dårlig transplantatoverlevelse er manglende evne til non-invasivt at kvantificere byrden af ​​transplantatimmunskade og forudsige akut afstødning forud for væsentlig funktionsnedgang og histologisk skade. Selv om det er velkendt, at KTx-patienter kontinuerligt udsættes for immun- og ikke-immune relaterede skader [4, 5], er periodisk KTx-monitorering afhængig af ufølsomme surrogatmarkører for allograft-dysfunktion såsom serumkreatinin (6, Z] og sporadisk KTx-overvågning er baseret på protokol allotransplantatbiopsier til at påvise subklinisk histologisk transplantatskade i fravær af forstyrrelse af serumkreatinin[8]. Selvom vurdering af transplantatdysfunktion kun baseret på serumkreatinin har følsomhed for ikke-specifik, etableret allotransplantatskade, det har lav specificitet for diagnosen akut afstødning (AR), da en stigning i serumkreatinin kan skyldes andre årsager, der ikke er direkte relateret til allotransplantatafstødning, såsom immunsuppressiv (IS) lægemiddelrelateret nefrotoksicitet, akut tubulær nekrose, infektion og interstitiel fibrose og tubulær atrofi (IFTA), mens brugen af ​​overvågningsbiopsier er blevet postuleret som guldstandardværktøjet til diagnosticering af al lograft læsioner, denne tilgang er dyr, invasiv, med proceduremorbiditet (risiko for blødning; procedure, der kræver sedation, især for pædiatriske KTx-patienter)[9], fyldt med inter-operator læsevariabiliteter og ofte dårligt repræsentativ for fokal histologisk skade. Derfor er brugen af ​​ikke-invasive biologiske markører, der nøjagtigt kan forudsige og kvantificere byrden af immunskade i allotransplantatet ville være et væsentligt fremskridt for præcis KTx-monitorering [10-12].

Undersøgelse af proteomiske, RNA- og mikroRNA-biomarkører i urinen hos KTx-patienter er blevet påvist af vores grupper og andre[13-17] at være en optimal biologisk væske til seriel overvågning af nyre-allotransplantatet, fordi det er et ultrafiltrat af nyre og afspejler de biologiske processer og inflammatorisk belastning, der findes i nyretransplantatet [18]. På trods af en række undersøgelser, der tidligere har evalueret urinbiomarkører som en ikke-invasiv diagnostisk tilgang til analyse af AR ved nyretransplantation, er det eksklusive fokus på enkelte biomarkører såsom særlige kemokiner og receptorer såsom CXCR3, CXCL9 eller CXCL10 [{{ 6}}] gør det vanskeligt at fange den molekylære kompleksitet og heterogenitet af AR på tværs af forskellige KTx-patienter. At fange denne heterogenitet er afgørende for at kvantificere skadesbyrden på en måde, der er anvendelig til prospektiv overvågning af AR og genopretning af graftskade efter terapeutisk intervention [25, 26].

I denne undersøgelse anvender vi den viden, der er opnået ved at udnytte en fælles afvisningsmodul (CRM) af 11 gener [27], oprindeligt udviklet ved hjælp af udtømmende meta-analyse af offentligt tilgængelige transplantationsvævsmikroarray-datasæt af biopsiprøver fra fire forskellige typer faste stoffer organer. CRM-generne i væv (tCRM) blev alle overudtrykt blandt AR-patienter, uanset typen af ​​organ, forskelle i immunsuppressionsprotokoller eller forskelle i de platforme, der forhørte genekspression. En kvantitativ tærskel bestemt ved beregningsmæssig analyse af en kombineret gen-score (tCRM-score) forudsagde nøjagtigt tilstedeværelsen af ​​AR ved krydsvalidering af vævsgenekspressionssignaturer i 8 uafhængige kohorter (n= 236 prøver) af human nyre-allotransplantat biopsier[27]. tCRM-scoren blev yderligere valideret af qPCR i en separat undersøgelse af KTx-biopsiprøver som diagnostisk for både AR og kronisk allograft-skade (CAl) med forskellige gensæt-tærskler [28]. Desuden blev dette sæt af CRM-gener valideret i et uafhængigt sæt af biopsieret væv fra lungetransplantationspatienter med kronisk lunge-allograft-dysfunktion (CLAD) [29].

I denne undersøgelse vurderer vi CRM-gensættet til brug på urinprøver fra KTx-patienter, parret med allograft-biopsier med kendt histologi, til den ikke-invasive diagnose af AR og andre immunmedierede skader. Yderligere udvikler vi en urin CRM(uCRM)-score, der præcist skelner mellem STA- og AR-patienter. Vi evaluerer det kliniske potentiale af denne score i påvisningen af ​​bAR ved at korrelere denne score med histologisk score for tubulitis og interstitiel inflammation.

VIRKNINGER AF CSITANCHE: FORBEDRE IMMUNITET

Materialer og metoder

Urinprøver og studiekohorten

Biobank-urinprøver (n=1760) fra KTx-modtagere, der var tilmeldt Stanford University mellem 2000 og 2011, og UCSF Medical Center, der var tilmeldt mellem 2014 og 2016, blev inkluderet i undersøgelsen. Undersøgelsen blev godkendt af Institutional Review Board og Ethics Committee ved University of California San Francisco, CA. Alle patienter gav skriftligt informeret samtykke til at deltage i forskningen i fuld overholdelse af Helsinki-erklæringen. De kliniske og forskningsmæssige aktiviteter, der rapporteres, er i overensstemmelse med principperne for Istanbul-erklæringen som skitseret i Istanbul-erklæringen om organhandel og transplantationsturisme. For urinprøver, der blev brugt til at bestemme uCRM-tærsklen for AR, blev 178 urinprøver identificeret med parrede nyre-allotransplantatbiopsier med klart definerede patologier af enten Banff-graderet AR[30,31] eller ingen skade/stabile(STA)-transplantater (Eig 1). Derudover evaluerede vi også signaturen for uCRM-assayet i BK viral nefropati, som er en vigtig konfounder for diagnosen AR og ofte viser sig med betydelig inflammation på allotransplantatbiopsien. Samlet set blev 28 prøver kasseret på grund af QC-problemer relateret til lavt indhold og RNA af dårlig kvalitet, hvilket resulterede i en endelig optælling på 150 urinprøver fra 150 individer til tværsnitsanalyse af immunmedieret KTx-skade. Hver urinprøve blev matchet med en biopsi på tidspunktet for urinopsamling, som blev evalueret af en central patolog ved Stanford University (Richard Sibley) eller ved UCSF (Zol-tan Laszik).

Patientkarakteristika

150 unique urine samples were assessed for the uCRM assay in 150 unique kidney transplant patients. Baseline clinical and demographic variables by AR, bAR, BKVN, or STA phenotype are shown in Table1, There were no significant differences between the groups in the demographic variables, except in recipient age (p= 0.025) and in donor-source (p=0.0008). These samples were used in cross-sectional analyses for modeling of gene expression data and subsequent development and validation of the uCRM threshold for biopsy-proven AR. Samples were collected from both pediatric (n=94) and adult (n=56)patients to enable a model-independent of recipient age or baseline immunosuppression. Based on the matched biopsy diagnosis, urine samples were categorized in the following categories: AR(n=64;45 biopsies met criteria for Banff confirmed AR with >i2,t2, and infiltration by >4 mononukleære celler /rørformet tværsnit, hvorimod 19 opfyldte kriterier for borderline AR med il/i2 og t0/t1 og infiltration af 1-4 mononukleære celler/rørformet tværsnit), STA (n { {8}}), BK-virus nefritis(n =43), Patienterne modtog en calcineurin-hæmmer ILS-kur baseret på tacrolimus og mycophenolatmofetil, med eller uden steroider, og induktionsterapi enten med Thymoglobulin eller anti-IL{{ 12}} receptor monoklonalt antistof (daclizumab eller basi. infliximab)[32]. Urinprøver blev taget i gennemsnit 731 dage efter transplantationen (interval 169-1335 dage).

Definition af skadesfænotyper

All kidney biopsies were blindly and centrally analyzed at each institution by staff pathologists (RS and ZL)and were graded by the Banff dassification[31,33] for acute rejection.Intragraft C4d stains were performed [34] to assess for acute humoral rejection(AHR)[35]. Transplant injury was defined as>20 procent stigning i serum-kreatinin fra dets tidligere steady-state baseline-værdi og en tilhørende biopsi, der enten var klassificeret som AR eller BKVN.AR, blev defineret som minimum ifølge Banff-skemaet en tubulitis-score større end eller lig med 1 ledsaget af en interstitiel inflammationsscore Større end eller lig med 1 med både Cd og DSA negative. Både Tcell-medieret AR (TCMR) og antistof-medieret afvisning (ABMR) tilfælde blev induceret, selvom alle observerede ABMR tilfælde havde en blandet fænotype af TCMR og ABMR, da overholdelse af ren ABMR sjældent observeres i lavrisiko, usensibiliserede kohorter. Borderline ændringer (bAR) blev observeret i nogle tilfælde af TCMR, karakteriseret ved infiltration af mononukleære celler (<25% of="" the="" parenchyma)or="" foci="" of="" mild="" tubulitis(1-4="" mononuclear="" cells/tubular="" cross-section),="" and="" for="" purposes="" of="" molecular="" correlation="" analysis,="" these="" have="" been="" shown="" as="" bar,="" as="" the="" burden="" of="" histological="" inflammation="" was="" overall="" lower="" for="" these="" biopsy="" samples.="" bkvn="" was="" defined="" as="" the="" positivity="" of="" polyomavirus="" pcr="" in="" peripheral=""><1000-28,800,000), together="" with="" a="" positive="" sv40="" stain="" in="" the="" concomitant="" renal="" allograft="" biopsy.="" normal="" (sta)="" allografts="" were="" defined="" by="" an="" absence="" of="" significant="" injury="" pathology="" on="" the="" 6-month="" protocol="" biopsy,="" as="" defined="" by="" banff="" schema,="" stable="" graft="" function,="" no="" proteinuria,="" and="" no="">

Fig. 1. Prøveudvælgelse og undersøgelsesskema over undersøgelsen. 1.760 urinprøver blev indsamlet mellem 2000 og 2016,

hvoraf 643 havde matchende biopsidata. 178 af disse 643 havde veldefinerede fænotyper af AR, bAR, BKVN eller STA.

Efter RNA-ekstraktion, cDNA-syntese og qPCR-kvantificering bestod 28 prøver ikke QA/QC, hvilket efterlod 150

prøver til statistisk analyse og modellering.

Urinopsamling, behandling, total RNA-ekstraktion, cDNA-syntese og qPCR

Urin (50 ml; steril beholder) blev opsamlet fra nyretransplanterede patienter før biopsiproceduren og før enhver intensivering af behandlingen for AR. RNA blev ekstraheret fra urincellesediment efter vores tidligere rapporterede protokol [36]. Kort sagt blev urinceller opnået ved at centrifugere 50-mL urinprøven ved 2000xg i 20 minutter. RNA blev ekstraheret fra urincellepelleterne ved hjælp af RNeasy Plus Micro Kit (Qiagen, Valencia, CA). RNA-kvaliteten blev vurderet med NanoDrop ND-2000-spektrofotometeret (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) med et forhold på 260/280. cDNA-syntese blev udført under anvendelse af 50 ng ekstraheret RNA under anvendelse af SuperScript VILO"Master Mix (Invitrogen, Carlsbad, CA). qPCR blev udført på cDNA syntetiseret fra 50 ng totalt RNA, derefter blev 1,56 ng cDNA behandlet gennem specifik målamplifikation og prøve fortynding med de poolede Taqman-assays for 1 l uCRM-generne i multiplex, med Taqman PreAmp Master Mix(ABI) til 5 ul slutvolumen, i 18 cyklusser i en termisk cycler, derefter fortyndet med DNA Suspension Buffer (TEKnova, CA). Mikrofluidisk qPCR blev udført på de 96,96 dynamiske arrays (Fluidigm, South San Francisco, CA) ved hjælp af 2,25 ul af den fortyndede prøve fra specifik målamplifikation, sammen med Taqman Assays(ABI) for hvert gentranskript (S1Tabel), Taqman Universal master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) og Loading Reagent (Fluidigm), ved at prime og indlæse chippen via HX IFC-controlleren og udføre qPCR i BioMark (Fluidgm)-systemet. Den relative mængde af RNA-ekspression blev beregnet ved hjælp af en sammenlignende cy. cle threshold(CT) metode. Ekspressionsværdier blev normaliseret til 18Using ribosomalt RNA endogen reference og universel RNA (Agilent Inc., Santa Clara, CA).

Statistik

Alle qPCR-assays blev kørt i duplikater. Alle data er præsenteret som middel ± SEM. Til sammenligning af CRM-generne pr. fænotype blev der brugt en mixed-effects-model med Geisser-Greenhouse-korrektionen, med flere sammenligningskorrektioner udført ved hjælp af to-trins lineær-trins-proceduren fra Beniamini, Krieger og Yekutieli. Pearson-korrelation og hierarkisk støvning blev udført i Morpheus (Broad Institute). For maskinlæringsforudsigelsesmodeller blev dataene opdelt i et træningssæt (80 procent) og et testsæt (20 procent). En beslutningstræklassificeringsmodel, valideret på testsættet, blev brugt til at bestemme den mest nøjagtige uCRM-score-cut-off. Variabel udvælgelse ved hjælp af tilfældige skove (VSURF) blev brugt til at klassificere AR ys STA samt til at evaluere og rangordne individuelle geners betydning. Outputtet af Random Forest variabel vigtighed er defineret som den gennemsnitlige procentvise reduktion af unøjagtighed af modellen af ​​variablen (genet) blev udelukket (tilfældigt permuteret) fra modellen. Uovervåget afstøvning for at visualisere fænotypeadskillelse blev udført ved hjælp af en distribueret stokastisk naboindlejringsalgoritme(t-SNE) i Mathematica 11.3 (Wolfram Research, Champaign. IL). Netværksanalyse af CRM-generne blev udført ved hjælp af GeneMANIA [37]. Statistik over demografiske variabler blev udført ved hjælp af Chi-kvadratanalyser for diskrete og Kruskal-Wallis-testen for kontinuerte variable i IMP 14.2 (SASInstitute, Cary, NC). Medmindre andet er angivet. alle andre analyser blev udført og visualiseret med Prism 8.0.1 (GraphPad, Carlsbad, CA).

Studiegodkendelse

Undersøgelsen blev godkendt af de etiske udvalg på både Stanford University Medical School og UCSF Medical Center. Alle voksne patienter og forældre/værger til ikke-voksne patienter gav skriftligt informeret samtykke til at deltage i forskningen i fuld overensstemmelse med Helsinki-erklæringen. De kliniske og forskningsmæssige aktiviteter, der rapporteres, er i overensstemmelse med principperne for Istanbul-erklæringen som skitseret i Istanbul-erklæringen om organhandel og transplantationsturisme.

VIRKNINGER AF CSITANCHE: FORBEDRE IMMUNITET

Resultater

Baseline kliniske og demografiske variabler for alle 150 KTx-modtagere med AR-, bAR-, BKVN- og STA-fænotyper er vist i tabel 1.

Relativ overflod og korrelation af CRM-genekspression i det murine cellesediment

Relativ overflod. For at bestemme den relative overflod af CRM-gentranskripterne i urinsedimenterne blev cyklustærskelværdierne (Ct) brugt som en metrik for overflod. Jo lavere Ct-værdien er, jo højere er dens overflod blandt CRM-generne. Blandt de 11 CRM-gener var BASP1 det mest udbredte transkript i urincelle-sedimentet. BASP1 blev efterfulgt af TAP1, PSMB9 og ISG20 som de 4 øverste talrige transkripter.LCK og CD6 var blandt de mindst udbredte transkripter i urinsedimenterne i CRM-gensættet. Da Ct-værdierne varierede fra den laveste Ct-værdi på 14 til den højeste Ct-værdi på 20, var der en 64-fold forskel mellem BASP1- og CD6-gentranskripterne, hvor CD6 var det mindst udbredte transkript.

Fig. 2. Relativ overflod og korrelation af overflod af CRM-gener i urinen og ekspression af CRM-gener på tværs af forskellige kliniske fænotyper af nyretransplantation. A. Pearson-korrelationsmatrix, der viser korrelation mellem 11 CRM-gener i deres ekspression i urincellesedimenter. Størrelsen af ​​firkanten tjener som en visuel indikator for styrken af ​​korrelationen. B. Heatmap med overvåget clustering efter fænotype, der demonstrerer relativ ekspression af CRM-gener i AR, bAR, BKVN og STA. C. Violinplot, der viser fordelingen af ​​CRM-generne i AR-, bAR-, BKVN- og STA-urincellepellet. � indikerer, at AR vs STA var signifikant efter flere sammenligninger. # indikerer, at bAR vs. STA var signifikant efter flere sammenligninger. Yderligere statistik er tilgængelig i tabel 2.

Korrelation af genekspression blandt CRM-gengener.

Dernæst evaluerede vi korrelationen af ​​genekspression blandt 11 CRM-gener. Korrelationen varierede fra meget svag (r=-0.17 for CXCL9 og NKG7 og r=-0.10 CXCL10 og RUNX3) til meget stærk (r=0.77 for INPP5D og TAP1 og samme værdi for CD6 og LCK). Selvom CXCL9 og CXCL10 er i samme klasse af kemokiner, var genekspressionskorrelationen mellem dem kun moderat (r=0.46). Den grafiske præsentation af korrelationsmatricen er vist i fig. 2A. Et heatmap genereret ved hjælp af overvåget clustering demonstrerer den betydelige stigning i genekspressionsværdier af CRM-generne i AR, bAR og BKVN sammenlignet med STA-fænotype (fig. 2B).

uCRM-genekspression i urinsedimenter med biopsi-bekræftet AR og BKVN

Genekspression af CRM-gener i AR og bAR. Dernæst evaluerede vi genekspressionen af ​​hvert af de 11 CRM-gener for deres relative ekspression i AR, bAR, BKVN og STA. Et resumé af resultaterne af analysen er præsenteret i tabel 2 og fig. 2C.10 ud af de 11 gener var signifikant forøget i AR-urinsedimenter sammenlignet med urinsedimenter fra STA. Imidlertid var kun fem CRM-gener (Cd6, Cxcll0, Cxd9, Nkg7 og Psmb9) signifikant opreguleret i bAR-prøver sammenlignet med STA, og deres ekspression i bAR-gruppen var relativt lavere end i Banff-graderet AR-gruppe, hvilket fremhæver, at uCRM-generne kan afspejle den inflammatoriske byrde i allotransplantatet Eig 2C.

Tabel 2. Genekspressionsniveauer af CRM-gener på tværs af forskellige fænotyper

Genekspression af CRM-gener i BKVN. Ekspression af CD6, CXCL10, CXCL9, LCK, NKG7 og PSMB9 var differentielt reguleret i urinprøver med patienter med BKVN sammenlignet med prøverne fra STA-patienter. Ud af de seks gener med statistisk forskellige genekspressionsværdier mellem BKVN- og STA-prøver, var ekspression af kun NKG7 væsentligt lavere i BKVN-urin.

Bestemmelse af en urin CRM(uCRM) genekspressionsscore for at identificere nyretransplantatafstødning

Fordi ekspression af CRM-gensættet ikke var homogen på tværs af transplantationsfænotyperne, og der var betydelig fysiologisk krydstale mellem de forskellige gener (S1 Fig), brugte vi ikke-lineære overvågede metoder til yderligere at differentiere og klassificere fænotyper. Uovervåget klyngedannelse via t-SNE blev udført for at bestemme forhold mellem uCRM-gener og fænotyper. Fig. 3A viser t-SNE-plottet, hvilket indikerer, at de 11 CRM-gener næsten fuldstændigt kunne adskille AR fra STA-prøver. VSURF-modellen, afhængig af Random Forests-vigtighedsscorer, bestemte, at PSMB9 og CXCL10 var de to vigtigste gener til at tilfredsstille AR fra STA. Fig. 3B viser yderligere betydningen af ​​disse 2 gener. Betydningsplottet af genvægte angiver, at et af de 2 gener, hvis det udelukkes fra modellen, svarer til et omtrentligt fald på 20 procent i unøjagtigheden af ​​modellen. Disse to gener kunne klassificere AR versus STA med næsten lige så høj nøjagtighed som 1l-genmodellen med en sensitivitet på 93,6 procent og specificitet på 97,6 procent. Genekspressionstærskler for disse to gener blev bestemt af en beslutningstræklassifikator, og log-skalaværdierne for disse to gener er afbildet i Fig. 3C. En tærskel på 28 for CXCL10 og 3 for PSMB9 korrekt klassificeret 86/88 AR & STA tilfælde for en samlet nøjagtighed på 97,7 procent. Navnlig faldt bAR-prøver mellem AR- og STA-fænotyperne, hvilket tyder på gradueringen af ​​disse to gener i graden af ​​allograft-inflammation.

For at udforske klassificeringsydelsen af ​​uCRM-scoren på AR-, borderline-AR- og STA-tilfælde blev der fremstillet en beslutningstræklassificering (Fig. 4A). Beslutningstræet bestemte optimale uCRM-scoretærskler for hver fænotype. En score større end 4 korrekt klassificerede 44/49 AR-tilfælde; en score mindre end 1,8korrekt klassificerede 33/35 STA-tilfælde.14/23 grænsetilfælde lå mellem disse to tærskler. Fordelingen af ​​uCRM-scoringer efter fænotype er afbildet i Fig.4B. Den gennemsnitlige uCRM-score (SEM) for AR,bAR og STA var 8.195 (0.631),3.265 (0.412{{21 }}), og henholdsvis 1,404(0,162), og alle sammenligninger var signifikante efter korrektion af flere sammenligninger. uCRM-scoren kunne skelne mellem AR og STA med høj nøjagtighed - ved en tærskel på 3,63 var sensitiviteten og specificiteten henholdsvis 95,35 procent og 97,78 procent (Eig 4C. Når man skelnede mellem AR og kombinationen af ​​bAR og STA, blev uCRM-scoren bibeholdt en høj nøjagtighed ved samme tærskel var sensitiviteten og specificiteten henholdsvis 87,10 procent og 97,78 procent (S2A Fig.).

Når BKVN-prøverne inkluderes, var alle fænotyper signifikant forskellige fra hinanden efter multiple sammenligningskorrektion undtagen bAR og BKVN(S2BFig). Når man skelner mellem AR og kombinationen af ​​bAR, STA og BKVN, beholdt uCRM-scoren stadig en høj, men lavere nøjagtighed. Ved at bruge de samme tærskler på 3,63 var sensitiviteten og specificiteten henholdsvis 76,92 procent og 97,78 procent (S2CFig).

ComScore korrelerer med AR-specifikke biopsi histologiske læsioner. Trenden med at øge uCRM-scoren fra STA til bAR til AR antydede især, at uCRM-scoren kunne detektere inflammationsgrader, der var klinisk relevante. Som sådan evaluerede vi, om uCRM-scoren var forbundet med omfanget af histologiske AR-læsioner observeret i matchede biopsier fra den samme patient, indsamlet samtidigt. Som det ses i fig. 5A og 5B korrelerede uCRM-scorerne med omfanget af tubulitis(t) og interstitiel inflammation(i)biopsiscore i AR(R=0.5479, P<0.0001 and="" r="0.4420,"><0.0001 for="" the="" ucrm="" score="" regarding="" t="" and="" ii,="" respectively).="" there="" was="" no="" correlation="" between="" the="" ucrm="" score="" and="" measures="" of="" tubular="" atrophy="" (ta),glomerulosclerosis="" (gs),mesangial="" matrix="" (mm),="" intimal="" proliferation="" (cv),="" medial="" arteriolar="" hyaline="" (ah),="" tubular="" vacuolization(tv),="" arteritis="" (v),="" or="" acute="" glomerulitis="">

VIRKNINGER AF CSITANCHE: ANTI-TRÆTHET

Diskussion

Der er et presserende behov inden for transplantationsmedicin for at udvikle pålidelige og ikke-invasive monitoreringsværktøjer, der kan hjælpe transplantationsklinikere med at forudsige risikoen for allotransplantatskade, fortrinsvis før allotransplantatskade allerede er blevet fastslået. Mens en række transkriptionelle biomarkører er blevet forbundet med AR, har de fleste af undersøgelserne dybest set fokuseret på en unik eller enkelt transkriptionel faktor og afspejler ikke hele den molekylære kompleksitet af den biologiske proces med allotransplantatafstødning [11,38]. Desuden, mens den nuværende guldstandard for diagnosticering af tilstedeværelsen af ​​immunmedieret allotransplantatskade er allotransplantatbiopsien, er det velkendt, at proceduren har vigtige begrænsninger i form af den hyppige uregelmæssige prøveudtagning, dens høje omkostninger og upraktiskheden for gentagne screening på grund af teknikkens invasive karakter.

Adskillige rapporter har vist værdien af ​​at studere forskellige biomarkører, der forudsiger AR i urinprøver fra nyretransplanterede modtagere [20-22]. Forøgede urinniveauer af immuneffektormolekyler og transkripter såsom granzyme B. CXCL10.CXCL9.IFN-y og CXCR3. har vist sig at være stærkt forbundet med AR og i nogle tilfælde endda forudsige fremkomsten af ​​AR på forhånd [19,24,39-43]. Ved at drage fordel af nyligt rapporterede data fra vores gruppe [2Z, 29,44], der viser et fælles afstødningsmodul for genekspression i allotransplantatbiopsier under AR, uanset typen af ​​vævsorgan, var hovedmålet med denne undersøgelse at undersøge, om vurderingen af CRM i urinen hos nyretransplanterede patienter kunne være nyttig som en ideel ikke-invasiv biomarkør, der forudsiger fremkomsten af ​​AR.

Mens mange af de individuelle CRM-gener og genprodukter er blevet vurderet individuelt, er dette den første rapport om den kollektive, ikke-invasive brug af CRM-generne i forudsigelsen af ​​AR i KTx. For eksempel var urin-CXCL9-mRNA og protein og CXCL10-mRNA tidligere blevet evalueret i multicenterundersøgelser til diagnosticering af AR[13,45,46.PSMB9-transkripter i nyrebiopsier var også tidligere blevet forbundet med graftkvalitet og forudsigelse af akut afstødning [ 47].

Vi har analyseret genekspressionsdata på urinsedimenter fra KTx-patienter for den relative overflod af CRM-transkripter og deres korrelation af ekspression blandt CRM-gener (Fig. 2A). CRM-generne havde øget ekspression i AR og andre transplantationsskader såsom AR og BKVN (fig. 2B og 2C). I denne rapport observerede vi også en stærk sammenhæng mellem den nyudviklede uCRM-score og histologiske inflammatoriske scores (t- og ii-score af nyrebiopsier). Da de fleste af disse CRM-gener næsten udelukkende udtrykkes i infiltrerende immunceller, tyder den øgede ekspression af CRM-gener i urinsedimenter på, at der er en øget frigivelse af infiltrerende immunceller i urinen hos nyretransplanterede modtagere, der gennemgår transplantatskade.

Dernæst brugte vi en kombineret score beregnet ud fra individuelle genekspressionsværdier for individuelle CRM-gener, ComScore, som en metrik til at klassificere nyretransplantationspatienter i enten patient med akut afstødning eller ingen skade og bestemte en tærskel for AR. Resultaterne fra denne undersøgelse viser, at kraften ved uCRM-assay ikke kun er at identificere patienter med AR, men også kvantificere graden af ​​skade, der finder sted i allotransplantatet, da scoren stiger fra lave værdier hos STA-patienter til mellemværdier hos bAR-patienter, og til høje værdier hos AR-patienter, som afspejlet i tubulitis- og interstitiel inflammationshistologiscore. Vi mener, at uCRM-scoren har potentiel nytte i transplantationsovervågning og kan tjene som et supplement til eller henvisningstest til biopsier. En patient med en lav uCRM-score kan muligvis undgå unødvendige protokolbiopsier, mens en patient med en høj uCRM-score kan kræve seriel overvågning eller en årsagsbiopsi for at vurdere transplantatstatus.

Vi anerkender adskillige begrænsninger af denne undersøgelse, der inkluderer (i) begrænset stikprøvestørrelse af undersøgelsen, (ii) fravær af andre transplantationsskadefænotyper såsom kronisk allograft-skade eller lægemiddeltoksicitet og (i) manglende vurdering af uCRM-score i en longitudinel prøve i større kohortestørrelse. Disse lovende resultater tyder på, at yderligere, prospektive undersøgelser er nødvendige for at validere og fuldt ud vurdere den potentielle nytte af uCRM-scoren i det kliniske miljø. Sammenfattende præsenterer vi en ikke-invasiv, urin-baseret biomarkør udviklet fra et fælles afstødningsmodul sammensat af 11 gener, der kan identificere transplantationsskade og afstødning hos nyretransplanterede patienter.

VIRKNINGER AF CSITANCHE: FORBEDR HUKOMMELSEN

Referencer

1 Wolfe RA, Ashby VB, Milford EL, Ojo AO, Ettenger RE, Agodoa LY, et al. Sammenligning af dødelighed hos alle dialysepatienter, patienter i dialyse, der afventer transplantation, og modtagere af en første dødstransplantation. New England Journal of Medicine. 1999; 341(23):1725-30.

2. Laupacis A, Keown P, Pus N, Krueger H, Ferguson B, Wong C, et al. En undersøgelse af livskvalitet og omkostningsnytte ved nyretransplantation. Nyre international. 1996; 50(1):235-42. PMID: 8807593.

3. Lodhi SA, Lamb KE, Meier-Kriesche HU. Forbedring af langsigtede resultater for transplantationspatienter: gør sagen for langsigtet sygdomsspecifik og multidisciplinær forskning. American journal of transplantation: officielt tidsskrift for American Society of Transplantation og American Society of Transplant Surgeons. 2011; 11(10):2264-5.

4. Naesens M, Khatri P, Li L, Sigdel TK, Vitalone MJ, Chen R, et al. Progressiv histologisk skade i nyre-allotransplantater er forbundet med ekspression af medfødte og adaptive immunitetsgener. Nyre international. 2011; 80(12):1364-76.

5. Sigdel TK, Li L, Tran TQ, Khatri P, Naesens M, Sansanwal P, et al. Ikke-HLA-antistoffer mod immunogene epitoper forudsiger udviklingen af ​​kronisk nyre-allotransplantatskade. Journal of American Society of Nephrology: JASN. 2012; 23(4):750-63.

6. Pape L, Offner G, Ehrich JH, de Boer J, Persijn GG. Renal allograftfunktion i matchede pædiatriske og voksne modtagerpar af samme donor. Transplantation. 2004; 77(8):1191-4. PMID: 15114083.

7. Provoost AP, Wolff ED, de Keijzer MH, Molenaar JC. Påvirkning af modtagerens størrelse på nyrefunktionen efter nyretransplantation. En eksperimentel og klinisk undersøgelse. Tidsskrift for pædiatrisk kirurgi. 1984; 19(1):63–7.

8. Moreso F, Lopez M, Vallejos A, Giordani C, Riera L, Fulladosa X, et al. Seriel protokol biopsier for at kvantificere progressionen af ​​kronisk transplantationsnefropati i stabile nyreallotransplantater. American journal of transplantation: officielt tidsskrift for American Society of Transplantation og American Society of Transplant Surgeons. 2001; 1(1):82-8. PMID: 12095044.

9. Davis ID, Oehlenschlager W, O'Riordan MA, Avner ED. Pædiatrisk nyrebiopsi: skal denne procedure udføres ambulant? Pædiatrisk nefrologi. 1998; 12(2):96-100. PMID: 9543363.

10. Roedder S, Sigdel T, Salomonis N, Hsieh S, Dai H, Bastard O, et al. kSORT-analysen til påvisning af nyretransplanterede patienter med høj risiko for akut afstødning: resultater af multicenter AART-studiet. PLoS medicin. 2014; 11(11):e1001759.

11. Sarwal M, Chua MS, Kambham N, Hsieh SC, Satterwhite T, Masek M, et al. Molekylær heterogenitet i akut renal allograft-afstødning identificeret ved DNA-mikroarray-profilering. New England Journal of medicine. 2003; 349(2):125–38.

12. Sigdel TK, Sarwal MM. Nylige fremskridt inden for opdagelse af biomarkører ved transplantation af solide organer ved hjælp af proteomikker. Ekspertgennemgang af proteomics. 2011; 8(6):705-15. https://doi.org/10.1586/epr.11.66 PMID: 22087656.

13. Suthanthiran M, Schwartz JE, Ding R, Abecassis M, Dadhania D, Samstein B, et al. Urincelle-mRNA-profil og akut cellulær afstødning i nyre-allotransplantater. New England Journal of Medicine. 2013; 369 (1):20–31.

14. Sigdel TK, Gao Y, He J, Wang A, Nicora CD, Fillmore TL, et al. Udvinding af det menneskelige urinproteom til overvågning af nyretransplantationsskade. Nyre international. 2016; 89(6):1244-52. https://doi.org/10.1016/j. strik.2015.12.049 PMID: 27165815.

15. Sigdel TK, Ng YW, Lee S, Nicora CD, Qian WJ, Smith RD, et al. Forstyrrelser i urineksosomet ved transplantatafstødning. Grænser i medicin. 2014; 1:57.

16. Yang JY, Sarwal MM. Transplantationsgenetik og genomik. Naturanmeldelser Genetik. 2017; 18(5):309-26.

17. Loupy A, Lefaucheur C, Vernerey D, Chang J, Hidalgo LG, Beuscart T, et al. Molekylær mikroskopstrategi til forbedring af risikostratificering ved tidlig antistof-medieret nyre-allograft-afstødning. Journal of American Society of Nephrology: JASN. 2014; 25(10):2267-77. Epub 2014/04/05.

18. Sigdel TK, Vitalone MJ, Tran TQ, Dai H, Hsieh SC, Salvatierra O, et al. En hurtig ikke-invasiv analyse til påvisning af nyretransplantationsskade. Transplantation. 2013; 96(1):97-101. PMID: 23756769.

19. Hauser IA, Spiegler S, Kiss E, Gauer S, Sichler O, Scheuermann EH, et al. Forudsigelse af akut renal allotransplantatafstødning af urinmonokin induceret af IFN-gamma (MIG). Journal of American Society of Nephrology: JASN. 2005; 16(6):1849-58.

20. Hu H, Kwun J, Aizenstein BD, Knechtle SJ. Ikke-invasiv påvisning af akutte og kroniske skader ved human nyretransplantation ved forhøjelse af flere cytokiner/kemokiner i urin. Transplantation. 2009; 87(12):1814–20. PMID: 19543058.

21. Jackson JA, Kim EJ, Begley B, Cheeseman J, Harden T, Perez SD, et al. Urinære kemokiner CXCL9 og CXCL10 er ikke-invasive markører for renal allograft-afstødning og BK-virusinfektion. American journal of transplantation: officielt tidsskrift for American Society of Transplantation og American Society of Transplant Surgeons. 2011; 11(10):2228-34.

22. Schaub S, Nickerson P, Rush D, Mayr M, Hess C, Golian M, et al. Urinernes CXCL9- og CXCL10-niveauer korrelerer med omfanget af subklinisk tubulitis. American journal of transplantation: officielt tidsskrift for American Society of Transplantation og American Society of Transplant Surgeons. 2009; 9 (6):1347-1353.

23. Segerer S, Cui Y, Eitner F, Goodpaster T, Hudkins KL, Mack M, et al. Ekspression af kemokiner og kemokinreceptorer under human nyretransplantatafstødning. Amerikansk tidsskrift for nyresygdomme: National Kidney Foundations officielle tidsskrift. 2001; 37(3):518-31. PMID: 11228176.

24. Tatapudi RR, Muthukumar T, Dadhania D, Ding R, Li B, Sharma VK, et al. Ikke-invasiv påvisning af renal allograft-inflammation ved målinger af mRNA for IP-10 og CXCR3 i urin. Nyre international. 2004; 65(6):2390-7.

25. Menon MC, Murphy B, Heeger PS. Flytning af biomarkører mod klinisk implementering i nyretransplantation. JASN. 2017.

26. Naesens M, Anglicheau D. Præcisionstransplantationsmedicin: Biomarkører til redning. JASN. 2017.

27. Khatri P, Roedder S, Kimura N, De Visser K, Morgan AA, Gong Y, et al. Et fælles afstødningsmodul (CRM) til akut afstødning på tværs af flere organer identificerer nye terapeutiske midler til organtransplantation. Tidsskriftet for eksperimentel medicin. 2013; 210(11):2205-21.

28. Sigdel TK, Bestard O, Tran TQ, Hsieh SC, Roedder S, Damm I, et al. En beregningsmæssig genekspressionsscore til forudsigelse af immunskade i nyreallotransplantater. PloS en. 2015; 10(9):e0138133.

29. Secrets A, Yang JYC, Vanaudenaerde BM, Sigdel TK, Liberto JM, Damm I, et al. Det fælles afstødningsmodul i kronisk afstødning efter lungetransplantation. PloS en. 2018; 13(10):e0205107. Epub 2018/10/06.

30. Sis B, Mengel M, Haas M, Colvin RB, Halloran PF, Racusen LC, et al. Banff '09 møderapport: antistof-medieret graft-forringelse og implementering af Banff-arbejdsgrupper. American journal of transplantation: officielt tidsskrift for American Society of Transplantation og American Society of Transplant Surgeons. 2010; 10(3):464-71.

31. Solez K, Colvin RB, Racusen LC, Haas M, Sis B, Mengel M, et al. Banff 07 klassificering af nyre allograft patologi: opdateringer og fremtidige retninger. American journal of transplantation: officielt tidsskrift for American Society of Transplantation og American Society of Transplant Surgeons. 2008; 8 (4):753-60.

32. Sarwal MM, Ettenger RB, Dharnidharka V, Benfield M, Mathias R, Portale A, et al. Fuldstændig steroidundgåelse er effektiv og sikker hos børn med nyretransplantationer: et multicenter randomiseret forsøg med tre-års opfølgning. American journal of transplantation: officielt tidsskrift for American Society of Transplantation og American Society of Transplant Surgeons. 2012; 12(10):2719-29.

33. Racusen LC. Banff-skemaet og differentialdiagnose af allograft-dysfunktion. Transplantationsprocedurer. 2004; 36(3):753-4.

34. Jianghua C, Wenqing X, Huiping W, Juan J, Jianyong W, Qiang H. C4d som en signifikant prædiktor for humoral afstødning i nyreallotransplantater. Klinisk transplantation. 2005; 19(6):785-91.

35. Crespo M, Pascual M, Tolkoff-Rubin N, Mauiyyedi S, Collins AB, Fitzpatrick D, et al. Akut humoral afstødning hos nyre-allograft-recipienter: I. Incidens, serologi og kliniske karakteristika. Transplantation. 2001; 71(5):652-8. PMID: 11292296.

36. Keslar KS, Lin M, Zmijewska AA, Sigdel TK, Tran TQ, Ma L, et al. Multicenter-evaluering af en standardiseret protokol for ikke-invasiv genekspressionsprofilering. AJT. 2013.

37. Montojo J, Zuberi K, Rodriguez H, Bader GD, Morris Q. GeneMANIA: Hurtig gennetværkskonstruktion og funktionsforudsigelse for Cytoscape. F1000 Forskning. 2014; 3:153.

38. Der SD, Zhou A, Williams BR, Silverman RH. Identifikation af gener differentielt reguleret af interferon alfa, beta eller gamma ved hjælp af oligonukleotid-arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1998; 95(26):15623-8.

39. Hartono C, Muthukumar T, Suthanthiran M. Ikke-invasiv diagnose af akut afstødning af renale allotransplantater. Aktuel mening i organtransplantation. 2010; 15(1):35–41. https://doi.org/10.1097/MOT. 0b013e3283342728 PMID: 19935064.

40. Lazzeri E, Rotondi M, Mazzinghi B, Lasagni L, Buonamano A, Rosati A, et al. Høj CXCL10-ekspression i afstødte nyrer og forudsigende rolle af prætransplantationsserum CXCL10 til akut afstødning og kronisk allotransplantat nefropati. Transplantation. 2005; 79(9):1215-20. PMID: 15880073.

41. Matz M, Beyer J, Wunsch D, Mashreghi MF, Seiler M, Pratschke J, et al. Tidlig post-transplantation urin IP-10 udtryk efter nyretransplantation er forudsigelig for kort- og langsigtet graftfunktion. Nyre international. 2006; 69(9):1683-90.

42. Simon T, Opelz G, Wiesel M, Ott RC, Susal C. Serial perifert blod perforin og granzyme B genekspressionsmålinger til forudsigelse af akut afstødning hos nyretransplantatmodtagere. American journal of transplantation: officielt tidsskrift for American Society of Transplantation og American Society of Transplant Surgeons. 2003; 3(9):1121-7. PMID: 12919092.

43. Yannaraki M, Rebibou JM, Ducloux D, Saas P, Duperrier A, Felix S, et al. Urincytotoksiske molekylære markører for en ikke-invasiv diagnose ved akut nyretransplantatafstødning. Transplant international: officielt tidsskrift for European Society for Organ Transplantation. 2006; 19(9):759-68. https://doi.org/10. 1111/j.1432-2277.2006.00351.x PMID: 16918537.

44. Yang JYC, Verleden SE, Zarinsefat A, Vanaudenaerde BM, Vos R, Verleden GM, et al. Cellefrit DNA og CXCL10 afledt af bronchoalveolær lavage forudsiger lungetransplantationsoverlevelse. J Clin Med. 2019; 8(2). Epub 2019/02/20.

45. Faddoul G, Nadkarni GN, Bridges ND, Goebel J, Hricik DE, Formica R, et al. Analyse af biomarkører inden for de første 2 år efter transplantation og 5-Year Kidney Transplant Outcomes: Results From Clinical Trials in Organ Transplantation-17. Transplantation. 2018; 102(4):673-80. Epub 2017/12/01.

46. ​​Hricik DE, Nickerson P, Formica RN, Poggio ED, Rush D, Newell KA, et al. Multicenter validering af urin CXCL9 som en risiko-stratificerende biomarkør for nyretransplantationsskade. American journal of transplantation: officielt tidsskrift for American Society of Transplantation og American Society of Transplant Surgeons. 2013; 13(10):2634-44. Epub 2013/08/24.

47. Kotsch K, Kunert K, Merk V, Reutzel-Selke A, Pascher A, Fritzsche F, et al. Nye markører i nul-timers nyrebiopsier indikerer graftkvalitet og klinisk resultat. Transplantation. 2010; 90(9):958-65. Epub 2010/09/23. PMID: 20859252.