En karakteristisk fordeling af hypoxi-inducerbar faktor-1 i dyrkede renale tubulære celler med hypoperfusion simuleret ved dækglasplacering

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Tomoko Honda¹| Yosuke Hirakawa¹ | Kiichi Mizukami²| Toshitada Yoshihara²| Tetsuhiro Tanaka¹| Seiji Tobita²| Masaomi Nangaku

Abstrakt

Kronisk hypoxi i det renale tubulointerstitium spiller en nøglerolle i udviklingen af ​​kroniskenyresygdom(CKD). Det er derfor vigtigt at undersøge tubulær hypoxi og aktiviteten af ​​hypoxi-inducerbar faktor (HIF)-1 som reaktion på hypoxi. Sjælden refaktion af den peritubulære kapillær forårsager hypoperfusion ved CKD; virkningen af ​​hypoperfusion på HIF'er er dog sjældent blevet undersøgt. Vi inducerede hypoperfusion forårsaget af dækglasplacering hos menneskernyre-2 celler og observerede en oxygengradient under dækglasset. Immuncytokemi af HIF-1 viste en doughnut-formet formation på kanten af ​​et pimonidazol-positivt område, som vi kaldte "HIF-ringen". Iltspændingen af ​​HIF-ringen blev estimeret til at være mellem ca. 4 mmHg og 20 mmHg. Dette resultat var ikke foreneligt med tidligere forskning, der viste HIF-1-akkumulering i det anoxiske område med homogen oxygenspænding. Vi observerede yderligere tilstedeværelsen af ​​en pH-gradient under et dækglas såvel som et skift af HIF-ringen på grund af ændringer i pH-værdien af ​​dyrkningsmediet, hvilket tyder på, at HIF-ringen blev dannet ved undertrykkelse af HIF-1-relateret til lav pH. Denne forskning viste, at HIF-1-aktivering efterligner den fysiologiske tilstand i dyrkede celler med hypoperfusion.

SØGEORDhypoperfusion, hypoxi, hypoxi-inducerbar faktor, oxygengradient, pH

Cistanche herbaforebygger nyresygdom, klik her for at få prøven

1|INTRODUKTION

Forekomsten af ​​kroniskenyresygdom(CKD) er stigende over hele verden, efterhånden som samfund ældes (Tonelli & Riella, 2014). Progressionen af ​​CKD er irreversibel, når nyreskaden når en vis grad og til sidst resulterer i end-stage renal disease (ESRD), uanset den underliggende sygdom. Dette resultat indikerer eksistensen af ​​en "endelig fælles vej." Ifølge tidligere patologiske analyser er faldet i nyrefunktionen stærkere korreleret med tubulointerstitiel skade end med glomerulær skade. Der har været flere rapporter, der viser, at nyrefibrose inducerer kronisk hypoxi i tubulointerstitium, og denne tubulointerstitielle hypoxi forværrer CKD og fører til ESRD. Disse beviser indikerer, at tubulointerstitiel hypoxi spiller en rolle i den sidste fælles vej for CKD (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Detnyreer meget modtagelig for hypoxi på grund af dens høje efterspørgsel efter ilt og eksistensen af ​​en ilt-shunt mellem de intrarenale arterier og vener (Nangaku, 2006; Welch et al., 2001; Zhang et al., 2014). Derfor vurderer vi, at det er essentielt at undersøge hypoxi og reaktionen på hypoxi i det renale tubulointerstitium.

Den primære biologiske reaktion på hypoxi i levende organismer sker via den hypoxi-inducerbare faktor (HIF) pathway (Hypoxia, 2011; Semenza & Wang, 1992; Zhou et al., 2003). HIF består af - og -underenheder. Selvom -underenheden er konstitutivt aktiv, nedbrydes -underenheden i nærvær af oxygen. Under normoksiske forhold hydroxyleres HIF- af prolylhydroxylasedomænet (Ph.D.), hvilket gør det genkendeligt af von Hippel-Lindau tumor suppressor (VHL). Denne genkendelse resulterer i ubiquitinering og nedbrydning af hydroxyleret HIF- i proteasomet. Under hypoxiske forhold akkumuleres HIF- i cytosolen, fordi ikke-hydroxyleret HIF- undslipper nedbrydning. Akkumuleret HIF- translokeres fra cytosolen til kernen, hvor den dimeriserer med HIF- og fungerer som en transkriptionel faktor, der fremmer ekspressionen af ​​nedstrømsgener. Af de tre identificerede isoformer af HIF-underenheder – HIF-1, HIF-2 og HIF-3 – er renale tubulære epitelceller kendt for at udtrykke HIF-1 (Tanaka et al. ., 2016). Tidligere undersøgelser har vist forbigående eller regional akkumulering af HIF inyremed CKD (Goldfarb et al., 2006; Yu et al., 2012), og denne HIF aktiveres i den reducerede iltspænding i CKD-miljøet. Fejltilpasningen til hypoxi ved kronisk nyreinsufficiens kan være forårsaget af tilstedeværelsen af ​​faktorer, der undertrykker HIF-veje (Asai et al., 2016; Tanaka et al., 2013; Thangarajah et al., 2009). Beskyttende virkninger af HIF-aktivering er blevet rapporteret i adskillige dyremodeller, herunder streptozotocin-inducerede diabetiske rotter og 5/6. nefrektomi-rotter (Deng et al., 2010; Nordquist et al., 2015). Ph.D. inhibitorer har for nylig tiltrukket sig opmærksomhed som nye terapeutiske tilgange til nyreanæmi hos patienter med CKD (Akizawa et al., 2019; Chen et al., 2017, 2019; Coyne et al., 2017; Miyata et al., 2011; Pergola et al. ., 2016; Provenzano et al., 2016). Men detaljerne i udviklingen af ​​nyrehypoxi og den måde, hvorpå HIF-akkumulering forekommer inyremed CKD, forbliv uklar. Iltafhængig hydroxylering af HIF- sker i cytosolen, og det er derfor vigtigt at måle intracellulær og ekstracellulær iltspænding. Der er flere metoder, der anvendes til måling af iltspænding, herunder brug af mikroelektroder eller blodilt afhængig magnetisk resonansbilleddannelse (BOLD-MRI). Vi brugte phosphorescence lifetime imaging mikroskopi (PLIM) til kvantitativ måling af den intracellulære iltstatus (Hirakawa et al., 2017; Yoshihara et al., 2015). BTPDM1 er et phosphorescerende farvestof baseret på iridium (III) komplekset BTP, (bp)2Ir(acc) (bp=benzoat-pyridin, aac=acetylacetone) med en kationisk dimethylaminogruppe, som er passivt fordelt i intracellulære lysosomer. Den blev syntetiseret som en phospho-nyere sonde til at måle det intracellulære ilttryk (Yoshihara et al., 2015). PLIM med BTPDM1 muliggjorde erhvervelse af højopløselige billeder af partialtrykket af oxygen i renale tubulære celler på nyreoverfladen af ​​normale mus, hvilket gav data, der indikerer tilstedeværelsen af ​​en oxygengradient, selv i normale nyrer (Hirakawa et al., 2018) ).

Der er iltgradienter i levende organer, bl.anyrer, selv under normale forhold (Hirakawa et al., 2018; Kietzmann, 2017; Zhdanov et al., 2015), og sådanne gradienter kan derfor også forventes ved CKD. Hypoperfusion er forårsaget af sjældenhed af mikrovaskulaturen ved CKD, hvor progressiv glomerulær skade resulterer i et fald i peritubulær kapillær blodgennemstrømning, hvilket forværrer interstitiel fibrose. Interstitiel fibrose hæmmer diffusionen og forsyningen af ​​ilt til de tubulære celler og fører til sjældenhed af mikrovaskulaturen, hvilket yderligere forværrer tubulointerstitiel hypoxi (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). De biologiske virkninger af hypoperfusion forbliver imidlertid uklare, fordi de fleste undersøgelser har undersøgt virkningerne af hypoxi og HIF-1 på dyrkede celler under betingelser med homogen perfusion og iltspænding (Rexius-Hall et al., 2017). Tidligere undersøgelser har vist, at monolagede dyrkede celler dækket med et dækglas giver en god model for hypoperfusion induceret af en barriere for diffusion i dyrkningsmediet. Den modellerede hypoperfusion er forbundet med en iltgradient, fordi et dækglas forhindrer iltdiffusion fra toppen af ​​mediet til cellerne (Pitts & Toombs, 2004; Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015). I et monolag af dyrkede celler dækket med et dækglas falder intracellulær iltspænding med afstand fra kanten af ​​dækglasset på grund af begrænset iltdiffusion ind i dyrkede celler. Som et resultat dannes der en iltgradient fra kanten til midten af ​​dækglasset, og den intracellulære iltspænding kan falde til et anoxisk område i midten af ​​dækglasset (Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015) . I den aktuelle undersøgelse fokuserede vi på HIF-aktivering og undersøgte, om der er en oxygenuafhængig ændring i HIF-ekspression i nærvær af hypoperfusion med en oxygengradient. Da hypoperfusion med en oxygengradient eksisterer i nyretubuli in vivo, kan observationen af ​​oxygenuafhængige virkninger på HIF-ekspression i dækglasmodellen give indsigt i den mekanisme, der ligger til grund for insufficiens af HIF-akkumulering ved CKD.

cistanche ekstraktfor nyre

2|MATERIALER OG METODER

2.1|Cellekultur

Dyrkede celler blev inkuberet i en fugtig inkubator med 5 procent CO2. Hypoksisk inkubation blev udført i en personlig CO2/multi-gas inkubator APM-30D (Astec). Anoxi blev induceret med en anoxipose, AnaeroPack og Anaerobic dyrkningssæt #A-13 (Mitsubishi Gas Chemical).

HK-2-celler (Homo sapiens, humannyre, hankøn, CRL- 2190, ATCC, RRID: CVCL_0302), en udødeliggjort proksimal tubuli-epitelcellelinje fra normal voksen human nyre, blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle's medium/næringsstofblanding F{{2} } Skinke (DMEM/F12) (D8062, Sigma Aldrich) indeholdende 10 procent føtalt bovint serum (FBS) (F7524, Sigma Aldrich) og penicillin-streptomycinopløsning (15070063, Thermo Fisher Scientific) i en 10 cm dyrkningsskål. Til passage blev HK-2-celler dissocieret med trypsin (204-16935, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) og centrifugeret ved 300 g i 5 min.

HeLa livmoderhalskræftceller og menneskelige embryonalenyreceller 293 (HEK293) blev dyrket i DMEM med lav (1000 mg/L) glucose (D6046, Sigma Aldrich) indeholdende 5 procent FBS i en 10 cm dyrkningsskål. Disse celler blev overført som HK-2-celler.

Renale proksimale tubuli-epitelceller (RPTEC'er) (CC- 2553, Cambrex) blev vedligeholdt ved hjælp af RenaLifeTM Comp-kits (LRC-LL0025, Lonza Ltd.). Til passage blev RPTEC'er dissocieret under anvendelse af trypsin, neutraliseret med Trypsin Neutralizing Solution (CC-5002, Lonza Ltd.) og centrifugeret ved 200 g i 5 min.

2.2|Etablering af en hypoperfusionsmodel ved en dækglasplacering

Rundformede dækglas med 15 mm diameter (C015001, Matsunami) blev renset ved hjælp af ultralyd og opbevaret i 99,5 procent ethanol før brug. To metoder blev anvendt, baseret på observation af celler uden for dækglasset.

Enlagede dyrkede celler blev klemt mellem et dækglas og bunden af ​​et fad (figur S1a, b) eller en alternativ metode (figur S1c), som beskrevet nedenfor. Enten den traditionelle eller den alternative metode blev valgt til at etablere vores dækglasmodel til live-billeddannelse, uanset om det er oxygen-billeddannelse eller PH-billeddannelse. Til immuncytokemi (ICC) blev den alternative metode valgt, fordi ved brug af den traditionelle metode løsnede størstedelen af ​​celler sig ofte fra bunden af ​​skålen under fjernelse af dækglas til cellefiksering (figur S2a).

2.2.1|Traditionel metode

På dag 1 blev celler placeret på bunden af ​​et 27 mm glasbaseret fad (3910-035, Iwaki) ved et sammenløb på 100 procent* (ca. 5,0 × 105/skål). De blev dyrket i DMEM/F12 indeholdende 10 procent FBS uden antibiotisk opløsning natten over. På dag 2 blev et dækglas placeret over de dyrkede celler i den angivne periode (figur S1b).

2.2.2|Alternativ metode

Celler blev podet på et dækglas i en 35 mm-kulturskål ved 100 procent sammenløb (ca. 5,0 × 105/skål) på dagen.

1. De blev dyrket i DMEM/F12 indeholdende 10 procent FBS uden antibiotisk opløsning natten over. På dag 2 blev dækglasset omvendt for at fastgøre overfladen af ​​dets celler til bunden af ​​en ny 27 mm glasbaseret skål i en bestemt periode (figur S1c).

Vi skabte også en dækglasmodel ved hjælp af rundformede dækglas med en diameter på 10 mm (CS01005, Matsunami) (figur S2b).

2.3|Live oxygen billeddannelse med BTPDM1

Dyrkede celler blev fremstillet på dag 1 som beskrevet ovenfor. På dag 2 blev cellerne skyllet to gange med Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (H8264, Sigma Aldrich) og inkuberet med 500 nM BTPDM1, et iridiumbaseret kationisk lipofilt farvestof anvendt som en intracellulær phosphorescerende probe (Yoshihara et al. 2015), i DMEM/F12 uden phenolrød (21041-025, Thermo Fisher Scientific) i 30 min. Efter at cellerne var blevet vasket to gange med HBSS, blev de lagt mellem et dækglas og bunden af ​​et fad som beskrevet ovenfor. Intensiteten af ​​phosphorescens fra BTPDM1 i dyrkede celler dækket med et dækglas blev observeret ved hjælp af et excitations- og emissionsfilter, og BTPDM1-phosphorescens (Hirakawa et al., 2015) blev påvist ved hjælp af et fluorescensmikroskop, BZ-X710 (Keyence Corporation). Billeder opnået fra det omvendte fluorescerende mikroskop blev justeret for lysstyrke og kontrast ved hjælp af BZ-X analysesoftware.

2.4|Immuncytokemi

Celler på et dækglas blev dyrket med 200 µM pimonidazol HCl (HP3-100, Hypoxyprobe, Inc.) i DMEM/F12 uden phenolrød i 1 time, hvorefter dækglasset blev vendt og fastgjort til en dækglasskål, som beskrevet tidligere. Cellerne blev derefter dyrket i DMEM/F12 uden phenolrød i en specificeret periode. Når pimonidazol modfarvning ikke blev brugt, blev forbehandling med pimonidazol udeladt.

Efter afslutning af dyrkningsperioden blev hvert dækglas opsamlet, og cellerne blev straks fikseret med methanol/acetone (1:1) på is, hvor de forblev i 30 min. Efter vask to gange med Dulbeccos phosphat-bufret saltvand (PBS) (D5652, Sigma Aldrich) blev cellemembranen permeabiliseret i 30 minutter, inkuberet med 5 procent bovint serumalbumin (BSA) (A3059, Sigma Aldrich) i 30 minutter og efterfølgende med serumfri proteinblok (X0909, DAKO) i 10 min. Cellerne blev farvet med et første antistof og efterfølgende med et andet, fluorescerende antistof. Listen over de første antistoffer er angivet i tabel S1. FITC-svin polyklonalt anti-kanin immunoglobulin (F0205, 1:20 fortynding, DAKO) blev anvendt som det første antistof, hvis værten var en kanin. Det fluorescerende antistof Alexa Fluor 594 streptavidin (S11227, 1:500 fortynding, Thermo Fisher Scientific) blev brugt som det første antistof, hvis værten var en mus, efterfulgt af biotinyleret anti-muse IgG (H plus L) (BA{{23} }, 1:1000 fortynding, Vector Laboratories), som det andet antistof. Nuklear farvning blev udført under anvendelse af bisBenzimid H 33342 trihydrochlorid (B2261, Sigma Aldrich) for hver prøve.

Fluorescerende signaler blev observeret ved hjælp af et inverteret fluorescerende mikroskop, BZ-X710 (Keyence Corporation) med følgende filtre: Texas Red med en excitationsbølgelængde (Ex) på 560/40 nm, emissionsbølgelængde (Em) på 630/75 nm, GFP ( Eks: 470/40 nm, Em: 525/50 nm) og DAPI (Eks: 360/40 nm, Em: 460/50 nm). Billeder blev justeret for lysstyrke og kontrast ved hjælp af BZ-X analysesoftware.

2,5|ICC af HIF af HK-2-celler behandlet med cobaltchlorid

Den alternative metode blev modificeret til at producere en dækglasmodel af HK-2-celler behandlet med koboltchlorid. HK-2-celler blev podet ved halvkonfluent densitet (2,5 × 105/skål) på et dækglas på dag 1 og behandlet med 300 µM cobaltchloridhexahydrat (C 8661, Sigma Aldrich) i 16 timer på Dag 2. På dag 3 blev dækglasset vendt for at fastgøre celleoverfladerne til bunden af ​​en ny 27 mm glasbaseret skål i 3 timer, og ICC af HIF blev udført.

2,6|Western blotting

For at undersøge HIF{{0}}-akkumulering under forskellige iltspændinger og ved forskellige pH-niveauer, 1.0 × 106 HK-2 celler pr. 10 cm dyrkningsskål blev inkuberet under enten normoxi, 2 procent oxygen, 1 procent oxygen eller anoxi i 5 timer eller i DMEM/F12 ved pH 7,4, pH 6,0 eller pH 5,0 i 5 timer.

Disse celler blev lyseret i RIPA-buffer indeholdende 50 mM Tris-buffer (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0,5 vægt/volumenprocent natrium deoxycholat, 0,1 vægt/volumenprocent SDS og 1,0 vægt/volumenprocent NP40.

Til western blotting, SDS-prøvebuffer indeholdende {{0}},35 M Tris-HCl (pH 6,8), 10 procent SDS, 36 procent glycerol, 0,012 procent bromphenolblåt og 0,1 M dithiothreitol (DTT) blev tilsat til proteinerne. Proteiner indeholdende SDS-prøvebuffer blev elueret ved kogning ved 95 grader i 5 minutter.

Proteinerne blev adskilt ved elektroforese på 10 procent SDS polyacrylamidgeler. Proteinerne blev derefter overført til en AmershamTM HybondTM PVDF-membran (10600023, GE Healthcare) i overførselsbuffer (48 mM Tris-base-buffer, 39 mM glycin, 0,04 % SDS og 20 v/v % methanol) under anvendelse af en Trans-Blot® TurboTM Transfer System (Bio-Rad). Membranerne blev inkuberet ved stuetemperatur med primære antistoffer, anti-HIF1 antistof (NB100-134, 1:500 fortynding, Novus Biologicals, RRID: AB_350071) og anti-actin antistof (A2066) , 1:2000 fortynding, Sigma Aldrich, RRID: AB_476693), og efterfølgende i det sekundære antistof, polyklonalt gede-anti-kanin immunoglobulin/HRP (P0448, 1:10000 fortynding, DAKO, RRID: AB{{26 }}). PierceTM ECL Plus Western Blotting Substrate (32132, ThermoFisher Scientific) blev brugt til detektion. Kemiluminescens blev observeret under anvendelse af en Luminoimage Analyzer ImageQuantLAS4000mini (GE Healthcare). Reproducerbarhed blev bekræftet ved at udføre mindst tre uafhængige eksperimenter. Intensiteten af ​​båndene blev kvantificeret ved hjælp af National Institutes of Health ImageJ software (Schneider et al., 2012).

2,7|Luciferase reporter assay

En luciferase reporter-assay blev udført for at måle HIF1-akkumulering i homogen hypoxisk kulturinkubation. Vi har tidligere konstrueret et mærket luciferasegen drevet af et hypoxi-responsivt element (HRE) og udviklet Hypoxia-Responsive Reporter Vector (Transgene Construction). Dette blev konstrueret ud fra tandemkopier af HRE fra det vaskulære endotelvækstfaktorgen fra rotte subklonet ind i 5'-regionen af ​​am CMV-promotor-luciferase-transkriptionsenheden (præ-Luc) (Chiang et al., 2011; Tanaka et al., 2011; Tanaka et al. al., 2004).

HK{{0}}-celler i en koncentration på 1,0 × 105 pr. brønd blev fremstillet i 12-brøndkulturplader (150628, Thermo Fisher Scientific). Cellerne blev co-transficeret med 500 ng pGL3-Basic HRE-luciferasevektorer og 30 ng af pRL-SV40 Renilla luciferase kontrolvektorer (Promega), under anvendelse af 2 µl FuGENE® HD Transfection Reagent (E2311, Promega) pr. godt. HK-2-celler co-transficeret med 500 ng pGL3-Basis-ildflue-luciferasevektorer og 30 ng af pRL-SV40 Renilla-luciferase-kontrolvektorer (Promega) blev brugt som en negativ kontrol.

De transficerede celler blev inkuberet under normoksi, 2 procent hypoxi, 1 procent hypoxi eller en anoxipose i 5 timer. Cellerne blev derefter høstet under anvendelse af 100 µl passiv proteinlysebuffer til dobbelt luciferaseassayet. Et LB9507 luminometer (EG og Berthold) blev brugt til målingerne. For at korrigere for transfektionseffektivitet blev den relative værdi af ildflue-luciferase-lysenheden divideret med den for Renilla-luciferasen.

cistanche for udg

2,8|Analyse af apoptose

Dyrkede celler blev dækket med et dækglas i 0 min, 15 min, 30 min, 1 time, 3 timer, 6 timer og 24 timer og derefter opsamlet under anvendelse af trypsin. Celler behandlet med 3 procent hydrogenperoxid (081- 04215, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) i 30 minutter blev fremstillet som en apoptotisk kontrol. Kvantitativ analyse af apoptose blev udført under anvendelse af Muse Annexin V og Dead Cell Kits (MCH100105, Millipore) i en Muse™ Cell Analyzer (Millipore) i henhold til producentens instruktioner.

2,9|Kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR)

Total RNA-ekstraktion og cDNA-syntese blev udført i henhold til producentens instruktioner for henholdsvis RNAiso Plus (9109, Takara) og PrimeScript™ RT Master Mix (RR036B, Perfect Real Time) (Takara). Real-time PCR blev udført ved hjælp af THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (QPS- 201, Toyobo) i CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). Transkriptniveauer blev normaliseret til niveauet af -actin-mRNA-ekspression. qRT-PCR blev udført i tre eksemplarer under anvendelse af genspecifikke primere. HIF-1 blev amplificeret ved hjælp af fremadrettede, 5'-CCATTAGAAAGCAGTTCCGC-3' og omvendte, 5'-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3′ primere. -actin blev amplificeret ved hjælp af fremadrettede, 5'-TCCCCAACTTGA GATGTATGAAG-3' og omvendte 5'-AACTGGTCTCAAG TCAGTGTACAGG-3'-primere.

2,10|Transfektion med siRNA

For at undersøge RNAi-induceret HIF-1-knockdown i HK-2-celler blev 5.0 × 104 HK-2-celler pr. brønd fremstillet i plader med seks brønde. To slags RNAi – HIF-1 siRNA (siHIF-1 #1 [HSS104774, Thermo Fisher Scientific] og siHIF-1 #2 [HSS104775, ThermoFisher Scientific]) – blev brugt sammen med Lipofectamine RNAiMAX Transfektionsreagens (Thermo Fisher Scientific). Som negativ kontrol blev Stealth RNAi™ siRNA Negative Control Med GC Duplex #3 (12935-113) brugt; 1,5 µl af hver siRNA og 5 µl RNAiMAX blev blandet. siRNA-transficerede celler blev inkuberet under normoxiske eller hypoxiske (1 procent O2) betingelser i 48 timer, og RNA blev ekstraheret. Effektiviteten af-HIF-1 knockdown blev undersøgt ved hjælp af qRT-PCR.

2.11|Live billeddannelse af effekter af en PH-gradient

Vi visualiserede den intracellulære pH-gradient af levende celler under et dækglas. Celler blev behandlet med pHrodo Green AM intracellulær pH-indikator (p35373, ThermoFisher Scientific) i henhold til producentens anvisninger før implementering af dækglasmodellen. Et inverteret fluorescensmikroskop, BZ-X710 (Keyence Corporation) med et GFP-filter blev brugt til at observere tidsovergangen af ​​fluorescensintensitetsgradienten under et dækglas.

2.12|Kvantitativ analyse af HIF-ringen

2.12.1|Stedet for HIF-ringen

Vi målte afstanden mellem HIF-ringene og pimonidazol-positive områder fra dækglaskanterne ved hjælp af ImageJ som følger. Arealerne af de ydre og indre cirkler af HIF-ringen og pimonidazol-positive cirkel blev bestemt, og radius af hver cirkel blev beregnet. Hver værdi blev trukket fra 7,5 mm, som er radius af et 15 mm dækglas, for at beregne dens afstand fra en dækglaskant. Tre uafhængige eksperimenter med ICC af HIF i hver tilstand blev udført.

2.12.2|Definition af HIF-ringen

Vi brugte fluorescerende billeder opnået fra en dækglasmodel inkuberet under normoxi og neutral pH. Vi definerede stedet for HIF-ringen og dens yder- og inderside som 2,5–3.0 skala (0.22–0.45 mm), 0.5 –1.0 skala (1,12– 1,35 mm) og 5.0–5,5 skala (2,24–2,47 mm) fra henholdsvis en dækglaskant ved hjælp af ImageJ. Vi målte fem websteder med HIF-1-signaler pr. prøve og beregnede gennemsnittet. Tre uafhængige eksperimenter med ICC af HIF blev udført.

cistanche ekstrakt pulver

2,13|Måling af ilttryk ved PLIM-billede

2.13.1|Konstruktion af en kalibreringslinje til måling af ilttryk

En kalibreringskurve af HK-2-celler blev lavet, baseret på metoden beskrevet i vores tidligere rapport (Yoshihara et al., 2015). HK-2-celler ladet med 500 nM BTPDM1 i 30 minutter blev dyrket i en iltkoncentration-udskiftelig multi-gas-inkubator udstyret med et omvendt fluorescerende mikroskop, der var forbundet til levetidsmålesystemet. En kalibreringslinje baseret på Stern-Volmer-analyser blev konstrueret ved hjælp af fosforescenslevetiden (PL) for HK-2-celler under flere forskellige iltspændinger vha.

Ligning (1)

hvor τp repræsenterer PL i pO2, τ0 repræsenterer PL i deoxygenering, kq repræsenterer quenching-hastighedskonstanten, og pO2 repræsenterer partialtrykket af oxygen. Ved hjælp af denne kalibreringslinje kunne ilttrykket beregnes ud fra PL.

2.13.2|PLIM billede af en dækglasmodel

HK-2-celler ladet med 500 nM BTPDM1 i 30 minutter blev forberedt. En dækglasmodel blev konstrueret og dyrket i en O2-koncentrationsomskiftelig multigasinkubator udstyret med et omvendt fluorescerende mikroskop, forbundet til levetidsmålesystemet.

Phosphorescence lifetime imaging microscopy (PLIM) billeder blev optaget ved hjælp af et inverteret fluorescensmikroskop udstyret med et konfokalt scanningssystem (Hirakawa et al., 2018). PLIM-billeder blev opnået efter 30 minutters inkubation i 21 procent O2 eller 4 procent O2. Fire PLIM-billeder pr. prøve, fra den øvre, nederste, venstre og højre region nær dækglaskanten, blev taget for at bestemme den gennemsnitlige PL under hensyntagen til variationen i PL'er i et dækglas.

2.13.3|Identifikation af HIF-ringen i et PLIM-billede

Pimonidazol var positivt under 10 mmHg oxygentryk. PL-ækvivalenten til 10 mmHg ilttryk var 4034,6 ns ifølge kalibreringslinjen, så den ydre linje af pimonidazolcirklen i PLIM-billedet kunne identificeres. Efterfølgende kunne stederne for de ydre og indre HIF-ringe i PLIM-billedet findes ved at bruge kvantitativ afstandsanalyse. Vi målte intervallet af gennemsnitlige PL'er svarende til HIF-ringen i 21 procent O2 og 4 procent O2.

2.13.4|Måling af ilttrykket i HIF-ringen

Vi beregnede området for ilttryk af HIF-ringen fra PL'erne ved hjælp af kalibreringslinjen. PLIM-billeder blev analyseret ved hjælp af SPCImage 5.0 (Becker & Hickl GmbH).

2,14|Statistisk analyse

Dunnetts test blev brugt til at sammenligne forsøgs- og kontrolgrupper, og værdier < 0,05="" blev="" anset="" for="" at="" indikere="" statistisk="" signifikante="" forskelle.="" elevens="" t-test="" blev="" brugt="" til="" at="" sammenligne="" tre="" eller="" flere="" grupper,="" og="" den="" bonferroni="" justerede="" p-værdi="" blev="" anvendt.="" alle="" statistiske="" analyser="" blev="" udført="" ved="" hjælp="" af="" jmp="" pro="" ver13.2.1="" (sas).="" værdier="" blev="" antaget="" at="" være="" afledt="" af="" en="" normalfordelt="" population="" og="" er="" vist="" som="" middel="" ±="" standardafvigelse="">

hvad er en cistanche

3|RESULTATER

3.1|Oxygengradientdannelse i hypoperfusionsmodellen

Vi bekræftede eksistensen af ​​en iltgradient i hypoperfusionsmodellen induceret af dækglasplacering ved direkte at vurdere iltspænding ved hjælp af fosforescens. Fosforescensintensitetsmåling kan forudsige en omtrentlig tendens i ilttryk (Hirakawa et al., 2015; Yoshihara et al., 2015). Vi observerede phosphorescensintensiteten af ​​en dækglasmodel af HK-2-celler behandlet med BTPDM1. Billeder af phosphorescensintensiteten viste hypoxi i det meste af området inde i dækglasset, men ingen hypoxi nær kanten, en observation, der antydede eksistensen af ​​en oxygengradient omkring kanten af ​​dækglasset i HK-2-celler dækket med en dækglas (figur 1a). Da intensiteten af ​​fosforescens afhænger af koncentrationen af ​​sonden og af excitationstiden, er en måling af fosforescenslevetid (PL) nyttig til kvantitativ analyse af ilttryk (Yoshihara et al., 2015). Til den kvantitative måling af iltspændingen af ​​dyrkede celler omkring kanten af ​​et dækglas opnåede vi således PLIM-billeder af HK-2-celler dækket med et dækglas i 30 minutter (figur 1b). PL udvidede sig, efterhånden som afstanden fra dækglaskanten steg. Vi bekræftede, at iltspændingen, beregnet ved hjælp af en kalibreringslinje (Figur S3), faldt, efterhånden som afstanden fra dækglaskanten steg, hvilket gav bevis for eksistensen af ​​en iltgradient omkring kanten af ​​dækglasset (Figur 1c). Undersøgelse af den tidsmæssige profil af fosforescensintensiteten indikerede, at iltgradienten begyndte at dannes 10 minutter efter dækglasplacering

(Figur 1d).

3.2|Unik HIF-1-fordeling i hypoperfusionsmodellen,"HIF-ring"

Vi undersøgte HIF-1-fordelingen i hypoperfusionsmodellen med en oxygengradient. ICC for HIF-1 i HK-2-celler viste en doughnut-formet forbedring på kanten af ​​det pimonidazol-positive område, som vi kaldte "HIF-ringen" (figur 2a). Intensiteten af ​​HIF-1-signalet var signifikant højere på HIF-ringen end i dets indre eller ydre områder (figur 2b). Dette fænomen blev bekræftet ved hjælp af ICC med et andet HIF-1-antistof (figur S4a) eller andre rørformede cellelinjer (figur S4b,c). Vi udførte også ICC-analyse af HIF-1 i andre former for dyrkede celler, såsom HeLa livmoderhalskræftceller. Selvom den svage vedhæftning af disse celler til et dækglas gjorde en detaljeret evaluering af HIF-1-fordelingen vanskelig, observerede vi en doughnut-formet forbedring af HIF-1 i HeLa-celler (figur S4d).

HIF-ringen og det pimonidazol-positive område begyndte at dannes flere timer efter dækglasplacering, og HIF-ringen fremstod statisk efter 3 timer (figur 2c). HIF-1 knockdown resulterede i forsvinden af ​​signalet HIF-1, inklusive HIF-ringen (Figur 2d, Figur S4e), hvilket indikerer, at HIF-ringen var afhængig af HIF-1.

For at undersøge muligheden for, at HIF-ringdannelse er afhængig af oxygen, undersøgte vi fordelingen af ​​HIF-1 i dækglasmodellen under inkubation med forskellige oxygenspændinger. Vi placerede et fad i hypoxiske kamre med forskellige iltspændinger umiddelbart efter at have lavet en dækglasmodel. Under hypoxisk inkubation observerede vi, at både HIF-ringen og det pimonidazol-positive område så ud til at udvide sig udad (figur 3a). Vi målte afstanden mellem hver HIF-ring og pimonidazol-positivt område fra en dækglaskant under normoxi, 4 procent O2 og 1 procent O2-inkubation. Både HIF-ringen og det pimonidazol-positive område udvidede sig udad, da den omgivende iltspænding faldt (figur 3b). Disse resultater indikerede, at HIF-ringen var afhængig af HIF-1 og iltspænding.

For at bekræfte, at doughnut-formet ophobning er et specifikt fænomen af ​​HIF, udførte vi ICC med husholdningsgener i dækglasmodellen. GAPDH- og actin-signalerne blev opretholdt over hele området af et dækglas og var sammenlignelige mellem regionen af ​​HIF-ringen og de andre regioner (figur S5a, b).

3.3|Måling af området for ilttryk i HIF-ringen

Vi bekræftede den ringformede forbedring af HIF-1-akkumulering i dyrkede celler dækket med et dækglas, et fænomen, der afhænger af iltspænding. For at bestemme rækkevidden af ​​involveret iltspænding analyserede vi ilttrykket af HIF-ringen ved hjælp af en phosphorescenslevetidsteknik. Vi fik PLIM-billeder af dækglasmodellen efter 3 0 min inkubation i 21 procent O2 eller 4 procent O2 (figur 4a). HIF-ringen dannet på kanten af ​​pimonidazolcirklen i ICC af HIF (figur 3b). Vi identificerede stedet i PLIM-billedet, der svarede til det pimonidazol-positive område i ICC af HIF og identificerede efterfølgende stedet svarende til HIF-ringen (figur 4b), ved hjælp af kvantitativ analyse af afstandsdataene fra HIF-ringen og pimonidazol-positivt område (figur 3b). Vi målte også området af PL'er i HIF-ringen og brugte derefter en kalibreringslinje (figur S3) til at beregne ilttrykket af HIF-ringen i 21 procent O2 (4,20 [3,46-4,97] ~35,9 [28,5-44,9] mmHg) og 4 procent O2 (2,19 [0,21-4,32] ~20,4 [17,1-24,1] mmHg) (figur 4c).

3.4|HIF-1 akkumulering under homogen iltspænding

Mens svage signaler af HIF-1 uden for HIF-ringen i en dækglasmodel kan tilskrives utilstrækkelig hypoxi, skal signalerne inde i ringen, hvor HIF-1 skulle have været kraftigere aktiveret af den lavere iltspænding, være styret af et ilt-uafhængigt fænomen. For at undersøge de fænomener, der forårsager en mangel på maksimal akkumulering af HIF-1 i det anoxiske område, der kun forekommer i hypoperfusionsmodellen, undersøgte vi, om der var en omvendt sammenhæng mellem iltspænding og HIF-1-akkumulering under inkubation med homogen iltspænding. Western blot-analyse af cellelysater under forskellige homogene oxygenspændinger viste en stigning i HIF-1-akkumulering under anoxisk inkubation (figur 5a). HRE-luciferase reporter-assayet indikerede også, at HIF-1-akkumulering blev øget med lavere oxygenspænding under betingelser med homogen oxygenspænding (figur 5b). Disse resultater indikerede, at akkumuleringen af ​​HIF-1 var iltspændingsafhængig, med den maksimale akkumulering observeret i det anoxiske område. Karakteristikaene for HIF-1 bør variere mellem en hypoperfusionsmodel og en model med homogen iltspænding. Vi spekulerede i, at det unikke fænomen med HIF-1-akkumulering i denne hypoperfusionsmodel kan være bestemt af en anden faktor end iltspænding.

3,5|HIF-ringdannelse var uafhængig af ph.d

Vi undersøgte, om HIF-1-nedbrydning, en mulig mekanisme for HIF-ringdannelse, var opreguleret inde i HIF-ringen. Denne idé syntes at være ugyldig, fordi hydroxylering ved Ph.D., en hastighedsbegrænsende proces med HIF-nedbrydning, kræver oxygen som et substrat. Cobaltchlorid er meget udbredt som en kemisk HIF-stabilisator. Vi konstruerede en dækglasmodel af HK-2-celler behandlet med cobaltchlorid og udførte ICC-analyse af HIF. HIF-1-signalet steg ikke inde i HIF-ringen, hvilket blev uklart på grund af det øgede signal af HIF-1 uden for ringen (figur 6c). ICC af HK-2-celler med knockdown af PHD2, som menes at være den primære HIF-prolylhydroxylase i cellekultureksperimenter (Strowitzki et al., 2019), producerede lignende resultater (figur S6). Disse resultater indikerede, at PHD-VHL-aksen for HIF-nedbrydning ikke var relateret til HIF-ringdannelse.

3,6|Indvirkning af pH på HIF-1-akkumulering

En tidligere rapport beskrev brugen af ​​en dækglasmodel af hjertemyocytter, der havde et fald i pH inde i dækglasset (Pitts & Toombs, 2004). Vi undersøgte pH under et dækglas og dets indvirkning på HIF-ringdannelse. Vi behandlede HK-2-celler med en intracellulær pH-indikator, hvis fluorescensintensitet tillader evaluering af pH i cellerne. Live billeddannelse viste, at pH faldt over det meste af det indvendige område, men ikke nær kanten af ​​dækglasset, hvilket tyder på eksistensen af ​​en pH-gradient rundt om kanten i dækglasmodellen (figur 6a). Kvantitativ analyse af korrelationen mellem fluorescensintensitet og afstand fra en dækglaskant viste, at førstnævnte blev forhøjet, efterhånden som afstanden øgedes, en observation, der understøttede eksistensen af ​​pH- og oxygengradienter omkring dækglaskanten (figur 6b). Western blot-analyse af cellelysater under homogene oxygenkoncentrationer viste, at inkubation med pH 5,0-medium undertrykte HIF-1-akkumulation under hypoxiske forhold (figur S7a-d). Vi bekræftede også, at HIF-1-akkumulering under hypoxi under forskellige pH-forhold faldt til under pH 6,0 (figur S8a-c).

En rapport understregede vigtigheden af ​​mildt sure forhold, ved pH omkring 6.0. Ifølge denne undersøgelse forsurede reoxygenering efter hypoxi mediet, hvilket forårsagede nukleolær sekvestrering af VHL. Til gengæld blev HIF-nedbrydning forhindret i C2C12-myotuber, PC12-neuroner og 786-0 nyrekræftceller (Mekhail et al., 2004). I vores undersøgelse var der ingen ændring i VHL-fordeling i tubulære celler mellem regionerne med HIF-1-akkumulering og dem, hvori den var undertrykt, i en dækglasmodel med pH-værdier fra 5.0 til 7,4 (Figur S9a–c). Rørformede celler udsættes for en lang række pH-forhold (Burke et al., 1999; Pavuluri et al., 2019; Raghunand et al., 2003), så vi undersøgte variationen af ​​HIF-ringen i medier med forskellig pH værdier mellem 5,0 og 8,5. HIF-ringen blev tydeligt observeret i medier med pH 8,5 og 7,4 (figur 6c). HIF-ringen eksisterede også ved pH 6,5, men var tilsløret (figur 6c). HIF-1-signalet blev dæmpet i hele området af et dækglas ved pH 5,0. (Figur 6c). Vi udførte yderligere kvantitativ analyse af positionsforholdet mellem HIF-ringen og kanten af ​​det pimonidazol-positive område (figur 7a) og opdagede, at ringens position varierede afhængigt af pH. Den indre cirkel havde en tendens til at udvide sig udad ved pH 6,5 sammenlignet med pH 7,4, mens den ydre cirkel krympede signifikant indad ved pH 8,5 baseret på kanten af ​​det pimonidazol-positive område (figur 7b, c). Vi bekræftede også, at aktiviteterne af husholdningsgener blev opretholdt i en dækglasmodel under sur inkubation (figur S10). Derfor ser pH ud til at spille en vigtig rolle i den mekanisme, der ligger til grund for HIF-ringdannelse.

4|DISKUSSION

I denne undersøgelse identificerede vi en unik fordeling af HIF-1 i renale tubulære celler ved hjælp af en model for hypoperfusion induceret af dækglasplacering. Vi fandt, at dannelsen og vedligeholdelsen af ​​HIF-ringen blev reguleret af oxygentryk og pH, som begge eksisterede i en gradient i dækglaskanten af ​​en dækglasmodel. Baseret på disse resultater foreslår vi en mulig mekanisme for HIF-ringdannelse, der involverer HIF-1, der akkumulerer med faldende iltspænding, og akkumuleringen undertrykkes på grund af lav pH inden for en vis afstand fra en dækglaskant (Figur 8) ).

Hypoperfusion induceres af sjældenhed af mikrovaskulatur i CKD (Mimura & Nangaku, 2{{20}}10; Nangaku, 2006). I vores tidligere arbejde brugte vi in ​​vivo billeddannelse til at demonstrere tilstedeværelsen af ​​en oxygengradient i renale tubulære celler af normale musenyrer (Hirakawa et al., 2018). Iltspænding forventes også at være heterogen i tubulære celler ved CKD. Det er dog stadig uklart, om eksistensen af ​​hypoperfusion med en iltgradient påvirker forsvarssystemet mod hypoxi, HIF. I denne undersøgelse undersøgte vi HIF-fordeling i dyrkede proksimale tubuliceller under en hypoperfusionsmodel og opdagede, at oxygengradienten i dyrkede renale tubulære celler med succes blev modelleret ved hjælp af et rundt glasdækglas. Beviser fra eksperimenter med homogen oxygenspænding indikerede, at HIF-1, hvis hydroxylering og efterfølgende nedbrydning hovedsageligt er oxygenafhængig, akkumulerede. Det vil sige, at mængden af ​​HIF-1 stiger, når iltspændingen falder. I vores dækglasmodel blev HIF-1 imidlertid undertrykt i det anoxiske område og havde den højeste akkumulering i en vis afstand fra en dækglaskant. Denne doughnut-formede HIF-akkumulering er aldrig blevet vist før. Vi viste, at HIF-ringdannelse kunne observeres uanset iltspændingen i den inkuberende atmosfære, men dens placering var afhængig af iltspændingen. Området for iltspænding på HIF-ringen blev målt til cirka 4-20 mmHg ved hjælp af PLIM med BTPDM1. De fleste tidligere undersøgelser, som var fokuseret på dyrkede celler i en atmosfære med en homogen iltspænding, fandt, at mængden af ​​HIF-1-protein steg i de hypoxiske eller anoxiske områder (Ameri et al., 2002; Carrera et al. , 2014). HIF-ringdannelsen må således i vores model have været påvirket af en anden faktor end iltspændingen; den var uafhængig af Ph.D., en hastighedsbegrænsende proces med HIF-nedbrydning. Et gennembrud i belysningen af ​​mekanismen for HIF-ringdannelse var vores opdagelse af pH-gradientens rolle, såvel som oxygengradienten, i dæklæbemodellen, hvilket begrænsede tilstrømningen af ​​medierne svarende til en in vivo hypoperfusion model. I denne hypoperfusionsmodel faldt den intracellulære pH, efterhånden som afstanden fra dækglaskanten steg, og en pH-gradient blev observeret omkring dækglaskanten. Vi viste, at HIF-1-akkumulering blev undertrykt ved lav pH, omkring pH 5,0, sammenlignet med inkubation ved omkring neutral pH under homogen oxygenspænding. Den ydre kant af HIF-ringen udvidede sig udad ved pH 6,5, og den indre kant af HIF-ringen krympede indad ved pH 8,5, baseret på kanten af ​​det pimonidazol-positive område. HIF-ringen blev sløret under sure forhold, og HIF-1-signalet forsvandt ved pH 5,0. Således belyste vi vigtigheden af ​​pH for HIF-ringdannelse i en dækglasmodel. Vi demonstrerede muligheden for, at HIF-ringen blev dannet ved undertrykkelse af HIF-1-akkumulering ved lav pH inde i ringen.

Adskillige tidligere undersøgelser med dækglasmetoden har brugt kræftceller. Ifølge en rapport, der bruger den humane hepatomcellelinje Hep3B, som udtrykker den oxygenafhængige rødforskydning af grønt fluorescerende protein (AcGFP1), viste levende billeddannelse af celler dækket med et rektangulært dækglas en rødforskydning, efterhånden som afstanden fra en dækglaskant steg (Takahashi & Sato, 2010). Emissionsspektret for hepatomceller skiftede fra bølgelængden af ​​grønt fluorescerende protein (GFP) fluorescens til rødt, da iltspændingen faldt. I en anden undersøgelse blev iltspændingen af ​​SCC-7-celler med et rundt 15-mm dækglas målt ved hjælp af en phosphorescenslevetidsteknik. Iltspændingen var 6,9 mmHg og 166 mmHg, beregnet ud fra PL, som var henholdsvis 3,89 µs og 893 µs, 0-2 mm inde og 0-1 mm uden for dækglaskanten (Yoshihara et al., 2015). Dækglasmetoden er også blevet brugt med hjertemyocytter, et system, der har tiltrukket sig opmærksomhed som en lovende in vivo iskæmi-reperfusionsmodel. Kelly et al viste, at myocytter dækket med et dækglas gennemgik markante morfologiske ændringer over tid, ledsaget af ændringer i mitokondrielt membranpotentiale og plasmamembrandynamik, hvilket til sidst resulterede i myocytdød. De viste også, at den intracellulære pH af myocytter dækket med et dækglas falder hurtigt til ca. pH 4 i midten af ​​et dækglas (Pitts & Toombs, 2004). En dækglasmodel, der hæmmer oxygen- eller ernæringsdiffusion til dyrkede celler under et dækglas, kan efterligne en in vivo-model af iskæmiske, normale og marginale zoner i henholdsvis midten, ydersiden og kanten af ​​et dækglas. Adskillige undersøgelser har brugt denne model som en iskæmi-reperfusionsmodel af myocytter in vitro (Chun et al., 2015; Pitts et al., 2008; Solhjoo & O'Rourke, 2015; Wang et al., 2012). Så vidt vi ved, er vores undersøgelse den første, der anvender en dækglasmetode til rørformede celler. I vores system var afstanden fra en dækglaskant til et område svarende til 10 mmHg iltspænding, hvor pimonidazol skulle blive positivt, 1,22 mm, og iltspændingen faldt til så lavt som nul inden for en afstand af 2 mm fra dækglaskanten . Dette resultat kan være foreneligt med tidligere rapporter, der bruger omkring 15 mm dækglas, hvilket viser eksistensen af ​​en iltgradient mindst inden for 2 mm fra kanten (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Vi undersøgte hastigheden af ​​apoptose af celler under dækglas (figur S11) og opdagede, at GAPDH og actin blev opretholdt selv inde i HIF-ringen, hvilket indikerer, at HIF-ringen ikke kun var forårsaget af celleapoptose eller død inde i HIF-ringen.

Flere undersøgelser har målt iltspændingen i nyrerne ved hjælp af forskellige metoder. Et par eksempler på iltspændingsmåling af normale nyrer var som følger: 50 mmHg og 30 mmHg i cortex og medulla ved hjælp af mikroelektroder; og 49 mmHg og 41 mmHg i S1- og S2-segmenterne af tubulære celler i cortex ved hjælp af PLIM (Hirakawa et al., 2017, 2018; Zhang et al., 2014). Iltspændingen af ​​syge nyrer ville være lavere. Ifølge en tidligere rapport, der brugte iltmikroelektroder, havde diabetiske rotter lavere renal parenkymal iltspænding: 36 mmHg og 11 mmHg i henholdsvis cortex og medulla (Heyman et al., 2013; Palm et al., 2003). Da iltmikroelektroder måler den gennemsnitlige parenkymale iltspænding, forventes et bredere område i syge nyrer. Den intracellulære iltspænding faldt til nul mmHg i en model af en iskæmisk nyre, hvis laterale nyrearterie og vene var klemt fast (Hirakawa et al., 2015). I betragtning af disse fund syntes området for iltspænding på HIF-ringen, cirka 4-20 mmHg, at være plausibelt in vivo.

Vi opdagede endvidere, at pH påvirkede HIF-ringdannelse såvel som iltspænding. Da tubulære epitelceller i nyren kontinuerligt udsættes for urinvæske, bør pH i tubulære celler påvirkes af urinens pH. I betragtning af det brede pH-område i urin besluttede vi at undersøge celler inkuberet ved et pH-område på 5.0–8.5. Der har været undersøgelser af pH-området i normale nyrer. En undersøgelse viste, at cortexens pH var 7,39 ± 0.{{10}}8, og at medulla var 7,20 ± {{2{{39} }}}.09, som målt ved hjælp af mikroelektroder (Burke et al., 1999). En anden undersøgelse, der brugte MRI-baseret pH-billeddannelse, viste pH-værdier på henholdsvis 7,3 ± 0.13 og 7.0 ± 0,29 (Raghunand et al., 2003). Det blev rapporteret, at nyrernes pH faldt fra 6,5 ​​til 6,32 og til så lavt som 5,83 i et alvorligt tilfælde i en musemodel af CKD med acidose (Pavuluri et al., 2019). Disse observationer har givet bevis for pH-fald og variation i CKD. Indvirkningen af ​​pH på HIF-1 induceret af kronisk hypoxi i CKD er imidlertid ikke blevet tilstrækkeligt undersøgt. I denne undersøgelse blev der observeret et skift af HIF-ringen mellem pH 6,5 og pH 7,4, et pH-område, der er plausibelt ved CKD. Dette resultat understøttede hypotesen om, at et mildt fald i pH påvirker HIF-1-akkumulering ved CKD. Baseret på bevis for et pH-fald til under 6,0 i alvorlige tilfælde af CKD, er det også nødvendigt at vurdere HIF-1 fysiologiske tilstand ved lavere pH. Selvom der har været rapporter om, at et surt miljø, selv ved normoksi, stabiliserer HIF-1, undersøgte de fleste af disse rapporter forhold med mild surhedsgrad over pH 6,0 (Filatova et al., 2016; Mekhail et al., 2004) . I dette arbejde viste vi undertrykkelse af HIF-1-akkumulering i tubulære celler ved pH 5,0 og dæmpning af HIF-1-signaler i en dækglasmodel inkuberet ved pH 5,0. Derfor kan nyre-pH-fald i CKD in vivo være korreleret med utilstrækkelig HIF-aktivering såvel som med uremiske toksiner i den hypoxiske nyre, hvilket forværrer CKD-progression (Tanaka et al., 2013).

Vores undersøgelse har flere begrænsninger. For det første, i området for hypoperfusion, bør dyrkningsmediet være mangelfuldt i næringsstoffer, ud over tilstedeværelsen af ​​iltmangel og nedsat pH. Det er imidlertid vanskeligt at afgrænse virkningerne af pH, iltspænding og andre faktorer induceret af hypoperfusion. I kroppen forekommer iskæmi, patologisk hypoperfusion af blodet forårsaget af en kombination af lavt iltindhold og lave næringsstoffer, i organer og celler. Det er vigtigt at forstå forskellene mellem hypoxi sensing og iskæmi sensing. På trods af vanskeligheden med at belyse den biologiske effekt af hver faktor, er vores hypoperfusionsmodel fysiologisk plausibel, idet den efterligner den patologiske status in vivo. For det andet kræver det at lave en dækglasmodel dygtighed og øvelse, da størstedelen af ​​cellerne lejlighedsvis blev løsrevet under fjernelse af et dækglas, især når man bruger den traditionelle metode (Figur S2a). Dette problem afhang af den anvendte cellelinje. For eksempel var det svært for os at anvende en dækglasmodel på HEK 293-celler, fordi deres vedhæftning til et dækglas var relativt svag. For det tredje var det ønskeligt at minimere beskadigelse af dyrkede celler under et dækglas. Antallet af beskadigede celler steg efterhånden som den periode, hvor de var dækket, steg, som vist ved analysen af ​​apoptose. Vi bestemte, at 3 timer var passende til at estimere HIF-ringen, når den så ud til at være statisk, og cirka så få som 10 procent af cellerne blev apoptotiske (figur S11). Den fjerde begrænsning var vanskeligheden ved at fastgøre dyrkede celler til et dækglas på en ensartet måde i hver prøve (figur S2b, c). Forskellen i tilknytning mellem en traditionel og en alternativ metode til at lave en cover-lip model kunne også have påvirket undersøgelsen. Vi målte området for iltspænding svarende til HIF-ringen ved hjælp af en phosphorescenslevetidsteknik, hvor vi skabte en dækglasmodel ved hjælp af en traditionel metode. Da HIF-ringen under immuncytokemi blev visualiseret ved hjælp af en alternativ metode, kan den sande iltspænding være anderledes. Vi minimerede disse fejl ved at bruge beviset for, at pimonidazol var positiv ved 10 mmHg eller mindre af iltspændingen. Den femte begrænsning er, at den intracellulære pH ikke nødvendigvis er den samme som dyrkningsmediets pH. Adskillige tidligere rapporter har vist, at intracellulær pH ​​er i overensstemmelse med medium pH til en vis grad i dyrkede celler (Michl et al., 2019), vi kunne kun vurdere tendensen i intracellulær pH ​​ved at ændre medium pH. In vivo er forholdet mellem pH i intracellulære og ekstracellulære regioner, såsom urin eller kropsvæske, mere kompliceret end i dyrkede celler. Yderligere undersøgelser af den måde, hvorpå pH-skift regulerer akkumuleringen af ​​HIF-1-protein in vivo, vil derfor være nødvendige for fremtiden.

Cistanche fordel: forbedre nyrefungere

En anden begrænsning er, at pH bør have en effekt på hypoximarkøren, pimonidazol. Vi sammenlignede afstanden af ​​kanten af ​​det pimonidazol-positive område fra midten af ​​et dækglas under forskellige pH-forhold i vores dækglasmodel. Kanten af ​​det pimonidazol-positive område var sammenlignelig mellem pH 6,5, 7,4 og 8,5 (figur S12a,b). En tidligere undersøgelse viste også opretholdelsen af ​​pimonidazolbinding ved forskellige pH-værdier (Kleiter et al., 2006). Baseret på disse beviser konkluderede vi, at pimonidazol er en passende hypoximarkør til vores dækglasforsøg. Den endelige begrænsning er, givet et iltspændingsområde mellem ca. 4 mmHg og 20 mmHg (0,52 procent O2 til 2,6 procent O2) af HIF-ringen, Pt(II)- og Pd(II)-porphyriner, som er meget udbredt som biologiske oxygensonder, har fordele til at måle meget lave oxygenkoncentrationer på grund af deres betydeligt længere phosphorescenslevetid sammenlignet med dem, der anvender Ir(III)-komplekser (Yoshihara et al., 2017). Men generelt har en kvantitativ iltmåling baseret på fosforescens, beregnet ved hjælp af Stern-Volmer-ligningen, bedre ydeevne ved lave O2-områder (Papkovsky & Zhdanov, 2016). Adskillige tidligere undersøgelser har vist den Ir(III)-kompleksbaserede måling af iltspændinger så lave som ca. 10 mmHg (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Derfor mener vi, at iltspændingens rækkevidde af HIF-ringen bør være et præcist resultat.

5|KONKLUSIONER

Sammenfattende fandt vi ud af, at forståelse af rollerne for både ilt og pH er afgørende for at forstå HIF-1 fysiologiske tilstand i CKD og kan opnås ved at undersøge tubulære celler med hypoperfusion. Dækglasmodellen, med dens begrænsninger af tilstrømningen af ​​medier, var en god model for hypoperfusion in vivo, især i tubuli ved CKD, da sjældenhed af peritubulære kapillærer er et væsentligt kendetegn for CKD (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Denne hypoperfusionsmodel kan også efterligne oxygen- og pH-gradienterne in vivo, såsom tumorer og iskæmiske læsioner. Modellen giver en lovende tilgang til belysningen af ​​disse biologiske mekanismer.

INTERESSEKONFLIKT

Alle forfattere har ingen interessekonflikter at erklære.

FORFATTERNES BIDRAG

Alle forfattere bidrog til dannelsen af ​​det overordnede koncept. TH udførte de overordnede forsøg. TH og YH analyserede resultaterne og lavede figurerne. TH skrev det originale manuskript. KM, TY og ST udførte eksperimentet ved hjælp af en phosphorescens levetidsteknik og redigerede den del af manuskriptet. YH, TT og MN redigerede det overordnede manuskript. Alle forfatterne har læst og godkendt det endelige manuskript.

REFERENCE

Akiyama, H., Takahashi, I., Shimoda, Y., Mukai, R., Yoshihara, T., & Tobita, S. (2018). Ir(iii) kompleks-baseret oxygen-billeddannelse af levende celler og øjenfundus med et gated ICCD-kamera. Photochemical and Photobiological Sciences, 17(6), 846–853.

Akizawa, T., Nangaku, M., Yamaguchi, T., Arai, M., Koretomo, R., Maeda, K., Miyazawa, Y., & Hirakata, H. (2019). Enarodustat, konverterings- og vedligeholdelsesbehandling for anæmi hos hæmodialysepatienter: Et randomiseret, placebokontrolleret fase 2b-studie efterfulgt af et langtidsforsøg. Nephron, 143(2), 77–85.

Ameri, K., Burke, B., Lewis, CE, & Harris, AL (2002). Regulering af et rotte-VL30-element i humane brystkræftceller i hypoxi og anoksi: HIF's rolle -1. British Journal of Cancer, 87(10), 1173-1181.

Asai, H., Hirata, J., Hirano, A., Hirai, K., Seki, S., & Watanabe- Akanuma, M. (2016). Aktivering af aryl-carbonhydrid-receptor medierer undertrykkelse af hypoxi-inducerbar faktor-afhængig erythropoietin-ekspression af indoxylsulfat. American Journal of Physiology. Cellefysiologi, 310(2), C142-C150.

Burke, TJ, Malhotra, D., & Shapiro, JI (1999). Faktorer, der opretholder en pH-gradient i nyren: rolle af vaskulaturarkitekturen. Kidney International, 56(5), 1826–1837.

Carrera, S., Senra, J., Acosta, MI, Althubiti, M., Hammond, EM, de Verdier, PJ, & Macip, S. (2014). HIF-1alfa-transkriptionsfaktorens rolle i øget celledeling ved fysiologiske iltspændinger. PLoS One, 9(5), e97938.

Chen, N., Hao, C., Peng, X., Lin, H., Yin, A., Hao, L., Tao, Y., Liang, X., Liu, Z., Xing, C., Chen, J., Luo, L., Zuo, L., Liao, Y., Liu, BC, Leong, R., Wang, C., Liu, C., Neff, T., … Yu, KHP (2019) ).

Roxadustat til anæmi hos patienter med nyresygdom, der ikke er i dialyse. New England Journal of Medicine, 381(11), 1001-1010.

Chen, N., Qian, J., Chen, J., Yu, X., Mei, C., Hao, C., Jiang, G., Lin, H., Zhang, X., Zuo, L., He, Q., Fu, P., Li, X., Ni, D., Hemmerich, S., Liu, C., Szczech, L., Besarab, A., Neff, TB, … Valone, F.

H. (2017). Fase 2 undersøgelser af oral hypoxi-inducerbar faktor prolylhydroxylasehæmmer FG-4592 til behandling af anæmi i Kina. Nephrology, Dialyse, Transplantation, 32(8), 1373–1386.

Chiang, CK, Tanaka, T., Inagi, R., Fujita, T., & Nangaku, M. (2011). Indoxylsulfat, et repræsentativt uremisk toksin, undertrykker erythropoietinproduktion på en HIF-afhængig måde. Laboratorieundersøgelse, 91(11), 1564–1571.

Chun, WJ, Nah, DY, Bae, JH, Chung, JW, Lee, H., & Moon, IS(2015). Glucose-insulin-kaliumopløsning beskytter ventrikulære myocytter fra neonatale rotter i en in vitro dækglasiskæmi/reperfusionsmodel. Korean Circulation Journal, 45(3), 234–241.

Coyne, DW, Goldsmith, D., & Macdougall, IC (2017). Nye muligheder for anæmi af kronisk nyresygdom. Nyre International Supplement, 7(3), 157-163. kys.2017.09.002

Deng, A., Arndt, MA, Satriano, J., Singh, P., Rieg, T., Thomson, S. et al (2010). Nyrebeskyttelse ved kronisk nyresygdom: hypoxi-inducerbar faktoraktivering vs. angiotensin II-blokade. American Journal of Physiology. Renal Physiology, 299(6), F1365–F1373.

Filatova, A., Seidel, S., Bogurcu, N., Graf, S., Garvalov, BK, & Acker, T. (2016). Acidose virker gennem HSP90 på en Ph.D./VHL-uafhængig måde for at fremme HIF-funktion og stamcellevedligeholdelse ved gliom. Cancer Research, 76(19), 5845-5856. KAN-15-2630

Goldfarb, M., Rosenberger, C., Abassi, Z., Shina, A., Zilbersat, F., Eckardt, KU, Rosen, S., & Heyman, SN (2006). Akut-på-kronisk nyresvigt hos rotter: funktionel kompensation og hypoxitolerance. American Journal of Nephrology, 26(1), 22–33.

Heyman, SN, Rosenberger, C., Rosen, S., & Khamaisi, M. (2013). Hvorfor er diabetes mellitus en risikofaktor for kontrastinduceret nefropati? BioMed Research International, 2013, 123589.

Hirakawa, Y., Mizukami, K., Yoshihara, T., Takahashi, I., Khulan, P., Honda, T., Mimura, I., Tanaka, T., Tobita, S., & Nangaku, M. (2018). Intravital phosphorescens-livstidsbilleddannelse af nyrebarken måler nøjagtigt renal hypoxi. Kidney International, 93(6), 1483-1489.

Hirakawa, Y., Tanaka, T., & Nangaku, M. (2017). Renal hypoxi i CKD; Patofysiologi og påvisningsmetoder. Frontiers in Physiology, 8, 99.