2.6. Udtryk af Caspase-3 og Caspase-6

Glycoside af cistanche kan også øge aktiviteten af ​​SOD i hjerte- og levervæv og signifikant reducere indholdet af lipofuscin og MDA i hvert væv, hvilket effektivt fjerner forskellige reaktive iltradikaler (OH-, H₂O₂ osv.) og beskytter mod DNA-skader forårsaget af OH-radikaler. Cistanche phenylethanoid glycosider har en stærk opfangningsevne af frie radikaler, en højere reducerende evne end C-vitamin, forbedrer aktiviteten af ​​SOD i spermsuspension, reducerer indholdet af MDA og har en vis beskyttende effekt på sædmembranens funktion. Cistanche polysaccharider kan øge aktiviteten af ​​SOD og GSH-Px i erytrocytter og lungevæv fra eksperimentelt senescent mus forårsaget af D-galactose, samt reducere indholdet af MDA og kollagen i lunge og plasma, og øge indholdet af elastin, har en god rensende effekt på DPPH, forlænge hypoksitiden hos senescent mus, forbedre aktiviteten af ​​SOD i serum og forsinke den fysiologiske degeneration af lunge hos eksperimentelt senescent mus Med cellulær morfologisk degeneration har forsøg vist, at Cistanche har den gode antioxidantevne og har potentialet til at være et lægemiddel til at forebygge og behandle hudaldringssygdomme. Samtidig har echinacosid i Cistanche en betydelig evne til at opfange DPPH-frie radikaler og har evnen til at opfange reaktive oxygenarter og forhindre frie radikal-induceret kollagen-nedbrydning, og har også en god reparationseffekt på anionskader af thymin frie radikaler.

Klik her for at kende Cistanche Tubulosa for antioxidant

【For mere information:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

TgAPP-mus viste en stigning i caspase{0}}-genekspression (figur 8C1, H1), som var signifikant og større end 30 procent sammenlignet med hippocampi af WT-mus (figur 8H1; p < 0,05). Hvad angår caspase-6-ekspression, blev der ikke observeret forskelle mellem transgene og ikke-transgene mus (figur 8C2, H2).

Quercetin- og rutinbehandlinger var i stand til at sænke caspase{0}}-mRNA-niveauer i hippocampus på en statistisk signifikant måde (figur 8H1; p < 0.05), med inhiberingsprocenter på omkring 17 procent og 27 procent for henholdsvis hun- og hanmus. I cerebral cortex blev der kun observeret signifikante forskelle i behandlingen med rutin hos mænd (figur 8C1; p < 0,05).

Om caspase-6 udviste quercetin- og rutinbehandlinger ikke nogen statistisk signifikant effekt i cortex eller hippocampus (figur 8C2, H2), selvom caspase-6 hos TgAPP-hanner i sidstnævnte viste en tendens til at fald (figur 8H2).

2.7. Inflammationsmarkører

Resultaterne opnået for genekspression af de inflammatoriske mediatorer IL-1, TNF- og IFN- er vist i figur 9.

I TgAPP var der en signifikant stigning i IL{0}}-genekspression på omkring 20 procent i cortex og hippocampus hos begge køn sammenlignet med WT-mus (Figur 9C1, H1; p < 0,05). Med hensyn til TNF-, selvom højere mRNA-niveauer er vist i TgAPP, er de ikke statistisk signifikante i WT-mus (figur 9C2, H2). Med hensyn til IFN- var der en stigning på omkring 30 procent i dets udtryk hos mænd, hvilket kun var statistisk signifikant i cortex (figur 9C3; p < 0,05).

Behandlinger med quercetin og rutin, både hos hunner og hanner, var i stand til at mindske IL{{0}}-ekspression i hjernebarken og hippocampus sammenlignet med kontrol-TgAPP-mus (figur 9C1, H1; p < {{8 }}.05), opnår værdier svarende til værdierne for WT-mus og især lavere i hippocampi hos hanmus (figur 9H1; p < 0,05).

Den samlede effekt af begge flavonoidbehandlinger på IL{{0}}-ekspression blev ikke observeret med TNF- eller med INF-. TgAPP-hanner gennemgik således efter quercetinbehandling et signifikant fald i hippocampus TNF- (figur 9H2; p < 0.05) og i kortikalt IFN-ekspression (figur 9C3; p < 0,05).

2.8. Vurdering af degenererende neuroner og deres projektioner

Ingen karakteristiske tegn på neurodegeneration blev observeret i den alder, hvor de transgene TgAPP-mus blev testet, sammenlignet med WT-mus, og behandlinger med quercetin og rutin viste heller ikke nogen ændring i 4 uger sammenlignet med TgAPP (Figur S1, Supplerende data).

2.9. Ekspression af ionotrope glutamatreceptorer

Der blev ikke fundet nogen signifikante forskelle i receptorekspression, idet man sammenlignede værdierne opnået for kontrol-TgAPP-musene med dem opnået for WT-musene. Der var heller ingen bemærkelsesværdige virkninger på ekspressionen af ​​disse ionotrope receptorer i nærvær af quercetin- eller rutinbehandling (tabel S5, Supplerende data).

3. Diskussion

Formålet med vores nuværende undersøgelse var at vurdere virkningen af ​​to flavonoider, quercetin og rutin, i de første stadier af AD-patogenese, uanset deres effekt på neurodegeneration og/eller kognitiv funktion. Cortex og hippocampus var de områder af hjernen, der blev analyseret, da de er de mest påvirkede hjernestrukturer i AD. Det bør tages i betragtning, at quercetin og rutin blev indgivet gennem en formuleret diæt indeholdende en af ​​de to flavonoider for i en AD-dyremodel at efterligne indtagelsen af ​​en sund menneskelig diæt indeholdende en aktiv ingrediens.

Især transgenet APPswe i C57B6-musen udøvede en signifikant indflydelse på GSH/GSSG-forhold, MDA-niveauer, antioxidantenzymkapacitet, APP-ekspression, BACE1-aktivitet og caspase-3- og IL-1-ekspression. Mens APP-mutationer hos mennesker generelt resulterer i typisk AD, er de overvejende forbundet med udelukkende amyloidpatologi i APP-transgene mus, og der er ingen mærkbar neurodegeneration [14,15], da der ikke var observeret karakteristiske tegn hos vores transgene mus TgAPP, i modsætning til WT-musene (Supplerende data, figur S1). Modfarvning med 40 -6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) af hippocampale neuroner gjorde det muligt for os at observere den nukleare morfologi, da denne forbindelse er et fluorescerende farvestof for nukleinsyrer. Vi observerede ikke fragmenterede eller lobulære kerner, typisk apoptotiske; vi observerede heller ikke nogen bemærkelsesværdige forskelle ved at sammenligne de hippocampale histologiske sektioner af den transgene kontrollinje TgAPP vedrørende WT-sektionerne; Vi observerede heller ikke nogen forskelle mellem quercetin- og rutinbehandlingerne vedrørende kontrol-TgAPP-musene.

I panelet af AD biokemiske egenskaber, der skulle analyseres, fokuserede vi primært på at bestemme GSH/GSSG-forholdet på en af ​​de to flavonoiddiæter, da udtømning af GSH-niveauer repræsenterer en af ​​de vigtigste tidlige biokemiske markører i AD [16,17 ] og er blevet observeret under dets patogenese og sygdomsprogression. Måling af hjernens GSH-niveauer [18] og for nylig, blodets GSH-niveauer [19] har været lovende som diagnostiske markører for de tidlige stadier af AD. Desuden er der også gjort en indsats for at supplere endogene GSH-lagre af sig selv eller deres forstadier [20-22]. I vores undersøgelse blev et fald i den cellulære reducerende kraft (GSH/GSSG) observeret i TgAPP-musene vedrørende WT-dyr, hos både hanner og hunner og i begge områder af hjernen. I cortex og hippocampus hos både WT- og TgAPP-mus var GSH/GSSG-forholdet lavere hos hanner end hos hunner. Quercetin- og rutin-diæter øgede signifikant GSH/GSSG-forholdet sammenlignet med ubehandlede TgAPP-mus, og denne stigning var mere udtalt i hippocampus. Ændringerne i GSH- og GSSG-niveauer og GSH/GSSG-forholdet efter quercetin- eller rutinbehandling af mænd med hensyn til stigende redoxkraft var mere fremtrædende end hos kvinder. Resultaterne fra vores bestemmelser kan afsløre et vigtigt grundlag for kønsrelaterede forskelle i Tg2576-mus i modtageligheden over for oxidative skader af makromolekyler på den ene side, da glutathionsystemet er en alsidig reduktionsmiddel i flere biologiske funktioner og i virkningen af ​​forebyggende flavonoid diæter til at genoprette sin fysiologiske status på den anden side. Som vi vil se gennem denne diskussion, har vi sat stigningen i GSH/GSSG-forholdet som hovedaksen, der kan forklare det sæt af effekter, der observeres i TgAPP-musene.

Det er for nylig blevet foreslået, at GSH/GSSG-forholdet, snarere end blot at fungere som en redoxbuffer, i stedet ville fungere som en hovedregulatorisk mekanisme, der tillader proteiner at opnå deres native konformation og funktionalitet ved at kontrollere thiol-disulfid-balancen i det cellulære proteom. Kort sagt opstår glutathionsystemet som essentielt for at bevare et sundt proteom, hvilket viser, at afbrydelse af glutathion-redox-homeostase (dvs. genetisk eller farmakologisk) øger proteinaggregering på grund af forstyrrelser i effektiviteten af ​​autofagi [23]. Derfor kan strategier, der sigter på at opretholde glutathion-redox-homeostase, have terapeutisk potentiale i sygdomme forbundet med proteinaggregering, såsom AD. Nært beslægtet med bevarelsen af ​​proteomet er ubiquitin-proteasom-nedbrydningsmaskineriet, som er involveret i patogenesen af ​​AD. Proteasomet nedbryder selektivt flere substrater, der er afgørende for at opretholde neuronal homeostase, herunder katabolismen af ​​oxiderede og aggregerede proteiner. BACE1 gennemgår ubiquitinering, og det er blevet påvist, at blokering af ubiquitin-proteasom-vejen vil hæmme BACE1-nedbrydning og følgelig føre til øget produktion af BACE1 enzymatisk aktivitet, mere -spaltningsprodukt C99 og stigninger i både A 1-40 og A { {8}} i neuronale og ikke-neuronale celler [10]. Vores tidligere undersøgelser har fundet ud af, at både flavonoider, quercetin og rutin, påvirker forskellige signalveje og molekylære netværk forbundet med moduleringen af ​​proteasomfunktionen i neuroblastomceller [9]. Derudover er det blevet påvist, at neuroner suppleret med reduceret glutathion (GSH) genvandt proteasomaktiviteten og reducerede aggregatdannelse [11], da proteasomfunktionen er redoxstatusreguleret [24]. Derfor er stigningen i GSH/GSSG-forholdet, som dyrene oplever efter at have en quercetin- eller rutin-diæt, i overensstemmelse med moduleringen af ​​proteasomet med quercetin og rutin, vist tidligere ex vivo.

Som tidligere nævnt fører redoxubalance til stærkt oxidativt modificerede proteiner, der har tendens til at akkumulere og skabe aggregater, hvilket resulterer i proteasomsvækkelse [25]. I betragtning af den afgørende rolle af oxidativt stress i patogenesen af ​​AD, blev biomarkører for oxidativt stress, herunder lipidperoxidation (MDA-niveauer) og antioxidantenzymer, vurderet i cortex og hippocampus i TgAPP- og WT-musene. SOD, CAT, GR og GPx er de vigtigste antioxidantenzymer, der virker mod frie iltradikaler og regulerer metabolismen af ​​frie radikaler i kroppen og spiller en rolle i det frie radikalopfangende system, der beskytter cellerne i kroppen mod lipidperoxidation . I vores undersøgelse, som en konsekvens af APP-overekspression, blev der observeret et generaliseret fald i antioxidantenzymaktiviteter i TgAPP-mus sammenlignet med WT-mus, hvilket var statistisk signifikant for CAT. I overensstemmelse med reducerede GSH-niveauer var lipidperoxidation signifikant øget i TgAPP-musene. Mens kilden til oxidativt stress i human AD er meget kompleks og multifaktoriel, synes amyloidpatologien udviklet i mus at være tilstrækkelig til at starte den patologiske proces, der fører til øget oxidativ stress i hjernen [26]. Dyr behandlet med rutin oplevede en stigning i CAT-aktivitet i cortex og GR-aktivitet i hippocampus, både hos hanner og hunner. Kun dyr behandlet med rutin oplevede ændringer i genekspression af CAT og GR i cortex og hippocampus hos både hanner og hunner og GPx i hippocampi hos hunmus. I denne sammenhæng har flere naturlige forbindelser vist sig at påvirke krydstalen mellem proteasom- og redoxreguleringen. Mere præcist er quercetin en kendt Nrf2-aktivator [27], der udviser antioxidantegenskaber gennem stimulering af proteasomfunktionen, fremmer øget oxidativ stressresistens og giver forbedret cellelevetid [28].

Vævsspecifik ekspression af BACE1 er kritisk for normal APP-behandling, og dens dysreguleringsekspression kan spille en rolle i AD-patogenese. BACE1 er overvejende udtrykt i hippocampale neuroner, cortex og det cerebellare granulære lag [10]. Det skal bemærkes, at tidligere undersøgelser har vist, at svenske mutant APP transgene mus havde signifikant øgede hjerneniveauer af A ved en steady state [29], hvilket tyder på, at BACE1 spiller en væsentlig rolle i den amyloidogene vej i AD patogenese og er et godt terapeutisk mål. til AD-behandling. I vores undersøgelse observerede vi en signifikant reduktion af BACE1-aktivitet ved quercetin- og rutinbehandlinger, hvilket kan bidrage til faldet i A-aflejring hos mus. Vi hævder, at mere end udelukkende at fungere som BACE1-hæmmere af enzymet, quercetin og rutin, kan udøve en reduktion i BACE1-aktivitet relateret til en stigning i forholdet GSH/GSSG, baseret på hypotesen om at øge genvinding af proteasomaktivitet. I denne forstand er det kendt, at målretning af BACE1-hæmmere til -spaltningsstedet for APPswe (svensk mutation) sker, før det når plasmamembranen, hvorimod APPwt (vildtype) behandles i et tidligt endosom, der stammer fra celleoverfladen. Derfor er BACE1, der spalter APPwt, nogle gange bundet til BACE1-hæmmeren på celleoverfladen før APP-behandling, men det enzym, der behandler APPswe er ikke [30]. Det er af denne grund, at den afvigende lokalisering af APPswe-behandling betydeligt kan sænke styrken af ​​quercetin og rutin som BACE1-hæmmere. Vi er således mere tilbøjelige til at støtte, at BACE-aktivitetens fald i denne in vivo-model ikke så meget skyldes inhiberingen af ​​enzymet, men stigningen i GSH/GSSG-forholdet. Under alle omstændigheder kunne reduceret BACE1-aktivitet tolkes som et formodet forsøg på at reducere -amyloidproduktion i TgAPP-musene. Hvad angår den mest bemærkelsesværdige effekt af quercetin og rutin i hippocampus på BACE1 aktivitetsdæmpning, er det værd at bemærke, at cortex har en signifikant højere neuron-densitet end hippocampus [31], og selektiv svækkelse af proteasomet i AD patologisk fænotype gør cortex mere sårbar og påvirket end hippocampus [32].

Efter at have bestemt virkningen af ​​behandlingerne på BACE1 enzymaktivitet, var vi interesserede i at evaluere dets ekspression. Mærkeligt nok blev der ikke fundet signifikante forskelle i BACE1-ekspression mellem TgAPP-mus sammenlignet med WT-mus, og ingen mærkbare ændringer blev observeret med quercetin- eller rutinbehandling. Derfor ser det ud til, at stigningen i BACE1-enzymaktivitet ikke er forbundet med en stigning i ekspression. I denne sammenhæng er det bemærkelsesværdigt, at Apelt et al. [14] fandt en stigning i kortikal BACE1-aktivitet i Tg2576-mus i alderen 9 til 13 måneder, mens ekspressionsniveauet af BACE1-protein og mRNA ikke ændrede sig med alderen. Endvidere er der fundet beviser, der understøtter, at fibrillært amyloid A 1-42. snarere end opløseligt amyloid A 1-42 kan opregulere BACE1-proteinekspression, og derfor kan små modifikationer i forholdet mellem amyloidisoformer modulere amyloidaggregatets konformationer og celleskade [ 33]. Således kan fraværet af ændring i BACE1-ekspression efter en stigning i dets aktivitet, som vi fandt, forklare forekomsten af ​​opløseligt amyloid A 1-42 over den fibrillære amyloid A 1-42-isoform i vores musemodel TgAPP.

Efter bestemmelsen af ​​genekspression af de enzymer, der er involveret i APP-behandling, evaluerede vi effekten af ​​quercetin og rutin på enzymet -sekretase involveret i den ikke-amyloidogene behandling af APP. Vi fokuserede på ADAM10, fordi det er den fysiologisk vigtigste konstitutive isoform af -sekretase. ADAM10 modvirker dannelsen af ​​neurotoksiske oligomere A-plaques via spaltning af APP inden for A-domænet for at producere sAPP og C-terminale fragmenter (-CTF) [34,35]. Selvom ændringerne i ADAM10-ekspression fundet i vores undersøgelse ikke var statistisk signifikante, blev der observeret et lille fald i ADAM10-ekspression i TgAPP-mus i forhold til WT-mus. Rutinbehandling viste overvejende en tendens til at øge ADAM10-genekspression i begge hjerneområder under undersøgelse. Postina et al. [36] viste, at opreguleringen af ​​vildtype ADAM10 i hippocampus af en AD musemodel medierede sAPP-sekretion, hvilket førte til inhibering af A-plakgenerering. Effekten af ​​quercetin er blevet undersøgt i en aluminiumchlorid-induceret AD rottemodel, der viser en signifikant forbedring af -sekretasen (ADAM10 og ADAM17) i hippocampus sammenlignet med ubehandlede. Dette indikerer, at quercetin har potentialet til at øge den ikke-amyloidogene vej gennem aktiveringen af ​​-secretase-gener [37]. Prækliniske data forstærker hypotesen om, at forbedring af hjernens sAPP-niveauer er en potentiel strategi til at forbedre AD-relaterede symptomer og dæmpe synaptiske underskud. ADAM10 og BACE1 konkurrerer om APP-spaltningen, derfor kan potentiering af ADAM10-aktivitet hæmme den neurotoksiske amyloidgenerering. Desuden kan sAPP forhindre aktivering af stress JNK-signalvejen, hvilket fører til aktivering af NF-KB-induceret fosforyleringsaktivitet, hvilket fører til proteasomnedbrydning [38]. Derfor reduceres dannelsen og akkumuleringen af ​​sygdomsrelaterede proteinaggregater signifikant, og den cellulære proteasomaktivitet øges, hvilket giver bevis for en funktion af sAPP i reguleringen af ​​proteostase [39]. Ydermere er det blevet påvist, at sAPP specifikt opregulerer glutamat AMPA-receptorsyntese og dens handel [40]. I vores undersøgelse undersøgte vi, om den lille stigning i ADAM10-ekspression ved rutinbehandling udøver en vis indflydelse på glutamatergisk synaptisk transmission. Som vist i afsnittet Supplerende data blev der ikke observeret nogen signifikante effekter på ekspressionen af ​​denne ionotrope receptor på quercetin- og rutindiæter, måske på grund af en svag stigning i ADAM10-ekspression, hvilket ikke er tilstrækkeligt til opregulering af AMPA-receptoren (Supplerende data) , figur S2 og tabel S5).

Det bør tages i betragtning, at in vitro-undersøgelser har vist en lang række ADAM10-substrater [41], og derfor kan uønskede virkninger opnået ved ikke-specifik ADAM10-målretning findes i cancerproliferation, celleadhæsion, fremme af T-celle/NK-celle-precursor og inflammation osv. [42]. For at omgå denne begrænsning foreslår vores undersøgelse en strategi, der sigter mod at fremme frigivelsen af ​​sAPP mere fysiologisk. Denne tilgang kan være baseret på et langsigtet indtag af en aktiv ingrediens (quercetin eller rutin), som indtages gennem en sund menneskelig kost. Der er dog behov for yderligere undersøgelser for at finde ud af, om stigningen i ADAM10 er flavonoiddosisafhængig, og om de potentielle gavnlige virkninger opvejer de formodede bivirkninger.

Med hensyn til ekspressionen af ​​APPswe, selvom indsættelsen af ​​det humane APP-transgen i musegenomet garanterer, at APPswe er overudtrykt fra fødslen, er det blevet rapporteret, at APP mRNA- og proteinhippocampus-niveauer viser betydelige udsving under dyrenes udvikling, idet de er maksimale, når mus er asymptomatisk (1-måned gammel) og aftagende, når fuld symptomatologi opstår [43]. På trods af dette problem var APP-ekspression både i cortex og hippocampus signifikant højere sammenlignet med WT-mus i vores undersøgelse. Yderligere behandling med quercetin eller rutin var i stand til signifikant at reducere sådan ekspression for både han- og hunmus i begge områder af hjernen. Disse resultater er i overensstemmelse med dem, der er rapporteret af Augustin et al. [44] som undersøgte et standardiseret ekstrakt af Ginkgo biloba (Egb761), rig på flavonoler såsom quercetin, i 4-måneder gamle TgAPP-hunmus, og fandt nedsatte APP-mRNA- og proteinniveauer. Når man tager i betragtning, at opregulering af APP translationel i Tg2576-mus forekommer i de prodromale og tidlige symptomatiske stadier [45], er det sandsynligt, at genoprettelse af APP-translation med quercetin eller rutin kan have fundet sted i vores TgAPP-mus og sandsynligvis i en tidlig symptomatisk stadium, hvilket resulterer i en reduktion af kortikale og hippocampale niveauer af APP, BACE1-aktivitet og caspase{10}}-aktivering.

Desuden er det blevet rapporteret andre steder, at der i Tg2576-mus (i fravær af neuronalt tab) er en stigning i caspase-3-aktivering i hippocampus [46], som fundet i vores undersøgelse, ved begyndelsen af ​​hukommelsessvækkelse , sammen med en reduktion af dendritiske rygsøjler før aflejringen af ​​ekstracellulært amyloid [46]. Der er bevis for ikke-apoptotiske roller for caspaser i nervesystemet uden neuronal død [47], og caspase-3 aktivitet er blevet lokaliseret til dendritiske rygsøjler, hvor det kan hæve calcineurinniveauer. Til gengæld menes dephosphoryleringen af ​​GluR1-underenheden af ​​AMPA-lignende receptorer, udløst af calcineurin, at resultere i postsynaptisk dysfunktion. Vores værdier for caspase-3-ekspression, som en konsekvens af transgenese, er i overensstemmelse med dem, der er opnået af andre forskere, der rapporterede en stigning i caspase-{10}}-ekspression på niveau med dendritiske rygsøjler i hippocampus af TgAPP-mus [48]. Da APP indeholder tre distinkte spaltningssteder for caspase-3 i sin aminosyresekvens, hvoraf to er placeret på niveauet af det ekstracellulære domæne og et i den intracellulære C-terminale del af APP-halen [49], hydrolyse af APP af caspase-3 kan ændre den proteolytiske processering af APP til fordel for den amyloidogene vej [50], hvilket fører til frigivelsen af ​​et cytotoksisk C-terminalt afledt peptid med en længde på 31 aminosyrer (C31), for eksempel [51]. Dette tyder på, at eftersom caspase-3 kan mediere amplifikationen af ​​toksisk fragmentfrigivelse fra APP, kan sænkning af caspase-3-ekspression med quercetin eller rutin muliggøre clearance af aggregeret protein. Derudover har vi, som tidligere nævnt, undersøgt indflydelsen af ​​både stigningen og faldet af caspase-3-ekspression i glutamaterg synaptisk transmission, baseret på calcineurin-aktiveret caspase-3s evne til at dephosphorylere GluR1-underenheden af AMPA-receptorer på det postsynaptiske niveau. Disse molekylære modifikationer ændrer glutamatergisk synaptisk transmission og neuronal plasticitet på niveauet af dendritiske rygsøjler i hippocampus [48]. Teoretisk set kan farmakologisk hæmning af caspase-3-aktivitet i TgAPP-mus redde de AD-lignende fænotyper fra en mekanisme, der driver synaptisk svigt. På trods af forøgelsen af ​​caspase-3-ekspression i vores TgAPP-mus fandt vi imidlertid ingen signifikante forskelle i AMPA-receptorekspression sammenlignet med den i WT-mus, som tidligere nævnt. Det kan være, at ændringerne i caspase-3-ekspression ikke er fremtrædende nok til at producere signifikante modifikationer i AMPA-receptorekspression (Supplerende data, figur S2 og tabel S5).

Hvad angår værdierne af caspase-6-ekspression, blev der ikke fundet signifikante forskelle mellem TgAPP- og WT-mus. Aktivering af caspase-6 er blevet identificeret som en vigtig mediator af neuronal stress, der spalter vigtige cytoskeletproteiner (Tau og -tubulin), og dermed forstyrrer ubiquitin-proteasom-nedbrydningen af ​​fejlfoldede proteiner og adskillige actin-regulerende post-synaptiske tætheder proteiner [52]. Den uændrede ekspression af caspase -6 i vores undersøgelse stemmer overens med fraværet af karakteristiske tegn på neurodegeneration i den alder, hvor disse transgene mus blev evalueret, sammenlignet med WT-musene (Supplerende data, figur S1).

En markant stigning i neuroinflammatoriske mediatorer er blevet observeret hos AD-patienter, hovedsageligt omkring senile plaques [53-55]. Astrocytter er hovedleverandøren af ​​GSH til mikroglia og neuroner. Under kronisk inflammation og oxidativt stress frigiver astrocytter giftige inflammatoriske mediatorer og frie radikaler, hvilket accelererer aktiveringen af ​​mikroglia og neurodegeneration [56]. Det er værd at bemærke, at nedsat intracellulær glutathion er relateret til aktiveringen af ​​de inflammatoriske veje, p38 MAP-kinase, Jun-N-terminal kinase (JNK), NF-KB, i humane mikroglia og astrocytter [57]. I denne forbindelse besluttede vi at kvantificere niveauerne af IL-1, IFN- og TNF- i vores dyremodel og bestemme effekten af ​​quercetin og rutin på dem. Som det er kendt fremmer inflammation defekt behandling af A-peptid og APP, fremmer A-peptidaggregation og modificerer igen A-reaktivitet [58]. I vores undersøgelse observerede vi således, at TgAPP-mus havde øgede mRNA-niveauer af de pro-inflammatoriske mediatorer IL-1, TNF- og IFN- sammenlignet med WT-mus, hvilket viste, at overekspression af APPswe kunne inducere neuro-inflammatoriske kaskader udløser en række molekylære veje i glia og neuroner, som ville aktivere den inflammatoriske reaktion. Quercetin og rutin var i stand til at svække IL-1-genekspression hos både mænd og kvinder og de undersøgte hjerneområder. Adskillige beviser understøtter den antiinflammatoriske effekt, som quercetin udøver på CNS-niveau, da det kan hæmme aktiveringen af ​​transkriptionsfaktorer såsom nuklear faktor-kappa B (NF-κB) [59], involveret i induktionen af ​​iNOS, og reducere derfor frigivelsen af ​​mediatorer såsom IL-1, TNF- og IFN- [60]. Med hensyn til virkningen af ​​GSH på det inflammatoriske respons, skal det bemærkes, at GSH er involveret i opretholdelsen af ​​optimale cytokinniveauer på en sådan måde, at ekspressionen af ​​pro-inflammatoriske cytokiner (TNF-, IL-1 og IL -6) øges på grund af GSH-depletering, hvorimod ekspressionen af ​​antiinflammatoriske cytokiner (dvs. IL-10) forblev uændret. Denne GSH-homeostase-ændring sker på grund af opregulering i NF-KB- og JNK-signalveje, som kunne være den mulige apoptotiske vej mod neuronal celledød [61]. I vores undersøgelse kan nedregulering af NF-KB af quercetin og rutin være en plausibel mekanisme til at genoprette GSH/GSSG-homeostasen og derfor årsagen til balancen mellem pro-inflammatoriske og anti-inflammatoriske cytokiner. Endelig, da BACE1-promotoren har et NF-KB-bindingssted, letter inflammationsinduceret aktivering af NF-KB opreguleringen af ​​BACE1-ekspression og øger efterfølgende A-produktion [62]. Så hvis nedregulering af NF-KB forekommer på quercetin- og rutin-diæter, vil BACE1-aktivitet falde som et resultat af frigivelsesreguleringen af ​​pro-inflammatoriske og ikke anti-inflammatoriske cytokiner.

4. Materiale og metoder

4.1. Forsøgsdyr

En transgen mus (Tg2576, B6; SJL-Tg(APPswe)2576 Kha), der udtrykker den svenske dobbeltmutation af humant amyloid precursorprotein (hAPP) blev brugt som dyremodel for eksperimentel AD [14]. Musen er en knock-in heterozygot linje, der udtrykker den humane A PP695 isoform med den dobbelte svenske mutation (K670N/M671L; Lys670→Asn og Met671→Leu) under kontrol af hamster prionproteinpromotoren [63]. Som et resultat udviser denne mus niveauer af humant amyloid-precursorprotein (A PP), seks gange større end niveauerne for en mus A PP. Derudover viser denne mus højere niveauer af A 40 og A 42. A-aflejringer begynder ved 9 måneders alderen [63]. Inden for Tg2576 hippocampus og cortex er APPswe transgenekspression primært neuronal [64].

Som en negativ kontrol blev vildtype (WT) mus fra den samme koloni [65,66] anvendt. Tg2576 (B6; SJL-Tg(APPswe)2576 Kha) musekolonien blev udviklet i vores laboratorium fra Tg2576 heterozygote hanner og vildtype hunner. De transgene forældre blev doneret af Dr. Diana Frechilla fra Neuroscience Division ved Center for Anvendt Medicinsk Forskning ved University of Navarra (Pamplona, ​​Spanien) [67].

Dyrene blev anbragt i individuelt ventilerede bure og holdt ved 22-24 ◦C i en 12-h lys/mørke-cyklus i 50-60 procent luftfugtighed. Dyreprotokoller blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Complutense University of Madrid og var i fuld overensstemmelse med det europæiske direktiv 2010/63/om beskyttelse af dyr brugt til videnskabelige formål og spansk lovgivning om dyrevelfærd ( Kongelig anordning 53/2013, 1. februar 2013).

4.2. Genotypiske analyser af mus

Transgenicitet blev bestemt inden for 30 dage efter fødslen ved halebiopsi. Genotypeanalyser af dyr blev udført ved PCR. I betragtning af at Tg2576 (TgAPP) er en heterozygot linje, blev insertionsgenet (PrP, fra prionprotein) brugt som en positiv reaktionskontrol. Genomisk DNA blev ekstraheret fra musehaler fordøjet med proteinase K (0,1 µg/µL) i NID-buffer (50 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM MgCl2, 0,05 procent gelatine, 0,45 procent NP-40 og 0,4 procent Tween 20) ved 56 ◦C i 3 timer og rystet. DNA-fragmenter blev præcipiteret med isopropanol og vasket med 70% ethanol. DNA-præcipitater blev opløst i 30 µL TE-buffer (10 mM Tris-1 mM EDTA). Renheden og koncentrationen af ​​DNA blev bestemt ved 260 og 280 nm.

PrP- og APP-generne blev amplificeret ved PCR. Sekvenser af primere anvendt til at screene de transgene mus var som følger: PrP fremad: CCTCTTTGGACTATGTGGACTGATGTCGG; PrP omvendt: GTGGATACCCCCTCCCCCAGCCTAGACC; APP omvendt: CCAGATCTCTGAAGTGAAGATGGATG. Trinene i PCR-reaktionen var som følger: denaturering ved 94 ◦C i 90 s, 39 cyklusser ved 60 ◦C i 60 s og 72 ◦C i 90 s, derefter endelig forlængelse ved 72 ◦C i 7 min.

I alle tilfælde blev negative kontroller (uden DNA-skimmel) og positive kontroller af APP-genet overvejet. De opnåede PCR-produkter blev adskilt ved elektroforese i 1,5 procent agarosegeler i 0.5X TBE (Tris-Borate-EDTA, Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) buffer ved 70 V (konstant spænding) og derefter afbildet ved farvning med GelRed (Millipore).

4.3. Dyrebehandlinger

TgAPP-mus og vildtype-kuldkammerater, begge i alderen 6-7 uger med en initial kropsvægt på 16,2 ± 0,8 g, blev randomiseret i følgende fire grupper (n=8/gruppe): ( a) Ubehandlet TgAPP; (b) Quercetin-behandlet TgAPP; (c) Rutin-behandlet TgAPP; og (d) ubehandlet vildtype. Da både han- og hunmus blev undersøgt, blev der etableret to sæt grupper. I en alder af 45 uger begyndte musene at blive behandlet med quercetin eller rutin i 4 uger.

Quercetin (3,30,40,5,7-pentahydroxyflavon) og rutinhydrat (quercetin-3-O-rutinosidhydrat) var mere end eller lig med 95 procent rene og købt hos Sigma-Aldrich. Hver af flavonoiderne blev inkorporeret i en standarddiæt (Harlan Ibérica, Barcelona, ​​Spanien) i en koncentration på 200 ppm, svarende til et indtag på 30 mg flavonoid/kg kropsvægt/dag. De ubehandlede mus modtog udelukkende den ikke-supplerede standarddiæt. Diæter og vand blev givet til ad libitum indtagelse.

4.4. Hjernevævsforberedelse til biokemiske og histologiske analyser

Ved afslutningen af ​​behandlingen blev musene fastet natten over, de blev aflivet ved hjælp af cervikal dislokation, og hele hjernen blev hurtigt fjernet. Hjernen blev skyllet i saltvand ved 4 ◦C, og arachnoidmembranen blev forsigtigt fjernet. Derefter blev hippocampus og cortex isoleret. Prøver blev straks opbevaret ved -80 ◦C indtil videre brug.

Hele hjernen fra nogle dyr blev brugt til at opnå histologiske sektioner, for hvilke hjerner, når de var blevet aflivet ved hjælp af cervikal dislokation, blev frosset ved nedsænkning i isopentan ved -80 ◦C. Umiddelbart derefter blev koronale sektioner af hjernen (30 µm tykkelse) lavet fra lugteløget til lillehjernen, 120 µm fra hinanden i en kryostat (Leica CM1850, Nussloch, Tyskland). Hele proceduren blev udført ved -20 ◦C. Histologiske snit blev opsamlet på objektglas og holdt ved -80 ◦C indtil analyse (se supplerende metoder).

4.5. Glutathion

Til glutathiontest blev prøver af hjernebark og hippocampus homogeniseret i en redox-dæmpende buffer -5 procent trichlorideddikesyre (RQB-5 procent TCA) (tidligere boblet med N2 i 15 minutter på is) i en koncentration på 25 mg/ml (vægt/volumen). Prøver blev resuspenderet ved sonikering i 10 s, derefter centrifugeret ved 12, 000 x g i 10 minutter ved 4 ◦C, og supernatanter blev opsamlet.

Derefter, i den opnåede supernatant, blev spektrofluorometriske metoder anvendt til at bestemme GSH- og GSSG-niveauer under anvendelse af o-phthalaldehyd-metoden, beskrevet af Senft et al. [68]. GSH- og GSSG-værdier blev korrigeret for spontan reaktion i fravær af en biologisk prøve. I begge tilfælde blev supernatanter inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur, og bagefter blev fluorescens målt ved hjælp af en FLUOSTAR mikropladelæser (BMG LABTECH, Ortenberg, Baden-Württemberg, Tyskland), med excitationsfilteret indstillet til 360 nm (båndbredde 5 nm) og emissionsfilteret indstillet til 460 nm (båndbredde 5 nm). Koncentrationen af ​​GSH og GSSG i hver prøve blev interpoleret fra kendte GSH-standarder. Koncentrationer af både GSH og GSSG blev udtrykt som nmol GSH/mg protein, hvilket gjorde det muligt at beregne glutathion-redoxforholdet GSH/GSSG.

De resterende pellets blev vortexet, indtil de var fuldstændigt opløst i 24 0 µL 0,1 M NaOH for at måle proteinkoncentrationen ved hjælp af bicinchoninsyre (BCA)-metoden under anvendelse af bovint serumalbumin som standard.

【For mere information:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】