Helgenomsekvensering til diagnosticering af neurologiske gentagelsesforstyrrelser i Storbritannien: En retrospektiv diagnostisk nøjagtighed og prospektiv klinisk valideringsundersøgelse

For mere information:ali.ma@wecistanche.com

Resumé

Baggrund

Gentagelsesforstyrrelser påvirker omkring 1 ud af 3000 individer og er klinisk heterogene sygdomme forårsaget af udvidelser af korte tandem-DNA-gentagelser. Genetisk testning er ofte locus-specifik, hvilket resulterer i underdiagnosticering af mennesker, der har atypiske kliniske præsentationer, især hos pædiatriske patienter uden en tidligere positiv familiehistorie. Helgenomsekventering bruges i stigende grad som en førstelinjetest for andre sjældne genetiske lidelser, og vi havde til formål at vurdere dens ydeevne i diagnosticering af patienter medneurologiskegentagne ekspansionsforstyrrelser.

Metoder

Vi vurderede retrospektivt den diagnostiske nøjagtighed af hel-genom-sekventering for at detektere de mest almindelige gentagelsesudvidelsesloci forbundet medneurologiskeresultater (AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, C9orf72, CACNA1A, DMPK, FMR1, FXN, HTT og TBP) ved hjælp af prøver opnået inden for National Health Service i England fra patienter, der var mistænkt for at haveneurologiskelidelser; tidligere PCR-testresultater blev brugt som referencestandard. Den kliniske nøjagtighed af hel-genom-sekventering til at detektere gentagne udvidelser blev prospektivt undersøgt hos tidligere genetisk testede og udiagnosticerede patienter rekrutteret i 2013-17 til 100 000 Genomes Project i Storbritannien, som var mistænkt for at have en genetiskneurologiskelidelse (familiære eller tidligt opståede former for ataksi, neuropati, spastisk paraplegi, demens, motorneuronsygdom,parkinsonbevægelselidelser, intellektuelle handicap eller neuromuskulære lidelser). Hvis der blev foretaget et gentaget ekspansionsopkald ved hjælp af hel-genom-sekventering, blev PCR brugt til at bekræfte resultatet.

Fund

Den diagnostiske nøjagtighed af hel-genom-sekventering til at detektere gentagne udvidelser blev evalueret i forhold til 793 PCR-tests tidligere udført inden for NHS fra 404 patienter. Helgenomsekventering klassificerede korrekt 215 af 221 udvidede alleler og 1316 af 1321 ikke-ekspanderede alleler, hvilket viste 97,3 procent sensitivitet (95 procent CI 94,2-99,0) og 99,6 procent specificitet (99,1-99) ·9) på tværs af de 13 sygdomsassocierede loci sammenlignet med PCR-testresultater. I prøver fra 11 631 patienter i 100 000 Genomes Project identificerede helgenomsekventering 81 gentagne udvidelser, som også blev testet ved PCR: 68 blev bekræftet som gentagne udvidelser i det fulde patogene område, 11 var ikke -patogene mellemliggende udvidelser eller permutationer, og to var ikke-udvidede gentagelser (16 procent falsk opdagelsesrate).

Fortolkning

I vores undersøgelse viste hel-genom-sekventering til påvisning af gentagne udvidelser høj sensitivitet og specificitet, og det førte til identifikation afneurologiskegentagne ekspansionsforstyrrelser hos tidligere udiagnosticerede patienter. Disse resultater understøtter implementeringen af ​​hel-genom-sekventering i kliniske laboratorier til diagnosticering af patienter, der har enneurologiskepræsentation i overensstemmelse med en gentagen ekspansionsforstyrrelse.

Finansiering

Medical Research Council, Department of Health and Social Care, National Health Service England, National Institute for Health Research og Illumina.

Introduktion

På trods af de seneste fremskridt i vores forståelse af det genetiske grundlag for sjældneneurologiskelidelser, forbliver op til 70 procent af patienter med sådanne lidelser genetisk udiagnosticeret.1-3 Dette skyldes til dels de tekniske udfordringer ved at teste for komplekse og gentagne genetiske varianter, herunder gentagne udvidelser; sådanne udvidelser anslås at påvirke omkring 1 ud af 3000 mennesker (appendiks p 1) og er den førende årsag til mere end 40 neurogenetiske lidelser4, herunder Huntingtons sygdom og skrøbeligt X-syndrom. Gentagen ekspansionsforstyrrelser er klinisk og genetisk heterogene, og gentagen ekspansion kan være forbundet med forskellige sygdomme. For eksempel kan udvidelser i C9orf72 vise sig som enten amyotrofisk lateral sklerose eller frontotemporal demens.5 Gentagne udvidelser i forskellige loci kan også give lignende fænotypiske træk, hvilket gør dem vanskelige at skelne klinisk: gentagne udvidelser i mindst ti spinocerebellare ataksi-gener, der ofte forekommer som voksne -opstået ataksi,6 og dem i C9orf72 og AR kan begge forårsage motorneuronsygdom.7,8

Gentagen ekspansionsforstyrrelser er forårsaget af en stigning i antallet af gentagne korte tandem-DNA-sekvenser, og patogenicitetstærsklerne for hver lidelse er locus-specifikke. Størrelsen af ​​udvidelsen varierer fra færre end 30 gentagelser (f.eks. i CACNA1A) til flere tusinde gentagne enheder (f.eks. i FMR1, DMPK, C9orf72 og FXN, som kan strække sig op til 5 kb i størrelse). Gentagne udvidelser udviser molekylær ustabilitet, hvilket kan føre til ændringer i gentagelsesstørrelsen (generelt stigende i længden) på tværs af generationer og væv.4 Under disse forhold fører en stigning i antallet af gentagelser ofte til en tidligere indtræden og mere alvorlig sygdom i successive generationer.4 Pædiatrisk debut af gentagne ekspansionsforstyrrelser kan vise sig som multisystemsyndromer uden specifikke fænotypiske signaturer,9 og børn med disse lidelser er derfor mere tilbøjelige til at blive underdiagnosticeret, når en familiehistorie med gentagen ekspansionsforstyrrelse er fraværende, end når den er til stede.10– 12

Laboratorievurdering af gentagne udvidelser er typisk begrænset til den målrettede molekylære vurdering af et individuelt locus styret af den formodede kliniske diagnose ved hjælp af PCR-baserede eller Southern blot-metoder13, hvilket kan være dyrt og tidskrævende. På grund af de varierede og overlappende fænotypiske træk ved disse lidelser kan sygdomsassocierede gentagne ekspansionsloci forblive utestede.14

Helgenomsekventering er ved at dukke op som et førstelinjediagnostisk værktøj hos patienter med sjælden sygdom15, men indtil for nylig blev det anset for at have begrænset evne til at vurdere loci, der indeholder gentagne udvidelser.16 Fremskridt inden for bioinformatik har imidlertid gjort det muligt at påvise sygdom. -forårsager gentagne udvidelser fra næste generations sekventeringsdata.17-22 Her rapporterer vi om den diagnostiske vurdering af en hel-genom-sekventeringstilgang til at detektere gentagne udvidelser ved hjælp af retrospektive PCR-data og dens kliniske validering hos patienter i 100000 Genomes Project, som havde en mistænkt neurologisk lidelse, udiagnosticeret med tidligere genetisk testning.

Metoder

Studiedesign og deltagere

Denne evaluering af hel-genom-sekventering til påvisning af gentagne udvidelser inkluderede både diagnostisk nøjagtighed og kliniske nøjagtighedsvurderinger. Diagnostisk nøjagtighed blev evalueret ved hjælp af data fra patienter, der tidligere var blevet testet med PCR for gentagne udvidelser, der vides at forårsage neurologisk sygdom.4 Patienterne blev identificeret fra to kilder: 100 000 Genomes Project og Genomic Laboratory baseret på Cambridge University Hospitals ( Cambridge, Storbritannien). For begge sæt patienter var PCR-test blevet udført på patientprøver af laboratorier i National Health Service (NHS) som en del af rutinemæssig klinisk vurdering: for prøver i 100000 Genomes Project blev PCR-test udført før rekruttering til projektet af University College London Hospital Neurogenetics Laboratory (London, Storbritannien); prøver med PCR-bekræftede gentagne udvidelser blev opnået fra patienter testet af Genomic Laboratory med base i Cambridge. Patienter med PCR-positive og PCR-negative testresultater for gentagne ekspansionsforstyrrelser blev identificeret til inklusion i vores undersøgelse gennem laboratoriejournalsystemer; alle patienter havde givet skriftligt informeret samtykke til brug af deres prøve til kvalitetssikring og forsknings- og træningsformål, som en del af klinisk serviceoptimering og validering.

Helgenomsekventering af hver prøve blev udført på et af to laboratorier: Genomics England (Hinxton, UK) for 100000 Genomes Project prøver (n=254) og Illumina Clinical Services Laboratory (ICSL; San Diego, CA, USA) for prøver opnået af Genomic Laboratory med base i Cambridge (n=150). Samlet set blev dette datasæt brugt til den diagnostiske nøjagtighedsdel af undersøgelsen og bestod af PCR og hel-genom-sekventeringsdata fra 404 patienter, der dækkede 13 loci, der repræsenterer de mest almindelige neurologiske gentagelsesforstyrrelser: 11 loci forbundet med ataksi og sen- opståede neurodegenerative lidelser (HTT, AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, TBP, C9orf72 og FXN), et locus forbundet med intellektuelt handicap (FMR1) og et locus forbundet med myotonisk dystrofi (DMPK). For hvert locus var PCR-testdata tilgængelige for mindst én udvidet allel (appendiks s. 24).

Klinisk nøjagtighed blev vurderet ved at undersøge overensstemmelsen af ​​gentagne udvidelser, som detekteret med hel-genom-sekventering, med formodet klinisk diagnose efter PCR-bekræftelse hos patienter med mistænkte genetiske neurologiske lidelser (familiære eller tidligt opståede former for ataksi, neuropati, spastisk paraplegi, demens motor neuron sygdom,parkinsonbevægelsesforstyrrelser, intellektuelle handicap eller neuromuskulære lidelser) rekrutteret til 100000 Genomes Project i 2013-17. 100000 Genomes Project er et britisk program til at vurdere værdien af ​​hel-genom-sekventering hos patienter med udækkede diagnostiske behov i sjældne sygdomme og cancer. Efter etisk godkendelse af 100000 Genomes Project af East of England Cambridge South Research Ethics Committee (reference 14/EE/1112), herunder til dataanalyse og returnering af diagnostiske fund til patienterne, blev disse patienter rekrutteret af sundhedspersonale og forskere fra 13 Genomic Medicine Centres i England og blev tilmeldt projektet, hvis de eller deres værge gav skriftligt samtykke til, at deres prøver og data blev brugt i forskning, herunder denne undersøgelse. Probander og, hvis det var muligt, andre familiemedlemmer, blev indskrevet i henhold til berettigelseskriterier fastsat for specifikke sjældne sygdomstilstande (bilag s. 5-11). Patienter blev rekrutteret til 100000 Genomes Project efter standard-of-care genetisk testning i NHS, som angivet i berettigelseskriterierne. Standardiserede kliniske baselinedata blev registreret ved brug af Human Phenotyping Ontology (HPO)23 mod sygdomsspecifikke datamodeller.24 Familiemedlemmers sygdomsstatus i forhold til probandens kliniske indikation for testning blev også indsamlet.

For at identificere kausative gentagne udvidelser hos patienter med genetisk udiagnosticeret sygdom, testede vi patienter med mistænkte genetiske lidelser i overensstemmelse med en gentagne udvidelsessygdom. Patienterne blev udvalgt på basis af overensstemmelse mellem deres sygdom og HPO-vilkår med gentagne ekspansionsassocierede lidelser. Patienternes hel-genom-sekventeringsdata blev forespurgt for at søge efter udvidelser i bestemte sæt af gentagelser ved hjælp af fire forskellige gentagelsesudvidelsespaneler i henhold til deres kliniske karakteristika (appendiks s. 5). De gentagne udvidelser, der er valgt til inklusion på disse paneler, er de mest almindelige neurologiske sygdomsfremkaldende gentagne udvidelsesloci. Patienter med kliniske træk, der potentielt er kompatible med mere end én gentagen ekspansionsforstyrrelse, blev testet på flere paneler. Hvis der blev foretaget et gentaget ekspansionskald ved hjælp af hel-genom-sekventering, blev bekræftende test ved PCR udført.

For hver patient med en bekræftet gentagen udvidelse blev den lokale kliniker informeret om det potentielle diagnostiske resultat, og bidraget fra den gentagne udvidelse til patientens kliniske egenskaber blev vurderet. For gentagne udvidelser, der helt eller delvist forklarede patientens kliniske træk, blev der udstedt en diagnostisk rapport i henhold til lokale standardprocedurer.

Procedurer

For de historiske NHS-prøver, der blev brugt i den diagnostiske nøjagtighedsdel af vores undersøgelse, var gentagne udvidelser tidligere blevet testet ved hjælp af PCR-amplifikation og fragmentanalyse. Southern blotting blev udført for store C9orf72-udvidelser. I den kliniske nøjagtighedsdel af vores undersøgelse blev gentagne udvidelser påvist ved hel-genom-sekventering hos patienter fra 100 000 Genomes Project testet ved PCR i prøver opbevaret i NHS genetiske laboratorier. Yderligere detaljer, herunder primersekvenser, findes i appendiks (s. 2–3, 25–26).

DNA blev forberedt til sekventering af hele genomet ved hjælp af TruSeq DNA PCR-fri biblioteksforberedelse, og 150 bp eller 125 bp parret ende sekventering blev udført på enten HiSeq 2000 eller HiSeq X platforme ved high throughput genom faciliteten for Genomics England og på ICSL . Genomer blev sekventeret til en gennemsnitlig dybde på 35× (31× til 37×; appendiks s. 27). Short-tandem-repeat genotyping blev udført ved hjælp af ExpansionHunter-softwarepakken version 3.1.2.25,26. Kort fortalt omjusterer ExpansionHunter sekventeringslæsninger på tværs af et foruddefineret sæt af korte tandem-gentagelser for at estimere størrelsen af ​​begge alleler fra et individ (appendiks s. 3).

ExpansionHunter-output inkluderer et estimat af antallet af gentagelseselementer, samlet størrelse og konfidensgrænse for hvert vurderet locus. Retningslinjer fra Association for Medical Pathology og College of American Pathologists anbefaler visuel inspektion af variantopkald under rutinevurderingen af ​​high-throughput sekventeringsvarianter.27

Korte tandem-gentagelsesvarianter kan imidlertid ikke visualiseres tilstrækkeligt med almindelige visualiseringsværktøjer såsom Integrative Genomics Viewer.28 For at undersøge hele genom-sekventeringsdata, der ligger til grund for hvert genotypekald, blev der brugt et grafvisualiseringsværktøj, som muliggør direkte visualisering af haplotyper og den tilsvarende læsepileup af ExpansionHunter genotyper (bilag s. 3, 15). Visuel inspektion af pileup-grafen blev udført på alle hele-genom-sekventerings-kort tandem-gentagelseskald for at bekræfte, at ExpansionHunter-forudsigelsen for alleler var fuldstændig indeholdt i hver læsning (dvs. gentagelsessekvensen var mindre end sekventerings-læselængden); at bekræfte tilstedeværelsen af ​​en monoallel eller biallel ekspansion; at opdage formodede falsk-positive opkald; og at detektere falsk-negative alleler i bialleliske gentagelsesudvidelser, såsom FXN (appendiks s. 4, 16).

ExpansionHunter estimerer gentagelsesstørrelse fra hel-genom-sekventeringsdata ved at analysere sekventeringslæsninger, der helt eller delvist indeholder en kort tandem-gentagelse. Hvis en kort tandem-gentagelsesallel er kortere end læselængden, forudsiger ExpansionHunter den nøjagtige størrelse; hvis en kort tandem-gentagelsesallel er længere end læselængden, estimerer ExpansionHunter gentagelsesstørrelsen inden for et CI, afhængigt af locus-sekvenssammensætning, dybden af ​​sekventering og kvaliteten af ​​sekventering.

Statistisk analyse

Vi klassificerede gentagelser som udvidet ved helgenomsekventering, hvis størrelsen forudsagt af ExpansionHunter var over præmutationsgrænsen, eller ikke-udvidet, hvis den forudsagte størrelse var under grænseværdien (bilag s. 28).

Sensitivitet og CI'er for gentagen ekspansionsdetektion for hel-genomsekventering blev beregnet som andelen af ​​alleler med udvidede gentagelser blandt tidligere PCR-bekræftede alleler med udvidede gentagelser. Specificiteten blev estimeret som andelen af ​​ikke-ekspanderede alleler blandt tidligere testede ikke-ekspanderede gentagelser ved PCR. En fuldstændig beskrivelse af de statistiske formler findes i appendiks (s. 1).

For at sammenligne gentagelsesstørrelser ved PCR med gentagne størrelsesestimater ved helgenomsekventering blev PCR-kvantificerede alleler sammenlignet med gentagelsesstørrelser forudsagt af ExpansionHunter for alleler, der var kortere end læselængden på tværs af alle 13 korte tandem-gentagelsesloci. Overensstemmelse blev beregnet ved procentdelen af ​​gentagelsesstørrelser forudsagt af ExpansionHunter, der var i overensstemmelse med PCR-kvantificeret størrelse, idet der blev taget hensyn til PCR-fejlen på plus eller minus én gentagelse. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af R statistisk software version 3.6.3.

Finansieringskildens rolle

Undersøgelsesdesign, patienttilmelding, dataindsamling og sekventering blev ledet af medarbejdere fra Genomics England og akademiske forskere. Ansatte hos Illumina udførte sekventeringen af ​​150 patientprøver som en planlagt komponent i hele genomsekventeringsdiagnostisk nøjagtighedsundersøgelse og udviklede ExpansionHunter. Ansatte i Genomics England, akademiske forskere og medforfattere RTH, ED og MAE udførte analysen og fortolkningen af ​​gentagne udvidelser hos patienter rekrutteret til 100 000 Genomes Project. Finansieringskilderne havde ingen rolle i datafortolkning eller skrivning af rapporten.

Resultater

Den diagnostiske nøjagtighed af hel-genom-sekventering til at detektere gentagne udvidelser blev evalueret i forhold til 793 PCR-tests tidligere udført inden for NHS fra 404 patienter (64 patienter blev testet for mere end én gentagelse; figur 1). Af disse tests blev 183 klassificeret som at have en udvidet gentagelse og 610 som ikke at have en gentagen ekspansion ved PCR, hvilket gav i alt 221 udvidede og 1321 ikke-ekspanderede individuelle alleler på tværs af 13 sygdomsloci (appendiks s. 24, 28). Helgenomsekventering klassificerede korrekt 215 af 221 udvidede alleler og 1316 af 1321 ikke-ekspanderede alleler sammenlignet med PCR-testresultater (appendiks s. 27, 29), hvilket viste en initial følsomhed på 97,3 procent (95 procent CI 94·2–99) ·0) og specificitet på 99·6 procent (99·1–99·9; tabel 1). Efter den visuelle korrektion af alle opkald baseret på kvaliteten af ​​aflæsningerne, steg sensitiviteten til 99,1 procent (96,8–99,9) og specificiteten til 100 procent (99,7–100; figur 2A, tabel 1). Visualisering af de udvidede alleler muliggjorde påvisning af falsk-positive resultater og omklassificering af alle falsk-negative alleler i FXN, hvoraf kun én allel korrekt blev klassificeret som ekspanderet i prøver med biallel udvidelser (appendiks s. 17, 18).

Gentagelseslængden blev kvantificeret ved PCR i 509 PCR-test, der forespurgte 945 alleler på tværs af 13 gentagne ekspansionsloci. Korrelationer mellem ExpansionHunter og PCR for gentagelsesstørrelser, der er kortere og større end sekventeringsaflæsningslængden (dvs. 150 bp) er vist i appendiks (appendiks s. 19). Høj overensstemmelse blev observeret for gentagelser kortere end læselængden, med 92·7 procent (836 af 902) overensstemmelse mellem PCR og ExpansionHunter. Lokusvariabilitet blev observeret med høj overensstemmelse mellem ExpansionHunter og PCR for ATXN2, ATXN7, CACNA1A og HTT og lav overensstemmelse for DMPK eller TBP (appendiks s. 30). Længderne af alleler, der var større end læselængden, blev undervurderet af ExpansionHunter, hvilket påvirkede nøjagtigheden af ​​at kalde DMPK, FMR1 og FXN (figur 2B, appendiks s. 19, 31).

Selvom ExpansionHunter var i stand til korrekt at identificere store udvidede alleler i FMR1, DMPK, C9orf72 og FXN (appendiks s. 29), havde de forudsagte størrelsesestimater en tendens til at være lavere end dem opnået ved PCR, da gentagelsesstørrelsen steg inden for det patogene område, hvilket påvirkede evne til at skelne mellem store og små udvidelser i DMPK, C9orf72 og FXN, eller mellem fulde udvidelser og permutationer i FMR1 (bilag s. 31). For eksempel havde loci med en PCR-vurderet gentagelseslængde større end 200 gentagelser i FMR1 og klassificeret som en fuld mutation en gennemsnitlig gentagelsesstørrelse estimeret af ExpansionHunter på 92·6 (SD 17·8; appendiks s. 31).

For at teste evnen til gentagen ekspansionsdetektion ved helgenomsekventering for at løse diagnosen af ​​tidligere testede og genetisk udiagnosticerede patienter, testede vi 11 631 patienter med en formodet genetisk neurologisk lidelse rekrutteret til 100000 Genomes Project (figur 1). Helgenomsekventeringsdata blev evalueret ved hjælp af fire forskellige gentagelsesudvidelsespaneler i henhold til patientens kliniske træk. Antallet af patienter testet med hvert af de fire paneler er vist i tabel 2.

Samlet set har vi opdaget og visuelt bekræftet gentagne udvidelser i prøver fra 105 patienter (tabel 2, appendiks s. 20, 33). Af disse var 81 prøver tilgængelige til bekræftende test ved PCR, og 68 blev bekræftet med en gentagen ekspansion (0·6 procent udbytte): 45 (1,2 procent) af 3692 i panel A, otte ({ {18}}·3 procent ) af 2743 i panel B, fem (0·6 procent ) af 860 i panel C og ti (0·1 procent ) af 6731 i panel D. Tretten af ​​81 udvidelsesopkald blev ikke bekræftet som patogene gentagne udvidelser (16 procent falsk opdagelsesrate). Af disse var to ikke-udvidede alleler i ATXN1 og ATXN2, fire var FMR1-mellemstørrelseskald (appendiks s. 21), og syv var FMR1-permutationer.

Kliniske detaljer om de 68 patienter med gentagne udvidelser bekræftet af PCR, inklusive deres kliniske præsentationer, den identificerede gentagne udvidelse og bidraget fra den gentagne udvidelse til patientens kliniske egenskaber er angivet i tabel 3; HPO-vilkårene, gentagelsesstørrelse estimeret af ExpansionHunter, og om der er udstedt en diagnostisk rapport, er anført i appendiks (s. 33).

Udvidelser blev observeret hos patienter med en bred vifte af overlappende kliniske præsentationer testet med panel A (tabel 3, appendiks s. 22), herunder en ATXN2 gentagen ekspansion hos en patient med levodopa-reagerende tidligt indsættende Parkinsons sygdom og en historie med progressiv cerebellar ataksi og AR-udvidelser hos fire patienter klinisk diagnosticeret med Charcot-Marie-Tooth sygdom, herunder en med en genetisk bekræftet demyeliniserende neuropati (dvs. Charcot-Marie-Tooth sygdom type 1, patient 42; bilag s. 33). En bred vifte af tidligere kliniske diagnoser blev observeret hos patienter med patogene gentagne udvidelser.

For eksempel, hos syv patienter med amyotrofisk lateral sklerose eller anden motorneuronsygdom blev udvidelser identificeret i AR (n=4) og C9orf72 (n=3). Hos patienter med mistanke om arvelig ataksi identificerede vi udvidelser i loci, der ikke var blevet vurderet som en del af rutinemæssig diagnostisk oparbejdning inden for NHS på rekrutteringstidspunktet, inklusive ATN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, FXN, TBP og HTT ( tabel 3). Vi påviste også gentagne udvidelser hos patienter med kliniske træk i overensstemmelse med alternative gentagelsesforstyrrelser, herunder en C9orf72-udvidelse i tidligt opstået og familiær Parkinsons sygdom (patient 24, tabel 3) og gentagne udvidelser i det reducerede penetransområde i HTT (38 gentagelser) hos to søstre med en bevægelsesforstyrrelse, demens, depression og talebesvær (patienter 44 og 45), hvilket understreger den diagnostiske udfordring, som disse gentagne ekspansionsforstyrrelser giver.

Otte børn testet med panel B viste sig at have store CAG-gentagelsesudvidelser (figur 3), hvoraf syv fuldt ud forklarede patientens kliniske træk. Seks patienter havde ikke en informativ familiehistorie og var ikke blevet tilbudt gentagen ekspansionstest som en del af deres kliniske vurdering på rekrutteringstidspunktet (patienter 48-53; tabel 3, appendiks s. 33). To af disse børn bar store HTT-udvidelser (90-100 CAG-gentagelser). Det skal bemærkes, at et barn havde arvet gentagelsen fra en upåvirket forælder uden nogen familiehistorie med Huntingtons sygdom. Familietest er i gang, men en reduceret penetrans-allel er blevet identificeret i den udvidede familie, hvilket indikerer, at gentagelsen var udvidet med over 60 gentagne enheder i en enkelt generation (patient 52). I skrivende stund viste ingen i familien tegn på Huntingtons sygdom, og genetisk rådgivning og test er i gang for forældrene. To børn under 5 år bar store gentagne udvidelser i ATXN7 og præsenterede med kompleks multisystemsygdom. For et af disse børn (patient 50) viste deres forælder gangproblemer 2 år efter tilmelding til 100000 Genomes Project. På samme måde blev en pige på 10 år med intellektuelt handicap fundet at have en 99-gentagen udvidelse i ATXN2, på trods af at begge forældre blev udpeget som upåvirkede, og en pige på 18 år med demens viste sig at bære en { {19}}gentag udvidelsen i ATN1 (appendiks s. 33).

Fem udvidelser i DMPK (panel C) blev påvist, herunder hos et barn og en mor med en klinisk diagnose muskeldystrofi, hos to søskende med mistanke om distal myopati og hos en teenager med medfødt myopati (patienter 54-58). FMR1-udvidelser (panel D) blev påvist hos ni drenge og en pige, og en diagnose af Fragilt X-syndrom forklarede helt eller delvist de præsenterende kliniske træk (patienter 59-68).

Diskussion

Diagnosen af ​​gentagne ekspansionsforstyrrelser er udfordrende i sundhedsvæsenet på grund af heterogene og overlappende kliniske træk og uspecifikke kliniske fund, som kan stige i sværhedsgrad med alderen og i hver efterfølgende generation. Gentagende ekspansionsforstyrrelser er blandt de mest almindelige årsager til arvelige neurologiske sygdomme.4 Ikke desto mindre kan patienter være underdiagnosticerede, enten fordi der ikke er udført tilstrækkelig genetisk testning, eller fordi de forårsagende genetiske varianter endnu ikke er blevet opdaget. Testmetoder er i øjeblikket fragmenterede, og patienter kan få testet det ukorrekte gentagne ekspansionslocus29 eller modtage en molekylær test for en anden klasse af varianter på grund af overlapning af kliniske træk med andre neurologiske genetiske lidelser.30

Helgenomsekventering er blevet brugt i flere indstillinger som en førstelinjediagnostisk test for sjældne neurologiske lidelser, men har tidligere været antaget at have en lav evne til at detektere gentagne udvidelser.16 Der er udviklet adskillige værktøjer til at identificere gentagne udvidelser fra hele genomet. sekventering i forskningsmiljøet31, men ingen af ​​disse tilgange er blevet anvendt på hel-genom-sekventeringsdata indsamlet fra et stort antal patienter i en enkelt sundhedstjeneste. Vi præsenterer bevis for, at en algoritme designet til at detektere gentagne udvidelser fra hel-genom-sekventering pålideligt kan vurdere de mest almindelige sygdomsfremkaldende gentagne udvidelser og løse tidligere genetisk udiagnosticerede tilfælde i en stor kohorte af patienter med neurologiske lidelser. Vores resultater indikerer, at hel-genom-sekventering kan skelne mellem ikke-ekspanderede og udvidede alleler med høj sensitivitet og specificitet på tværs af 13 gentagne ekspansionsloci (som kan forbedres yderligere ved visuel inspektion), nøjagtigt kan beregne størrelsen af ​​alleler, der er mindre end læselængden , og kan undervurdere størrelsen af ​​store udvidelser i FMR1, DMPK, FXN og C9orf72.

Når påvisning af gentagne udvidelser ved helgenomsekventering blev vurderet mod positive og negative resultater, der tidligere er opnået ved kliniske diagnostiske genomiske laboratorier ved hjælp af guldstandardmetoder, fandt vi et minimum på 97,3 procent sensitivitet og 99,6 procent specificitet. Ydermere viste vi, at både specificiteten og sensitiviteten kan forbedres ved manuel kuration af den læste pileup, hvilket muliggør påvisning af falsk-positive resultater og omklassificering af falsk-negative alleler i prøver med biallel-udvidelser. Af de 6731 patienter, der blev testet for FMR1 (panel D), blev 124 opkald forudsagt at blive udvidet. Vi var i stand til at udelukke 97 gennem visuel inspektion som sandsynlige falske positive. Dette indikerer, at 1 ud af 54 hele genomsekventeringstests ville have et FMR1-kald, der skulle inspiceres visuelt for at kassere et potentielt falsk-positivt opkald. Der arbejdes løbende på at forbedre ExpansionHunter-genotypemetoden for at reducere antallet af falsk-positive opkald til FMR1.

We show that repeat sizing is accurate for repeats smaller than the sequencing read lengths, and therefore that most non-expanded and premutation CAG repeat expansion disorder alleles can be sized accurately. These results are consistent with other studies showing a strong correlation between whole genome sequencing and PCR quantification of repeat lengths smaller than the sequencing read length.19,25,26 Whole genome sequencing expansion detection is limited in its sizing of alleles considerably larger than the read length, such as in Fragile X syndrome. We note that all FMR1 repeats previously classified by PCR as fully expanded (ie, >200 repeats) were classified by whole genome sequencing as permutation (50–200 repeats) in this study. Repeat size estimation for repeats larger than the read length is particularly important for loci in which the length of the repeat correlates with the disease clinical features. This includes DMPK, for which small expansions (50–150 repeats) cause mild myotonic dystrophy type 1 and large expansions (>1000 gentagelser) forårsager mere alvorlig sygdom, og spinocerebellar ataksi type 36 (NOP56), hvor udvidelser større end 650 gentagelser anses for at være patogene, og gentagelsesstørrelser på 15-650 betragtes som mellemliggende og varianter af usikker betydning.

Mere end 40 gentagne ekspansionsloci er blevet identificeret; mange af disse loci er først blevet identificeret for nylig og er nu forbundet med tidligere uforklarlige tilstande, herunder cerebellar ataksi med neuropati og vestibulært areflexia syndrom (RFC1) 32 og myoklonisk epilepsi (SAMD12).33 De mest almindelige neurologiske sygdomsfremkaldende loci af gentagne ekspansion var udvalgt til vores undersøgelse baseret på tilgængeligheden af ​​positive og negative kontrolprøver.

De fund, der præsenteres her, tyder på, at ExpansionHunter bør være i stand til at klassificere ikke-ekspanderede og udvidede alleler nøjagtigt på ethvert gentaget ekspansionslocus, hvis de ikke-ekspanderede alleler er mindre end læselængden (dvs. 150 bp). Selvom de fleste gentagne ekspansionsloci har alleler, der er mindre end 150 bp, når de ikke er ekspanderet, kan nogle loci, for hvilke størrelsen af ​​den ikke-ekspanderede allel er tæt på 150 bp (f.eks. NOTCH2NLC)34 være vanskeligere at genotype ved hjælp af denne fremgangsmåde. For loci, hvor den udvidede gentagelse er væsentligt større end læselængden, kan hel-genomsekventering detektere patogene udvidelser (f.eks. NOP56,35 RFC120,32). Nye langlæste sekventeringsteknologier kan tilbyde komplementære tilgange til genotypning af store udvidelser.36

Vurdering af gentagne udvidelser ved hjælp af hel-genom-sekventering i 11 631 udiagnosticerede patienter rekrutteret til 100 000 Genomes Project gav 68 patienter med forklarende fund. Patienter blev rekrutteret til 100 000 Genomes Project efter standard-of-care genetisk testning; derfor repræsenterer andelen af ​​gentagne udvidelser identificeret i denne kohorte en stigning af det diagnostiske udbytte fra standard NHS-test, som inkluderer locus-specifik test for gentagne udvidelsesforstyrrelser såsom FXN eller DMPK. Det skal bemærkes, at nogle diagnoser ikke var mistænkt baseret på patientens kliniske træk, herunder seks pædiatriske patienter, som ikke havde nogen kendt familiehistorie med en gentagen ekspansionsforstyrrelse. De gennemsnitlige gentagne ekspansionsstørrelser forudsagt af hele genomsekventering hos pædiatriske patienter beskrevet i denne undersøgelse er væsentligt større end gennemsnittet hos voksne, i overensstemmelse med forventningen om, at større ekspansion er forbundet med tidligere og mere alvorlig debut, selv hos børn. Der er behov for yderligere arbejde, men dette fund tyder på, at en aldersafhængig og gentagen størrelsesafhængig vurdering af patogenicitet kan understøtte en pædiatrisk diagnose ved at reducere den potentielle risiko ved at identificere risikoalleler for voksne, hvilket fører til uopfordret prædiktiv test hos børn.

Vores resultater muliggør etablering af en klinisk diagnostisk arbejdsgang for helgenomsekventering (bilag s. 23). Vi foreslår, at der udføres visuel inspektion for alle opkald, der er klassificeret som udvidet for at detektere falske positiver, og for bialleludvidelser, for hvilke der kun er blevet detekteret én udvidet allel (f.eks. FXN). Vi anbefaler, at laboratorier bruger ExpansionHunter til at vurdere tilstedeværelsen af ​​en udvidelse uden overholdelse af størrelsesestimering og udføre bekræftende PCR-test som en standardkomponent i test-workflowet.

Sjældne arvelige sygdomme omfatter en bred vifte af kliniske træk, hvilket gør locus-specifik genomisk testning ineffektiv, besværlig og dyr. Vi præsenterer beviser for, at sekventering af hele genomet af klinisk kvalitet med potentiale til at diagnosticere en række sjældne neurologiske sygdomme, der typisk præsenteres med en enkelt base, indel eller kopinummervarianter, nu kan udvides til gentagne udvidelser. Fordi hel-genom-sekventering giver en enkelt test, der kan identificere de mest almindelige gentagne udvidelser, såvel som muliggør test af punktmutationer og kopiantalvarianter i gener forbundet med disse tilstande samtidigt, giver det mulighed for at identificere de fleste patienter med disse heterogene lidelser som ikke er blevet diagnosticeret ved hjælp af locus-specifik test. I en tid med nye terapier for disse lidelser kan tidlig påvisning blive afgørende.37 Disse resultater understøtter implementeringen af ​​hel-genom-sekventering til påvisning af gentagne udvidelser i kliniske diagnostiske laboratorier, en tilgang, der allerede er inkluderet i NHS England National Genomic Test Directory,38 til undersøgelse af udiagnosticeret sjælden neurologisk sygdom.

Referencer

1 Ngo KJ, Rexach JE, Lee H, et al. Et diagnostisk loft for exome-sekventering i cerebellar ataksi og relaterede neurologiske lidelser. Hum Mutat 2020; 41: 487-501.

2 Lynch DS, Koutsis G, Tucci A, et al. Arvelig spastisk paraplegi i Grækenland: karakterisering af en tidligere uudforsket befolkning ved hjælp af næste generations sekventering. Eur J Hum Genet 2016; 24: 857-63.

3 Graziola F, Garone G, Stregapede F, et al. Diagnostisk udbytte af et målrettet næste generations sekventeringsgenpanel for pædiatriske bevægelsesforstyrrelser: en 3-årig kohorteundersøgelse. Front Genet 2019; 10:1026.

4 Paulson H. Gentagende ekspansionssygdomme. Handb Clin Neurol 2018; 147: 105-23.

5 Gossye H, Engelborghs S, Van Broeckhoven C, van der Zee J. C9orf72 frontotemporal demens og/eller amyotrofisk lateral sklerose. Seattle, WA: University of Washington, 2015.

6 Klockgether T, Mariotti C, Paulson HL. Spinocerebellar ataksi. Nat Rev Dis Primere 2019; 5:24.

7 Shakkottai VG, Fogel BL. Klinisk neurogenetik: autosomal dominant spinocerebellar ataksi. Neurol Clin 2013; 31: 987-1007.

8 La Spada A. Spinal og bulbar muskelatrofi. I: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al., red. GeneReviews. Seattle, WA: University of Washington, 1999.

9 Gousse G, Natural H, Touraine R, et al. Dødelig form for spinocerebellar ataksi type 7 med tidlig indtræden i barndommen. Arch Pediatr 2018; 25:42-44.

10 Ansorge O, Giunti P, Michalik A, et al. Ataxin-7 aggregering og ubiquitinering i infantil SCA7 med 180 CAG-gentagelser. Ann Neurol 2004; 56: 448-52.

11 Ramocki MB, Chapieski L, McDonald RO, Fernandez F, Malphrus AD. Spinocerebellar ataksi type 2 med kognitiv regression i barndommen. J Child Neurol 2008; 23: 999-1001.

12 Mitchell N, LaTouche GA, Nelson B, Figueroa KP, Walker RH, Sobering AK. Spinocerebellar ataksi 3 i barndommen: tungedystoni som en tidlig manifestation. Tremor Other Hyperkinetic Mov 2019; offentliggjort online 13. september.

13 Fugl TD. Myotonisk dystrofi type 1. I: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, red. GeneReviews. Seattle, WA: University of Washington, 2019.

14 Aydin G, Dekomien G, Hoffman S, Gerding WM, Epplen JT, Arning L. Hyppighed af SCA8, SCA10, SCA12, SCA36, FXTAS og C9orf72 gentagne udvidelser hos SCA-patienter negativ for de mest almindelige SCA-subtyper. BMC Neurol 2018; 18:3.

15 Turro E, Astle WJ, Megy K, et al. Helgenomsekventering af patienter med sjældne sygdomme i et nationalt sundhedssystem. Natur 2020; 583: 96-102.

16 Ashley EA. På vej mod præcisionsmedicin. Nat Rev Genet 2016; 17: 507–22.

17 Liu HY, Zhou L, Zheng MY, et al. Diagnostisk og klinisk anvendelighed af hel-genom-sekventering i en kohorte af udiagnosticerede kinesiske familier med sjældne sygdomme. Sci Rep 2019; 9: 19365.

18 Mousavi N, Shleizer-Burko S, Yanicky R, Gymrek M. Profilering af det genomomfattende landskab af tandem-gentagelsesudvidelser. Nucleic Acids Res 2019; 47: e90.

19 Tankard RM, Bennett MF, Degorski P, Delatycki MB, Lockhart PJ, Bahlo M. Detektering af udvidelser af tandemgentagelser i kohorter sekventeret med kortlæste sekventeringsdata. Am J Hum Genet 2018; 103: 858-73.

20 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Bennett MF, et al. Bioinformatik-baseret identifikation af udvidede gentagelser: en ikke-reference intronisk pentamer-udvidelse i RFC1 forårsager CANVAS. Am J Hum Genet 2019; 105: 151-65.

21 Gross AM, Ajay SS, Rajan V, et al. Kopinummervarianter i klinisk genomsekventering: implementering og fortolkning for sjælden og udiagnosticeret sygdom. Genet Med 2019; 21: 1121-30.

22 Trost B, Engchuan W, Nguyen CM, et al. Genom-dækkende påvisning af tandem DNA-gentagelser, der udvides ved autisme. Natur 2020; 586: 80-86.

23 Robinson PN, Kohler S, Bauer S, Seelow D, Horn D, Mundlos S. Den menneskelige fænotypeontologi: et værktøj til at kommentere og analysere menneskelig arvelig sygdom. Am J Hum Genet 2008; 83: 610-15.

24 Genomics England. Sjældne sygdomstilstande kliniske datamodeller. 2018. https://www.genomicsengland.co.uk/?wpdmdl=5500 (tilganget 4. august 2021).

25 Dolzhenko E, van Vugt JJFA, Shaw RJ, et al. Påvisning af lange gentagelsesudvidelser fra PCR-fri helgenomsekvensdata. Genome Res 2017; 27: 1895-903.

26 Dolzhenko E, Deshpande V, Schlesinger F, et al. ExpansionHunter: et sekvensgrafbaseret værktøj til at analysere variation i korte tandem-gentagelsesområder. Bioinformatik 2019; 35: 4754-56.

27 Roy S, Coldren C, Karunamurthy A, et al. Standarder og retningslinjer for validering af næste generations sekventeringsbioinformatikpipelines: en fælles anbefaling fra Association for Molecular Pathology og College of American Pathologists. J Mol Diagn 2018; 20:4–27.

28 Robinson JT, Thorvaldsdottir H, Winckler W, et al. Integrativ genomics viewer. Nat Biotechnol 2011; 29:24–26.

29 Schneider SA, van de Warrenburg BPC, Hughes TD, et al. Fænotypisk homogenitet af den Huntington-sygdomslignende præsentation i en SCA17-familie. Neurology 2006; 67: 1701-03.

30 Schneider SA, Bird T. Huntingtons sygdom, ligner Huntingtons sygdom og benign arvelig chorea: hvad er nyt? Mov Disord Clin Practice 2016; 3: 342-54.

31 Bahlo M, Bennett MF, Degorski P, Tankard RM, Delatycki MB, Lockhart PJ. Nylige fremskridt inden for detektering af gentagne udvidelser med kortlæst næste generations sekvensering. F1000Res 2018; 7: 736.

32 Cortese A, Simone R, Sullivan R, et al. Biallel ekspansion af en intronisk gentagelse i RFC1 er en almindelig årsag til sent opstået ataksi. Nat Genet 2019; 51: 649-58.

33 Ishiura H, Doi K, Mitsui J, et al. Udvidelser af intronisk TTTCA- og TTTTA-gentagelser ved benign familiær myoklonisk epilepsi hos voksne. Nat Genet 2018; 50: 581-90.

34 Ishiura H, Shibata S, Yoshimura J, et al. Ikke-kodende CGG-gentagelsesudvidelser i neuronal intranukleær inklusionssygdom, oculopharyngodistal myopati og en overlappende sygdom. Nat Genet 2019; 51: 1222-32.

35 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Pope K, et al. Hurtig diagnose af spinocerebellar ataksi 36 i en tre-generations familie ved hjælp af kortlæste hel-genom sekventeringsdata. Mov Disord 2020; 35: 1675-1679.

36 Mantere T, Kersten S, Hoischen A. Langlæst sekventering fremkommer i medicinsk genetik. Front Genet 2019; 10:426.

37 Ellerby LM. Gentagne ekspansionsforstyrrelser: mekanismer og terapi. Neuroterapeutika 2019; 16: 924–27.

38 Det nationale sundhedssystem. National Genomic Test Directory: testkriterier for sjælden og arvelig sygdom. oktober 2021.