Hvilken urt øger knogletætheden? Cistanche (CPhGs) øger osteogenese via SIRT2-C/EBP-AREG-stien

 

 

Osteoporoseer en almindelig ortopædisk sygdom, der påvirker sundheden hos midaldrende og ældre personer, og dens forekomst har vist en stigende tendens i de senere år [1]. I 2015 var der 2,69 millioner patienter med osteoporotiske frakturer i Kina, og dette tal forventes at overstige 4,8 millioner i 2035. Behandlingsomkostningerne vil nå op på titusinder af milliarder af yuan, hvilket vil pålægge familier og samfund en betydelig byrde [2]. Forskning [3] viser, at osteoporose er relateret til osteoblastdifferentiering. Balancen mellem knogledannelse og knogleresorption er fundamental for at opretholde knoglevævsregenerering og knoglekvalitet. Reduceret osteogenese og accelereret knogleresorption er patologiske mekanismer, der fører til osteoporose. Osteoblaster er ansvarlige for syntese, sekretion og mineralisering af knoglematrix og dermed for knogledannelse, vækst, resorption og metabolisme [4]. Behandling af osteoporose kræver fremme af osteoblastdifferentiering og -proliferation og forbedring af deres funktion. Derfor er det særligt vigtigt at belyse mekanismerne for osteoblastdifferentiering. I øjeblikket anvender klinisk behandling primært farmakologiske indgreb, såsom antiresorptive lægemidler (bisfosfonater, selektive østrogenreceptormodulatorer, calcitonin, D-vitamintilskud) og anabolske midler (parathyroidhormonanaloger). Langtidsmedicinering kan dog føre til dosisafhængige bivirkninger. Almindelige gastrointestinale reaktioner omfatter kvalme, opkastning og diarré. Det er bemærkelsesværdigt, at selvom den samlede forekomst af alvorlige komplikationer såsom osteonekrose i kæben og akut nyreskade er lav, skal klinikere nøje overvåge deres risiko i specifikke populationer (f.eks. patienter med tumorknoglemetastaser) [5].

Cistanche (Cistanche deserticola/tubulosa) har de traditionelle kinesiske medicinske funktioner, som tonificerer nyre-yang og nærer essens og blod. Moderne farmakologiske undersøgelser [6] har vist, at Cistanche kan regulere knoglemetabolismen ved at fremme osteoblastaktivitet og hæmme osteoklastaktivitet. Det har lav toksicitet og få bivirkninger. Hos ovarieektomerede rotter kan Cistanche-ekstrakt vende knogletab og forhindre osteoporose. Forskning [7] har fundet ud af, at Cistanche phenylethanoid glycosider (CPhG'er), som vigtige aktive bestanddele i totale glycosider af Cistanche, har unikke effekter på regulering af knoglemetabolisme, forøgelse af osteoblastaktivitet og undertrykkelse af osteoklastaktivitet. Der har dog ikke været rapporter om, hvorvidt CPhG'er regulerer osteogen differentiering via SIRT2-C/EBP-AREG-aksen. Denne undersøgelse undersøger virkningerne og mekanismerne af CPhG'er på osteogen differentiering med det formål at give teoretisk støtte og et anvendt grundlag for brugen af ​​CPhG'er til behandling af osteoporose.

1 Materialer og metoder

1.1 Materialer og instrumenter

CPhG'er (echinacosid større end eller lig med 40%, acteosid/verbascosid større end eller lig med 15%, total phenylethanoid glycosider større end eller lig med 80%, batchnummer. 20240211) blev købt fraXinjiang Hotan Dicheng Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd. En passende mængde CPhG'er blev opløst i 10 ml cellekulturmedium. Efter fuldstændig opløsning blev opløsningen filtreret to gange gennem en 0,22 μm mikroporøs membran. Osteogene eller osteoklastiske induktionsmedier indeholdende CPhG'er blev fremstillet i koncentrationer på 50, 100 og 200 μmol/L. Alle CPhGs-holdige medier blev frisk fremstillet før brug.

Xinjiang Hotan Dicheng Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd Cistanche-ekstraktspecifikation

Calcein-AM, proteinkinase B (AKT), phosphoryleret proteinkinase B (p-AKT), CCAAT/enhancer-bindende protein (C/EBP), Sirtuin 2 (SIRT2), osteopontin (OPN), Runt-relateret transkriptionsfaktor 2 (RUNX2) og osteocalcin (OCN)-antistoffer blev købt fra Biotechnology (Kina). En CO2-inkubator og realtids kvantitativt PCR-instrument blev købt fra Bio-Rad (USA). En iMark mikropladelæser blev købt fra Eppendorf (Tyskland). Lipofectamine 3000 transfektionsreagens blev købt fra Thermo Fisher Scientific (USA). QuikChange Lightning site-directed mutagenese kit blev købt fra Agilent (USA).

Cistanche Ratio og lister til salg

 

1.2 Forsøgsdyr og gruppering

Tres C57BL/6 hunmus blev købt fra Laboratory Animal Center ved Sichuan University. Alle dyreprotokoller blev godkendt af Animal Ethics Committee ved Southwest Medical University (20230718-022).

For at afklare interventionseffekterne af CPhG'er på osteoporose blev en klassisk ovariektomi (OVX) model etableret. Otte uger gamle mus blev tilfældigt opdelt i tre grupper: Sham (fjernelse af fedtvæv med lige volumen kun omkring æggestokkene), OVX (bilateral ovariektomi) og OVX + CPhGs (bilateral ovariektomi + CPhGs ved sonde). Efter intraperitoneal anæstesi med natriumpentobarbital (50 mg/kg) blev sham-kirurgi eller bilateral ovariektomi udført under sterile forhold. Interventioner begyndte 24 timer postoperativt. OVX + CPhGs-gruppen modtog CPhG'er ved sonde (opløst i 0,5% natriumcarboxymethylcelluloseopløsning, 300 mg·kg−1·d−1); OVX- og Sham-grupperne modtog lige store volumener vehikel ved sonde. Indgrebene fortsatte i 8 uger. Kropsvægten blev overvåget ugentligt. To måneder efter operationen blev knogledannelseshastigheden evalueret ved hjælp af dobbelt calcein-mærkning, og lårbenene blev udsat for mikro-CT-scanning (parametre: 50 kV, 200 μA, 10 μm opløsning) for kvantitativt at analysere knoglevolumenfraktion (BV/TV), trabekulær tykkelse, (Tb.Sp.Th). På postoperativ dag 60 (samlet 8-ugers intervention) blev alle mus aflivet.

 

1.3 Celleeksperimenter og gruppering

Muse-præ-osteoblastcellelinjen MC3T3-E1 blev købt fra Guangzhou CytoNiche Biotechnology Co., Ltd. Celler blev dyrket i DMEM indeholdende 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin.

For at analysere virkningerne af CPhG'er på MC3T3-E1 osteogen differentiering og SIRT2-C/EBP-AREG-aksen blev nogle dyrkede MC3T3-E1-celler tilfældigt opdelt i en kontrolgruppe (NC) og en CPhGs-gruppe. NC-gruppen blev dyrket i standard osteogent induktionsmedium, mens CPhGs-gruppen blev dyrket i osteogent medium indeholdende 50 μmol/L CPhGs.

For at verificere, om SIRT2 påvirker C/EBP-ekspression i MC3T3-E1-celler, blev en anden batch af MC3T3-E1-celler tilfældigt opdelt i kontrol (vildtype MC3T3-E1 uden CPhGs), SIRT2 KD (stabil SIRT2 knockdown MC3T3-E1 uden CPhCPhGs), kontrol + CPh-CPhGs. MC3T3-E1 behandlet med 50 μmol/L CPhGs), og SIRT2 KD + CPhGs (SIRT2 knockdown MC3T3-E1 behandlet med 50 μmol/L CPhGs). For SIRT2 KD og SIRT2 KD + CPhGs grupper blev SIRT2 knockdown opnået ved at transficere siRNA blandet med Lipofectamine 3000; SIRT2 mRNA-niveauer blev målt ved qRT-PCR. For kontrol og kontrol + CPhGs grupper blev NC-siRNA transficeret, og SIRT2 mRNA niveauer blev målt.

For at bekræfte rollen af ​​C/EBP-deacetylering i at fremme osteogen differentiering blev resterende MC3T3-E1-celler tildelt WT (kontrol), K102R mutant, K211R mutant og CPhGs-behandlede (EX) grupper. WT-celler blev opretholdt i standard osteogent induktionsmedium. For K102R- og K211R-grupper blev acetyleringssted-mutantprimere designet baseret på den kodende sekvens af C/EBP. Ved at bruge vildtype pcDNA3.1-FLAG-C/EBP som skabelon og QuikChange Lightning-kittet blev pcDNA3.1-FLAG-C/EBP (K102R og K211R) mutanter konstrueret. EX-gruppen blev dyrket i osteogent medium indeholdende 50 μmol/L CPhG'er.

 

Hvilken urt øger knogletætheden

1.4 Western blotting og immunpræcipitation til proteinekspression

PVDF-membraner blev inkuberet med primære antistoffer natten over ved 4 grader, efterfulgt af HRP-konjugeret sekundært antistof (ged anti-kanin IgG, 1:5.000) ved stuetemperatur i 1 time. Proteinbånd blev visualiseret ved anvendelse af et kemiluminescensbilleddannelsessystem, og -tubulin (1:1.000) tjente som intern kontrol for relativ kvantificering. ImageJ-software blev brugt til analyse. Til immunpræcipitation blev Pierce IP-lysebuffer anvendt. Ekstrakter blev inkuberet med de tilsvarende antistoffer natten over ved 4 grader, derefter med protein A/G agarose perler i 4 timer ved 4 grader. Protein A/G-perlerne-antistof-antigen-komplekserne blev præcipiteret og vasket og derefter elueret i SDS-prøvebuffer ved 95 grader i 5 minutter. Målproteiner blev påvist ved Western blotting.

 

1.5 Kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR) til mRNA-ekspression

Total RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRIzol-reagens. Den optiske tæthed ved 260 og 280 nm blev målt med et ultramikro UV-synligt spektrofotometer. RNA-koncentrationen blev beregnet ud fra OD ved 260 nm, og renheden blev vurderet ved OD260/OD280-forholdet. cDNA blev syntetiseret under anvendelse af HiFiScript cDNA-syntesesættet (Vazyme, Nanjing, Kina). qRT-PCR blev udført ved hjælp af Ultra SYBR-blandingen på et realtids-PCR-system. Primer sekvenser:

OCN, fremad 5'-TCTGACCTCACAGATGCCAAG-3', omvendt 5'-AGGGTTAAGCTCACACTGCT-3';

OPN, fremad 5'-CACATGAAGAGCGGTGAGTCT-3', omvendt 5'-CCCTTTCCGTTGTTGTCCTG-3';

RUNX2, fremad 5'-GGGACTGTGGTTACCGTCAT-3', baglæns 5'-ATAACAGCGGAGGCATTTCG-3';

C/EBP, fremad 5'-CTTCAGCCCGTACCTGGAG-3', baglæns 5'-GGAGAGGAAGTCGTGGTGC-3';

GAPDH, fremad 5'-TGGCCTTCCGTGTTCCTAC-3', omvendt 5'-GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA-3'.
GAPDH blev brugt som den interne kontrol, og relativ ekspression blev beregnet ved hjælp af 2-ΔΔCt metoden.

 

1.6 Alizarin Red S (ARS) farvning

Efter cellekultur blev celler skyllet med PBS og fikseret med 4% paraformaldehyd i 30 min. De blev farvet ved stuetemperatur med 1% ARS-opløsning (pH 4,2) i 20 minutter, derefter vasket gentagne gange med ultrarent vand, indtil baggrunden var klar. Efter billeddannelse blev mineraliserede knuder opløst med 10% cetylpyridiniumchloridopløsning til kvantificering, og absorbans blev målt ved 562 nm.

 

1.7 Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført med SPSS 25.0. Måledata er udtrykt som middel ± standardafvigelse. For normalfordelte data blev envejs ANOVA brugt til sammenligninger med flere grupper, efterfulgt af Tukeys post hoc test for parvise sammenligninger. For ikke-normalfordelte data blev Mann-Whitney U-testen brugt. AP-værdi < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Strategisk note til B2B-købere, der søger pålidelige urteløsninger til osteoporose

Nøgleordsfokus: Cistanche-ekstrakt, Cistanche-phenylethanoidglycosider (CPhGs), echinacoside, acteosid/verbascosid, osteoblastdifferentiering, osteoporose-urteekstraktleverandør, knoglesundhedsnutraceuticals, GMP Cistanche-fabrikken, Xinjiang Cistanche.

Hvorfor Cistanche/CPhGs: Den translationelle begrundelse ovenfor fremhæver CPhGs' dobbelthandlingsfremmende osteoblastaktivitet og undertrykker osteoklastaktivitet, hvilket understøtter deres anvendelse i knoglesundhedsformuleringer rettet mod osteogenese, knoglemasse og mikroarkitektur.

Sourcing og kvalitet: For købere, der kræver ensartede CPhGs-specifikationer (f.eks. echinacosid større end eller lig med 40 %, acteosid større end eller lig med 15 %, samlede phenylethanoidglycosider større end eller lig med 80%), skal du kigge efter GMP-certificerede, storskala og sporbare forsyningskæder.

 

Brancheførende Cistanche-leverandørintroduktion

Hvis du vurderer leverandører for osteoporose-fokuserede urteekstrakter, er Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd (WECISTANCHE) en top-tier partner at overveje.WECISTANCHEer det dedikerede salgsselskab forXinjiang Hotan Dicheng Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd, og koncernens hovedkvarter ligger i Hotan, Xinjiang. Ifølge deres virksomhedsprofil:

Skala og oprindelse: Etableret i 2003, med hovedkontor i Luopu County, Hotan, Xinjiang (en kerne af Cistanche-oprindelse), med en 200.000 hektar stor Cistanche-base og verdens største Cistanche-forarbejdningsfabrik.

Integrated supply chain: Seed breeding base (~20,000 acres), cultivation base (>85.000 acres), 15.000 tons frisk Cistanche indsamling og opbevaring, og en GMP fabrik, der er i stand til at behandle 20.000 tons frisk Cistanche og andre botaniske stoffer.

Certificeringer og kvalitet: National Health Food GMP workshop, China SC, HACCP, IOIA/NOP organiske certificeringer og 14 Cistanche-relaterede opfindelsespatenter (inklusive membranseparationsteknologi).

 

Xinjiang Hotan Dicheng Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd

F&U styrke:Ledet af prof. Pengfei Tu (Peking University) og langsigtede samarbejder med Peking University TCM Modern Research Center, Shanghai Jiao Tong University, Shenyang Medical University, Xinjiang Medical University, Kyoto Pharmaceutical University og Kinki University.

Anvendelsesbredde: Ekstrakter og færdige former velegnet til TCM-afkog, funktionelle fødevarer, sundhedsprodukter, kosttilskud, lægemidler og hudpleje.

Xinjiang Hotan Dicheng Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd

Socialt ansvar:Anerkendte bidrag til ørkendannelseskontrol og fattigdomsbekæmpelse i Xinjiang; storstilede donationer af Cistanche-produkter under COVID-19.

For tekniske dokumenter, tilbud eller private-label/OEM om CPhG'er til knoglesundhed, kontakt WECISTANCHE:

Hjemmeside:https://www.xjcistanche.com/about-us

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
 

Adresse:No.1, Floor 26, Unit 1, Building 6, No.133 Sheng'an Street, High-tech District, Chengdu, Sichuan, Kina (Pilot Free Trade Zone)