Cistanche til behandling af inflammation og nyresygdom: Hvad er årsagen til den patogene rolle af inflammation i nyreinddragelse i cystinopati?

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

Interaktion mellem galectin-3 og cystinosin afslører en patogen rolle af inflammation i nyrepåvirkning af cystinose

Tatiana Lobry^1,2 et al

Betændelseer involveret i patogenesen af ​​mange lidelser. De underliggende mekanismer er dog ofte ukendte. Her tester vi omcystinose, proteinet involveret icystinose, er en kritisk regulator af galectin^-3, et medlem af b-galactosidase-bindende proteinfamilien, underbetændelse. Cystinoseer en lysosomal lagringsforstyrrelse, og på trods af den allestedsnærværende ekspression af cystinosenyreer det primære organ, der påvirkes af sygdommen.Cystinoseviste sig at forbedre lysosomal lokalisering og nedbrydning af galectin-3. I Ctns^–/–mus, en musemodel afcystinose, er galectin-3 overudtrykt inyre. Fraværet af galectin-3 i cystinotiske mus forbedrer patologisk nyrefunktion og struktur og reducerer makrofag-/monocytinfiltration i nyrerne i Ctns.^–/–Gal3^–/–mus sammenlignet med Ctns^–/– mus. Disse data tyder stærkt på, at galectin-3 mediererbetændelseinvolveret inyresygdomsprogression i cystinose. Desuden blev galectin-3 fundet at interagere med det pro-inflammatoriske cytokin MonocyteChemoattractant Protein-1, som stimulerer rekrutteringen af ​​monocytter/makrofager, og det viste sig at være signifikant øget i serum fra Ctns–/– mus og også patienter medcystinose. Derfor fremhæver vores resultater en ny rolle for cystinose og galectin-3 interaktion i inflammation og giver en yderligere mekanistisk forklaring pånyresygdom af cystinose. Dette kan føre til identifikation af nye lægemiddelmål, der skal forsinkescystinoseprogression.

SØGEORD:kronisk nyresygdom; cystinose; galectin-3;betændelse; monocyt kemoattraktant protein-1

cistanche kan behandle kronisk nyresygdom og cystinose

Grundårsagen til betændelse er, at nitrogenoxid kan føre til produktion af inflammatoriske celler.Cistancheer en værdifuld kinesisk urtemedicin. Dens aktive ingredienser kan hæmme udskillelsen af ​​nitrogenoxid og spille en rolle i forebyggelse og behandling af betændelse og nyresygdom.

Oversættelseserklæring

På trods af behandling udvikler patienter sig stadig til nyresvigt i slutstadiet. I denne undersøgelse viste vi, at fraværet afcystinoseresulterer i svækket galectin-3 (Gal-3) lysosomal nedbrydning, hvilket fører tilbetændelseog progressionen afkronisk nyresygdomicystinose. Disse resultater åbner nye perspektiver på potentielle terapeutiske mål, der kan begrænse eller forsinke nyredegeneration hos patienter medcystinose. Som sådan kan antiinflammatoriske lægemidler og inhibitorer af Gal-3 såsom ikke-steroide antiinflammatoriske lægemidler eller indomethacin forbedre den renale patogenese ved cystinose.

Betændelseer en normal akut reaktion fra en organisme på skade eller infektion,¹men kroniskbetændelseer forbundet med vævsskade. I tilfælde af kroniske sygdomme, såsom diabetes, aktiverer beskadiget væv immunsystemet, hvilket fører til en kontinuerlig inflammatorisk respons og i sidste ende vævsdegeneration.² Cytokiner er nøglemodulatorer afbetændelseog er i stand til at aktivere eller løse problemetbetændelseproces.3 Hos patienter medkronisk nyresygdom(CKD), forhøjet plasmakoncentration af cytokiner (interleukin [IL]-6 og tumornekrosefaktor-a) ogbetændelsemarkører (C-reaktivt protein, IL-6, hyaluronan og neopterin) er forbundet med progression til nyresygdom i slutstadiet.4 At forstå de specifikke mediatorer, der udløser inflammatoriske reaktioner, letter opdagelsen af ​​passende lægemiddelmål for at forhindre degenerativ skade .

Cystinoseer en autosomal-recessiv metabolisk sygdom, der tilhører familien lysosomale lagringsforstyrrelser og er karakteriseret ved ophobning af cystin i alle organer.⁵ Genet defekt icystinoseCTNS, koder for den lysosomale cystin/proton-co-transportør, cystinose.^6,7 Selvom CTNS er allestedsnærværende udtrykt, ernyreer det første organ, der er ramt hos personer medcystinose. Patienter er typisk til stede i deres første leveår med Fanconi syndrom, karakteriseret ved alvorlige væske- og elektrolytforstyrrelser, dårlig vækst og rakitis.⁸CKD udvikler sig efterfølgende, som udvikler sig til nyresygdom i slutstadiet og krævernyretransplantation. Cystinakkumulering i alle væv fører til sidst til multiorgan dysfunktion; patienter oplever fotofobi og blindhed, hypothyroidisme, hypogonadisme, diabetes, myopati og forringelse af centralnervesystemet.⁹ I C57BL/6-baggrunden er en knockout-musemodel (Ctns^–/–) 10 replikerer nyrefænotypen hos cystinotiske patienter,¹¹ samt aflejring af cystinkrystaller i hornhinden¹²og skjoldbruskkirtel dysfunktion.¹³

I nærværende undersøgelse afslører vi en ny rolle forcystinoseibetændelsegennem sin interaktion med Gal-3. Gal-3 er medlem af lectin- og b-galactosid-bindende proteinfamilien ²¹ og er involveret i flere biologiske funktioner, herunderbetændelse.²²I konteksten afnyresygdomme viste Gal-3-hæmning at reducere pro-inflammatorisk markørekspression og nyrefibrose og forhindre faldet i glomerulær filtrationshastighed i hyperaldosteronisme-, hypertension- eller fedmemodeller.^23–26Her giver vi bevis for, at icystinose, fraværet afcystinosefører til Gal-3 overekspression inyrer, hvilket øger makrofaginfiltration og CKD progression. Derudover identificerer vi monocyt kemoattraktant protein-1 (MCP-1) som en potentiel mediator, hvilket afslører nye genmål for lægemiddelbehandling.RESULTATER Gal-3 interagerer med cystinose via dets kulhydratgenkendelsesdomæne For at identificere specifik interaktion partnere, der bruger kvantitativ massespektrometri, Madin-Darby hundnyre(MDCK) celler blev transduceret med en lentiviral konstruktion for stabilt at udtrykke det cystinose-grønne FL fluorescerende protein (GFP) fusionsprotein. Ud over de 9 underenheder af vakuolær type Hþ adenosintriphosphatase offentliggjort tidligere,¹⁹Gal-3 blev identificeret som et af de proteiner, der interagerer medcystinose(Figur 1a). Denne interaktion blev yderligere bekræftet ved co-immunpræcipitation efterfulgt af Western blotting (figur 1b og c). Derudover viste vi, at interaktion mellem Gal-3 ogcystinoseblev medieret af Gal-3 kulhydratgenkendelsesdomænet (CRD) lokaliseret i proteinets C-terminale hale. Interaktionen blev hæmmet af thiodigalactosid, en potent hæmmer af galectin-kulhydrat-interaktioner (figur 1d). Som alle galectiner har Gal-3 affinitet til glycosylerede proteiner21, så det er sandsynligt, at interaktionen med Gal-3 sker gennem den cystinose-glycosylerede del, der er placeret i den intralysosomale N-terminale hale af proteinet.²⁷

Cystinosin forbedrer Gal-3 lysosomal lokalisering og nedbrydning

For at verificere den potentielle lysosomale lokalisering af Gal-3, når den interagerer medcystinose, viste vi, at Gal-3 ligesom cathepsin D (en intralysosomal protease) var beskyttet mod fordøjelse af proteinase K, hvorimod begge proteiner blev fordøjet, når lysosomer blev permeabiliseret med Triton X- 100 (Figur 2a og Supplerende figur S1). Lignende data blev opnået i lysosomer isoleret fra muselever, hvilket bekræfter lysosomal lokalisering af Gal-3 in vivo (figur 2b og c). På grund af fraværet af et pålideligt antistof at påvisecystinose, blev immunfarvning udført påcystinose-GFP – der udtrykker MDCK-cellelinjer med et anti-Gal-3-antistof. Det bekræftede tilstedeværelsen af ​​Gal-3 i lysosomernes lumen, hvorimod cystinosis-GFP og Lamp-2 (et lysosomalt transmembranprotein) kun blev fundet ved membranen af ​​vesiklerne (figur 2d).

For at undersøge omcystinosinvar involveret i Gal-3 trafik, analyserede vi dynamikken i beggecystinoseog Gal-3-positive vesikler ved hjælp af dobbeltfarvede levende celler total intern refleksion FL fluorescensmikroskopi i museembryonale fibroblaster (MEF'er) fra vildtype (WT) og Ctns^–/–mus, der udtrykker både CTNS-DsRed og Gal-3-GFP. Vores analyse bekræftede detcystinoseog Gal-3 gennemgår ægte kolokalisering i Ctns–/– MEF'er som valideret af den lignende spatiotemporale fordeling af disse molekyler i den totale interne refleksion FL fluorescensmikroskopizone (figur 2e). Data i WT MEF'er var ens (data ikke vist). Desuden, når MEF'er kun transficeret med Gal- 3-GFP blev analyseret, blev Gal-3-GFP fundet i cytoplasmaet, og der blev ikke observeret nogen tydelig vesikulær struktur, i modsætning til co-transfektionen med CTNS-DsRed ( data ikke vist).

Disse data blev bekræftet i 293T-celler, hvor et stærkt GFP-signal i cytoplasmaet blev observeret i celler, der kun udtrykker Gal-3-GFP, hvorimod i celler, der udtrykker både Gal-3-GFP ogcystinosin-DsRed, Gal-3-GFP var hovedsageligt lokaliseret i cystinose-DsRed-udtrykkende lysosomer (figur 3a). Desuden kvantificering af Gal-3-proteinekspression i celler transficeret med Gal-3–GFP alene eller Gal- 3–GFP og CTNS-DsRed, og Gal-3–GFP og DsRed som kontrol, viste signifikant færre Gal-3-GFP-proteiner i celler co-transficeret med CTNS-DsRed sammenlignet med celler transficeret med Gal-3-GFP alene eller co-transficeret med DsRed (figur 3b). Alt i alt tyder disse resultater på detcystinosinforbedrer den lysosomale lokalisering og nedbrydning af Gal-3. Cystinosin blev vist at være involveret i CMA.28 Heat shock 70 kDa protein (Hsc70) deltager i CMA ved at hjælpe med udfoldning og translokation af substratproteiner over membranen ind i det lysosomale lumen på en LAMP2A-afhængig måde.29,30 Fordi Gal{ {8}} blev foreslået nedbrudt af CMA,31 vi undersøgte lokaliseringen af ​​Gal-3 i forhold til Hsc70 i cystinotiske MEF'er. Konfokal mikroskopianalyse bekræftede kolokaliseringen af ​​Gal-3-GFP ved Hsc70- positive strukturer i både WT (data ikke vist) og Ctns^–/–celler (figur 3c), der understøtter samtransporten af ​​Gal-3 med Hsc70 og antyder, at lysosomal internalisering, men ikke Gal-3-genkendelse af chaperonen er defekt icystinose.

Gal-3 er involveret i nyrebetændelse i Ctns^–/–mus

At studere rollen som Gal-3 icystinosein vivo genererede vi en dobbelt knockout-musemodel, der var mangelfuld i beggecystinosinog Gal-3 (Ctns^–/–Gal-3^–/–mus). WT, Ctns^–/–, og Gal-3^–/–mus blev brugt som kontrolpersoner. I C57BL/6 Ctns^–/–mus, opstår nyreanomalier omkring 10 måneders alderen.11 Derfor blev undersøgelser udført efter 8 til 9 måneder, hvornyreanomalier begynder at blive opdaget, og efter 12 til 15 måneder, når nyreanomalier er udviklet. Fordi cystinindholdet viste sig at være forskelligt i mandlige og kvindelige Ctns^–/– nyrer, blev de analyseret separat. Hvis cystinindholdet stiger med alderen i begge genotyper, blev der ikke observeret nogen signifikant forskel i han- og hunnyrer mellem Ctns–/– Gal-3–/– musene og Ctns^–/– mus ved 8 til 9 måneder og 12 til 15 måneder gamle (figur 4a).

Nyrefunktionen blev vurderet i serum og urin, og der blev ikke observeret nogen signifikant forskel mellem WT og Ctns^–/–mus ved 8 til 9 måneder (data ikke vist), men efter 12 til 15 måneder, Ctns^–/–mus viste signifikant højere serumkreatinin- og urinstofniveauer sammenlignet med WT-mus. Interessant nok, Ctns^–/–Gal-3^–/–mus udviste forbedret nyrefunktion sammenlignet med Ctns^–/–mus på 12 til 15 måneder med lavere serumkreatinin (P < 0.05) og urinstof (P < 0,05; tabel 1).

Histologiske undersøgelser af 8- til 9-måned gammel og 12- til 15-måned gammel musnyresektioner afslørede tilstedeværelsen af ​​alvorlige anomalier i Ctns^–/– nyrer, herunder tubulær atrofi, tilbagetrukne glomeruli og mononukleære infiltrater. Blind analyse af nyresnit varierede omfanget af kortikal skade fra 1 (bevaret vævsstruktur) til 6. Den gennemsnitlige score for Ctns^–/–mus var 2.64 - 0.36 ved 9 måneders alderen (n ¼ 7) og 4.12 0.37 ved 12 til 15 måneders alderen (n ¼ 16). I nyrerne af Ctns^–/–Gal-3^–/–mus i samme alder, var disse anomalier signifikant mindre omfattende: 1.62 - 0.11 efter 9 måneder (n ¼ 21; P < 0.05,="" mann-whitney="" t-="" test)="" og="" 3.04="" -="" 0.22="" efter="" 12="" til="" 15="" måneder="" (n="" ¼="" 33;="" p="">< 0,05,="" mann-whitney="" t-test)="" (figur="" 4b="" og="" supplerende="" figur="" s2).="" desuden="" blev="" en="" procentdel="" af="" tubulær="" atrofi="" tildelt="" hvert="" væv="" og="" gennemsnittet="" for="">^–/–mus og Ctns^–/–Gal-3^–/–mus var henholdsvis 66 procent og 42 procent efter 12 til 15 måneder (P ¼ 0.01). Endvidere er en slående Forskel mellem Ctns^–/–og Ctns^–/– Gal-3^–/– nyresektioner var tilstedeværelsen af ​​få mononukleære infiltrater i Ctns^–/–Gal-3^–/–sektioner, hvorimod tunge infiltrater konsekvent blev observeret i Ctns^–/– nyre(Figur 4b).

Vi karakteriserede de mononukleære infiltrater observeret ved histologisk undersøgelse i 8- til 9-måned gamle Ctns^–/– nyrersom makrofager/monocytter ved co-immunfarvning med CD68 og CD45 og med CD68 og større histokompatibilitetsklasse II (Supplerende figur S3), men ikke med CD68 og CD163, hvilket tyder på, at disse makrofager har en M1--lignende proinflammatorisk profil.32 ,33 Kvantificering af CD68- positive celler afslørede signifikant færre makrofager/monocytter i WT, Gal-3^–/–og Ctns^–/–Gal-3^–/– nyrersammenlignet med Ctns^–/– nyrer(Figur 4c), der bekræfter de histologiske data (Figur 4b).

Alt i alt tyder disse resultater på, at Gal-3 er involveret i rekruttering af makrofager/monocytter i cystinotiskenyrerog at dens fravær afhjælper nyresygdom inCtns^–/–mus. Derfor tyder det på detbetændelseer ansvarlig, i det mindste delvis, for nyreforringelse i Ctns^–/– mus.

Ctns-mangelfulde nyrer udviser Gal-3 overekspression

Ved hjælp af Western blot-analyse fandt vi ud af, at Gal-3-ekspression var signifikant øget inyreraf 12-måned gammel Ctn^s–/–mus sammenlignet med WT-mus (figur 5a og b). For at undersøge, om dette øgede udtryk for Gal-3 er specifikt for Ctns^–/– nyrer, kvantificerede vi Gal-3-ekspression ved transkript- og proteinniveauerne inyrerfra mus med CKD induceret ved standard subtotal 2-trinsnephrektomioperation og fra dyrene, der gennemgik en skinoperation. WT og Ctns^–/–mus blev brugt som kontrolpersoner. Gal-3-transkriptioner var signifikant øget i Ctns–/– og falske nyrer, men stærkt øget i CKDnyrersammenlignet med WT-mus (figur 5c). I modsætning hertil blev Gal-3 på proteinniveau kun påvist i Ctns^–/–nyrer, hvilket stærkt tyder på, at kun Ctns^–/–nyrerne var ude af stand til at nedbryde Gal-3-protein (figur 5d). Immunfluorescerende farvning af Gal-3 i murinennyreefter 8 til 9 måneder viste også overekspression af Gal-3 i Ctns^–/– nyrersammenlignet med WTnyrer(Figur 5e). Desuden blev Gal-3 udtrykt af CD68þ makrofager såvel som nyreceller i Ctns^–/– nyrerved 8 til 9 måneder (Supplerende figur S4). Alt i alt stemmer disse data overens med reduceret Gal-3-nedbrydning i fravær afcystinosesom vist in vitro (figur 3a og b), hvilket fører til akkumulering af Gal-3-protein i Ctns^–/– nyrer.

Fraværet af cystinosin fører til øget serum MCP-1 via Gal-3 opregulering

Gal-3 regulererbetændelsegennem forskellige mekanismer.34 Således at få yderligere indsigt i mekanismen icystinose, undersøgte vi ekspressionen af ​​forskellige pro-inflammatoriske eller anti-inflammatoriske cytokiner i serum fra 12- til 15-måned gammel WT, Ctns^–/–, Gal-3^–/–og Ctns^–/–Gal- 3^–/–mus. Seks cytokinniveauer blev målt med musecytometrisk perlearray, MCP-1, interferon-g, tumornekrosefaktor og IL-10, IL-6 og IL-12p70. Kun MCP-1-ekspression var signifikant øget i Ctns–/– museserum sammenlignet med WT og Gal-3–/– mus og også til Ctns^–/–Gal-3^–/–mus, hvis MCP-1-serumniveauer var sammenlignelige med WT-mus (figur 6a). MCP-1 produceres af forskellige celletyper, hvor hovedkilden til MCP-1 er makrofager og monocytter35 og fungerer som et kemoattraktant for monocytter og makrofager, der regulerer deres migration og infiltration. I modsætning hertil fandtes Gal-3-ekspression i samme alder at være ens i serum fra Ctns–/– mus (44,33 9,81 ng/ml; n ¼ 5) og WT-mus (40.{{12} },41 ng/ml; n ¼ 7).

Forholdet mellem Gal-3 og MCP-1 blev yderligere undersøgt ved co-immunpræcipitation ved hjælp af Gal-3–GFP og MCP-1–DsRed– eller Gal-3– GFP og CTNS-DsRed – (som en positiv kontrol), der udtrykker 293T-celler. Interaktion mellem Gal-3 og MCP-1 blev observeret (figur 6b), hvilket tyder på en direkte induktion af MCP-1 af Gal-3. Inkubation med N-Acetyl-D-lactosamin (LacNAc), en hæmmer af Gal-3 CRD, viste, at i modsætning tilcystinosininteraktion, er CRD ikke involveret i interaktionen mellem Gal-3 og MCP-1 (figur 6c).

For at vurdere, om dette fund er relevant hos mennesker, målte vi Gal-3- og MCP-1-niveauer hos patienter medcystinosesom ikke var i immunsuppressiv behandling eller tog anti-inflammatorisk medicin. Selvom Gal-3-niveauet viste sig at være en smule forhøjet i serum fra patienter med cystinose sammenlignet med raske donorer, var forskellen ikke signifikant (figur 6e), hvilket bekræfter vores resultater opnået i Ctns^–/–mus. Kun 2 patienter havde et højt Gal-3-niveau (25,34 og 39,54 ng/ml); de blev betragtet som outliers og var derfor ikke inkluderet i figur 6e. I modsætning hertil viste det sig, at serum-MCP-1-niveauer var signifikant forhøjet hos patienter med et enzymbundet immunosorbentassay rettet mod humant MCP-1 (figur 6d)cystinose(252.1 - 18,4 pg/ml; n ¼ 19; aldersgruppe 1-23 år) trods cysteaminbehandling sammenlignet med raske kontrolpersoner (166.9 -13,5 pg/ml; n ¼ 1 0; aldersgruppe 8-63 år) (P < 0,001).="" der="" er="" ikke="" fundet="" nogen="" sammenhæng="" mellem="" alder="" og="" mcp-="" 1-niveau="" hos="" begge="" patienter="">cystinoseog raske donorer (data ikke vist).

Cistancheharanti-inflammatoriskejendomme

DISKUSSION

På trods af det faktum, at cystin ophobes i alt væv hos patienter, der er ramt medcystinose, nyrer er de organer, der er mest sårbare over for skader. Derfor mener vi, at cystinakkumulering ikke alene er ansvarlig for nyredegeneration. Heri beskriver vi en ny rolle forcystinosini reguleringen afbetændelseinvolveret i udviklingen af ​​kronisk nyresygdom icystinose. Denne undersøgelse kan forklare, hvorfor patienter udvikler sig til nyresvigt i slutstadiet på trods af at de gennemgår cysteaminbehandling.

Undersøgelsen af ​​cystinose-molekylære partnere afslørede en direkte interaktion med Gal-3, som kan hæmmes af inhibitorer af Gal-3 CRD. Nylige undersøgelser viste, at Gal-3 kunne interagere med glykaner placeret i det lysosomale lumen efter lysosomale skader såsom krystalopbygning.36 I vores undersøgelse er interaktionen mellem Gal-3 ogcystinosinblev undersøgt i raske celler, der udtrykkercystinosinog derfor ikke akkumulerer cystein eller cystinkrystaller. Derudover modificerede overekspression af både Gal-3 og cystinosin i raske celler den subcellulære lokalisering af Gal-3, som derefter blev lokaliseret til lysosomerne, sammenlignet med overekspression af kun Gal-3, hvilket var placeret i cytoplasmaet. Disse resultater tyder kraftigt på, at interaktion mellem Gal-3 og cystinosin forekommer uafhængigt af lysosomal skade, og at cystinosin er aktivt ansvarlig for Gal-3 lysosomal lokalisering. Tidligere har Gal-3 vist sig at blive nedbrudt gennem lysosomal-afhængig proteolyse i fravær af Abl og Arg, 2-tyrosinkinaser.³¹

Derudover viste vi detcystinoseog Gal-3 co-lokaliserer til dynamiske vesikulære strukturer og mobiliseres sammen på en spatiotemporal måde.Cystinosintidligere har været forbundet med menneskehandelsmekanismerne af den lysosomale LAMP2A, den eneste kendte CMA-receptor, som er fejllokaliseret icystinose.²⁸Gal-3-nedbrydning har tidligere vist sig at være medieret af CMA.³¹Konfokal mikroskopianalyse bekræftede kolokaliseringen af ​​Gal-3 ved Hsc70-positive strukturer i begge Ctns^–/– og WT-celler, der understøtter co-transporten af ​​Gal-3 med Hsc70 til præsentation ved lysosomet og nedbrydning af CMA, da Hsc70 hjælper translokationen af ​​substratproteiner over membranen ind i det lysosomale lumen.^29,30En mulig fortolkning af vores resultater er detcystinosinregulerer handel og levering af Gal-3 til de CMA-aktive lysosomer til nedbrydning.

Denne nye vej afcystinosin-afhængig Gal-3 lysosomal lokalisering og nedbrydning understøttes in vivo asCtns-deficiente mus udviser overekspression af Gal-3 inyre. Desuden, hvorimod øget Gal-3 mRNA var begrænset i Ctns^–/–nyrer sammenlignet med en anden model af CKD, blev en stor mængde Gal-3-protein kun påvist inCtns^–/– nyrer. Disse data understøtter stærkt den konklusion, atcystinosiner involveret i nedbrydningen af ​​Gal-3-protein, som kan kontrollere overekspressionen af ​​Gal-3-mRNA under stresstilstande såsom CKD.

Gal-3 har flere biologiske roller, herunder roller i akutte og kroniskebetændelseved at tiltrække monocytter og makrofager.^37,38I Ctns^–/– mus, observerede vi tunge mononukleære infiltrater hovedsageligt inyresom tidligere beskrevet,^11,39som blev karakteriseret som monocytter/makrofager. I modsætning hertil nyrer fra den dobbelte knockout Ctns^–/–Gal-3^–/–mus udviste meget få monocytter/makrofager infiltrater, hvilket kraftigt tyder på, at Gal-3 er involveret ibetændelsei nyrerne af Ctns^–/–mus. I forbindelse med gentagne vævsskader kan Gal-3 udløse overgangen til kroniskbetændelseog fibrose.³⁴I overensstemmelse med disse resultater viser vores data involveringen af ​​Gal-3 i udviklingen af ​​CKD icystinose. Faktisk den dobbelte knockout Ctns^–/– Gal-3^–/–mus udstillede bedrenyrefunktion og struktur sammenlignet med Ctns^–/–mus. Tilsvarende udviser Gal-3-mangelfulde mus mindre nyrefibrose inyresammenlignet med WT-mus efter ensidig ureterisk obstruktion,⁴⁰ og Gal-3 knockout-mus udsat for iskæmi-reperfusionsskade havde en bedre nyrefunktion sammenlignet med WT-mus udsat for iskæmi-reperfusionsskade.⁴¹

Selvom der blev fundet en sammenhæng mellem niveauer af Gal-3 i plasma og udviklingen af ​​CKD42, blev der ikke observeret nogen forskel i Gal-3-ekspression i serum fra mus og mennesker, der var ramt afcystinoseog sunde kontrolpersoner. Ved at måle forskellige cytokinniveauer i serum fandt vi en signifikant stigning i MCP-1 i Ctns^–/–mus, hvorimod Ctns^–/–Gal-3^–/–mus havde niveauer sammenlignelige med WT-mus. MCP-1 er et cytokin, der kan frigives i serumet og danner en gradient for at tiltrække monocytter og makrofager til skadestedet.35 Forøgelsen af ​​MCP-1 i sera af Ctns^–/–mus sammenlignet med Ctns^–/–Gal-3^–/–mus var uafhængige af cystinakkumulering pganyrecystinindholdet var ens i begge genotyper. På trods af cysteaminbehandling, der gjorde det muligt at forlade cystin ud af lysosomerne, blev MCP-1 desuden fundet signifikant forhøjet i sera fra patienter medcystinosesammenlignet med raske donorer. Disse data tyder stærkt på, at fraværet afcystinosin, snarere end cystinakkumulering, er ansvarlig for MCP-1-stigningen i serum. Derudover viste vi en direkte interaktion mellem Gal-3 og MCP-1, som for nylig blev foreslået af Gordon-Alonso et al.43, men som ikke blev undersøgt yderligere. Mekanismen for Gal-3-medieret MCP-1-aktivering blev ikke undersøgt her. En hypotese er tilstedeværelsen af ​​et signalpeptid i det humane MCP-1, som kan spaltes for at øge dets sekretion.44 Desuden kan plasmin spalte C-terminalen af ​​MCP-1, hvilket øger dets kemoattraktant styrke.45 Derudover, korreleret med vores data, forhindrede hæmning af MCP-1 i en musemodel af diabetisk nefropati nyremakrofaginfiltration og forbedret nyrefunktion.46,47 Icystinose, vores data tyder stærkt på, at fraværet afcystinosinfører til stigningen af ​​Gal-3, som aktiverer MCP-1 blodmobilisering, hvilket forbedrer nyrernebetændelseog progressionen afkronisk nyresygdom.

Disse resultater åbner nye perspektiver på potentielle terapeutiske mål, der kan begrænse eller forsinke nyredegeneration hos patienter medcystinose. Faktisk har ikke-steroide antiinflammatoriske lægemidler såsom aspirin og indomethacin vist sig at hæmme Gal-3-ekspression ved at hæmme dets transkription.48 Indomethacin bruges faktisk til at regulere polyuri og polydipsi icystinose,49 og en nylig undersøgelse af 307 europæiske patienter med cystinose viste et forbedret nyreresultat hos patienter behandlet med indomethacin.50 I lyset af vores undersøgelse viste brugen af ​​indomethacin eller ikke-steroide antiinflammatoriske lægemidler vedr.cystinosepatienter kan genovervejes.

METODER

Dyreforsøg

C57BL/6 Ctns^–/–mus blev leveret af Dr. Antignac (Inserm U1163, Paris, Frankrig). C57BL/6 galectin-3 null (Gal-3^–/–) mus blev leveret af Dr. Fu-Tong Liu (University of California, Davis) og Dr. Jerrold M. Olefsky (University of California, San Diego). Avlsstrategien til at generere WT, Ctns^–/–, Gal-3^–/–, Ctns–/– og Gal- 3^–/–mus er beskrevet i Supplerende metoder.

Cellelinjer

rodet blev genereret fra nyfødte hudbiopsier af WT og Ctns^–/–mus. MEF, 293T og MDCK type II cellelinjer (ATCC, Manassas, VA) blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium indeholdende 10 procent føtalt kalveserum eller føtalt bovint serum, 100 enheder/ml penicillin, 0,1 mg/ml streptomycin og 2 mM L-glutamin.

Co-immunpræcipitation og massespektrometrianalyse

For at studere protein-protein-interaktioner blev MDCK-celler transduceret under anvendelse af den lentivirale pRRL.SIN.cPPT.PGK/WPRE vektor-rygrad til stabilt at udtrykkecystinosin-GFP.⁵¹Co-immunpræcipitation blev udført som beskrevet i Supplerende metoder. Co-immunpræcipiterede proteiner blev opløst ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og analyseret ved massespektrometri, LTQ Orbitrap som allerede beskrevet.¹⁹

293T-celler, der udtrykker Gal-3–GFP og MCP-1–DsRed eller Gal-3– GFP og CTNS-DsRed, blev brugt til co-immunpræcipitation som beskrevet i Supplerende metoder. Co-immunpræcipiterede proteiner blev løst ved SDS-PAGE, og Gal-3-bindende MCP-1 blev påvist ved anvendelse af et anti-DsRed antistof (Clontech Laboratories, Mountain View, CA).

Subcellulær fraktionering

Otte lever blev opnået fra C57BL/6-mus og fremstillet som beskrevet tidligere.52 Gradientens betingelser var i det væsentlige de samme som beskrevet i den originale publikation,52 bortset fra at Nycodenz blev brugt i stedet for metrizamid.

Gal-3–hæmmer- og proteinase K-behandlinger

Lysater fracystinosin-GFP MDCK-celler og 293T-udtrykkende Gal-3-GFP og CTNS-DsRed eller Gal-3-GFP og MCP-1-DsRed blev inkuberet med eller uden 5 mM thiodigalactosid eller 5 mM N -Acetyl-D-Lactosamin, henholdsvis 2 hæmmere af Gal-3 CRD. Efter 30 minutters inkubation ved 4 - C med konstant omrystning, blev lysater inkuberet med 50 ml anti-GFP mikroperler, og immunpræcipitation blev udført som nævnt tidligere. Præcipiterede proteiner blev opløst ved SDS-PAGE på 10% gel.

Lysater fracystinosin-GFP MDCK-celler og muselever lysosomberigede fraktioner blev inkuberet med eller uden 2 procent Triton X-100 i 10 minutter ved 4 - C og derefter inkuberet i 30 minutter med eller uden 2,5 mg/ml og 25 mg hhv./ml proteinase K. Efter enzyminaktivering med 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid i 5 minutter ved 4 - C, blev proteiner opløst ved SDS-PAGE på 10 procent gel.

Immunfluorescensanalyse

Faste MDCK-celler blev inkuberet med anti-Lamp-2 (OriGeneTechnologies, Rockville, MD) og anti-Gal-3 antistof (CedarlaneLaboratories, Burlington, Ontario, Canada) 2 timer ved stuetemperatur, efterfulgt af Alexa Fluor 555 sekundært antistof (Invitrogen, Carlsbad, CA) i 1 time ved stuetemperatur. Konfokale billeder blev taget ved hjælp af et Zeiss LSM 700 mikroskop (Carl ZeissMicroscopy, Jena, Tyskland).

293T-celler, der transient udtrykker Gal-3–GFP alene, Gal-3–GFP og DsRed eller Gal-3–GFP ogcystinosin-DsRed blev dyrket på et dækglas, før de blev monteret på et objektglas. Celler blev afbildet under anvendelse af et Keyence BZ-X700-instrument (Keyence Corp., Osaka, Japan).

Fastnyresektioner blev inkuberet natten over ved 4 - C med anti-CD68 (BioLegend, San Diego, CA) eller anti-Gal-3 antistof (BioLegend), efterfulgt af Alexa Fluor 488 sekundært antistof (Invitrogen), 1 time ved stuetemperatur. Billeder blev erhvervet ved hjælp af et Keyence BZ-X700 instrument. Kvantificering af CD68-ekspression er beskrevet i Supplerende metoder.

MEF'er, der udtrykker Gal-3-GFP, blev farvet ved hjælp af et anti-Hsc70-antistof (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) og afbildet som beskrevet tidligere.⁵³

Total intern refleksion FL fluorescensmikroskopi

WT og Ctns^–/–MEF, der udtrykker Gal-3-GFP og CTNS-DsRed, blev podet på en 4-kammer 35- mm borosilikatbundskål (Cellvis, Mountain View, CA). Efter 2 dage i kultur blev MEF'er analyseret ved total intern refleksion FL fluorescensmikroskopi som beskrevet tidligere⁵⁴og i Supplerende Metoder. Billeder blev analyseret ved hjælp af ImageJ-software.

Gal-3 udtryksanalyse

293T-celler, der udtrykker Gal-3-GFP, Gal-3-GFP og DsRed, eller Gal-3-GFP og CTNS-DsRed og eksplanteretnyrerblev lyseret i radioimmunpræcipitationsassaybuffer indeholdende en proteinaseinhibitorcocktail. Proteiner blev adskilt på en 4 procent til 15 procent gel og afsløret ved hjælp af anti-Gal-3 (Abcam, Cambridge, UK) eller anti-glyceraldehyd-3-phosphat dehydrogenase (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) antistof .

Nyrerblev homogeniseret i RLT-buffer indeholdende b-mercaptoethanol under anvendelse af Precellys 24 (Bertin Instruments, Montigny-le-Bretonneux, Frankrig). RNA blev isoleret, og Gal-3-specifik dråbe digital polymerasekædereaktion blev udført som beskrevet i Supplerende metoder. Gal-3 transkriptekspression blev udtrykt som et forhold sammenlignet med den endogene kontrol 18S. En enzym-linked immunosorbent assay (Abcam) blev brugt til at detektere Gal-3 niveauet i mus og humane sera i henhold til producentens instruktioner.

Nyrefunktion

Serum- og urinfosfat-, serumkreatinin- og urinstofniveauer blev estimeret ved hjælp af QuantiChrom Phosphate Assay Kit, Quanti Chrom Creatinine Kit og QuantiChrom Urea Assay Kit (BioassaySystems, Hayward, CA). Proteinniveauer i urin blev målt under anvendelse af Pierce BCA Protein Assay Kit (Rockford, IL).

Histologi

På det tidspunkt, hvor musene blev dræbt,nyrerblev opsamlet, fikseret i formalin og indlejret i paraffin. Sektioner farvet med hæmatoxylin og eosin blev gennemgået på en blind måde af Dr. Marie Claire Gubler som beskrevet i de supplerende metoder.

Måling af cystinindhold

Vævscystinmåling blev udført ved massespektrometri (LC-ESI-MS/MS) som beskrevet tidligere.³⁹

Standard nefrektomi og falsk operation

Mus CKD blev induceret af standard subtotal 2-stadium nefrektomioperation som beskrevet tidligere.^55,56Den falske gruppe af mus gennemgik den samme procedure, men uden at skære nogennyrevæv.

Cytokinniveau i serum

For at måle cytokinniveauer i museserum, en musbetændelsekitcytometrisk perlearray (BD Biosciences, San Jose, CA) blev udført i overensstemmelse med producentens instruktioner. MCP-1-koncentrationen i humant serum blev bestemt ved hjælp af et enzymbundet immunosorbentassay rettet mod MCP-1 (Abcam, Cambridge, UK) i henhold til producentens instruktioner.

Statistisk analyse

Værdier er udtrykt som middelværdi - SEM. Betydningen af ​​resultatet blev vurderet ved uparret 2-hale t-test eller uparret 2-hale t-test med Welchs korrektion. Gruppesammenligninger af 3 tilstande eller flere blev lavet med parametriske variansanalyser efterfulgt af Tukey multiple sammenligningstest for parvise sammenligninger. Histologiske resultater blev sammenlignet ved hjælp af Mann-Whitney-testen. Analyser blev udført under anvendelse af Prism 6-software (GraphPad, San Diego, CA). En P-værdi mindre end 0.05 blev betragtet som signifikant.

Studiegodkendelse

Museksperimenter blev udført i overensstemmelse med InstitutionalAnimal Use Committee-protokollerne. Brugen af ​​humant væv i denne undersøgelse blev godkendt af University of California, San Diego, HumanResearch Protections Program.

AFSLØRING

SC er et videnskabeligt bestyrelsesmedlem og medlem af bestyrelsen forcystinoseForskningsfonden. SC er medstifter, aktionær og medlem af både den videnskabelige bestyrelse og bestyrelsen for GenStem TherapeuticsInc. Vilkårene for dette arrangement er blevet gennemgået og godkendt af University of California-San Diego i overensstemmelse med dets interessekonfliktpolitikker. Alle de andre forfattere erklærede ingen konkurrerende interesser.

leverer Galen-3^–/–mus. Vi takker Lou Devanneaux og NicholeFlerchinger for deres tekniske hjælp og Elizabeth Souter for at have gennemgået manuskriptet. Vi anerkender Christopher Alfonso fra BDBioscience for at levere musenbetændelsecytometrisk perlearray og for hans hjælp med fortolkningen af ​​resultaterne. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health-stipendier RO1-DK090058 og R01-DK110162,CystinoseResearch Foundation og California Institute of Regenerative Medicine (CIRM, CLIN-09230). TL er støttet af et kandidatstipendium fra Vaincre Les MaladiesLysosomales. AB og JZ støttes af et stipendium fracystinoseForskningsfonden. UCSD Neuroscience MicroscopyShared Facility blev finansieret af National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) bevilling P30-NS047101.

REFERENCER

1. Medzhitov R. Oprindelse og fysiologiske roller afbetændelse. Natur. 2008;454:428-435.

2. Donath MY. Rettet modbetændelsei behandlingen af ​​type 2-diabetes. Diabetes Obes Metab. 2013;15(suppl 3):193–196.

3. Jaffer U, Wade RG, Gourlay T. Cytokines in the systemic inflammatory response syndrome: a review. HSR Proc Intensive Care Cardiovasc Anesth. 2010;2:161-175.

4. Pecoits-Filho R, Heimburger O, Barany P, et al. Forbindelser mellem cirkulerende inflammatoriske markører og resterende nyrefunktion hos CRF-patienter. Am JNyreDis. 2003;41:1212-1218.

5. Gahl WA, Thoene JG, Schneider JA.Cystinose. N Engl J Med. 2002;347: 111-121.

6.Cherqui S, Kalatzis V, Trugnan G, Antignac C. Målretningen afcystinosintil den lysosomale membran kræver et tyrosinbaseret signal og et nyt sorteringsmotiv. J Biol Chem. 2001;276:13314-13321.

7. Kalatzis V, Cherqui S, Antignac C, Gasnier B.Cystinosin, proteinet defekt icystinose, er en H( )-drevet lysosomal cystintransporter. EMBO J. 2001;20:5940-5949.

8. Cherqui S, Courtoy PJ. Det renale Fanconi syndrom icystinose: patogene indsigter og terapeutiske perspektiver. Nat Rev Nephrol. 2017;13:115–131.

9. Nesterova G, Gahl W. Nephropathiccystinose: sene komplikationer af en multisystemisk sygdom. Børnelæge Nephrol. 2008;23:863–878.

10. Cherqui S, Sevin C, Hamard G, et al. Intralysosomal cystinakkumulering hos mus manglercystinosin, proteinet defekt icystinose. Mol Cell Biol. 2002;22:7622-7632.

11. Nevo N, Chol M, Bailleux A, et al. Renal fænotype afcystinosemusemodel er afhængig af genetisk baggrund. Nephrol skivetransplantation. 2010;25:1059-1066.

12. Kalatzis V, Serratrice N, Hippert C, et al. De okulære anomalier i encystinosedyremodel efterligner sygdomspatogenese. Pediatr Res. 2007;62:156-162.

13. Guide Chevronnay HP, Janssens V, Van Der Smissen P, et al. En musemodel foreslår to mekanismer for skjoldbruskkirtelændringer hos spædbørncystinose: nedsat thyroglobulinsyntese på grund af endoplasmatisk retikulumstress/udfoldet proteinrespons og nedsat lysosomal processering. Endokrinologi. 2015;156:2349-2362.

14. Brodin-Sartorius A, Tete MJ, Niaudet P, et al. Cysteaminbehandling forsinker progressionen af ​​nefropatiskcystinosehos sene unge og voksne.NyreInt. 2012;81:179-189.

15. Cherqui S. Cysteaminterapi: en behandling forcystinose, ikke en kur.NyreInt. 2012;81:127-129.

16. Gahl WA, Balog JZ, Kleta R. Nephropathiccystinosehos voksne: naturlig historie og virkninger af oral cysteaminbehandling. Ann Intern Med. 2007;147:242-250.

17. Cherqui S, Courtoy PJ. Det renale Fanconi syndrom icystinose: patogene indsigter og terapeutiske perspektiver. Nat Rev Nephrol. 2017;13:115–131.

18. Napolitano G, Johnson JL, He J, et al. Svækkelse af chaperone-medieret autofagi fører til selektive lysosomale nedbrydningsdefekter i den lysosomale opbevaringssygdomcystinose. EMBO Mol Med. 2015;7:158-174.

19. Andrzejewska Z, Nevo N, Thomas L, et al.Cystinosiner en komponent i det vakuolære H-ATPase-regulator-rag-kompleks, der kontrollerer pattedyrsmål for rapamycinkompleks 1-signalering. J Am Soc Nephrol. 2016;27: 1678-1688.

20. Rega LR, Polishchuk E, Montefusco S, et al. Aktivering af transkriptionsfaktoren EB redder lysosomale abnormiteter hos cystinotiskenyreceller.NyreInt. 2016;89:862–873.

21. Dumic J, Dabelic S, Flogel M. Galectin-3: en åben historie. Biochim Biophys Acta. 2006;1760:616-635.

22. Sciacchitano S, Lavra L, Morgante A, et al. Galectin-3: et molekyle for et alfabet af sygdomme, fra A til Z. Int J Mol Sci. 2018;19(2).

23. Calvier L, Martinez-Martinez E, Miana M, et al. Virkningen af ​​galectin-3-hæmning på aldosteron-inducerede hjerte- og nyreskader. JACC hjertesvigt. 2015;3:59–67.

24. Frenay AR, Yu L, van der Velde AR, et al. Farmakologisk hæmning af galectin-3 beskytter mod hypertensiv nefropati. Am J Physiol Renal Physiol. 2015;308:F500–F509.

25. Kolatsi-Joannou M, Price KL, Winyard PJ, Long DA. Modificeret citruspektin reducerer galectin-3-ekspression og sygdomssværhedsgrad i eksperimentel akutnyreskade. PloS One. 2011;6:e18683.

26. Martinez-Martinez E, Ibarrola J, Clavier L, et al. Galectin-3 blokade reducerer nyrefibrose i to normotensive eksperimentelle modeller af nyreskade. PloS One. 2016;11:e0166272.

27. Nevo N, Thomas L, Chhuon C, et al. Indvirkning afcystinoseglycosylering på proteinstabilitet ved differentiel dynamisk stabil isotopmærkning af aminosyrer i cellekultur (SILAC). Mol Cell Proteomics. 2017;16:457-468.

28. Napolitano G, Johnson JL, He J, et al. Svækkelse af chaperone-medieret autofagi fører til selektive lysosomale nedbrydningsdefekter i den lysosomale opbevaringssygdomcystinose. EMBO Mol Med. 2015;7:158-174.

29. Majeski AE, Dice JF. Mekanismer for chaperone-medieret autofagi. Int J Biochem Cell Biol. 2004;36:2435-2444.

30. Xie W, Zhang L, Jiao H, et al. chaperone-medieret autofagi forhindrer apoptose ved at nedbryde BBC3/PUMA. Autofagi. 2015;11:1623-1635.

31. Li X, Ma Q, Wang J, et al. c-Abl og Arg tyrosinkinaser regulerer lysosomal nedbrydning af onkoproteinet Galectin-3. Celledød er forskellig. 2010;17:1277-1287.

32. Takeuchi H, Tanaka M, Tanaka A, et al. Overvægt af M2-polariserede makrofager i blærekræft påvirker angiogenese, tumorgrad og invasivitet. Oncol Lett. 2016;11:3403-3408.

33.Chavez-Galan L, Olleros ML, Vesin D, Garcia I. Meget mere end M1 og M2 makrofager er der også CD169( ) og TCR( ) makrofager. Front Immunol. 2015;6:263.

34. Henderson NC, Sethi T. Reguleringen afbetændelseaf galectin-3. Immunologisk rev. 2009;230:160-171.

35. Deshmane SL, Kremlev S, Amini S, Sawaya BE. Monocyt kemoattraktant protein-1 (MCP-1): en oversigt. J Interferon Cytokine Res. 2009;29:313-326.

36. Skowyra ML, Schlesinger PH, Naismith TV, Hanson PI. Udløst rekruttering af ESCRT-maskineri fremmer endolysosomal reparation. Videnskab. 2018;360(6384).

37. MacKinnon AC, Farnworth SL, Hodkinson PS, et al. Regulering af alternativ makrofagaktivering med galectin-3. J Immunol. 2008;180: 2650-2658.

38. Sano H, Hsu DK, Yu L, et al. Humant galectin-3 er et nyt kemoattraktant til monocytter og makrofager. J Immunol. 2000;165:2156-2164.