Variation i genekspression mellem to sorghum bicolor linjer, der adskiller sig i medfødt immunitetsrespons

Abstrakt:

Mikrobe-associeret molekylært mønster (MAMP'er) udløst immunitet (MTI) er en nøglekomponent i plantens medfødte immunrespons på mikrobiel genkendelse. Men det meste af vores nuværende viden om MTI kommer fra modelplanter (dvs. Arabidopsis thaliana) med forholdsvis mindre arbejde udført ved brug af afgrødeplanter. I dette arbejde studerede vi det MAMP-udløste oxidative burst (ROS) og det transkriptionelle respons i to Sorghum bicolor genotyper, BTx623 og SC155-14E. SC155-14E er en linje, der viser høj anthracnose-resistens, og linjen BTx623 er modtagelig for anthracnose. Vores resultater afslørede en klar variation i genekspression og ROS som reaktion på enten flagellin (flg22) eller chitin-fremkaldelse mellem de to linjer. Mens den transkriptionelle respons på hver MAMP og i hver linje var unik, var der en betydelig grad af overlapning, og vi var i stand til at definere et kernesæt af gener forbundet med sorghum MAMP-transkriptionsresponset. GO-termen og KEGG-pathway-berigelsesanalysen opdagede flere immunitets- og patogenresistensrelaterede DEG'er i MAMP-behandlede SC155-14E-prøver end i BTx623 med samme behandling. Resultaterne giver en baseline for fremtidige undersøgelser for at undersøge medfødte immunitetsveje i sorghum, herunder bestræbelser på at øge sygdomsresistens.

Klik for at købe enforbedret immunitetsprodukt

    For more information:1950477648nn@gmail.com

Nøgleord:

Sorghum bicolor; ROS; medfødt immunitet; MAMP'er; RNA-seq; genekspression

1. Introduktion

Planter er naturligt udsat for en række forskellige belastninger, herunder adskillige bakterielle, svampe og virale patogener [1]. Planter beskytter sig selv mod patogener ved hjælp af præformede strukturer og kemikalier og infektionsinducerede reaktioner fra immunsystemet. Plantens immunsystem anvender et to-trins perceptionssystem med to indbyrdes forbundne lag af receptorer.

Det første niveau aktiveres af overfladelokaliserede mønstergenkendelsesreceptorer (PRR'er), som registrerer molekyler uden for cellen ved at genkende det invaderende patogen gennem påvisning af bevarede strukturelle motiver, kaldet Microbe-Associated Molecular Patterns (MAMP'er), som udløser en moderat, men bred forsvarsreaktion [2]. Flagellin, kitin, lipopolysaccharider, peptidoglycaner (PGN'er) og forlængelsesfaktor Tu er eksempler på velundersøgte MAMP'er [3-5]. Dette forsvarsrespons kaldes MAMPtrigged immunitet (MTI) [6]. Det andet forsvarsniveau kendt som Effector-Triggered Immunity (ETI) opstår som reaktion på specifikke patogen-afledte effektorproteiner, som genkendes af planten gennem virkningen af ​​resistensproteiner, hvilket resulterer i et stærkt, men meget specifikt immunrespons. ETI kan ofte genkendes ved induktion af lokaliseret celledød kaldet et hypersensitivt respons (HR) [7]. Både MTI- og ETI-systemer registrerer patogenerne og reagerer ved at aktivere antimikrobielt forsvar i den inficerede celle og naboceller [3,8]. Planter bærer også immunreceptorer, der genkender meget variable patogeneffektorer, disse inkluderer NBS-LRR-klassen af ​​proteiner [9].

Derudover er systemisk erhvervet resistens (SAR) en "helplante"-resistensrespons, der opstår efter en tidligere lokaliseret eksponering for et patogen. SAR er forbundet med induktion af en bred vifte af gener (patogenese-relaterede gener), og aktiveringen af ​​SAR kræver akkumulering af endogen salicylsyre (SA) [10].

Undersøgelser, der primært er udført med Arabidopsis, har vist, at MTI kan forårsage en række forskellige reaktioner, herunder ændringer i produktionen af ​​reaktive oxygenarter (ROS), produktion af reaktive nitrogenarter såsom nitrogenoxid (NO), callose-aflejring, intracellulære calciumniveauer, ionflux over plasmaet membran, induktion eller undertrykkelse af ekspressionen af ​​flere planteforsvarsrelaterede gener, ændringer i plantecellevæggen, induktion af antimikrobielle forbindelser og syntesen af ​​patogenese-relaterede (PR) proteiner [3,11].

Selvom flere af disse MTI-responser kan betragtes som generelle planteresponser, kan deres størrelse være planteartsspecifikke og endda kultivarspecifikke [12-17]. Metoder er blevet udviklet til at kvantificere plantens MTI-respons. Disse metoder omfatter måling af ROS- eller NO-produktion, mitogenaktiveret proteinkinase-phosphorylering, specifik MAMP-induceret genekspression, kimplantevæksthæmning, lignin- og cellevægsbundne phenoler og MAMP-induceret resistens over for bakterielle og svampepatogener [18-20].

Sorghum bicolor (L.) Moench er en nøgle, global kornafgrøde, der er blevet tilpasset til en række levesteder og opdrættet til forskellige formål [21]. Dyrkning af sorghum forventes at stige betydeligt på verdensplan som en af ​​de vigtigste afgrøder til fødevare- og biomasseproduktion [22].

Efterhånden som praksisserne og de geografiske områder under sorghumdyrkning stiger, er det uundgåeligt, at sygdomspresset vil stige. Sorghum udmærker sig blandt andre kornsorter ved sin usædvanligt brede vifte af sygdomme, hvilket er en af ​​de vigtigste begrænsninger for dens produktion. Globalt set er udbredte svampesygdomme de mest ødelæggende sorghumsygdomme, der resulterer i store tab i udbytte, både hvad angår mængden og kvaliteten af ​​kornene [23]. Anthracnose er en af ​​de mest alvorlige svampesygdomme, der påvirker sorghum-kornudbytte og biomasseproduktion. Udbyttetab på grund af dette patogen kan være 50 til 70 procent i modtagelige kultivarer [24,25]. Planter har udviklet forskellige forsvarsstrategier for at bekæmpe patogeninvasion. I sorghum inkluderer disse strategier aktivering af PR-proteiner [26], akkumulering af hydrogenperoxid [27] og biosyntese af flavonoide phytoalexiner [28]. Forskellige tilgange er blevet brugt til at studere sorghums resistensresponser, identificere forsvarsforbindelser og identificere fysiske barrierer mod anthracnose (se reference [29,30] for gennemgang). Genekspressionsundersøgelser blev i vid udstrækning brugt til at identificere kandidatresistensgener i planter baseret på den differentielle ekspression mellem resistente og modtagelige sorter eller ikke-inokulerede og patogen-inokulerede planter (f.eks. referencer [31-37]). Wang et al., [37] udførte transkriptomisk analyse for at studere responsen af ​​sorghum cultivar BTx623 på C. subline-ola. De rapporterede, at gener involveret i phenylpropanoidmetabolisme og biosyntesen af ​​sekundære metabolitter blev identificeret som differentielt udtrykt som reaktion på infektion med patogenet i forhold til ikke-inokulerede kontrolplanter.

Disse eksperimenter blev dog udført med frøplanter af den modtagelige sort BTx623. Yderligere transkriptomiske undersøgelser for at sammenligne genekspressionsrespons på et patogen i de modtagelige og resistente sorghum-kultivarer ville være af værdi. Derfor er det vigtigt at forstå den genetiske arkitektur, der kontrollerer sorghum basal sygdomsresistens og dens forbindelse til kvantitativ sygdomsresistens.

Som et indledende skridt i denne retning har vi for nylig screenet et sæt forskellige sorghum-kimplasmer for variation i deres respons på flg22 og kitin-elicitation, såvel som svampesygdomsresistens [38]. I dette tilfælde blev MTI kvantificeret ved at måle ROS-produktion ved MAMP-elicitation. Blandt resultaterne af denne tidligere undersøgelse var identifikation af sorghum-genotyper, der viste enten en stærk eller svag respons på MAMP-fremkaldelse.

Næste generations high-throughput sekventering og undersøgelse af transkriptomer kan hjælpe med at tydeliggøre svampeinfektionsresponser i planter og øge forståelsen af ​​værtsresponser. Transkriptomanalyser blev i vid udstrækning brugt til at studere planterespons på svampeinfektion i mange plantearter, herunder kornafgrøder (f.eks. referencer [31-37]).

Imidlertid har offentliggjorte data om sammenlignende transkriptomanalyse af kornafgrøder primært fokuseret på responsen på forskellige patogener. I sorghum fokuserede adskillige publikationer på transkriptomsammenligninger af planter behandlet med forskellige patogener, herunder anthracnose [35,37]. Nogle tidligere publikationer antydede, at der ikke er nogen signifikant sammenhæng mellem responsen på MAMP'er og svampesygdomme. For eksempel har Zhang et al. [17] rapporterede en stærk korrelation mellem respons på to MAMP'er flg22 og chitin i en majskortlægningspopulation, men ingen overensstemmelse med respons på svampesygdom. Kimball et al. [38] rapporterede også en lav korrelation mellem flg22-inducerede ROS-responsscorer og målbladplet-resistensscore i to sorghum RIL-populationer inklusive en BTx623/SC155-14E-population. I betragtning af de mangelfulde data følte vi det derfor vigtigt at transkriptionelt profilere sorghum-responset på MAMP-behandlinger.

I denne aktuelle rapport udvider vi vores tidligere analyse ved at måle den globale transkriptionelle respons på MAMP-elicitation. Vi brugte Illumina-baseret RNA-sekventeringsanalyse til at undersøge transkriptionelle ændringer som svar på enten flg22- eller chitinbehandling i sorghumgenotyperne BTx623 og SC155-14E, som vi tidligere karakteriserede som henholdsvis svage og stærke MTI-respondere. BTx623 er Sorghum bicolor genom-referencelinjen [22] og SC155-14E er en linje, der viser forhøjet anthracnoseresistens [39]. Patil et al. [39] rapporterede, at SC155-14E udviste et højt niveau af stabil resistens (næsten sygdomsfri) over for anthracnosesygdom i alle testede miljøer, mens BTx623 er modtagelig for denne svampesygdom. Vores RNA-seq-analyse identificerede 5252 og 8085 differentielt udtrykte gener (DEG'er) i BTx623 behandlet med henholdsvis flg22 og chitin og 3849 og 5786 DEG'er i henholdsvis flg22 og kitinbehandlede SC155-14E ubehandlede mock-kontroller. af disse to genotyper.

Desuden viste en sammenligning af DEG'er udvalgt ved hjælp af to forskellige bioinformatiske pipelines meget ens resultater. Ekspressionsprofiler af de differentielt udtrykte gener, genontologi (GO) berigelsesanalyse og KEGG pathway berigelsesanalyse viste en klar genotypebaseret variation i MTI-relateret genekspression. GO-termen og KEGG pathway berigelse resultater afslørede flere immunitet og patogen resistens-relaterede DEG'er (PR gener, gener respons på kitin, gener respons på salicylsyre, gener respons på stress osv.) præsenteret i MAMP-behandlet SC{{4} }E prøver i forhold til MAMP-behandlet BTx623. Resultaterne giver en basislinje til identifikation af de forskellige komponenter i sorghum MTI-responsen.

2. Resultater og diskussion

2.1. Variation af det oxidative udbrud i forskellige Sorghumblade

Vores tidligere analyse af MTI-responset af forskellige sorghum-genotyper afslørede signifikant variation i det MAMP-udløste oxidative udbrud mellem genotyperne BTx623 og SC155-14E [38]. Desuden er SC155-14E en linje, der viser høj anthracnose-resistens, mens linje BTx623 er modtagelig for anthracnose [39]. Det var af disse grunde, at disse to genotyper blev valgt til sammenligning under anvendelse af RNA-seq.

Mens vi udførte de tidligere ROS-målinger, fandt vi betydelig variation selv inden for det samme anlæg, hvilket fik os til at undersøge kilden til denne variation mere omhyggeligt. Specifikt testede vi ROS-produktion ved hjælp af tre sæt blade, der gik fra bunden til toppen af ​​femten dage gamle BTx623- og SC155-14E-planter. Bladene blev markeret som #1, #2 og #3, fra bund til top som vist i figur 1A. ROS-analyseresultaterne (Figur 1B) viste, at: (1) ROS-produktionsniveauet var lavere i de ældre blade (blad #1), mens de højeste niveauer af ROS-produktion som svar på enten flg22 eller kitin var fra de yngste blade ( blad #3). (2) Både MAMP-behandlet og ubehandlet BTx623 2og de yngste blade (blad #2) producerede sammenligneligt lave niveauer af ROS-produktion.

I modsætning hertil producerede MAMP-behandlede 2. yngste blade af SC155-14E signifikant (på 0.01-niveau) højere niveauer af ROS-produktion end den ubehandlede mock, såvel som den behandlede eller mock af BTx{ {5}}og yngste blade. (3) Det oxidative udbrud udløst af påføringer af flg22 eller kitin blev påvist i bladskiver fra de yngste blade (blad #3) af begge genotyper, selvom niveauerne af ROS-produktion, som tidligere observeret, var højere i MAMP-behandlet SC 155-14E i forhold til BTx623. Tidsforløbet for flg22-udløst og kitin-udløst ROS-produktion i SC155-14E 2. yngste blad afslørede, at kitin-udløst ROS-produktion fandt sted tidligere end flg22- udløste ROS-produktion (Figur 1C ). Lignende resultater blev rapporteret af Zhang et al. [17] hvor den kitin-udløste ROS-produktion optrådte tidligere end flg22-udløste ROS-produktion i flg22 og kitinbehandlede majsfrøplanter. Det blev rapporteret [40] at ROS-produktion som svar på flg22 viste den højeste produktion af ROS omkring 12 minutter og var den laveste ved 30 minutter i Arabidopsis. Vores ROS-analyseresultater i sorghum viste den højeste ROS-produktion omkring 13 min. og den laveste 30 min. efter flg22-behandling, hvilket er meget lig resultaterne i Arabidopsis. Da vores mål var at finde de optimale betingelser for sammenligning af MTI-responset for de to genotyper, valgte vi de 2. yngste blade af 15-daggamle planter til RNA-ekstraktion og efterfølgende transkriptomisk analyse. Variationen mellem blade af enkelte sorghumplanter er en påmindelse om, at resultaterne kan variere mellem eksperimenter afhængigt af kilden, timingen og andre træk ved et givent eksperiment, og at eksperimentelle parametre derfor skal kontrolleres omhyggeligt.

Det oxidative udbrud, en hurtig, forbigående, produktion af reaktive oxygenarter (ROS), er et af de tidligste observerbare aspekter af en plantes forsvarsrespons [41]. I betragtning af, at ROS-udbruddet er et øjeblikkeligt respons, forventes en lidt senere transkriptionel respons af gener relateret til MTI. Vi høstede prøver 60 minutter efter MAMPs-behandling til RNA-Seq-analyse.

2.2. Differentielt udtrykte gener (DEG'er) af BTx623 og SC155-14E som svar på MAMP-behandlinger

For at evaluere ekspressionsniveauet af annoterede Sorghum bicolor-proteinkodende gener for hver prøve blev antallet af rene aflæsninger af RNA-seq, der var kortlagt til hvert gen, beregnet og derefter normaliseret til FPKM (fragmenter pr. kb exonmodel pr. million kortlagte fragmenter). Ekspressionsændringerne af hvert gen i MAMP-behandlede bladskiver af BTx623 og SC155-14E i sammenligning med falske (vand) behandlinger blev undersøgt. De samlede udtrykte gener var ens i alle behandlinger af begge genotyper: 27.171, 27.283, 27.161, 27.182, 27.512 og 27.175 gener udtrykt i mock af BTx623, flg22-behandlet BTx623, BTx{100}{101} {22}}E, flg22-behandlet henholdsvis SC155-14E og kitinbehandlet SC155-14E. Vi brugte BTx623-referencegenomet til at læse kortlægning i begge linjer, da den specifikke reference for SC155-14E ikke er tilgængelig. De udtrykte gennumre hentet fra BTx623 og SC{{30}}E med alle betingelser ovenfor afslørede, at begge linjer delte lignende antal udtrykte gener. De overordnede læsekortlægningshastigheder for prøver af SC155- 14E mock (3 replikater), SC155-14E behandlet med flg22 (3 replikater), SC155-14E behandlet med kitin (3 replikater) . , 93,1 procent , 96,9 procent , 97.0 procent , 97.0 procent , 97.2 procent , 96.8 procent , 97.0 procent , 96.9 procent , 97.0 procent , henholdsvis 97,0 procent . Disse resultater antydede, at de forskellige virkninger af MAMPs-behandling på transkriptomer af BTx623 og SC155-14E ikke skyldtes de genomiske sekvensforskelle mellem de to genotyper

Genekspressionen PCA-plot giver indsigt i sammenhængen mellem prøver. For at udforske ligheden mellem vores prøver udførte vi PCA-analyse. Prøveplotning på PC1 og PC2 (figur 2) viste, at fire eksperimentelle forhold (BTX623_flg22; SC155-14E_flg22 flg22; BTX623_kitin og SC{ {10}}E_kitin) var vidt adskilt. I modsætning hertil var de tre biologiske replikater af hver sorghumlinje og hver MAMP-behandling, såvel som den falske behandling, tæt klynget sammen, hvilket indikerer en god reproducerbarhed mellem biologiske replikater (figur 2).

Vulkanplot i figur 3 viser genekspression i de to sorghumlinjer behandlet med flg22 eller kitin. Et vulkanplot er en type scatterplot, der viser statistisk signifikans (p-værdi) versus størrelsen af ​​ændringen (foldændring). Det muliggør hurtig visuel identifikation af gener med store ændringer, der også er statistisk signifikante. Disse kan være de mest biologisk betydningsfulde gener. I figur 3 betragtes gener med −log10 (p-værdi) lig med eller større end 3 DEG'er. De røde farvepunkter repræsenterer DEG'er, og de sorte farveprikker repræsenterer ikke-DEG'er. I hvert plot er gener med log2 (fold{10}}ændring) større end 0 opregulerede gener, ellers nedregulerede gener. De mest opregulerede gener er mod højre, de mest nedregulerede gener er mod venstre, og de mest statistisk signifikante gener er mod toppen.

Differentielt udtrykte gener (DEG'er) blev udvalgt fra hver behandling i henhold til deres ekspressionsbetydning (p-værdi 0.001). Det skal bemærkes, at vi brugte en p-værdi på 0.001 som vores tærskel, men ikke FDR (q-værdier) til at vælge DEG'er i denne rapport. FDR (q-værdier) var også signifikante på dette niveau (Tabel S2-S5). Ved en p-værdi på 0.001 var FDR'erne 0,0039, 0,0051, 0,0025 og 0,0035 for BTx623 med flg22-behandling, SC155-14E med flg22-behandling, BTx623 med{{kitin-behandling 26}} E med henholdsvis kitinbehandling. P-værdierne og q-værdierne for generne af BTx623 og SC155-14E under alle forhold er angivet i tabel S2-S5. Ved at analysere ekspressionsmønstrene for disse gener i MAMP-behandlede blade af BTx623 og SC155-14E, observerede vi et stort antal gener (14-30 procent af de samlede udtrykte gener), der udviste store forskelle efter flg22 eller kitin behandling i begge sorghumlinjer. Antallet af totale DEG'er af kitinbehandlet BTx623 (8085) var meget tæt på det, der blev rapporteret i et tidligere transkriptomstudie i BTx623 inficeret med anthracnosepatogenet C. subline-ola (8078) [37]. Antallet af DEG'er var højere i flg22 (19 procent) eller chitin (30 procent) behandlede BTx623-blade i forhold til SC155-14E (henholdsvis 14 procent og 21 procent).

Selvom det højere antal DEG'er i den MAMP-behandlede BTx623 i forhold til SC155-14E var modsat ROS-responsen af ​​disse to genotyper, er dette måske ikke overraskende, eftersom ROS-responset og genekspressionsresponset på MAMP-behandling forekommer kl. forskellige tider, er stort set uafhængige og medieres af forskellige mekanismer [42,43]. GO-termen og KEGG-vejberigelsen afslørede flere immunitets- og patogenresistensrelaterede DEG'er præsenteret i MAMP-behandlede SC155-14E-prøver. Desuden matchede det faktum, at antallet af DEG var højere i de kitinbehandlede prøver i forhold til dem, der blev behandlet med flg22, godt med ROS-responsassays (figur 1B), hvor vi så et stærkere ROS-respons ved kitinbehandling.

For at undersøge, i hvilket omfang gener og biologiske processer er delt mellem flg22- og chitinbehandlingerne i BTx623 og SC155-14E, sammenlignede vi deres DEG'er mere detaljeret. Venn-diagrammer i figur 4A viser overlapningen i DEG'er i det samlede op- og nedregulerede gensæt ved en p-værdi på 0.001. Ud af de i alt 10.535 DEG reagerede et kernesæt på 2272 gener på både flg22- og chitinbehandling i begge sorghum-linjer. Tilsvarende, fra de i alt 5410 opregulerede gener, blev et kernesæt på 1778 gener opreguleret i begge genotyper, mens ud af i alt 5125 nedregulerede gener blev et kernesæt på 474 nedreguleret i begge genotyper.

RNA-seq-data præsenteret her blev analyseret ved hjælp af bioinformatik-pipeline med værktøjerne Bowtie2 2.3.4.3, TopHat 2.1.1 og Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) med standardparametre (pipeline #1). For yderligere at bekræfte assayresultaterne brugte vi en anden pipeline (pipeline #2) med HiSat2, HTSeq og edgeR til at udføre analysen. HiSat2 er den næste udvikling af TopHat2. Vi sammenlignede DEG'erne for hver tilstand (dvs. to genotyper behandlet med flg22 eller chitin, alle op- eller nedregulerede DEG'er) udvalgt ved hjælp af begge pipelines. Resultaterne (figur 5) viste, at de DEG-tal, der blev valgt ved brug af begge rørledninger, var meget tætte.

De samlede DEG'er valgt med pipeline #1 vs. pipeline #2 var BTx623_flg22: 5241 vs. 5413; SC155-14E_flg22: 3849 vs. 3476; BTx623_kitin: 8085 vs. 8320; SC155-14E_kitin: 5786 vs. 5383. De opregulerede DEG'er valgt med pipeline #1 vs. pipeline #2 var BTx623_flg22: 3074 vs. 3076; SC155-14E_flg22: 2591 vs. 2483; BTx623_kitin: 4156 vs. 4583; SC155-14E_kitin: 3486 vs. 3346. De nedregulerede DEG'er valgt med pipeline #1 vs. pipeline #2 var BTx623_flg22: 2152 vs. 2237; SC155-14E_flg22: 1257 vs. 993; BTx623_kitin: 3919 vs. 3757; SC155-14E_kitin: 2296 vs. 2037. Derudover afslørede resultaterne i figur 5 også, at en høj procentdel af DEG'er valgt ved hjælp af de to rørledninger overlappede under alle forhold. Procentdelen af ​​overlappede DEG-tal/DEG-tal valgt ved brug af pipeline#1 var 79,6 procent og 73,7 procent. 80,8 procent og 74,4 procent af de samlede DEG'er af BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_kitin og SC155-14E{{73} }chitin, henholdsvis; 83 procent , 80,6 procent , 85,3 procent og 81,1 procent af opregulerede DEG'er af BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_kitin og SC{{ henholdsvis 88}}E_kitin; 75,1 procent , 59,5 procent , 75,8 procent og 67,4 procent af nedregulerede DEG'er af BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_kitin og SC{{ hhv. 105}}E_kitin. Disse sammenlignende resultater viste således, at de præsenterede RNA-seq-data er korrekte, uanset hvilken af ​​de to metoder, der anvendes til analysen.

Varmekortet for grupperede ekspressionsprofiler af DEG'erne af BTx623 og SC155-14E behandlet med flg22 eller chitin for de tre biologiske replikater er vist i figur 6. Genekspressionsværdierne blev normaliseret som z-scores. Farven skifter fra lilla til rød, når værdien stiger, hvilket indikerer genekspressionen fra lav til høj. Dette varmekort viser tydeligt den differentielle regulering af gener i BTx623 og SC155-14E som svar på flg22- eller chitinbehandling. Derudover viser resultaterne også, at varmekortene for tre biologiske replikater i hver tilstand var meget tætte, hvilket indikerer god reproducerbarhed mellem biologiske replikater.

Derudover viste parvise sammenligninger (figur 7A) mellem op- og nedregulerede DEG'er fra flg22- og chitinbehandlingerne, at der var et stort overlap mellem BTx623 og SC155-14E. Blandt de 3074 flg22-inducerede gener i BTx623 blev 83,8 procent også induceret i BTx623 som reaktion på chitinbehandling, hvorimod af de 2591 flg22-inducerede gener i SC155-14E, {{ 16}},6 procent reagerede også på kitinbehandlet SC155-14E. Dette er måske ikke overraskende, da tidligere værker i Arabidopsis thaliana viste betydelig overlapning i gener, der reagerer på en række forskellige MAMP'er, som definerer de generelle MTI-veje [44-46].

Ydermere har Zhang et al. [17] rapporterede også en signifikant sammenhæng mellem flg22 og chitinrespons i majs. Mindre overlap blev observeret mellem BTx623 og SC155-14E bladskiver behandlet med den samme MAMP (figur 7A). 64,3 procent af flg22-inducerede gener i BTx623 blev induceret i flg22-behandlet SC155-14E og 68,3 procent chitin-inducerede gener i BTx623 blev induceret i kitinbehandlet SC155-14 E. Tilsvarende blev en høj procentdel (75,9 procent) af de 2152 gener nedreguleret efter flg22-behandling af BTx623 også nedreguleret af kitin i BTx623. Ud af 1257 gener nedreguleret af flg22 i SC155-14E, blev 70,8 procent også nedreguleret af kitin i SC155-14E. Imidlertid var kun 29 procent af flg22 nedregulerede gener i BTx623 også nedreguleret i flg22-behandlet SC155-14E, og 45 procent af de chitin-nedregulerede gener i BTx623 var nedregulerede i kitinbehandlet SC155-14E (figur 7A). Derfor, mens der var signifikant konvergens i MTI-vejene til flg22 og chitin i de to sammenlignede genotyper, antyder dataene også interessant kompleksitet om, hvordan disse to genotyper reagerer på forskellige MAMP'er.

2.3. Genfunktionel berigelsesanalyse, der sammenligner MTI-responsen af ​​BTx623 og SC155-14E

For at bestemme de funktionelle kategorier af gener, der er reguleret som respons på enten flg22 eller kitin og den differentielle respons af de to afprøvede sorghumlinjer, brugte vi PlantRegMap [47,48] platformen til at udføre gensætberigelsesanalyse baseret på de detekterede DEG'er i de biologiske proceskategori. Figur 8A og B viser de øverste GO-udtryk for biologiske procesberigede gener med opregulerede DEG'er og nedregulerede DEG'er fra både BTx623 og SC155-14E. Den komplette liste over DEG'er findes i tabel S6–S13. Mange af disse gener er forbundet med processer, herunder stressrespons, planteforsvarsrespons, respons på stimulus, respons på biotisk stimulus, respons på bakterien, respons på en anden organisme, cellekommunikation, fosformetabolisk proces og proteinphosphorylering.

Resultaterne i figur 8A og B viser klare forskelle i ekspressionen af ​​gener, der normalt er forbundet med medfødt immunitet mellem de to sorghum-genotyper. I disse berigede GO-termer blev der fundet nogle unikke DEG'er i hver tilstand med overlap. For eksempel GO-term forsvarsrespons (GO 0006952): 91 og 84 opregulerede DEG'er blev beriget med henholdsvis BTx623 eller SC155-14E behandlet med flg22. Inden for disse DEG'er var 24 DEG'er unikke i BTx623, og 15 DEG'er blev kun fundet i SC155-14E, og de andre blev præsenteret i begge sorghumgenotyper. Tilsvarende blev 102 og 93 opregulerede DEG'er beriget med henholdsvis BTx623 eller SC155-14E behandlet med chitin. Inden for disse DEG'er var 20 DEG'er unikke i BTx623 og 14 DEG'er var unikke i SC155-14E, og de andre blev præsenteret i begge sorghum-genotyper.

I GO-udtrykket "respons på kitin (GO: 0010200)" observerede vi 18 opregulerede DEG'er ud af i alt 779 gener i denne kategori beriget i de kitinbehandlede SC155-14E-prøver (Figur 8) ), hvorimod intet gen blev beriget i de chitinbehandlede BTx623-prøver. Derudover blev 16 opregulerede DEG'er beriget med flg22-behandlede SC155-14E-prøver, og 12 opregulerede DEG'er blev beriget i flg22-behandlede BTx623-prøver (figur 8). Sammenligning af DEG-listerne for GO-udtrykket "respons på kitin" i flg22 og kitinbehandlet BTX623 og SC155-14E (tabel S9) afslørede, at DEG'erne var beriget med flg22 eller kitinbehandlet SC155- 14 E var de samme, bortset fra at chitin inducerede to flere DEG'er end flg22. I modsætning hertil var alle 12 DEG'er beriget med flg22-behandlet BTX623 forskellige fra DEG'er induceret af MAMP'er i SC155-14E. Disse MAMPs-inducerede DEG'er kan bidrage til resistensresponsen af ​​anthracnose i SC155-14E, da kitin er et typisk MAMP-molekyle fra svampecellevægge, som fremkalder planteimmunresponser. Stringlis et al. [49] rapporterede også, at et sæt opregulerede DEG'er blev beriget i GO-udtrykket "respons på chitin" fra chitin, flg22, og en plante gavnlige rhizobakterier Pseudomonas simiae WCS417 behandlede Arabidopsis-planter. Matic et al. [33] rapporterede, at 21 DEG blev beriget i GO-udtrykket "respons på kitin" fra risblads RNA-seq-analysen af ​​en resistent kultivar, men ikke fra en modtagelig kultivar efter infektion med svampepatogenet Fusarium fujikuroi.

PR (patogenese-relaterede) gener er involveret i plantens immunrespons [50] og har antifungal aktivitet mod mange fytopatogene svampe [51]. PR-10-proteiner er små, primært sure, intracellulære proteiner med svampedræbende egenskaber, der er blevet forbundet med forsvarsreaktioner i plantearter, herunder sorghum [52]. PR-10-genfamiliemedlemmer blev induceret af patogenangreb i en lang række plantearter [53]. I sorghum har Lo et al. [26] rapporterede, at PR-10-ekspression blev induceret som en del af sorghums aktive værtsforsvar mod bladsvampepatogenerne C. heterotrophus og C. sublineolum. Katie et al. [54] rapporterede, at adskillige sorghum-kultivarer viste signifikant induktion af normaliserede relative mængder PR-10 efter inokulering med svampesporer af C. lunata og F. capsicum i feltforsøg. I drivhustilstanden viste klumme af inokulerede planter induktion af PR-10 mRNA, og responsen var større i to resistente sorter, der blev testet i forhold til to modtagelige sorter.

Vores resultater afslørede, at der blandt de identificerede DEG'er blev fundet fire PR-10 gener (SORBI_3001G401300, SORBI_3001G401200, SORBI_3001G400800, SORBI_3001 G401000). I SC155-14E blev alle fire PR-10 DEG'er opreguleret af flg22 eller chitinbehandling, derimod i BTx623, SORBI_3001G401000 blev ikke fundet i DEG'er, og SORBI{{15} }G401300 (opreguleret) blev kun præsenteret i BTx623 med kitinbehandling, men ikke med flg22-behandling. Dette indikerede, at ekspression af PR-gener kunne anvendes som svar på højere ROS-produktniveauer efter MAMPs-behandling og resistens mod anthracnose i SC155-14E.

Salicylsyre (SA) er et planteimmunsignal, der er afgørende for både lokalt forsvarsrespons og systemisk erhvervet resistens. Det spiller en vigtig rolle i resistens og planteforsvar mod patogenangreb [55]. I sorghum, Tugizimana et al. [56] rapporterede kvantitative ændringer i niveauerne af jasmonsyre, salicylsyrekonjugater og abscisinsyre i C. subline-ola-inficeret sorghum. C. subline-ola er årsagsagenset til anthracnose. Sorghum-genotyper med forhøjede niveauer af aminosyrer (tryptophan og tyrosin), jasmonsyre og salicylsyrekonjugater og zeatin var mere resistente over for anthracnose. I denne undersøgelse blev GO-udtrykket 'respons på salicylsyre' (GO:0009751) inklusive 19 opregulerede DEG'er specifikt beriget kun i SC155-14E behandlet med kitin (tabel S9). Derfor kan den salicyliske signalvej spille en vigtig rolle som reaktion på højere ROS-produktionsniveauer efter MAMP-behandling og resistens mod anthracnose i SC155-14E.

Ydermere blev 169 opregulerede DEG'er beriget i GO-termrespons på stress udelukkende i SC155-14E behandlet med kitin (tabel S9). De andre GO-termer, der udelukkende findes i SC155-14E behandlet med MAMP'er, men ikke i BTx623 med samme behandling, er sekundære metaboliske processer (GO:0019748), phosphatidylcholin biosynteseproces (GO:0006656) og lipidbiosynteseproces ( GO:0008610).

Ydermere blev 169 opregulerede DEG'er beriget i GO-termrespons på stress udelukkende i SC155-14E behandlet med kitin (tabel S9). De andre GO-termer, der udelukkende findes i SC155-14E behandlet med MAMP'er, men ikke i BTx623 med samme behandling, er sekundære metaboliske processer (GO:0019748), phosphatidylcholin biosynteseproces (GO:0006656) og lipidbiosynteseproces ( GO:0008610).

Vi undersøgte også sammensætningen af ​​gener, der er co-reguleret mellem de to genotyper efter flg22- eller chitinbehandling samt kernesættene af DEG'er i alle behandlinger og to genotyper ved GO-berigelsesanalyse (figur 4B og 7B). Den fulde liste over DEG'er findes i tabel S14 og S15. Figur 4B viste de berigede GO-termer for kernesættene af de samlede, op- og nedregulerede DEG'er i BTx623 og SC155-14E med alle behandlinger. GO-termerne relateret til MAMPs respons og planteforsvar (f.eks. chitinbinding, forsvarsrespons, proteinkinaseaktivitet, proteinphosphorylering, proteinserin/threoninkinaseaktivitet) blev signifikant beriget i opregulerede DEG'er, mens GO-udtryk for sekundær metabolitbiosynteseproces, jernionbinding, oxidoreduktaseaktivitet blev kun beriget i nedregulerede DEG'er. Dette resultat svarede til resultaterne i Arabidopsis, hvor GO-termer relateret til respons på elicitorer (flg22-peptider fra P. simile WCS417 og P. aeruginosa PAO1, kitin og bakterieceller fra P. simile WCS417) var mest signifikant beriget i de opregulerede kernesæt af DEG'er [49].

Figur 7B viste de signifikant berigede GO-termer af co-regulerede (dvs. op- eller nedregulerede i begge genotyper) sæt af DEG'er mellem BTx623 og SC155-14E efter flg22- eller chitinbehandling. Resultaterne afslørede, at GO-termer relateret til MAMPs-respons og planteforsvar (f.eks. forsvarsrespons, proteinkinaseaktivitet, proteinphosphorylering, proteinserin/threoninkinaseaktivitet) kun blev beriget i flg22 eller kitin opregulerede DEG'er i begge genotyper, mens GO-termer af sekundær metabolitbiosynteseproces, hæmbinding, jernionbinding, oxidoreduktaseaktivitet af et iltatom og phosphatidylcholinbiosynteseprocessen blev beriget udelukkende i nedregulerede sæt af DEG'er.

2.4. KEGG Pathway Enrichment Analyse af MTI-responset af BTx623 og SC155-14E

Figur 9 viser KEGG pathway-berigelsesanalysen af ​​de opregulerede DEG'er fundet i de MAMP-behandlede BTx623- og SC155-14E-prøver ved hjælp af DAVID-onlineværktøjet [57]. Den fulde liste over DEG'er findes i tabellerne S16–S20. Resultaterne identificerer de specifikke top KEGG veje beriget som et resultat af aktiveringen af ​​MTI i de to sorghum genotyper. I KEGG-vejen "plante-patogen-interaktion" observerede vi, at 24 opregulerede DEG'er blev beriget i de kitinbehandlede SC155-14E-prøver, mens ingen af ​​DEG'erne blev beriget i de chitinbehandlede BTx623-prøver. Det stærkere chitinrespons af genotype SC155-14E korrelerer med den større resistens af denne genotype over for svampesygdommen anthracnose [39]. Desuden afslørede KEGG pathway berigelse 28 gener involveret i term phenylpropanoid biosyntese i SC155-14E behandlet med flg22. Phenylpropanoid biosyntesevejen begynder med phenylalanin, som kan omdannes til aromatiske forbindelser såsom flavonoider, benzenoider, coumarin, hydroxycinnamater og lignin [58,59]. Mange phenylpropanoider og flavonoider var involveret i sygdomsresistensresponsen [28,60]. Produktion af phytoalexiner er en vigtig forsvarsreaktion mod anthracnosepatogen C. subline-ola [28] i sorghum. 3- deoxyanthocyanidinerne er en usædvanlig gruppe af flavonoider, der anerkendes som phytoalexiner i sorghum. Phytoalexiner er små molekyler med antimikrobiel aktivitet produceret efter patogeninfektion [61]. Wang et al. [37] fandt også, at KEGG term phenylpropanoid biosyntese var signifikant beriget i DEGs af C. subline-ola-inficerede planter i deres transkriptomiske undersøgelse af sorghum. Vi bør bemærke, at KEGG pathway berigelse resultater (figur 9) også viste en højere respons af BTx623 efter MAMPs behandling i nogle veje, som kan spille en rolle i plante-patogen interaktioner (fx i pathways phenylalanin og tryptophan biosyntese, antibiotika biosyntese).

Ydermere afslørede resultater af KEGG pathway berigelsesanalyse af de nedregulerede DEG'er, at ti nedregulerede DEG'er blev annoteret som 'fotosyntese-antenneproteiner' og 84 DEG'er blev annoteret som deltog i 'biosyntesen af ​​sekundære metabolitter' blev beriget med flg22 behandlet BTx623. Sådanne genekspressionsundersøgelser kan imidlertid identificere gener differentielt udtrykt som respons på MAMPs behandling eller patogeninfektion, men det viser ikke nødvendigvis, at disse gener er kritiske for resistens mod et specifikt patogen. Der ville således være behov for yderligere forskning for at forstå de årsagsmæssige sammenhænge mellem svamperesistens og aktiveringen af ​​disse KEGG-veje i begge genotyper, som afsløret ved RNA-Seq-analyse.

Vi udførte også KEGG pathway-berigelsesanalyse for kernesættene af DEG'er under alle forhold (figur 4C) såvel som de co-regulerede DEG'er mellem de to genotyper efter flg22 eller chitinbehandling (figur 7C). Resultaterne afslørede, at seks signifikante veje, inklusive plante-patogen-interaktionsvejen, kun blev beriget i opregulerede kernesæt af DEG'er, men ikke i nedregulerede kernesæt af DEG'er. På samme måde blev syv og tre veje, inklusive plante-patogen-interaktionsvejen, signifikant beriget i chitin opregulerede DEG'er og flg22 opregulerede DEG'er i henholdsvis BTx623 og SC155-14E. I modsætning hertil blev kun ribosombiogenese i eukaryote-vejen beriget i chitin-nedregulerede DEG'er i begge genotyper.

2.5. Validering af RNA-Seq-data ved hjælp af kvantitativ RT-PCR af udvalgte gener

For at bekræfte genekspressionsprofileringsdataene opnået med RNA-seq udførte vi qRT-PCR-analyse for at evaluere ekspressionen af ​​ni udvalgte kandidatgener. Disse ni gener blev udvalgt baseret på ekspressionen observeret af RNA-seq i tre kategorier: (a) udtrykt på samme måde i BTx623 og SC155-14E med flg22 eller chitinbehandling; (b) kun udtrykt i MAMP'er behandlet SC155-14E, men med ekstremt lavt udtryk i behandlet BTx623 og (c) udtrykt 2-21-fold højere i MAMP'er behandlet SC155-14E i forhold til BTx623 . qRT-PCR-analyseresultaterne (tabel 1) afslørede en fuld overensstemmelse med ekspressionsniveauerne bestemt ved RNA-seq-analyse for hvert af de ni evaluerede gener. Disse resultater giver os tillid til, at målingerne foretaget af RNA-seq afspejler sorghumlinjernes transkriptionelle respons på MAMP-behandling

2.6. Konklusioner

I denne undersøgelse fandt vi først de optimale betingelser for sammenligning af MTI-responsen af ​​de to genotyper ved at teste ROS-produktion ved hjælp af tre sæt blade og valgte de næstyngste blade af femten dage gamle planter til RNA-ekstraktion og efterfølgende transkriptomisk analyse. Et tidsforløb af flg22-udløst og kitin-udløst ROS-produktion i sorghumlinje SC155-14E (Figur 1C) viste, at kitin-udløst ROS-produktion fandt sted tidligere end den, der blev udløst af flg22-behandling. Vi opnåede ekspressionsprofilerne for svampesygdommen anthracnose-resistente Sorghum bicolor genotype SC155-14E med høj respons på MAMPs-behandling på ROS-produktion og den modtagelige genotype BTx623 med lav respons på ROS-produkt til MAMP-behandling i de tidlige stadier af den medfødte immunitetsreaktion.

Resultaterne viser en klar variation af genekspression i sorghum-genotyperne BTx623 og SC155-14E som svar på MAMP-behandling. Mens svarene på de to MAMP'er viste betydelig overlap inden for hver linje (86.6-70.8 procent ), var de forskellige. Nogle, omend lavere, overlapninger (68,3-29 procent) blev også observeret mellem svarene fra de to linjer på den samme MAMP. Et betydeligt antal DEG'er, 2272 ud af 10.535 DEG'er, blev identificeret under alle fire betingelser og definerer foreløbigt kerne MAMP-responsen. Denne liste over gener bør være nyttig for de laboratorier, der ønsker at profilere genekspressionsresponsen på MAMP-behandling. RNA-seq-analysen identificerede store sæt af differentielt udtrykte gener i BTx623 og SC155-14E behandlet med flg22 eller kitin sammenlignet med ubehandlede falske kontroller af disse to linjer. Desuden viste en sammenligning af DEG'er udvalgt ved hjælp af to forskellige bioinformatikpipelines meget ens resultater. Detaljeret ekspressionsprofilanalyse af disse DEG'er, GO-berigelsesanalyse og KEGG pathway-analyse afslørede en klar variation i genekspressionsresponsen af ​​de to genotyper. GO-termen og KEGG pathway berigelse opdagede flere immunitets- og patogenresistens-relaterede DEG'er (PR-gener, geners respons på kitin, geners respons på salicylsyre, respons på stress, phenylpropanoid biosyntese osv.) i MAMP-behandlet SC{{18} } E prøver i forhold til BTx623 med samme behandling. Denne information giver vigtig basislinjeinformation om, hvordan det medfødte immunsystem af denne nøgleafgrødeplante reagerer på MAMP's fremkaldelse. I betragtning af den generelle mangel på information om afgrødeplanters medfødte immunrespons, i forhold til modellen Arabidopsis, giver genlister og metoder, der er beskrevet, en ressource til yderligere udforskning af sorghums respons på patogener og bør lette indsatsen for i sidste ende at forbedre sygdomsresistens i denne vigtige fødevare- og biomasseafgrøde.

3. Materialer og metoder

3.1. Plantematerialer

To sorghumlinjer leveret af Dr. William Rooney (Texas A&M University, College Station, USA) og Dr. Stephen Kresovich (Clemson University, Clemson, USA) blev brugt i denne undersøgelse. BTx623 er en standard sorghumlinje med en tilgængelig hel genomsekvens [22], og SC155-14E er en linje udviklet til anthracnoseresistens [39].

3.2. ROS-assays

Sorghumfrø af BTx623 og SC155-14E blev overfladesteriliseret (70 procent ethanol i 1 min og derefter 10 procent blegemiddel i 10 minutter, skyllet med autoklaveret ddH2O) og plantet i autoklaveret Sunshine potteblanding og spiret i vækstkamre ( 16 timer/8 timer lys/mørke, 28/26 ◦C, 60-70 procent luftfugtighed). Femten dage gamle planter blev brugt til eksperimenter.

To MAMP'er, flg22 (Genscript katalog# RP19986) og kitin fra krabbeskal (Sigma-Aldrich, katalog# C3641), blev brugt i denne undersøgelse. Flg22 er et peptid afledt af flagellin N-terminalen af ​​plantepatogene bakterier og er velkendt for at fremkalde et specifikt medfødt immunrespons i planter [62]. Chitin er et typisk MAMP-molekyle afledt af svampecellevægge, som fremkalder planteimmunresponser [3]. ROS-assays blev udført ifølge Kimball et al. [38]. For at vurdere variationen i MAMP-responset inden for individuelle genotyper, såvel som bladenes position, blev alle tre fuldt udvidede blade af planterne af hver genotype vurderet individuelt. Bladene fra bunden til toppen af ​​de femten dage gamle sorghumplanter af hver genotype blev markeret som blad #1, #2 og #3. Vi brugte kun den midterste del af bladet til prøveudtagning for at måle ROS-produktion. Umiddelbart efter behandlinger blev det kemiluminescerende signal fra hver prøve registreret i 30 minutter ved anvendelse af et Photek CCD-kamera (Photek Ltd., East Sussex UK). Otte brønde bestod af en mock-behandling (uden MAMP) og otte brønde bestod af en behandling (med MAMP'er). I hvert tilfælde blev tre biologiske replikater med i alt 8 prøver sammenlignet for hver behandling.

3.3. Prøvebehandling med MAMP'er

Femten dage gamle planter blev brugt til eksperimenter. MAMPs-behandlingerne blev udført som beskrevet i Valdes-Lopez et al. [12] med mindre ændringer. Kort fortalt blev det andet blad (fra toppen, dvs. det næstyngste blad) fra fem planter for hver sorghumlinje løsnet og derefter vakuuminfiltreret med autoklaveret ddH2O i 2 min. Omkring 50 1 cm diameter bladskiver blev skåret fra de vand-infiltrerede blade af hver genotype og samlet. Femogfyrre bladskiver fra hver genotype blev overført til tre forskellige petriskåle (15 bladskiver i hver petriskål) og derefter flydte natten over ved stuetemperatur på autoklaveret ddH2O med pladerne dækket med aluminiumsfolie. Den næste dag blev vandet fjernet fra alle petriskåle og erstattet med 10 ml ddH2O (mock), 10 ml 1 µM flg22 eller 10 ml 20 mg/ml kitinopløsning. Efter en 60-min. behandling blev mock- og MAMP-behandlede bladskiver høstet i forskellige rør og straks frosset i flydende nitrogen. Bladskiveprøverne (for 101 quenced "ies ied-11272) immunityBTx623 og SC155-14E med mock-, flg22- eller kitinbehandlinger, tre biologiske replikater) blev opbevaret ved -80 ◦C til RNA-ekstraktion. Alle de ovenfor beskrevne procedurer blev udført under mørke forhold for at eliminere enhver mulig fotosynteseeffekt.

3.4. RNA-ekstraktion, sekventering og bibliotekskonstruktion

RNA-ekstraktionen blev udført ved hjælp af Direct-zol RNA Miniprep Plus-sættet fra Zymoresearch (katalog #R2071) i henhold til producentens instruktioner

High-throughput sekventering blev udført på University of Missouri DNA Core Facility. Atten biblioteker blev konstrueret efter producentens protokol med reagenser leveret i Illuminas TruSeq mRNA-strengede prøveforberedelseskit. Prøvekoncentrationen blev bestemt ved hjælp af Qubit fluorometer (Invitrogen) under anvendelse af Qubit HS RNA-assay-kittet, og RNA-integriteten blev kontrolleret ved hjælp af Fragment Analyzer automatiserede elektroforesesystem. Kort fortalt blev det poly-A-holdige mRNA oprenset fra totalt RNA (1 µg), RNA blev fragmenteret, dobbeltstrenget cDNA blev genereret fra fragmenteret RNA, og indekset indeholdende adaptorer ligeret til enderne. De amplificerede cDNA-konstruktioner blev oprenset ved tilsætning af Axyprep Mag PCR Clean-up perler. Den endelige konstruktion af hvert oprenset bibliotek blev evalueret ved hjælp af Fragment Analyzer automatiserede elektroforesesystem, kvantificeret med Qubit fluorometer ved anvendelse af Qubit HS dsDNA assay kit og fortyndet i overensstemmelse med Illuminas standard sekventeringsprotokol til sekventering på NextSeq 500. læst på 75 baser.

3.5. Kortlægning og behandling af RNA-Seq-aflæsninger

Sekvensdataene repræsenterede seks forskellige tilstande: BTx623 med mock-, flg22- eller chitinbehandling og SC155-14E med mock-, flg22- eller chitinbehandling. Hver tilstand var repræsenteret af tre biologiske replikater, hvilket resulterede i 18 samlede prøver. Først blev de 30 ender af aflæsningerne "trimmet" til Illumina-adaptere, for tvetydige nukleotider (N'er) og (på grund af NextSeq-teknologi) for kunstigt poly-G (repræsenteret som G{100}) ved hjælp af cutadapt version 1.15 (http://dx.doi.org/10.14806/ej.17.1.200, tilgået den 21. august 2019) for læsninger, hvis 30 ender overlapper med adapteren i mindst 3 baser med 90 procent identitet. Hvis en aflæsning efter denne trimning indeholdt færre end ti baser, blev den kasseret (sammen med dens parrede aflæsning, hvis relevant). Kvalitetsscorerne for RNA-seq-dataene efter trimning blev undersøgt ved hjælp af FASTQC (version 0.11.9) [63]. For alle positioner i læsninger er mediankvalitetsscore omkring 34, hvilket indikerer, at basisopkaldsnøjagtigheden er højere end 99,9 procent. Aflæsninger for hver prøve blev justeret til referencegenomet (Sorghum_bicolor_NCBIv3.dna. top-level. fa) med Tophat 2.1.1. De resulterende justeringsfiler blev leveret til Cufflinks 2.2.1 for at samle transskriptioner for hver prøve. Den annotationsversion, der blev brugt i denne undersøgelse, var Sorghum_bicolor_NCBIv3.38.gff3. Prøver fra samme tilstand blev slået sammen ved hjælp af Cuffmerge. Formålet var at give et ensartet grundlag for beregning af gen- og transkriptekspression i hver tilstand.

3.6. Bioinformatisk analyse af RNA-Seq-data

RNA-seq-data blev analyseret ved hjælp af bioinformatikværktøjer Bowtie{{0}}.3.4.3, TopHat 2.1.1 og Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) med standardparametre. Vi brugte den samme pipeline med disse værktøjer som beskrevet i Trapnell et al. [64]. For yderligere at bekræfte analyseresultaterne brugte vi en anden pipeline med HiSat2 (version 2.1.0), HTSeq (version 0.12.4) og edgeR (version 3.26.8) til at udføre analysen. HiSat2 er den næste udvikling af TopHat2. Først brugte vi HiSat2 til at udføre justeringen ved hjælp af Sorghum-referencegenomet. Derefter brugte vi HTSeq til at tælle, hvor mange læsninger der blev kortlagt til hvert gen. Til dette havde vi brug for bam-filerne genereret fra det forrige trin og genom-annotationen (gif-fil). Bemærk, at referencegenomet og annotationsfilerne er de samme, som vi brugte i den originale pipeline. Endelig brugte vi R-pakken edgeR til at bestemme de differentielt udtrykte gener i hver tilstand

3.7. Identifikation af differentielt udtrykte gener
Den fusionerede samling blev ført til Cuffdiff, som beregner udtryksniveauer og tester den statistiske signifikans af observerede ændringer mellem to forhold. Vi sammenlignede betingelserne mellem mock vs. flg22 og mock vs. chitin for henholdsvis BTx623 og SC155-14E. De differentielt udtrykte gener blev ekstraheret ved hjælp af 0.001 p-værdi tærskler. Vulkanplottene blev lavet ved hjælp af R-pakken (ggplot2 V3.3.0) for at vise betydningen af ​​genekspressionsændring i forhold BTx623 behandlet med flg22 eller chitin og SC155- 14E behandlet med henholdsvis flg22 eller chitin. Genprikkerne med -log10 (p-værdi) lig med eller større end tre blev betragtet som DEG. I hvert plot var genprikkerne med log2 (fold_ændring) større end nul opregulerede gener, ellers nedregulerede de gener.

3.8. PCA plot

For at undersøge forholdet mellem genekspressionsværdier af tre biologiske replikater af hver sorghum-linje og hver MAMP-behandling, blev principal komponentanalyse (PCA) plots genereret ved hjælp af R-pakker (ggfortify V{{0}}.4.10, ggplot2 V3 .3.0). Hver prik repræsenterer en tilstand efter kortlægning fra det oprindelige funktionsrum (genekspression) til de første to hovedkomponenter. Prikker, der tilhører samme tilstand, har en tendens til at klynge sig sammen

3.9. Varmekort over DEG

1 afdeling for plantevidenskab og -teknologi og biokemi, CS Bond Life Sciences Center, University of Missouri, Columbia, MO 65211, USA; cuiy@missouri.edu (YC); chendq@cau.edu.cn (DC)

2 Department of Electrical Engineering and Computer Science, CS Bond Life Sciences Center, University of Missouri, Columbia, MO 65211, USA; yjm85@mail.missouri.edu (YJ); xudong@missouri.edu (DX)

3 Department of Entomology and Plant Pathology, NC State University, Raleigh, NC 27695, USA; pjbalint@ncsu.edu

4 Plant Science Research Unit, USDA-ARS, Raleigh, NC 27695, USA

* Correspondence: staceyg@missouri.edu