To triterpenoider fra Rubus Fraxinifolius-blade og deres tyrosinase- og elastasehæmmende aktiviteter

Venligst kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mere information

Talrige terapeutiske forbindelser er blevet isoleret fra naturligt rigelige organiske ressourcer, som kan tilbyde økonomiske og bæredygtige kilder til forbindelser med sikre og effektive biologiske aktiviteter. I kosmetikindustrien søges ivrigt efter naturlige forbindelser med anti-aging-aktiviteter. Således fremstillede vi forskellige ekstrakter fra Rubusfraxinifolius-blade og brugte enzymhæmningsassays til at isolere forbindelser med beskyttende virkning mod hudens aldring. To triterpenoider blev isoleret fra Rubus fraxinifolius Poir. blade. Strukturerne blev karakteriseret ved spektroskopiske analyser (LC-ESI-MS,1D/2D NMR) og sammenligning med rapporterede data. Forbindelse 1 og 2 blev bestemt som 2,3-O-ethylenglycol,19-hydroxyurs-12-en-23,28-disyre og 2,{{15} }O-propandiol,19-hydroxyurs-12-en-28-oic acid. Methanolekstrakt og isolater blev vurderet for deres hæmmende virkninger på elastase og tyrosinase. Forbindelser 1 og 2 inhiberede elastase med ICso 122,199 ug/ml og 98,22 ug/ml og hæmmede også tyrosinase med ICso 207,79 ug/hær og 221,51 ug/ml. Den molekylære docking viste, at begge forbindelser har affiniteter over for enzymerne.

Klik venligst her for at vide mere

Selvom det er udfordrende at opnå, kan naturlige anti-aldringsstoffer, der er sikre for mennesker, høstes økonomisk og bæredygtigt fra rigelige naturressourcer. Omkring 700 arter af Rubus (Rosaceae) er udbredt globalt, selvom få arter findes i troperne. Denne slægt indeholder næringsstoffer (sukker, vitaminer osv.), sekundære metabolitter (triterpenoider, flavonoider, polyphenoler osv.) og har mange anti-aldringsaktiviteter (antioxidant, myre elastase, myre tyrosinase, anti-collagenase, anti-UV, anti-inflammatorisk, sårheling osv.)1. Derudover rapporterede Rubus-arter også indeholdende forskellige triterpener med forskellige biologiske aktiviteter -'.

I Indonesien, R. fraxinifolius Poir. (Rosaceae) er udbredt på Java, Borneo osv., og populært kendt som 'urban.hvad er cistancheDesuden høster nogle lokale landmænd disse planter, og bærfrugterne indtages normalt enten friske eller frosne. Vores tidligere undersøgelse viste, at R. frascinifolius stammeekstrakt har aktiviteten til at hæmme elastase, tyrosinase og som en antioxidant8. Nogle andre undersøgelser viste også, at bladet og frugten af ​​R. fraxinifolius har en potent antioxidantaktivitet?10. Undersøgelsen af ​​R. fraxinifolius er imidlertid kun blevet forsket lidt, og der er ikke rapporteret om undersøgelser af kemiske komponenter.

Cistanche kan anti-aging

Elastase er et serinprotease-enzym, som har en afgørende rolle i hudens rynker eller fald gennem nedbrydning af dermal elastisk fiber (elastin) og forårsager tab af hudens elasticitet. En af disse er hudfibroblast-afledt elastase. Som moderatorer af elastinfibernedbrydning, der forårsager hudens aldring, har elastasehæmmere således tiltrukket sig opmærksomhed som midler til kosmetiske præparater12. Melanogenese medieres af tyrosinase og regulerer melaninbiosyntesen gennem en to-trins reaktion. I det indledende trin hydroxyleres L-tyrosin til L-3,4-dihydroxyphenylalanin (L-DOPA). I ​​det andet trin oxideres L-DOPA til den tilsvarende O-quinon. Derfor er naturlige forbindelser med tyrosinaseinhiberende aktivitet almindeligt anvendt i kosmetik, der hæmmer hyperpigmentering med melanin og dermed favoriserer hudblegning.Anti-aging cistancheElastase- og tyrosinase-enzymhæmmerne kunne udvikles som hudblegnings-, anti-aldrings- eller anti-rynkemidler til behandling af dermatologiske lidelser44.

Denne undersøgelse isolerede ursane triterpenoider fra R.fraxinifolius-blade og belyste deres strukturer i spektroskopiske analyser ved hjælp af elektrosprayioniseringsmassespektroskopi (ESI-MS) og 'H NMR, |3CNMR og 2D NMR (DEPT, HSQC, HMQC og HMBC). Efterfølgende udførte vi assays af elastase- og tyrosinaseinhiberende aktiviteter af råekstrakter, fraktioner og isolerede forbindelser.

Aktiviteten af ​​to udvalgte forbindelser blev også observeret gennem in silico-metoden i denne forskning. En molekylær docking-tilgang blev udført med DockThorl516. Makromolekylerne anvendt i denne forskning blev opnået fra proteindatabank (RCSB PDB, 2000) med identiteter 2y9x og 3hgp for henholdsvis tyrosinase og elastasel718. Makromolekylerne blev optimeret i UCSF-kimærer og molekylerne blev observeret med PyMOL1920.

Resultater og diskussion

The ethyl acetate and methanolic extracts of R. fraxinifolius leaves showed potential as elastase inhibitors with percent inhibitory>40 procent i 100 ug/ml, hvorimod n-hexanekstrakt ikke havde nogen aktivitet (fig. 1). Nogle Rubus viste også elastaseinhiberende aktivitet såsom R. Sanctus（procent hæmning 14.68-49.20 i 100 ug/mL）, R.compactus,R. robustus, etc.221. Derfor fraktionerede vi de aktive ekstrakter under anvendelse af vakuumvæskekromatografi/VLC og opsamlede 11 fraktioner fra hver. Fraktioner fra ethylacetatekstrakt viste svage elastaseinhiberende aktiviteter (<20% in="" 100="" ug/ml),but="" some="" methanol="" fractions="" showed="" potential="" activity="" in="" these="" assays.="" we="" choose="" metha-nol="" fraction="" 8(m8)for="" further="" isolation="" because="" it="" hadthe="" largest="" yield(57%)="" and="" also="" have="" elastase="" inhibitory="" activity(44.82%).m8="" was="" further="" partitioned="" and="" purified="" over="" silica="" gel="" and="" through="" a="" sephadex="" column,="" and="" two="" amorphous="" powders="" were="">

Isolater blev identificeret og karakteriseret ved hjælp af væskekromatografi-massespektroskopi (LCMS), 'H og 13CNMR, DEPT, heteronukleær enkelt kvantekohærens (HSQC), heteronukleær multipel kvantekorrelation (HMQC) og heteronukleær multipelbindingskorrelation (HMBC). Tabel 1 viste NMR-spektraldata for forbindelser.

Forbindelse 1: blev isoleret som et amorft hvidt pulver. LCMS-ESI-spektre for denne forbindelse viste en molekylær iontop ved m/z 543,32[MH]t, hvilket tyder på molekylformlen C32H48O- med ni umættethedsækvivalenter.IR-spektre afslørede absorptionsmaksima svarende til hydroxyl (3.343,4 cm-l) og olefiniske (1,684 cm-1) funktionelle grupper. Desuden afslørede 'H NMR-spektre af forbindelse I methinproton (CH) et singletsignal på 2,6, et karakteristisk signal for H-18 af ursane-typen triterpener med 19-O-substitutioner. Triterpentypen 19a-hydroxy-ursane har også et typisk protonsignal i området omkring ou 2,6 ppm. Dette afskærmede signal kan afvige markant fra andre ordinale methylenprotonsignaler med et karakteristisk skift på grund af en olefinisk proton(H12) på ou 5,28(t,J=6Hz).cistanche benefíciosFuldstændige og utvetydige 'H- og l3C-kemiske skifttildelinger blev assisteret af HMQC(13Cx'H)- og HMBC(15Cx'H)-spektre. Fra HMBC-krydstoppen blev protonen ved ou 2,60 bekræftet at være H{ {5}}(Fig.2a). Andre specifikke karakterer blev fundet for de fem methylsingletter på 1.89,1.02,0.82,1.32,1.20(hver,H24-27;29),en methyldublet på og 0.92(d, J=6 Hz), og det olefiniske protonsignal på 5,30(t, J=7 Hz, H-12). De nuværende 13CNMR-spektre viser 32 carbonresonanser, og med DEPT- og HMQC-spektre viste to carbonylcarbonatomer (δC183.70,C-28 og 8-178.96,C-23), et olefinisk kulstof ved oc 127.23,C-12,et olefinisk kvaternært carbon(oc139.49,C-13),et oxygenbærende kvaternært carbon (o-72.7, C-19 ）, ti alifatiske methylener og seks methylcarbonatomer. De to olefiniske carbonatomer ved δ-127.23（C-12) og 139.49(C-13) var karakteristiske for ursane-triterpenoid-typen. Et andet signal indikerede tilstedeværelsen af ​​ethylenglycol （-OCH-CH-O-） blev vist ved signaler ved δ4.62（d, J=11.5 Hz）,4.05（d, J=11. 5 Hz）, 3,52（d, J=11.5Hz）og 4.06（d, J=11.5Hz）og understøttet med δ61.27（t） og 63.20（t）. Den var placeret ved C-2ogC-3 baseret på tilstedeværelsen af ​​langdistancekorrelation i HMBC-spektrene. Derfor blev forbindelse 1 identificeret som 2,3-O-ethylenglycol,19-hydroxyurs-12-en-23,28-disyre (fig. 3a).

Forbindelse 2: blev opnået som et hvidt amorft pulver. MS-ESI m/z 527,33 [MH]t (beregnet for 528,3815). I LCMS-ESI-spektre er en molekylær iontop til stede ved m/z 527,33 [MH]t, hvilket indikerer molekylformlen CH Os, som krævede 8 grader af umættethed." IR-spektret indeholdt absorptionsmaksima svarende til hydroxyl (2.927,8 cm{ {15}}) og olefiniske (1.686 cm-1) funktionelle grupper. Ydermere viste 'HNMR-spektre for forbindelse 2 en singlet på 2,42, hvilket er karakteristisk for H18 af en triterpen af ​​ursane-typen med {{24 }}O-substitution.Cistanche Extract Anti RadiationAndre specifikke karakteristiske spektre omfattede tilstedeværelsen af ​​seks methylsingletter ved og1.22 0.76,0.97,0.69,1.30og 1.17(hver,H -24-28,H-30), en methyldublet ved 0,91 (d,J=7Hz), og det olefiniske protonsignal ved ou 5,37 (d, J=7 Hz, H-12). Tilsvarende l3(CNMR- og DEPT-spektre viser 33 carbonresonanser, og HSQC- og HMQC-spektre indikerer tilstedeværelsen af ​​et carbonylcarbon(oc 182,23, C-28), et olefinisk carbon (δ-129.36, C -12), et olefinisk kvaternært carbon （δ-140.24, C-13）, et oxygenbærende kvaternært carbon (oc73.68, C-19), elleve alifatisk methylen og syvmethylcarboner. Disse data indikerede, at forbindelse 2 bærer et ursane-triterpenoid-skelet. De andre signaler er angivet tilstedeværelsen af ​​1,3-propandiol funktionel gruppe,at og 3.22(d,J=11 ,5 Hz),3,42(d,J=10,5 Hz),1,38(m),1,51(m) og 4,02(d,J=11,5Hz) og 3,36(t, J{ {57}}.5Hz). Dens funktionelle gruppe har en lang rækkevidde korrelation med C2-C3. Baseret på disse resultater blev forbindelse 2 således identificeret som 2,3-O-propandiol,{{ 66}}hydroxyurs-12-en-28-oic acid(fig.2b og 3b).En lignende forbindelse er 2,3-O-Isopropyliden-pinesyre, isoleret fra Rubus xanthocarpus.7

I tabel 1 blev alle 'H- og ''C-NMR-spektre sammenlignet med pinesyre (TA/2a,3a,19-trihydroxy-12-ursen-28-oic acid）², som er en ursane triterpenoid, der er blevet fundet i flere Rubus arter-p Tormentsyre havde stærke ligheder med forbindelser 1 og 2, bortset fra at kemiske skift relateret til C-23 og C31-33 var forskellige. Denne del blev også bekræftet i DEPT-, HMQC- og HMBC-eksperimenter (fig. 2).

Triterpenoiden plager syre er vidt udbredt i naturlige vegetabilske fødevarer. Det har forskellige bioaktiviteter: hypoglykæmiske virkninger, anti-inflammatoriske og anti-atherogene egenskaber reducerede vaskulær glatmuskelcelleproliferation og antiproliferative aktiviteter i nyre-, prostata- og melanomkræftcellelinjer2426. Derfor, fordi disse forbindelser har det samme skelet, kan de have mulige passende potentielle aktiviteter.

Figur 4 repræsenterer den inhiberende elastase- og tyrosinaseaktivitet af isolater. Dataene opnået fra in vitro enzyminhiberingsassays blev udtrykt som standardafvigelsen (SD). Forbindelser 1 og 2 hæmmede elastase med ICso 122.199 og 98.22 ug/mL og hæmmede også tyrosinase med ICso 20 hhv. 7.79 og 221.51 ug/ml. Nogle pentacykliske triterpenoider (ursolsyre og oleanolsyre) rapporterede at have elastasehæmmende aktivitet2728. Elastaseinhiberingsværdien af ​​forbindelse 2 er lavere end for forbindelse 1. Begge forbindelser havde mindre inhiberingsaktivitet end den positive kontrol-oleanolsyre, som havde en ICso-værdi på 90,39 ug/ml. I overensstemmelse hermed viste tidligere undersøgelser en ICso for oleanolsyre på 76,5 ug/mL og en ICso-værdi på 31,0 ug/ml for ursolsyre28. Tidligere rapporterede kinetiske analyser af pentacykliske triterpener viste, at disse forbindelser kompetitivt og reversibelt hæmmer neutrofil elastase. I samme undersøgelse viste molekylære docking-eksperimenter, at den molekylære stilladsdel 28-COOH og dobbeltbindinger i pentacykliske triterpener er afgørende for deres hæmmende aktiviteter

Et af de problemer, der opstår med stigende alder, er hyperpigmentering.cistanche herbaDerfor er der en løbende søgning efter hudlysende midler eller ny depigmentering. Undertrykkelse af tyrosinase kan virke mod melanogenese". Som vist i fig. 4 udviste methanolekstraktet og forbindelserne I og 2 moderate aktiviteter som tyrosinaseinhibitorer.

I denne forskning blev molekylær docking også brugt til at analysere bindingsaktiviteterne af udvalgte forbindelser til tyrosinase og elastase som deres mål. De anvendte krystalstrukturer var 2Y9X, en krystalstruktur af tyrosinase fra Agaricus bisporus med inhibitor tropolon; og BHGP, en krystalstruktur af porcin pancreaselastase kompleksbundet med en potent peptidylinhibitor FR130180. Begge blev udvalgt, fordi de blev opnået fra den samme organisme, der blev brugt til in vitro-analysen af ​​denne forskning. Makromolekylerne er også bundet til deres respektive inhibitorer, således at den aktive tilstand af enzymkonformationerne kunne opnås. Kokrystallerne blev brugt som centrum af det molekylære docking-mål for at indsnævre forbindelsens bindingssandsynligheder, så scoringsprocessen bliver mere effektiv.

Fra den molekylære docking blev gennemsnitlige bindingsaffiniteter opnået for begge forbindelser som vist i fig. 5 og 6. Affinitetsforudsigelsen bruges til at rangordne forskellige ligander under hensyntagen til den øverste energiposition for hver forbindelse, en forudsigelse af en bedre energiposition er vist ved at lavere bindingsaffinitetsscore16. Redocking af udpeget inhibitor tropolon blev udført med gennemsnitlige bindingsaffiniteter på -7,41 kcal/mol. De gennemsnitlige bindingsaffiniteter af forbindelser 1 og 2 til tyrosinase var henholdsvis -7,84 kcal/mol og -8,37 kcal/mol (tabel 2). Begge forbindelser blev forudsagt at have en bedre affinitet end inhibitoren.

I mellemtiden var den gennemsnitlige bindingsaffinitet for elastase-docking -7.84 kcal/mol. De gennemsnitlige bindingsaffiniteter af forbindelser 1 og 2 til elastase var henholdsvis -7,58 kcal/mol og -8,06 kcal/mol. Selvom resultatet viste, at forbindelse 1 har lavere affiniteter end cokrystallen, er den lidt anderledes(<0.5 kcal/mol)compared="" to="" the="" inhibitor="" used="" hence="" the="" scores="" may="" ovelrlap31.="" these="" scores="" showed="" that="" both="" compounds="" were="" predicted="" to="" have="" affinities="" toward="" the="" enzymes,="" which="" is="" in="" conjunction="" with="" the="" in="" vitro="" assay="">

Metoder

Generelle eksperimentelle procedurer. 'H- og 'NMR-spektre blev optaget ved 500 MHz under anvendelse af et JEOL JNM-ECZ500R/S1-instrument. Infrarøde (IR) spektre blev målt med en FTIR, IRPrestige-21, Shimadzu. Andre analyser blev udført ved hjælp af et Waters UPLC-MIS XEVO G2-XS QTof-instrument, en VersaMax Microplate-læser og en BioTek ELX800 Microplate Reader, lore-coatede aluminiumsplader TLC-Silicagel 60 GF254 (Merck, Darmstadt, Tyskland) søjlekromatografi (CC) blev udført under anvendelse af Silicagel 60 (Merck, Darmstadt, Tyskland) med 70-230 mesh til åben kromatografi og 230-400 mesh til vakuumkromatografi. Plantematerialer. R. fraxinifolius-blade blev indsamlet fra et plantageområde i Pangrango-bjerget, West Java i en højde af 4.343 ft, i december 2018. Prøven blev identificeret af en botaniker (Dr. Joni Setijo) ved Research Center for Biology, Indonesian Institute of Sciences, Indonesien, med prøvenummer 033/IPH.1.01/If.07. Indsamlingen af ​​plantemateriale havde modtaget tilladelse fra landmanden og overholdt institutionelle regler og retningslinjer.

Udvinding og isolering. Lufttørrede pulveriserede blade (2300 g) blev ekstraheret under anvendelse af et Soxhlet-apparat med gradientopløsningsmiddel (n-hexan, EtOAc og MeOH) for at tilvejebringe de respektive ekstrakter, og derefter inddampet med en rotationsfordamper og vakuumovn. Methanolekstrakten (291 g) og ethylacetatekstrakten (65 g) blev adsorberet på silicagelen og udført vakuumvæskekromatografi/VLC under eluering med en trinvis gradient af EtOAc: MeOH (fra 1:0 til 0:1) til producere fraktioner for hvert ekstrakt (Eal-Hall og M1-Mill and). Lignende fraktioner, som havde positive reaktioner med vanillin svovlsyrereagenser i TLC, blev kombineret. Fraktionsudbytte: Eal-3 (2,27 g);Ea4-6(8,47 g);Ea7-8(12,9 g);Ea9-11 (22,3 g); og M1-3 (4,89 g);M4-5 (5,1 g);M6-7 (6,02g);M8(166,42g);M9(10,53g);M{{38 }}(2,9 g). Alle fraktioner blev indsendt for inhibitor-elastaseaktivitet, Fr. M8 gav det største udbytte og havde kraftig aktivitet. Fr. M8 successivt opdeles yderligere med CC over silicagel (eluent CH2Cl2/MeOH med en trinvis gradient) og renset ved hjælp af Sephadex LH-20 kolonne (eluering med CHCl3-MeOH 100:10, v/v. To fraktioner viste fast natur og blev krystalliseret med chloroform og methanol for at få to isolater: forbindelse 1 (18 mg) og: 2 (31 mg) Renheden af ​​alle isolaterne blev vurderet ved todimensionel TLC og visualisering af pletten under anvendelse af 5 procent svovlsyre syre i methanol, efterfulgt af opvarmning af pladerne ved 110 grader i 5 min.

Krystallerne blev identificeret og karakteriseret ved hjælp af væskekromatografi-massespektroskopi (LCMS), LH og '3C-forvrængningsforøgelse ved polariseringsoverførsel (DEPT) NMR, heteronukleær enkelt kvantekohærens (HSQC), heteronukleær multipel kvantekorrelation (HMQC) og heteronukleær multiple obligationskorrelation (HMBC).

Elastaseinhiberingsassay. Elastasehæmningsassay blev udført som beskrevet tidligere med nogle modifikationer32. Kort fortalt, i Nunc-96-brøndmikrotiterplader, 20-μL alikvoter af 0.8-enheder/mL PPE i Trizma-graders basebuffer （pH 8.0 ） blev blandet med 20-μL prøver, og blandingerne blev derefter fortyndet til 180 μL i Trizma graders basebuffer. Testekstrakter blev præinkuberet med enzym i 15 minutter, og 20-μL alikvoter af substratet N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilid (A3PVN; 2,9 mM) blev tilsat og inkuberet i yderligere 15 minutter. Positiv kontrol og blanke brønde indeholdt henholdsvis oleanolsyre og vand. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer, og inhiberingshastigheder blev bestemt i henhold til absorbering; ance ved 401 nm ved hjælp af en VersaMax mikropladelæser. Procentvis inhibering blev beregnet ved hjælp af følgende ligning:

hvor Eis absorbansen af ​​enzymreaktionen, Eb er absorbansen af ​​enzymblindprøven, T er absorbansen af ​​testprøven, og Tb er absorbansen af ​​testblindprøven. også værdier blev bestemt ud fra en lineær graf af procent elastasehæmning mod koncentration (50,75,100,125,150 ug/mL). Tyrosinaseinhiberingsassay. Tyrosinaseinhibering blev bestemt ved anvendelse af DOPA-chrom-dannelsesmetoden som beskrevet tidligere med små modifikationer13. Kort fortalt, i 96-brøndsplader blev 20 μL aliquoter af DMSO (kontrol) eller testforbindelser i varierende koncentrationer blandet med 40 μL aliquoter af 30 U/mL svampetyrosinase (Sigma Aldrich) og {{11}μL 0.1-M fosfatbuffer (pH 6,8). De blev præinkuberet i 10 minutter ved stuetemperatur. Reaktioner blev initieret ved addirg4μL alikvoter af 10mML-DOPA til hver brønd og inkubering ved 37 grader i 20 minutter. Tyrosinaseaktivitet blev derefter bestemt ved at måle absorbans ved 475 nm. Kojinsyre blev anvendt som en positiv kontrol. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer. Procentdelen af ​​tyrosinaseinhibering blev beregnet ved hjælp af følgende ligning:

hvor E er absorbansen af ​​enzymreaktionen, Eb er absorbansen af ​​enzymblindprøven, T er absorbansen af ​​testprøven, og Tb er absorbansen af ​​testblindprøven. også værdier blev bestemt ud fra en lineær graf af procent elastaseinhibering mod koncentration (250,125,62,5,31,25,15,6 ug/ml).

Molekylær docking. I denne forskning blev farmakologisk aktivitet i silico forudsagt med molekylær docking ved hjælp af en læge. Målrettet molekylær docking blev udført ved at anvende en cokrystalliseret ligand som centrum af det aktive sted. Struktur 2Y9X blev brugt til tyrosinase molekylær docking med tropolon, en inhibitor af svampe tyrosinase, som dens cokrystal. Midten af ​​det molekylære dockingsted er defineret ved -10.032;-28.769 og -43.467 som henholdsvis X-, Y- og Z-dimensioner. Kæde A blev adskilt til brug, og Holmium-atomet blev fjernet fra strukturen under anvendelse af UCSF Chimera.

Strukturen af ​​3HGP, en porcin elastase, blev også brugt i denne forskning.FR130180, da co-krystallen blev brugt som centrum for det molekylære dockingsted. Koordinaterne var henholdsvis 12.453, 9.237 og 1.199 for X,Y,Z dimensioner. Bindingsaffiniteten blev analyseret ud fra de ti bedste konformere af hver molekylær docking-beregning.

Denne artikel er uddraget fra Scientifc Reports|(2021) 11:20452|https://doi.org/10.1038/s41598-021-99970-x