To menneskelige metabolitter redder A C. Elegans model for Alzheimers sygdom via et cytosolisk udfoldet proteinrespons

Aldersrelaterede ændringer i cellulær metabolisme kan påvirke hjernens homeostase og skabe betingelserder er tilladelige for opståen og progression af neurodegenerative lidelser som f.eks Alzheimer's og Parkinson's sygdomme. Selvom metabolitternes roller har været omfattendeundersøgt med hensyn til cellulære signalveje, forbliver deres virkninger på proteinaggregering relativt uudforskede. Ved beregningsmæssig analyse af Human Metabolome Database, identificerede vi to endogene metabolitter, carnosin og kynureninsyre, der hæmmer aggregeringen af ​​amyloid beta-peptidet (A ) og redning aC. elegansmodel afAlzheimer's sygdom. Vi fandt ud af, at disse metabolitter virker ved at udløse et cytosolisk udfoldet proteinrespons gennem transkriptionsfaktoren HSF-1 og nedstrøms chaperonerne HSP40/Jproteins DNJ-12 og DNJ-19. Disse resultater hjælper med at rationalisere tidligere observationer vedrde mulige anti-aging fordele ved disse metabolitter ved at tilvejebringe en mekanisme for deres virkning. Tilsammen voresfundgive en sammenhæng mellem metabolit homeostase ogproteinhomeostase, som kunne inspirere til forebyggende indgreb modneurodegenerative lidelser.

Klik her for at få flere oplysninger om, hvordan Cistanche forhindrerAlzheimers og Parkinsons sygdomme

Spørg for mere:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950

Alzheimer's sygdom (AD) er en kompleks lidelse karakteriseret ved tilstedeværelsen af ​​afvigende proteinaflejringer i hjernevæv1–3. Selvom den molekylære oprindelse af denne sygdom stadig skal værefastetableret, er det generelt anerkendt, at tilstedeværelsen af ​​proteinaflejringer er forbundet med dysreguleringen af ​​proteinhomeostase-netværket4,5. Til gengæld er dette system en del af et bredere cellulært homeostase-system, som omfatter en række andre komponenter, herunder metabolit-homeostase-systemet6,7. Metabolitter påvirker nøgletrin i cellulære veje, hvor de fungerer som substrater for enzymer eller som signalmolekyler til aktivering af biokemiske veje. For eksempel hæmmer kaloriebegrænsning og intermitterende faste strukturelt og funktionelt fald under aldring hos laboratoriegnavere og aber8–10. 

Desuden har signalveje udviklet sig til at reagere på cellulær stress ialdring, hvor AMPK- og mTOR-vejene studeres bredt i cellulær udvikling og aldring11–14. Det er derfor vigtigt at forstå, hvordan neurodegenerative lidelser forbundet med aldring, såsom AD, er forbundet med aberrationer i cellulær homeostase. Den specifikke hypotese, som vi undersøger her, er, om dysreguleringen af ​​metabolitniveauer er forbundet med den afvigende aggregering af proteiner i AD. Vi nærmer os dette ved at teste, om supplering af de dysregulerede metabolitter kan forhindre eller fjerne aggregeringen af ​​fejlfoldede proteiner. Forringelsen af ​​forskellige biologiske processer bidrager til opståen og progressionen afAD, herunder DNA-reparation, iflflammation, mitokondriel funktion, oxidativ stress, neuronal netværks excitabilitet, metalion-homeostase, autofagi, hypothalamus-regulering, neurogenese hos voksne og proteinhomeostase (fig.1)1,15–28. Små molekylers metabolitter spiller nøgleroller i disse biokemiske processer, men det vides stadig ikke i detaljer, hvilke af disse roller der erførstdysreguleret og er forbundet med den patofysiologiske debut og progression af sygdommen. I denne sammenhæng er det endnu uvist, om fænomenet med proteinfejlfoldning og -aggregering er en årsag eller en konsekvens af svækkelsen af ​​disse biologiske processer.fastetableret. En lang række undersøgelser har indikeret, at proteinaggregering direkte kan resultere i aktiveringen af ​​de nedstrøms biokemiske kaskader, der betyderfifikan ikke fremme patologien af ​​AD29. De giftige aggregatarter er anerkendt for at være A og Tau-oligomerer, hvis unormale interaktion med cellulære komponenter kan forringe neuronale funktioner29,30. I betragtning af vores nuværende forståelse af AD, kan nedsættelse eller hæmning af proteinaggregering bidrage til at forhindre fremskridt af sygdommen. Forståelse af, hvilke veje der bidrager til dette mål, kan således tilbyde indsigtsfulde muligheder for forebyggende og terapeutiske interventioner, samt give retningslinjer for bæredygtige måder at leve på (f.eks. livsstilsfaktorer, motion og kost), der undertrykkerADog fremmesund aldring.

Fig. 1 Metabolithomeostase og proteinhomeostase iAlzheimer's sygdom (AD). a AD er forbundet med en lang række dysfunktioner i cellulær homeostase (farvede kasser). En række af endogene metabolitter er involveret i reguleringen af ​​disse cellulære processer (grå boksindsatser).b Lille molekyleendogene metabolitter kan modulere proteinaggregationsprocesserne forbundet med sygdommen. Ved at designe systematiske undersøgelser kan vi afdække de nøjagtige molekylære mekanismer, hvorved de balancerer proteinhomeostase.

og fejlfoldning og de udfoldede proteinresponser (UPR) i det endoplasmatiske retikulum og mitokondrier31,32. Mange varmechokproteiner fra HSR er molekylære chaperoner, der styrer konformationen af ​​proteiner under biogenese og forhindrer fejlfoldning og aggregering, der forstyrrer cellulær funktion21. Da cytoplasmaet også er en pulje af forskellige metabolitter produceret og shuttlet på tværs af biokemiske netværk, forventes det, at deres niveauer og tærskelkoncentrationer i cellen kan have en effekt som små molekyle regulatorer på protein homeostase netværket og dermed holde aggregeringstilbøjelige proteiner i deres opløselige tilstand. Patel og kolleger viste, at ATP øger proteinopløseligheden ved fysiologiske koncentrationer (mM-interval)33. Man kan således forestille sig, at andre endogene metabolitter også kan bidrage til moduleringen af ​​proteinaggregering. Forbedret ekspression af molekylære chaperoner, som primært reguleres af transkriptionsfaktoren varmechokfaktor 1 (HSF-1), har vist sig at genoprette proteinhomeostase i en række forskellige proteinfejlfoldningssygdomsmodeller, hvilket tyder på, at denne mekanisme kan repræsentere en lovende mål for forebyggende og terapeutiske tilgange34. Calamini et al. identificeret nye klasser af småmolekyle-proteinhomeostaseregulatorer, der inducerer HSF1-afhængig chaperoneekspression og genopretter proteinfoldning i flere proteinkonformationelle sygdomsmodeller. Disse gavnlige virkninger på proteomstabilitet medieres af HSF1, FOXO, NRF2 og chaperonemaskineriet34. Faktisk er endogene metabolitter også små molekyler, der regulerer vigtige biologiske processer. Da niveauerne af disse metabolitter kan ændre sig som reaktion på miljømæssige signaler, er det vigtigt at forstå deres direkte virkninger på proteinhomeostase. I dette arbejde spurgte vi, om endogene metabolitter kan påvirke aggregeringen af ​​proteiner eller ej, og hvis de gør, hvad er deres virkningsmekanisme. Er det en direkte indflydelse ved at binde til monomer, oligomer ogfibrillærearter eller aggregater, eller er det indirekte ved at virke på forskellige andre cellulære homøostatiske mekanismer? Gennem vores undersøgelser identificerede vi to humane endogene metabolitter, der udløser et cytoplasmatisk udfoldet proteinrespons ved at øge niveauerne af HSF-1 og downstream HSP40 co-chaperones J-proteiner, hvilket i sidste ende resulterer i clearance af A aggregater i enC. elegansmodel af AD.

Resultater

Identifikation af endogene metabolitter som små molekyle protein homeostase regulatorer. 

For at identificere metabolitter forbundet medAD, startede vi med at beregne fragmenter og lighedsscore35 (se"Metoder" afsnit) af de små molekyler rapporteret som proteinhomeostaseregulatorer af Cala mini et al.34 (Fig.2en). Ved hjælp af disse fragmenter screenede vi Human Metabolome Database (HMDB)36 for metabolitter påvist i cerebrospinalvæsken (CSF). Da det er i direkte kontakt med det ekstracellulære rum i hjernen, giver CSF et vindue på hjernens metabolisme ved at afspejle hjernens biokemi37 i form af dets tilknyttede metabolitter. I dette arbejde overvejede vi kun endogene metabolitter, da vi ønskede at undersøge molekyler aktive i primære cellulære mekanismer, der ikke involverede eksogene metaboliske produkter. Vores begrundelse er, at fokus på endogene metabolitter kan hjælpe med at identificere fundamentale cellulære processer, der er kompromitteret i neurodegeneration som en reaktion på miljøet og/eller cellulære fornærmelser. Da påvisning og kvantificering af metabolitter i kropsvæsker er udfordrende, filtrerede vi kun de metabolitter, der blev påvist og kvantificeret i vid udstrækning. Vi brugte derefter KEGG-databasen38 at identificere biokemiske veje forbundet med disse metabolitter, og yderligere de metabolitter, der er særligt dysregulerede i neurodegeneration (Supplerende data 1). I tilfælde af dysregulering er niveauerne af opregulering og nedregulering af disse metabolitter tilgængelige fra HMDB og tilhørende litteratur tilgængelig deri. Vi udførte derefter en litteratursøgning for at bekræfte den dysregulerede status af metabolitterne i neurodegeneration. Vi rangerede denne status som en associationsscore ved at udføre en PubMed-søgning (se"Metoder" afsnit) (Supplerende data 1). I princippet beskriver associationsscoren associationen af ​​AD med den identificerede endogene metabolit på tværs af undersøgelser rapporteret i PubMed. Klassificering af de identificerede metabolitter i opregulerede og nedregulerede giver et indblik i virkningerne af deres normale koncentrationer på opretholdelse af cellulær homeostase og deres dysregulering ved sygdom. Vi fandt, at 186 af de 380 endogene CSF-metabolitter var dysregulerede i neurodegeneration (Supplerende data 1). Vi fokuserede derefter på seks af disse metabolitter: 1-methylhistidin, homovanillinsyre, melatonin,L-carnosin, vanylglycol og kynurensyre (tabel1), som blev udvalgt, fordi de delte overlappende fragmenter med kendte HSF-1-proteinhomeostaseregulatorer (fig.2b). Vi undersøgte derefter eksperimentelt deres mulige roller i modulering af aggregeringen af ​​A 42, den meget cytotoksiske 42-restform af A .

Carnosin og kynurensyre redder en C. elegans-model af AD. C. eleganser en velkarakteriseret model for aldring, der deler grundlæggende biokemiske ligheder med mennesker.

Desuden med en gennemsnitlig levetid på 2–3 uger giver det et kraftfuldt in vivo-værktøj til at studere proteinaggregering. Da vi undersøger endogene metabolitter og ønskede at undersøge, om og ved hvilken mekanisme metabolitter kan rense aggregater, overvejede vi at vælgeC. elegansin vivo system til screening i stedet for en in vitro screening tilgang. Vi udførte først en dosisafhængig screening (0, 1, 5 og 10μM) (udvidede data i Supplerende Fig. 1 og 2) af de seks metabolitter, som vi identificerede som proteostaseregulatorer for at teste den overordnede egnethed af en veletableretC. elegansmodel, GMC101 (GMC), hvor A 42 er overudtrykt i de store muskelceller39. Denne model viser aldersafhængig inklusionsdannelse og relateret toksicitet, som kan måles ved et fald i antallet af kropsbøjninger pr. minut (BPM), en stigning i lammelseshastigheden og et fald i bevægelseshastigheden39 (Fig.3). Vi rapporterer enhver signififikan ikke gavne ved metabolitbehandling som ændringer i den overordnede kondition, hvor vi betragter fitness som ormenes samlede adfærdsrespons som en funktion af BPM, hastighed (mm/s) og leveforhold. Vi brugte Thioflflavin-T (ThT) som en positiv kontrol, der tidligere har vist sig at forlænge levetiden dybt og bremse aldring hos voksneC. elegans40; disse gavnlige virkninger af ThT afhænger af HSF-1, stressresistens og lang levetid transkriptionsfaktor SKN-1, molekylære chaperoner, autofagi og proteasomale funktioner40 (Supplerende figurer 1 og 2). GMC og vildtype N2-orme blev flyttet over på metabolitterne på L4-stadiet for at undgå udviklingsmæssige effekter og underkastet motilitetsassays på dag 5 i voksenalderen, når de fænotypiske manifestationer af A 42 toksicitet er fremtrædende (fig.3). Vi fandt ud af, at tre metabolitter, carnosin, enhver glycol og kynurensyre, forbedrede ormenes kondition sammenlignet med de ubehandlede GMC-orme (Supplerende figurer 1, 2, og for detaljeret karakterisering se fig.3). Vi brugte ThT som en positiv kontrol for ormfifitness40. Vi fandt ud af, at resultaterne opnået med carnosin og kynurensyre var yderst reproducerbare med hensyn til øget motilitet og markant reducerede NIAD-4--farvede aggregater sammenlignet med de ubehandlede orme, og vi valgte derfor disse to metabolitter til yderligere karakterisering.

Fig. 2 Identifikationaf endogene metabolitter som protein-homeostase-regulatorer, der er dysreguleret i AD. -enSkematisk over den beregningsmæssige fragmentbaserede strategi, som vi brugte til at identificere endogene metabolitter fra Human Metabolome Database (HMDB) som kandidatproteinhomeostaseregulatorer, der også er dysreguleret i AD.b Ved hjælp af denne tilgang identificerede viseks kandidatmetabolitter, der tjener som proteinhomeostaseregulatorer (tabel1, Supplerende Fig. 1 og Supplerende Data 1).

Ved forskellige doser af metabolitter viser både carnosin og kynureninsyre et klart respons i forbedringen af ​​motilitet på dag 5 (fig.3b–e) sammenlignet med de første (yngre) dage af voksenlivet. GMC-motiliteten (i BPM) var højest ved en koncentration på 15μM carnosin og 10μM kynurensyre, med et tilsvarende lavere antal aggregater (fig.3f, g). Vi så, at carnosin er lige så effektivt i koncentrationsområdet 10–25 μM, og. kynurensyre var mest effektiv til at sænke det samlede antal til 15μM koncentration.

I begge tilfælde, yderligere stigning i koncentrationer (Større end eller lig med50 μM) viste ingen forbedring i motilitet, muligvis på grund af ikke-relaterede toksiske virkninger af metabolitterne iC. elegans(Supplerende fig. 1h, i). Vi har ikke observeret nogen åbenlyse virkninger af carnosin og kynureninsyre på ændringer i ormemotilitet og totalfitnessscore i vildtype N2-orme (Supplerende Fig. 4). Totalfitnessscore beregnes ved hjælp af målinger, der inkluderer kropsbøjninger, hastighed, lammelsesrater, areal pr. dyr og middelfejl. Det resulterendefingeraftryker genereret i form af et radarkort ved hjælp af open source software som beskrevet i Perni et al.41.